TOM TATĐề tai thực hiện khảo sát các đặc điểm probiotic của nắm men Saccharomycesboulardii va toi ưu hóa sinh khối giàu hoạt tinh probiotic trên môi trường YPD bangphương pháp quy hoạch
TONG QUAN TÀI LIEU1.1 Khái niệm probiotic, prebiotic, chất mang và synbiotic
Probiotic duoc dinh nghia lần đầu bởi nhà khoa học người Nga Elie Metchnikoff vào dau thé ky 20, khi ông phát hiện những lợi ích của vi khuẩn lactic trong sữa lên men.
Theo Fuller (1989) probiotic là những vi sinh vật được bồ sung trong thực phẩm có lợi cho vật nuôi hay con người nhờ vào việc giúp cân bằng hệ thống vi sinh đường ruột.
FAO/WHO năm 2001 đã định nghĩa probiotic là những vi sinh vật sống khi được sử dụng với SỐ lượng đủ nhiều mang đến lợi ích cho vật chủ Có nhiều vi khuẩn được sử dụng như là probiotic đa phan là các vi khuẩn lactic và bifidobacteria (xem bảng 1.1).
Saccharomyces boulardii là nầm men probiotic được sử dụng từ rat sớm.
Bang 1.1 Các vi sinh vat probiotic (Holzapfel, 2001) Lactobacillus sp | Bifidobacteriums sp | Các vi khuẩn lactic Các vi khuẩn khác khác
L.acidophilus B adolescentis Enterococcus faecalis* Bacillus cereus var toyoi*
L.amylovorus B animalis/B lactis | Enterococcus faecium Escherichia coli strain nissle L casei B bifidum Lactococcuslactis Saccharomyces boulardii
L rhamnosus B breve Leuconostocmesenteroids | Saccharomyces cerevisiae
L paracasei B infantis Pediococcusacidilactici* | Propionibacteriumfreudenreic ods hii L plantarum B longum Sporolactobacillusinulinu s
(*) Sử dụng chủ yếu trên vật nuôi
Dé có thé được sử dụng như probiotic, vi sinh vật phải đáp ứng được các yếu tố như không độc, không gây bệnh, phát triển được trong hệ thống tiêu hóa vật chủ, mang lại lợi ích cho động vật hay người sử dụng, đồng thời vi sinh vật này có thé sản xuất với số lượng lớn và bảo quản được trong thời gian dài (Fuller, 1989) Các đặc tính sinh hóa để xác định probiotic có hoạt tính tốt bao gồm kha năng sống sót qua môi trường da dày, mudi mật của động vật, khả năng bám dính lên tế bào biéu bì thành ruột, kháng kháng sinh, phân cắt các chất dinh dưỡng Theo tiêu chuẩn quốc tế sản phẩm probiotic phải có mật độ vi sinh vật 10°- 108 tế bào/g hay 10° tế bào trên liều sử dụng (Milanovic,
Thuật ngữ prebiotic được sử dụng lần đầu bởi Gibson và Roberfroid năm 1995, theo đó prebiotic có nghĩa là những thực phẩm không thể tiêu hóa được, có ảnh hưởng tốt đến vật chủ băng cach tăng cường hoạt động của hệ vi sinh đường ruột một cách chọn lọc. Đến năm 2010 Gibson và cộng sự đã thống nhất định nghĩa: “Prebiotic là thành phan thực phẩm không tiêu hóa được, kích thích có chọn lọc sự sinh trưởng và trao đối chất của vi khuẩn, tăng cường sự cân băng hệ vi khuẩn tiêu hóa, cải thiện sức khỏe đường ruột” Fructooligosaccharide, inulin, oligofructose, lactulose và galactooligosaccharide từ lâu đã được chap nhận là những prebiotic với kha năng bên trong môi trường muối mật dạ dày, chồng lại sự thủy phân của enzyme tiêu hóa, có thé được tiêu thụ bởi hệ vi sinh vật có lợi trong đường ruột (Gibson, 2010) Nhiều prebiotic được nghiên cứu và phát triển gần đây như ligosaccharide (isomaltooligosaccharide, lactosucrose, xylooligosaccha-ride và glucooligosaccharide), sugar alcohol va polysaccharide, điều này cho thay vai trò của prebiotic là rất quan trong trong lĩnh vực probiotic Prebiotic đã được chứng minh có những lợi ích như tăng cường số lượng vi sinh có lợi trong ruột kết, tăng khả năng hấp thụ canxi, giảm thời gian tiêu hóa, thậm chí còn giảm lượng mỡ trong máu (Anandharaj, 2014).
Khi probiotic và prebiotic được kết hợp với nhau sẽ được gọi là synbiotic, sự kết hợp này tăng cường kha năng phát triển của sinh vật prebiotic trong đường ruột bang cách cung cấp kịp thời chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của vi sinh vật Điều này có ý nghĩa quan trọng đặc biệt trong môi trường ruột kết, khi đó synbiotic có thé phát triển và cạnh tranh với sinh vật gây hại nhờ vào cơ chất prebiotic (Anandharaj, 2014).
1.1.2 Chat mang protein và protein đậu nành (SPI)
Quá trình sấy phun gây biến tính protein, và thay đổi cau trúc tế bào vi sinh vật làm tăng tỷ lệ chết tế bao trong suốt quá trình say Chất mang có vai trò là tác nhân bảo vệ đối tượng sấy phun, quyết định chất lượng sản phẩm đối với các cơ chất nhạy cảm như protein, enzyme, tế bào vi sinh vật thì việc lựa chọn chất mang phù hợp là nhân tố được xem xét đầu tiên khi sử dụng phương pháp sấy phun (Dianawati, 2014) Về cơ bản, chất mang sử dung trong quá trình vi gói probiotic phải đáp ứng được những điều kiện như : tạo được màng bao hay cầu trúc mạng bảo vệ vi sinh vật, an toàn sinh học, giải phóng vi sinh vật tại cơ quan đích, giá thành rẻ và cảm quan tốt (Motazavian, 2007).
Có nhiều chất mang được sử dụng trong giai đoạn đầu của công nghệ vi gói như alginate, tinh bột và các chất hỗ trợ như chitosan, xanthan đã được chứng minh có hiệu quả trong việc bảo quản vi sinh, trong đó alginate la chất mang được sử dụng rộng rãi nhất.
