ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
- Vỏ cây hoa sữa, đƣợc lựa chọn một cách ngẫu nhiên trên đại bàn thành phố Đà Nẵng
- Nghiên cứu trên nguồn nguyên liệu tại thành phố Đà Nẵng
- Phân lập, tinh chế một số hợp chất hóa học có trong mẫu cao chiết từ vỏ cây hoa sữa
- Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập đƣợc
- Thăm dò hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập đƣợc.
MỤC TIÊU VÀ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU
- Xây dựng qui trình chiết tách các hợp chất từ vỏ cây hoa sữa
- Phân lập một số hợp chất hóa học trong một số dịch chiết của vỏ cây hoa sữa
- Xác định cấu trúc các hợp chất đã phân lập đƣợc
- Nghiên cứu, xác định cấu trúc của một số hợp chất hóa học của vỏ cây hoa sữa.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Để thực hiện đề tài này, tôi sử dụng các phương pháp nghiên cứu sau:
- Thu thập, tổng hợp các tài liệu, tư liệu, sách báo trong và ngoài nước có liên quan đến đề tài
- Hội thảo, trao đổi kinh nghiệm với các chuyên gia, thầy cô giáo và cộng sự
- Phương pháp chọn, thu hái và xử lí mẫu
- Phương pháp xác định các chỉ số hóa lý
- Phương pháp chiết, phân lập chất
Các phương pháp xác định cấu trúc bao gồm việc kết hợp đo phổ hồng ngoại (FT–IR), phổ khối (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D NMR) Những kỹ thuật này giúp cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc phân tử, từ đó hỗ trợ trong việc phân tích và nhận diện các hợp chất hóa học Sự kết hợp này không chỉ nâng cao độ chính xác mà còn tiết kiệm thời gian trong quá trình nghiên cứu.
Phương pháp phổ hạt nhân từ (NMR) như 1H–NMR, 13C–NMR, DEPT, cùng với các kỹ thuật hai chiều (2D NMR) như COSY, NOESY, HSQC, và HMBC, đóng vai trò quan trọng trong việc xác định cấu trúc của các chất phân lập Những phương pháp này cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc phân tử, giúp các nhà nghiên cứu hiểu rõ hơn về tính chất và ứng dụng của các hợp chất.
- Các phương pháp thử hoạt tính sinh học: thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxi hoá, gây độc tế bào ung thƣ.
BỐ CỤC LUẬN VĂN
Luận văn bao gồm 76 trang, 18 bảng, 31 hình, ảnh, 32 tài liệu tham khảo Với: Phần mở đầu (3 trang)
Chương 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU (23 Trang) Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN (33 Trang)
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ (2 Trang)
TÀI LIỆU THAM KHẢO (4 Trang)
TỔNG QUAN
GIỚI THIỆU VỀ HỌ APOCYNACEAE VÀ CÂY HOA SỮA
Họ La bố ma (Apocynaceae), còn gọi là họ Dừa cạn, họ Trúc đào và họ Thiên lý, bao gồm nhiều loài cây thân gỗ cao trong rừng mưa nhiệt đới, chủ yếu sinh trưởng ở các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới ẩm ướt Một số loài có thể phát triển trong môi trường khô hạn, trong khi cũng tồn tại các cây lâu năm thân thảo ở khu vực ôn đới Hiện tại, họ La bố ma được công nhận có khoảng 4.555 loài, được chia thành 415-424 chi khác nhau.
Chi Hoa sữa (Alstonia) là một chi cây gỗ và cây bụi thường xanh phổ biến, được Robert Brown đặt tên vào năm 1811 Tên gọi này được lấy từ Charles Alston, một giáo sư thực vật học tại Edinburgh từ năm 1716 đến 1760 Chi Alstonia hiện có khoảng 40 loài khác nhau.
Có khoảng 60 loài Alstonia, chủ yếu phân bố ở khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Phi, Trung Mỹ, Đông Nam Á, Polynesia, New South Wales, Queensland và miền bắc Úc, với phần lớn các loài thuộc khu vực Malesia Loài điển hình của chi này là Alstonia scholaris (L.) R.Br., ban đầu được Linnaeus đặt tên là Echites scholaris vào năm 1767.
1.1.2 Cây hoa sữa a Đặc điểm sinh thái
Tên thường gọi - cây mò cua, mù cua, tinpet, popeal-khê…
Tên khoa học - Alstonia scholaris L R Br ( hay còn gọi - Echites scholaris L Mant., Pala scholaris L Roberty)
Họ : Apocynaceae ( La bố ma)
Cây hoa sữa, mọc hoang và được trồng ven đường phố, không chỉ mang lại bóng mát mà còn có hoa nở vào mùa thu với mùi thơm đặc trưng Vỏ cây có thể thu hái quanh năm, nhưng thời điểm tốt nhất là vào mùa xuân và mùa hè Cây hoa sữa có nguồn gốc từ nhiều khu vực khác nhau.