Gan đây các chất mang trên nền tang protein bao gồm sữa gay, casein, whey protein và các protein không có nguồn gốc từ sữa đã được chú trọng nghiên cứu và cho thay trong nhiều trường hợp có hiệu quả tốt hơn các chất mang truyền thống như aginate (Dianawati, 2014) Các chuỗi đường ngắn trong protein có hiệu quả tăng cường khả năng sống sót của vi sinh tốt hơn các polysaccharide trong các chat mang truyền thống có bản chat carbohydrate Trong quá trình say phun dưới tác động của nhiệt độ, bề mặt tế bào là thành phần nhạy cảm và bị tốn thương dau tiên, các chuỗi glycoprotein trên chất mang protein liên kết với màng tế bào, giúp củng cô và bảo vệ màng tế bào tốt hơn các chất mang truyền thông (Heidebach, 2010).
Theo Hiệp Hội Kiểm Soát Thực Phẩm Hoa Kỳ (AAFCO) thì SPI là sản phẩm protein từ đậu nành đã tách vỏ, tách béo và các thành phần không phải protein, có chứa ít nhất 90% protein trên hàm lượng chất khô Xét về mặt giá trị dinh dưỡng, protein đậu nành là protein tot nhât trong sô các loại protein có nguôn gôc thực vật, có hàm lượng protein cao, dê tan trong nước, chứa nhiêu acid amin cân thiệt và không thay thê đôi với người và động vat SPI được sử dụng nhiêu trong lĩnh vực thực phầm như sản xuât sữa, các loại súp, bánh mì, các sản phầm từ thịt và cá, nước châm, thức ăn dinh dưỡng nhằm nâng cao giá trị dinh dưỡng cho thực phẩm (Nesterenko, 2013).
Bang 1.2 Thanh phan các acid amin trong soy protein islate (Bùi Thanh Binh, 2011)
Acid amin Ham lượng acid amin (ứ/100g protein) Cystine 1,33
Isoleucine 454 Leucine 7,78 Lysine 6,38 Methionine 1,26 Phenylalanine 4.94
Trong lĩnh vực san xuất probiotic, SPI có những đặc tính quý dé có thé sử dụng như một chất mang, bao gồm khả năng hòa tan trong nước, tạo gel, nhũ hoá, tính liên kết nước và khả năng khuyếch tán là những đặc tính quan trọng cua SPI (Franzen, 1976).
1.2 Nắm men Saccharomyces boulardii 1.2.1 Lịch sử phát hiện va đặc điểm sinh hoc
Sacharomyces boulardii được phát hiện lần đầu vào năm 1923 bởi nhà khoa học ngườiPháp Herry Boulard trên vỏ trái cây chín, ông đã phân lập nam men này khi thấy người dân bản địa (Nam A) ăn vỏ quả vai và măng cụt dé trị bệnh tiêu chảy Ké từ năm 1980 có hàng loạt nghiên cứu vệ lợi ich cũng như đặc tính của nam men này, các nghiên cứu sinh học phân tử, sinh hóa, đã cho thay S.boulardii cùng họ với Saccharomyces serevicea nhưng khác biệt vê một sô đặc tính biên dưỡng, phân loại và di truyền
(Fietto, 2004) Hệ thống phân loại $.boulardii được mồ tả ở bang 1.3.
Bảng 1.3 Hệ thống phân loại nam men Saccharomyces boulardii Cấp độ phân loại Danh pháp
GIới Fungi Nganh Ascomycota Phan nganh Saccharomycotina Lop Saccharomycetes Bộ Saccharomycetales Họ Saccharomycetaceae Chị Saccharomyces Loài Saccharomyces boulardii
Về mặt hình thái S.bouladrii có hình cầu bầu dục, kích thước 4-6 x 6-9 wm Không giống như các nam men khác, S.boulardii không có khả năng tạo bào tử và sinh sản vô tính bằng cách nảy chổi Chéi được phát triển trên tế bào mẹ đến khi đạt kích thước trưởng thành sau đó tách ra khỏi tế bào mẹ (hình 1.2).
Hình 1.1 Nắm men Saccharomyces boulardii (Czerucka, 2007)
Trong khi S.serevices phát triển tôi ưu ở 30°C, S.boulardii phát triển tối ưu ở 37°C, đặc điểm này giúp S.boulardii phát trién dễ dàng trong hệ thống tiêu hóa người và vật nuôi Các nghiên cứu đã chỉ ra rang S.boulardii là sinh vật hiếu khí tùy ý, có thé lên men đa dạng các loại đường đơn đa phân tử, đường đơn, đường đôi, ethanol, acetate, glycerol, pyruvate va lactate dé phát triển Trong con đường biến dưỡng carbonhydrat S.boulardii tạo ra một lượng nhỏ acid lactic và ethanol Nam men này phát triển mạnh trên môi trường có chứa glucose và galactose, tuy nhiên lại không thể sử dụng lactose cho quá trình biến dưỡng, glucose được chuyển hóa thông qua con đường glucolytic, các con đường chuyển hóa proteolytic hay lipolytic không tôn tại nên S.boulardii không thé sử dung các acid hữu cơ như citric hay succinic acid, đồng thời nam men này cho thấy có kha năng phát triển tốt trên môi trường có acid lactic (Diep D.T.N,
Tế bào me mang vô sắc vi ống eC Se > CS) So So |
Enzyme phan ơ giảmàảng _ - — ò Thanh tê bao Nhân tổ hoạt hóa _ _zZ = k : = = Hệ thống tông hợp polysaccharide
- ‹ - Bào Hệ thống kiêm hảm tông hợp polysaccaride x iy if \ 2 \ | Tébao con
Quá trì trình sinh sản vô tính cua Saccharomyces boulardii (Cole, 1996)1.2.2 Một số đặc tính probiotic ưu thé của S.boulardii S.boulardii được sử dung dé điều trị bệnh tiêu chảy và các hội chứng liên quan từ năm
1962 dưới dạng đông khô Các nghiên cứu sâu hơn của Farland và Benasconig năm
1993 đã xác nhận S.boulardii có hiệu quả trong điều trị bệnh tiêu chảy và an toàn khi sử dụng dạng uống (bảng 1.4).
Bảng 1.4 Hiệu quả của S.boulardii trong điều trị hội chứng tiêu chảy (Farland, 1993)
Hiệu quá | Tác dụng Chứng bệnh ` Tài liệu tham khảo điêu trị (%) | phụ
Ngăn ngừa tac dụng phụ | 56,7-56,9 Không Surawicz, 1989; Farland, 1993. cua khang sinh trong điêu trị hội chứng tiêu chảy
Bệnh liên quan đến 46,5 Không Surawiczl, 2000.
Diộu tri tiộu chay cap 75 Khong Hửchter Chase, 1990. Điều tri hội chứng tiêu 52,8 Khong Saint-Marc, 1991. chay lién quan dén HIV
Trong khi co chế các probiotic còn chưa rõ rang, thường được giải thích với chức năng tăng cường phòng vệ của cơ thé, cạnh tranh với các vi khuẩn gây bệnh, tăng cường hệ miễn dịch S.boulardii có cơ chế tác động rõ ràng: tiết ra enzyme proteinase làm giảm độc tố do Clostridium difficile và enzyme phosphatase làm bất hoạt các nội độc tố do E.coli tiết ra, tăng lượng IgA, tăng các men lactase, sucrase, maltase, va naminopeptidase, tăng hấp thu ở người tiêu chảy, duy trì các acid béo chuỗi ngắn can thiết cho cho việc hấp thu nước và chất điện giải (Farland, 2010) Thêm vào đó, S.boulardii làm giảm viêm ở đường ruột do kích thích tế bào T, ức chế mitogenactivatingprotein (MAP), nuclear factorkappaB (NFKB), do đó làm giảm interleukin (IL8) và tumor necrosis factor alpha (TNFa) (Dias, 1995) Đồng thời S.boulardii không bi ảnh hưởng bởi khang sinh và sulfamide, điều nay có ý nghĩa quan trọng trong việc sử dụng S boulardii dé điều trị và phòng chống hội chứng tiêu chảy, tái cân bằng hệ thống vi sinh đường ruột khi sử dụng kháng sinh trong thời gian dài.
Một yếu tố lợi thế khác giúp S boulardii trở nên hữu ích dé sử dụng như probiotic là
9 khả nang chong chịu môi trường pH dạ dày người cũng như môi trường mudi mật ở người và động vật.
Trong nghiên cứu lâm sàng S.boulardii, đã được nghiên cứu trong vài thử nghiệm ở trẻ em và người lớn để cải thiện hiệu quả, tăng dung nạp thuốc trong liệu pháp điều trị nhiễm trùng H.pylori Hurduc (2009) công bố kết quả của nghiên cứu lâm sàng về S.boulardii ở 90 trẻ em có triệu chứng nhiễm H.pylori Tất cả trẻ em trong nghiên cứu được điều trị omeprazole/esomeprazole, clarithromycin, va amoxicillin từ 7 đến 10 ngày và những trẻ này được phân bố ngẫu nhiên vào nhóm S.boulardii 250mg hoặc giả dược (dùng 2 lần mỗi ngày trong 4 tuân) Tỷ lệ sạch H.pylori 93.3% ở nhóm có dùng
S.boulardii so với 80.9% ở nhóm dùng gia dược, ty lệ các tác dụng phụ có hại đi kèm với trị liệu kháng sinh ở nhóm dùng S boulardii thấp hơn nhiều so với nhóm dùng gia được (8,3% so với 30.9%, p=0,047) (Marcia, 2009).
1.3 Tống quan về kỹ thuật vi gói và say phun
1.3.1 Kỹ thuật vi gói Đáp ứng nhu câu phát triển của xã hội, nhu cầu về sử dụng thực phẩm chức năng và các chất có hoạt tính sinh học ngày một cao, để tạo sự thuận tiện và nâng cao giá tri sản phẩm, các kỹ thuật vi gói ngày càng được phát triển đa dạng, mạnh mẽ Công nghệ vi gói từ một phân của lĩnh vực công nghệ sinh học đã phát triển thành một bộ phận của ngành công nghệ thực phẩm từ hơn 60 năm nay Về cơ bản, công nghệ vi gói là kỹ thuật đóng gói các thành phan có tính năng sinh học nhằm vận chuyền và kiểm soát sự phân giải trong điều kiện tiễn trình sinh học tối ưu Vi gói trong thực phẩm được định nghĩa là một tiễn trình bẫy các vật liệu có hoạt tính như vitamin, khoáng chất, protein, amino acid, lipid có hoạt tính, các chiết xuất từ thực vật hay các tế bào sống (ví dụ như probiotic) trong chất mang, hay một mạng các chất bao phủ như protein, polysaccharide, protein hay lipid Vi gói có hai cau trúc cơ bản là vi gói đơn nhân (sigle- core) va vi gói đa nhân (multiple-core) Đối với cấu trúc thứ nhất vật liệu cần mang được bao phủ trong một lớp dày của chất mang, đối với cau trúc đa nhân vật liệu được gan vào cầu trúc mạng của chất mang trong một thé đồng nhất (Desai, 2005).
Hình 1.3 Cau trúc vi gói đơn nhân va đa nhân, A- cau trúc đơn nhân, B- cau trúc đa nhân (Desai, 2005)
Hiện nay có nhiều kỹ thuật vi gói được sử dụng như, sấy phun, nhũ tương nhỏ giọt, huyền phù, sấy thăng hoa Việc lựa chọn phương pháp vi gói phụ thuộc vào rất nhiều yếu tô như, quy mô sản xuất, tính chat của đối tượng cần sấy, tính chat chất mang, yêu cầu và giá trị sản phẩm Nguyên tac của một số kỹ thuật vi gói thông dụng được miêu tả ở hình 1.4 Các loại dược phẩm b6 sung và thực phẩm chức năng bao gồm probiotic, vitamin, chất tạo hương vị, màu sắc, các peptide có hoạt tính sinh học có các đặc tính khác nhau vé cau tạo phân tử, tính chất hóa lý điều kiện biểu hiện chức nang, vì vậy cần được vận chuyền và phân giải trong hệ thống tiêu hóa để đạt được kết quả tốt nhất Đề giải quyết van dé này các giải pháp được đưa ra bao gồm keo tụ, kết tủa, nhũ tương bay trong gel, được phát triển dé tạo thực phẩm và dược phẩm có chức năng Vi gói bảo vé các chất có hoạt tính sinh học, nhạy cảm với môi trường với các lợi thế như sau: Thứ nhất, bảo vệ hoạt tính sinh học của chất mang dưới điều kiện tác động của môi trường như nhiệt độ anh sang, độ âm cho đến khi sản phẩm được phân phối Ở VỊ trí mong muốn Thứ hai, ngăn ngừa các phản ứng oxi hóa, hydrat hóa, lipid hóa của thực phẩm với môi trường và chất mang đảm bảo sự ôn định của hợp chất trong hệ thống tiêu hóa Thứ ba, cho phép thiết kế hương vị và mùi hương mong muốn nhằm tạo cảm quan cho người sử dụng bang cách phối trộn, bố sung các thành phan trong chất mang, chất bao phủ Thứ tư, che dấu các mùi vị không mong muốn của hợp chất có hoạt tính, trong trường hợp này nhiều hợp chất có mùi và vị khó chịu (đăng, hôi ).
Thứ năm, tang cường hoạt tính sinh học của hợp chất, nhiều hoạt chất như vitamin ky nước có thé được gan vào các acid béo chưa bảo hòa trong chat mang thắm nước (bột ca cao, protein sữa ) để biểu hiện hay tăng cường hoạt tinh sinh học (Gharsallaoui,
Nhỏ giọt Say phun Nhũ tương Sây bao phủ Ngưng kết x10 SỐ ~
Hình 1.4 Một số kỹ thuật vi gói thông dụng (Poncelet, 2011) Đặc biệt trong thời gian gần đây công nghệ vi gói được áp dụng như một công cụ dé cố định tế bào với mục đích tăng hiệu quả sử dụng Có thé kế đến tác dụng của kỹ thuật vi gói đối với probiotic và synbiotic như sau: Thứ nhất; bảo vệ probiotic trước những điều kiện bất lợi của môi trường cũng như trong điều kiện khắc nghiệt của hệ thống tiêu để đạt được mục đích sử dụng tốt nhất, thứ hai; tạo điều kiện kết hợp tốt nhất giữa probiotic và prebiotic tạo thành một thé thống nhất gọi là synbiotic, thứ ba; sự kết hop giữa probiotic và prebiotic không tiêu hóa (lactulose, lactitol, xylitol, inulin ) giúp tăng cường khả phát triển của probiotic trong hệ thống tiêu hóa Cuối cùng, công nghệ vỉ gói tăng cường thời gian bảo quản của sản phẩm probiotic (Mortazavian, 2007).
1.3.2 Kỹ thuật vi gói say phun
Say phun là kỹ thuật đầu tiên và được áp dung rộng rãi nhất để vi gói trong ngành công nghiệp thực phẩm từ những năm 1870 Hiện nay 80-90% sản phẩm vi gói được sản xuất bằng phương pháp say phun (Milanovic, 2010) Say phun là một phương pháp san
12 xuất sản phẩm dạng bột từ hỗn hợp lỏng hay huyền phù sử dụng khí nóng làm khô nhanh vật liệu (Mujumda, 2007) Trong quá trình sấy phun vật liệu cần vi gói và chất mang được kết hợp với nhau dưới dạng mạng không gian ba chiều (matrix) trong buông sấy Sản phẩm dạng bột tạo thành thường có kích thước khoảng 10-15 um đến 2-3mm tùy theo vật liệu và điều kiện say Một trong những đặc điểm của đáng chú ý của phương pháp say phun là sản phẩm thường có độ am thấp vì vậy thích hop bao quản ở điều kiện thông thường trong thời gian dài (Chávarri, 2012). vật liệu cẳn sây Bộ phận đông nhât Hôn từ
—T ''l00004 nie —{) ew ung môi và chất mang / \\
Hình 1.5 nguyên tắc hoạt động hệ thống say phun (Chavarri, 2012) Nhìn chung phương pháp sấy phun bao gôm bốn giai đoạn bao gồm:
- Giai đoạn phun sương: Hỗn hop lỏng được phun vào buồng say phân tách thành các hạt nhỏ, nhờ vào áp suất hay lực ly tâm Việc phân tách thành các giọt nhỏ giúp cau trúc vi gói có diện tích tiếp xúc với không khí nóng cao hơn.
- Giai đoạn thứ hai là giai đoạn các giọt chất lỏng nóng tiếp xúc với không khí nóng và bắt đầu quá trình bay hơi nước.
- Giai đoạn thứ ba là sự bay hơi nước của giọt chất lỏng nóng và sự hình hạt sản phẩm vi gói Quá trình bay hơi diễn ra ngay lập tức trong giọt nóng, khi hàm lượng nước quá thấp không đủ để duy trì tình trạng bão hòa, lớp vỏ khô bắt đầu hình thành và chuyển sang giai đoạn cuối cùng.
- Giai đoạn cuối cùng là quá trình phân tách các hạt sản phẩm vi gói khô ra khỏi ra hỗn hợp không khí 4m trong buông say (Chavarri, 2012).
1.3.3 Tác động của quá trình sấy phun đối với sản phẩm probiotic Đối với phương pháp say phun các thông số kỹ thuật chính ảnh hưởng đến sản phẩm bao gồm: Tốc độ nhập liệu, áp suất khí nén và nhiệt độ sấy phun.
Tốc độ nhập liệu là yếu tố quyết định năng suất tạo sản phẩm, tuy nhiên tốc độ nhập liệu cảng tăng thì thời gian lưu của vật liệu say trong buông sấy giảm, hiệu quả say sẽ không cao Độ âm chế phẩm sẽ tăng, các hạt âm bám lại trong buồng sấy cũng tang, dẫn đến hiệu suất thu hồi sản phẩm sau quá trình say phun giảm Đối với chế phẩm probiotic độ âm chế phẩm càng cao thì thời gian bảo quản càng thấp.
Khí nén có nhiệm vụ làm quay đầu phun sương, tạo các hạt say Ap suất khí nén càng tăng thì tốc độ quay của đầu phun càng tăng, của quá trình say phun, điều này có ảnh hưởng đến kích thước hạt và độ âm chế phẩm sấy phun Khi áp suất khí nén tăng thì đầu phun sẽ quay nhanh hơn, các hạt sương sẽ có kích thước nhỏ hơn, diện tích tiếp xúc với không khí nóng tăng, đồng thời hạt nhẹ và khô sẽ ít bị dính lại trên thành buông sấy, hiệu suất thu hồi cao hơn và độ âm thấp hơn (Anal, 2007).
Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng chính đến chất lượng chế phẩm probiotic say phun (Zahra, 2015) Nhiệt độ đóng vai trò là tác nhân chính lay di hơi nước va tao ra san phẩm có độ am thấp, đối với sản phẩm say phun nhiệt độ càng thấp thi sản pham có độ âm càng cao, đồng thời nhiệt độ cao sẽ làm biến tính các chất sấy phun Đối với chế phẩm synbiotic nhạy cảm với tác nhân nhiệt, nhiệt độ là tác nhân gây sốc, thay đổi hoạt tính và làm chết tế bào trong suốt quá trình say phun (Guergoletto, 2012) Nhiệt độ gây ra một loạt các ảnh hưởng đến tế bào như khử nước, oxi hóa, tích Itty các chất gây hại
VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 Thời gian va địa điểm thực hiện Địa điểm: Phòng thí nghiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Khoa Kỹ Thuật Hóa Hoc, Trường Đại Học Bách Khoa Thành Phố Hỗ Chí Minh.
Thời gian: Tháng 01 năm 2015 đến tháng 12 năm 2015.
2.2.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là Saccharomyces boulardii và vi sinh vật chỉ thị E coli ATCC 8739, Samonella ATCC 14028 Có nguon sốc từ bộ lưu trữ giống vi sinh vật - Đại học
2.2.2 Vật liệu và hóa chất thí nghiệm 2.2.2.1 Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị: Sử dụng các thiết bị thí nghiệm bao gồm: Tủ am, nôi hấp tiệt trùng cân điện tử, máy ly tâm, máy vortex, tủ cây, kính hiển vi, máy đo pH, máy đo độ âm, máy say phun.
Dụng cụ: Sử dụng các dụng cụ dùng trong phòng thí nghiệm như ống nghiệm, đĩa Petri, đèn cồn, que cấy, que trải, cốc thủy tinh, giá đỡ ống nghiệm, bình tam giác và ống đong
2.2.2.2 Hóa chất và môi trường e Soy protein Isolate (SPI). e Bột SPI xuất xứ Dai Loan, tiêu chuẩn kỹ thuật ham lượng protein > 90%. e Inulin: xuất xứ Mỹ (sigma) e© Nước muối sinh lý (0,9% NaCl)
NaCl 9,0g/I Nước vừa du 1000ml e Môi trường Yeast peptondextron (Y PD).
Pepton 3g/I Nước vừa đủ I000ml pH =6.5
Môi trường YPD agar: Môi trường YPD bố sung 2% (W/V) agar
Mỗi trường LB Tryptone I0gi/]
NaCL 5g Nước vừa đủ I000ml pH= 7.5
Môi trường LB — agar: Môi trường LB bồ sung 2% agar. Đệm photphat NaH›POx 5,17g/I Na›HPOx 6,09g/]
Nước vừa đủ I000ml pH =7
Môi trường muối mật nhân tạo (SIF)
NaCl 9¢/I Mat bò 3g/l Nước vừa đủ I000ml pH=6,5
Môi trường da dày nhân tao (SGJ) NaCl 9¢/I
Pepsin 3¢/INước vừa đủ I000ml pH=2
2.3 Phương pháp va nội dung thực hiện
2.3.1 Sơ đồ tổng quát nội dung nghiên cứu e Khao sát hình thái và đường cong sinh trưởng S.boulardii
Các thí nghiệm tiền đề e Khao sát một số đặc tinh probiotic bao gôm:
- Chong chịu môi trường da day, muối mật nhân tao
- - Đối kháng vi khuẩn gây bệnh
- Giam cholesterol ke He ns k e Sang lọc các yếu tố thí nghiệm
Tôi ưu hóa môi trường nudi cay theo nh háo Placket-B thu nhận sinh khối S.boulardii CƠ PSMODE PSAP blacker burman e Thiệt kê tôi ưu hóa môi trường theo phương pháp RSM-CCD e Khảo sát nhiệt độ đầu vào Thử nghiệm sấy phun e Khao sát nồng độ SPI e Khao sát nông độ inulin tuk & —— e Tái kiểm tra một số hoạt tính
Chê pham say phun và viên va probiotic chế phẩm say phun nang synbiotic
—Y>_ |e _ Theo dõi thời gian bảo quản viên nang
Hình 2.1 Tổng quát nội dung nghiên cứu
2.3.2 Các thí nghiệm tiền đề về đặc điểm sinh trưởng và hoạt tinh probiotic
S.boulardii 2.3.2.1 Hình thái va đường cong sinh trưởng cua S.boulardii trên moi trường YPD Muc dich:
- Kiêm tra mức độ thuan va hình thái cua nam men.
- Khao sát thời gian tăng trưởng cua nam men theo thời gian nuôi cây trên môi trường
YPD làm cơ sở cho các thí nghiệm tiếp theo.
Phương pháp thực hiến: a) Quan sát hình thái
- Quan sát vi thé nam men băng phương pháp hién vi, thực hiện tạo tiêu bản từ canh trường YPD chứa nam men đã hoạt hóa, quan sát và ghi nhận hình ảnh trên kính hiển vi với độ phóng dai X10, X40.
- Quan sát đại thé, mức độ thuân và định lượng nắm men bang phương pháp trải đĩa.
Lay 1ml môi trường nuôi cay nam men sau 24 giờ nuôi cay, pha loãng với các nông độ từ 10! đến 107, tiễn hành trải 0,1mI dung dich pha loãng trên môi trường YPD agar , ủ ở 37°C và quan sát ghi nhận hình thái khuẩn lạc, mức độ tạp nhiễm. b) Khảo sát đường cong sinh trưởng của nắm men Nhân giống so cấp nam men S.boulardii trong ống nghiệm chứa 10 ml môi trường YPD (year-peptone-dextrose) qua đêm, sau đó chuyển 5ml canh khuẩn nam men đã hoạt hóa qua bình tam giác chứa 100ml môi trường YPD dé khảo sát sự phát triển của sinh khối Ghi nhận sự tăng sinh của nắm men sau mỗi 4 giờ nuôi cay bằng phương pháp trải đĩa trên môi trường YPD agar và đếm trên buồng đếm.
2.3.2.2 Phương pháp kiểm tra kha năng sống của probiotic trong môi trường dạ dày nhân tạo
Khảo sát khả năng tôn tại của nắm men S.boulardii trong môi trường da dày nhân tạo với pH 2.
- Chung nam men S.boulardii được nuôi cay trên môi trường YPD
- Ly tâm dịch nuôi cay S.boulardii sau 36 giờ với tốc độ 5000v/p trong 10 phút.
: Thu sinh khối, rửa sạch 2 lần với nước muối sinh lý.
: Bồ sung Iml dung dich huyền phù vào 10ml dung dich môi trường da dày nhân tạo.
: Theo dõi (30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút), xác định % tế bào nam men tôn tại so với mật độ tế bào nắm men ban đầu (Katarzyna, 2010).
2.3.2.3 Phương pháp kiểm tra kha năng sống của probiotic trong môi trường muôi mật nhân tạo
Khảo sát khả năng tổn tại của nam men S.boulardii trong môi trường muối mật MRS
- Chung nam men S.boulardii được nuôi cay trên môi trường YPD - Ly tâm dịch nuôi cay S.boulardii sau 36 giờ với tốc độ 5000v/p trong 10 phút.
- Thu sinh khối, rửa sạch 2 lần với nước muối sinh lý.
- Bồ sung Iml dịch huyền phù vào 10ml dung dịch YPD 0,3% muối mật va mẫu đối chứng không b6 sung muối mật, ủ 37°C Thực hiện lặp lại 3 lần.
- Theo dõi (0 giờ, 1 giờ, 2 gid), Xác định % tế bao nam men tôn tại so với mật độ tế bào nắm men ban dau Số tế bào xác định băng phương pháp đếm gián tiếp trên môi trường Y PD (Zainad, 2014).
2.3.2.4 Phương pháp thử nghiệm đối kháng với vi khuẩn E.coli và Salmonella sp băng phương pháp đục lỗ thạch Để xác định hoạt tính kháng khuẩn của S.boulardii, nam men và các vi khuẩn kiểm định được hoạt hóa và nhân giống trong bình tam giác 250ml chứa 100ml môi trường nuôi cay Nam men được nuôi cấy trên môi trường YPD trong khoảng 32 giờ, vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường LB lỏng qua đêm Đối với chế phẩm nắm men sấy phun, 0,5g chế phẩm được huyền phù trong 20 ml đệm photphate, giữ trong tủ lạnh 2 giờ để hydrat hóa hoàn toàn Dung dịch nuôi cay E.coli và Salmonella được pha loãng với mật độ khoảng 10° tế bao/ml va được trải lên đĩa petri, thạch được duc lỗ đường kính 6mm, dung dịch nuôi cay nam men và chê phâm đã chuân bị được cho vào các
24 giếng với thé tích 50 zl/giễng Quan sát và ghi nhận vòng kháng khuẩn sau 36 đến 48 giờ nuôi cay (Izguet, 1997).
2.3.2.5 Phương pháp xác định khả năng giảm cholesterol của nam men S.boulardii
Tiến hành: tương tự phương pháp xác định khả năng chịu dịch dạ dày và muối mật nhân tạo trên môi trường (bồ sung cholesterol với nồng độ cudi 100ug/ml) Sau 2,5 giờ cây đêm mẫu xác định nồng độ cholesterol còn lại và mật độ tế bào của mẫu băng phương pháp trải đĩa.
Tiến hành định lượng cholesterol trong môi trường như mô tả sau: ly tâm dịch nam men sau 2,5 giờ nuôi cấy, thu nhận dich nỗi Iml dịch nối, thêm 1ml KOH (33%) va 2ml ethanol, vortex, ủ 60°C trong 15 phút Bố sung 3ml hexane, vortex Thêm 2ml nước cat, vortex Hút Iml lớp hexane chuyên vào ông nghiệm Lam tan trong 2ml 0- phthalaldehyde trong 10 phút Thêm 0,5ml HzSŠO4, vortex trong 1 phút Do OD 550 nm sau 60 phút Đường chuẩn xây dựng giá trị cholesterol tuyến tính với giá tri OD đã được xây dựng trước đó Dựa vào giá trị OD trên, thay vào phương trình đường chuẩn suy ra hàm lượng cholesterol hiện diện trong dung dịch (Edward, 2008).
2.3.3 Quy hoạch thực nghiệm các yếu tố anh hướng đến sự phát triển sinh khối
2.3.3.1 Khao sát nồng độ chat dinh dưỡng anh hướng đến sự phát triển sinh khối nắm men làm tiền đề cho thiết kế Plackett-Burman
Mục đích: Xác định nông độ môi trường thích hợp cho sự phát triển của sinh khối nam men Saccharomyces boulardii Sử dụng kết quả ứng dụng thiết kế quy hoạch thực nghiệm theo phương pháp Plackett-Burman.
Phương pháp thực hiện: Trên cở sở môi trường YPD có nồng độ Glucose 10g/1, cao nắm men 3g/1 và pepton 3g/1 cùng với nghiên cứu đã công bố của Tam S Chin (2015) với các nồng độ glucose cao hơn (10-90g/l) cho thay kha năng tao sinh khối nắm men Saccharomyces boulardii tốt hơn, các yếu tô cao nam men và pepton cũng được tăng theo dé thiết kế các thí nghiệm tiền dé như ở bảng 2.1.
Bảng 2.1 Bồ trí các nghiệm thức (NT) khảo sát mức độ ảnh hưởng chất của cơ chất đến sinh khối S.boulardii.
NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 Glucose 10 20 30 20 30 40
Thí nghiệm được thực hiện ở 37°C và theo dõi sự phát triển của sinh khối sau khi nuôi cay ở 24, 36 và 48 giờ nuôi cấy.
2.3.3.2 Thiết kế sàng lọc yếu tố thí nghiệm theo Plackett — Burman
Mục đích: Xác định các yếu tố thí nghiệm môi trường có ảnh hưởng đến sự phát triển sinh khối của nắm men theo phương pháp Plaket-Burman Kết quả thu được ở thí nghiệm này sẽ được sử dụng làm nên tảng cho thiết kế tối ưu hóa môi trường trong các thí nghiệm tiếp theo.
Thiết kế các thí nghiệm theo như ma trận Plackettt — Burman ở bảng 2.2 với mức ý nghĩa œ = 0.05 Kết quả được phân tích bằng phần mềm Design — expert phiên bản 9.0.
KET QUÁ VÀ BIEN LUẬNpepton (% (wv))Hình 3.9 Đồ thị bề mặt đáp ứng biéu diễn sự ảnh hưởng tương tác của nồng độ glucose và pepton đến mật độ sinh khối nắm men S.boulardii.
Des iqgn-ExpertŒ Software Factor Coding: Actual R1 ® Design Points 9.86688 9.0086
tine (h)Hình 3.10 Đồ thị bề mặt đáp ứng biểu diễn sự ảnh hưởng tương tác của nông độ glucose và thời gian đên mật độ sinh khôi nam men
Design-Expert® Software Factor Coding: Actual R1 ® Design Points 9.86688 9.0086
Hình 3.11 Đồ thị bề mặt đáp ứng biểu diễn sự ảnh hưởng tương tác của nồng độ pepton và thời gian đền mật độ sinh khôi nam men.
Các đồ thị 3.9, 3.10 và 3.11 thé hiện sự tương tác của các yếu tô làm cho hàm sinh khối S.buolardii đáp tng cực dai Từ các đồ thị này chúng ta có thé thay sự tương tác xảy ra trên cả ba yếu tố Mật độ sinh khối S boulardii tỷ lệ thuận với nồng độ glucose, pepton và thời gian thực nghiệm Đồ thị và các hệ số trong bang 3.8 cho thay việc chon thời điểm thu sinh khối có tính chất quyết định mật độ sinh khối đồng thời glucose có ảnh hưởng đến sự phát triển của sinh khôi nhiều hơn nồng độ pepton Kết quả này cho thay sự phù hợp về mặt lý thuyết và thực nghiệm đã được công bố trước Glucose với vai trò là nguồn cung cấp nguồn carbon đã được Tam Sang Chin (2015) nghiên cứu và xác nhận tạo được mật độ sinh khối cao nhất ở nông độ 20g/1 cùng với 15 g/l dịch chiết từ hạt ngô là nguồn cung cấp carbon, Khi tăng thêm nông độ glucose sinh khối có xu hướng giảm, nghiên cứu này cũng đồng thời chỉ ra ở đồng độ đường càng cao khả năng tạo ra hàm lượng ethanol càng lớn ngay cả trong điều kiện nuôi cấy hiếu khí, nồng độ ethanol tăng mạnh theo thời gian nuôi cay, đây cũng là nguyên nhân ức chế và làm giảm mật độ sinh khối nam men khi sinh khối vượt quá đỉnh sinh trưởng.
Design-Expert® Software Factor Coding: Actual Desirability
Hình 3.12 Đồ thị bề mặt đáp ứng 3D biểu diễn sự ảnh hưởng của nồng độ glucose và pepton ở thời gian dự đoán sinh khối tối ưu
Dựa vào kết quả dự đoán của mô hình và thực nghiệm ở bảng 3.7, các kết quả thí nghiệm ở tâm được sử dụng dé đánh giá ý nghĩa của tính ảnh hưởng của từng biến đến kết quả tối ưu ở tâm phương án theo tiêu chuẩn Student:
Bang 3.8 Phân tích thí nghiệm ở tâm phương an No Yo Yo Yo-Yo (Yo-Yo)? x10
Tính ý nghĩa ¢; được tính theo công thức: t= Hal , VỚI bị là hăng sô hôi quy va Si, được bj tính theo công thức bên dưới.
Với No là nghiệm thức ở tâm, N là tổng số thí nghiệm.
Tra bang student: t,(f), với p= 0,05; f= No— 1= 5; ta có fooz(Š) = 2,015
Các hang số được cho là có tính ý nghĩa khi ¢ > t)(f) Bang 3.9 So sánh tính ý nghĩa của các hằng số hồi quy theo tiêu chuẩn Student
Các biến số hồi quy | Các hăng số hồi quy | Tính ý nghĩa | Kiểm định ý nghĩa
Xo 9.8619 9392.89 + XI 0.1198 114,11 + X2 0.0245 23,32 + X3 0.2592 246,91 + X1X2 0,0127 12,08 + X1X3 -0.0428 40,81 + X2X3 -0.0030 2,83 + XI -0,1084 103,29 + x2 -0.0567 54,00 + x3" -0,1670 159,07 + Ghi chú: (+) Hang số có ý nghĩa
Phương trình hồi quy trong trường hợp này được thé hiện như sau:
Các phân tích của phân tích RSM-CC chỉ ra rằng sinh khối sẽ đạt mức cực đại ở điều kiện như trong bảng 3.7 với mức độ ý nghĩa 98,23% (về mặt lý thuyết) Các thông số được sử dụng để thiết kế thực nghiệm lặp lại 3 lần với kết quả được trình bày trong cùng bảng (bảng 3.10) Việc sử dụng phương pháp RSM-CCD để thiết kế thực nghiệm và tạo được sinh khối ở mức 7,86x10°, tương ứng 9,985 (log CFU/ml) cho thấy cao hơn ở tất cả các nghiệm thức thực tế đã thí nghiệm cho thấy hiệu quả của phương pháp này trong áp dụng thực tế.
Bảng 3.10 Điều kiện đáp ứng tối ưu sinh khối theo phương pháp RSM-CCD
Glucose | Pepton Thoi Mật độ sinh | Mật độ sinh khối | Ty lệ thực (?%,w/v) | (%, wiv) gian khối dự đoán thực nghiệm nghiệm so với
(giò) | (log CFU/ml) | (log CFU/ml) | lý thuyết (%)
Từ những kết qua thí nghiệm áp dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm dé toi wu hóa môi trường nhằm thu nhận sinh khối toi wu, có thé thay phương pháp Plackett-
Burman và RSM-CCD có hiệu qua và giảm được thoi gian thực nghiệm so với phương pháp truyền thống Kết quả lý thuyết của phương pháp đã cho thấy sự phù hợp trong thực nghiệm với kết quả mát độ sinh khối toi wu thu được 7,86x10° cao hon các nghiém thức thiết kế và đạt được 99,10% so với mức dự đoán của phương pháp mô phỏng.
3.3 Vi gói sấy phun và bước đầu tạo chế phẩm synbiotic 3.3.1 Kết quả khảo sát nhiệt độ đầu vào anh hưởng đến mật độ sinh khối chế phẩm sấy phun
Kết quả thí nghiệm sấy phun với nhiệt độ đầu vào khác nhau được trình bày ở bảng 3.11 cho thấy nhiệt độ có ảnh hưởng quyết định đến mật độ sinh khối của chế phẩm sây phun Nhiệt độ càng cao thì mật độ sinh khối càng thấp, đồng thời độ âm cũng tỷ lệ nghịch với nhiệt độ đầu vào của quá trình sấy phun Kết quả này phù hợp với nhiều nghiên cứu vi gói bằng phương pháp sấy phun trước đây.
Bảng 3.11 Mật độ sinh khối và độ âm chế phẩm sấy phun trong điều kiện sấy với nhiệt độ đầu vào khác nhau
Mật độ sinh khối Độ am (%)
Nhiệt độ đầu vào (log CFU/g)
Mật độ sinh khối va độ âm của chế phẩm say phun là một yếu tổ hết sức quan trọng dé đánh giá chế phẩm sấy phun Thông thường độ âm là nhân tố xác định khả năng bảo quản của chế phẩm chế phẩm probiotic, theo kết quả ở bảng 3.10 có thé thấy ở các nhiệt độ khảo sát ngoại trừ 90°C (độ âm 10,2%) các nghiệm thức còn lại đều có độ âm phù hợp cho quá trình bảo quản ở trời gian dài (Theo Heidebach (2010) độ âm chế phẩm sấy phun thích hợp để bảo quản trong thời gian dài đối với sản phẩm probiotic năm trong mức 4-7%) Trong thí nghiệm này ở nhiệt độ đầu vào 90°C và nồng độ SPI 6% có mật độ sinh khối tốt nhất 7,52 (log CFU/g) tuy nhiên độ âm của chế phẩm sấy phun quá cao không phù hợp cho quá trình bảo quản Từ kết quả này nhiệt độ đầu vào 100°C với độ 4m phù hợp và mật độ cao nhất được chon để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo khảo sát nồng độ chất mang SPI và inulin.
So sánh với nghiên cứu sấy phun S.boulardii của Diệp D T N (2013) sử dụng chất mang là whey protein, với nhiệt độ đầu vào 90°C , với mật độ sinh khối ban dau là 9,03 log CFU/g chất khô tạo chế phẩm có mật độ sinh khối 7,55-7,62 log CFU/g có thé thay chất mang SPI sử dụng trong nghiên cứu này có hiệu quả bảo vệ sinh khối trong quá trình say phun là khả quan.
Từ kết quả thí nghiệm chúng tôi chọn nhiệt độ đâu vào 100°C dé thực hiện các thí nghiệm khảo sát say phun vi gói tiếp theo.
3.3.2 Anh hưởng nồng độ SPI đến mật độ sinh khối chế phẩm sấy phun.
Từ kết quả thí nghiệm 3.3.1 nhiệt độ đầu vào 100°C được chọn để đánh giá sự ảnh hưởng của nồng độ chất mang SPI đến mật độ sinh khối và độ âm của chế phẩm, kết quả được trình bày trong bảng 3.13 Từ kết quả này có thé thay ở nồng độ SPI 5% cho mật độ sinh khối chế phẩm tốt nhất 7,43 log CFU/g, tuy nhiên ở nghiệm thức này độ âm của chế phẩm là 8,29%, đây là độ 4m không phù hợp dé có thé bảo quản chế phẩm trong thời gian dài Kết quả thí nghiệm cũng cho thấy khi nông độ chat mang tăng độ âm và mật độ sinh khôi có xu hướng giảm.
Bảng 3.12 Mật độ sinh khối và độ âm chế phẩm say phun với nồng độ SPI khác nhau
Mật độ sinh khối Độ am (%)
Nong độ SPI (log CFU/g)
Trên cở sở chọn nghiệm thức có mật độ sinh khối cao và độ âm phù hợp để tạo sản phẩm có thời gian bảo quan dài, nghiệm thức chất mang SPI nông độ 6% với mật độ sinh khối 7,17 log CFU/g, độ âm 6,11% được chọn để thực hiện nghiên cứu tiếp theo khảo sát sự kết hợp với prebiotic là inulin tạo chế phẩm hoàn chỉnh.
3.3.3 Anh hưởng của nông độ inulin đến mật độ sinh khối chế phẩm sấy phun
Inulin là prebiotic đã được kết hợp với S.boulardii dé điều trị bệnh tiêu chảy với hiệu qua đã được xác nhận (Hurduc, 2009; Gotteland, 2005) Với mục tiêu tao chế phẩm synbiotic, prebiotic inulin được sử dụng để thực hiện quá trình sây phun Nong độ chat mang SPI 6% va nhiệt độ đầu vào say phun là 100°C được sử dung dé thực hiện quá trình say phun Nham tao ra số lượng chế phẩm đủ nhiều để phục vụ quá trình đóng nang và theo dõi thời gian bảo quản quá trình sây phun được thực hiện trên hệ thống
54 sây phun công nghiệp Chỉ tiêu đánh giá bao gồm mật độ sinh khối và độ âm chế phẩm được trình bày trong bang 3.13.
Bang 3.13 Mật độ sinh khối và độ 4m chế phẩm sấy phun với nông độ inulin khác nhau
Mật độ sinh khối | Độ ẩm (%)
Nông độ Inulin (log CFU/g)
Từ kết quả thu nhận được như trên bang 3.13 cho thay chế phẩm synbiotic thu được ở cả ba nghiệm thức đều có mật độ sinh khối cao và độ am phù hợp Số liệu thống kê cho thay không có sự khác biệt giữa ba nghiệm thức vì vậy trong trường hop này hướng đến hiệu quả kinh tế, nghiệm thức inulin 1% được sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo.
Như vậy từ các nghiên cứu khảo sát nhiệt độ đâu vào, nông độ SPI, nông do inulin, có thé thấy với nhiệt độ đầu vào 100°C, nông độ SPI 6% và nông độ inulin 1% tạo ra chế phẩm synbiotic có mật độ sinh khối 8,12 (log CFU/g) va độ ẩm 6,12% phù hợp dé tạo chế phẩm viên nang synbiotic có thé bảo quan trong thời gian dai.
3.3.4 Tái kiếm tra họat tính của chế phẩm say sấy phun
Chế phẩm sấy phun có mật độ sinh khối cao và độ 4m phù hợp được sau khi thu nhận từ kết quả thí nghiệm 3.3.3 được đánh giá lại hoạt tính probiotic trước khi đóng viên nang và khảo sát điều kiện bảo quản viên nang.
KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊTu những nghiên cứu trên chúng tôi rút ra được những kết luận sau:
Nam men Saccharomyces boulardii có những đặc tinh probiotic tốt như khả năng kháng môi trường muối mật dạ dày, kháng các chủng vi khuẩn gây bệnh và giảm cholesterol.
Phương pháp quy hoạch thực nghiệm Plackett-Burman và RSM-CCD sử dụng để tối ưu hóa môi trường lên men YPD cho kết quả tốt với mật độ sinh khối thu được tôi ưu 7,68x10? CFU/ml sau thời gian lên men 39 giờ, ở nhiệt độ 37°C, với nồng độ glucose 29,24 g/l, pepton 6,75 g/l và cao nam men 3 g/l.
Chế phẩm say phun với nồng độ chất mang SPI 6%, prebiotic inulin 1%, được thực hiện say phun ở nhiệt độ đầu vào 100°C Kết quả thu nhận được chế phẩm synbiotic có mật độ sinh khối 1,32 x 10° CFU/g, độ âm 6,12%, bảo toàn được các hoạt tính probiotic của S.boulardii đồng thời tăng cường khả năng chống chịu môi trường da day nhân tạo.
Từ chế phẩm synbiotic bước dau thử nghiệm tạo viên nang synbiotic có khả năng bảo quan trong điều kiện bảo quản thông thường, sau 8 tuân thử nghiệm 85,54% sinh khối được bảo toàn.
Mặt dù đề tài đã thu nhận được một số kết quả khả quan ban đầu tuy nhiên dé có thé có được những kết quả tốt hơn để tạo ra sản phẩm viên nang synbiotic có tiềm năng thương mại chúng tôi có một số kiến nghị như sau:
- Mở rộng thêm các nghiên cứu tôi ưu hóa sinh khối thực nghiệm trên môi trường thí nghiệm và trên môi trường nuôi cay công nghiệp với các yếu tô như nhiệt độ, chế độ lac, ty lệ cay giống, các nguôn chất dinh dưỡng dé định hướng quy trình nhân giống và sản xuât quy mô lớn.
- Các thí nghiệm với chat mang SPI, các loại prebiotic với các nồng độ khác nhau cùng với các điều kiện say phun như nhiệt độ, áp suất, tốc độ nhập liệu là những yếu tố cần được nghiên cứu sau thêm dé có thé thu được chế phẩm synbiotic có mật độ sinh khối và hoạt tính tốt nhất Cơ cau và kích thướt hạt chế phẩm sấy phun cũng là một yếu tố cần được mở rộng nghiên cứu.
- Thời gian bảo quan chế phẩm có thé cần được theo dõi dai hơn dé có thé xác định được hạn sử dụng của chê phâm viên nang.