Trung Quốc: Quảng Tây (tây nam), Vân Nam (nam)
Tiểu lục địa Ấn Độ: Ấn Độ; Nepal; Sri Lanka
Đông Nam Á: Campuchia; Myanma; Thái Lan; Việt Nam, Indonesia;
Malaysia; Papua New Guinea; Philippines
Cây hoa sữa cũng đƣợc trồng tại một số khu vực có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới b Đặc tính thực vật
Cây hoa sữa là loại cây gỗ lớn, cao trên 40 m, có vỏ dày và nứt nẻ Lá cây thường mọc vòng, từ 5 đến 7 lá (đôi khi 4-10 lá) xếp quanh nhánh, dài từ 9 đến 20 cm và rộng từ 2 đến 5 cm, với mặt trên bóng và mặt dưới xám Hoa lƣỡng tính nhỏ, có 5 lá đài dài 2 mm và 5 cánh hoa màu vàng chanh, không có đế hoa hình đĩa, nở chủ yếu từ tháng 6 đến tháng 11 Quả đại mọc theo cặp, dài từ 30 đến 60 cm, chứa nhiều hạt hình chữ nhật có lông ngắn, chín từ tháng 12 đến tháng 5 Phiến lá dày, hình thuôn dài với nhiều gân phụ, sắp xếp đối nhau hoặc vòng quanh, và có gân lá hình lông chim.
Hình 1.1 Cây hoa sữa c Công dụng của cây hoa sữa
Hoa sữa, một biểu tượng đặc trưng của Hà Nội, không chỉ thu hút bởi vẻ đẹp lãng mạn và hương thơm quyến rũ mà còn được biết đến như một loại thảo dược quý giá giúp con người vượt qua nhiều bệnh tật.
Một số công dụng sức khỏe từ cây hoa sữa :
Vỏ cây hoa sữa chứa các alkaloid tự nhiên như ditamine, echitenine và echitamine, được sử dụng như thuốc kháng khuẩn và điều trị sốt rét thay thế cho Quinine Dịch cồn chiết xuất từ vỏ cây này cho thấy hoạt tính kháng khuẩn mạnh đối với Salmonella paratyphi-B và Aspergillus niger.
Nước sắc vỏ cây có tác dụng hiệu quả trong việc điều trị tiêu chảy, rối loạn tiêu hóa, hạ sốt và điều hòa kinh nguyệt Ngoài ra, nước sắc lá cây còn được sử dụng để chữa bệnh beriberi, một loại bệnh viêm đa dây thần kinh do thiếu Vitamin B1.
Cây hoa sữa không chỉ có tác dụng ngừa ung thư và điều trị viêm phế quản mà còn bảo vệ tế bào gan, chống lại sự phát triển của tế bào ung thư Ngoài ra, cây còn giúp giảm đau, chống loét đường tiêu hóa, và cung cấp tác dụng chống oxy hóa Với khả năng điều hòa miễn dịch, cây hoa sữa có tác dụng giãn phế quản, chống dị ứng, làm dịu tổn thương trên da và giảm triệu chứng dị ứng hiệu quả.
Kích thích ăn uống: Hoa sữa còn có tác dụng kích thích ăn uống và làm tăng tiết sữa ở phụ nữ cho con bú
Nhuộm vải: Vỏ cây cũng đƣợc sử dụng để nhuộm quần áo từ len, sợi bông ra các gam màu vàng khác nhau
Một số Bài thuốc dân gian
Thường vỏ cây hoa sữa được dùng làm thuốc bổ, chữa sốt, điều kinh, chữa lỵ với các cách sau:
1 Bột vỏ cây sữa phơi khô hoặc sấy khô rồi tán nhỏ, ngày uống 0.2-0.3 g
2 Rƣợu vỏ cây hoa sữa: Vỏ cây sữa tán nhỏ 75 g, rƣợu uống (35-400) 500 ml, đậy kĩ, ngâm trong 7 ngày, thỉnh thoảng lắc đều Sau đó lọc và thêm rƣợu vào cho đủ 500 ml Ngày uống 4-8 g rượu này Uống 15 phút trước 2 bữa ăn chính
3 Cao lỏng vỏ cây sữa: Chế bằng cồn 60 0 theo phương pháp chế cao lỏng hoặc có thể ngâm bột vỏ sữa với cồn 60 0 trong 7 ngày Thỉnh thoảng lắc, lọc và thêm cồn 60 0 cho bằng trọng lƣợng của vỏ Ví dụ ngâm 1 kg vỏ thì sẽ đƣợc 1 lít cao lỏng Cao lỏng này dùng với liều 0.5-1.5 g mỗi ngày Nhiều nhất chỉ uống 2 g/lần và 6 g trong 1 ngày.
TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI VỀ CÂY
Research indicates that various parts of the plant contain numerous bioactive compounds, including echitamidine, loganin, lupeol, boonein, ursolic acid, Nα-formylechitamidine, and β-amyrin, with alkaloids and triterpenoids being significant components The bark of the flower tree is particularly rich in alkaloids, with concentrations ranging from 0.16% to 0.27% Key alkaloids identified include echitenine, ditamine, echitamine, echitamidine, and ellipatamine, along with lesser-known alkaloids such as alstonidine, alstonine, and others Additionally, the plant contains various other compounds, including steroids, triterpenoids like lupeol linoleate and beta-amyrin, as well as flavonoids, phenolic acids, and fatty acids.
1.2.1 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Theo tài liệu công bố, nhóm nghiên cứu của Trần Văn Sung, Nguyễn Hồng Vân và Phạm Thúy Hà tại Việt Nam đã tiến hành nghiên cứu về lá và vỏ cành cây hoa sữa, trong đó xác định cấu trúc của ba loại alkaloid, bao gồm picrinin.
(1), vallesamin (2) và scholaricin (3) có cấu tạo nhƣ sau [3]:
Nguyễn Thị Thanh Huyền và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học của vỏ cây hoa sữa tại Đà Nẵng Kết quả nghiên cứu cho thấy, thông qua phân tích bằng phổ GC-MS, vỏ cây hoa sữa chứa ba loại alkaloid: cetylpyridinium, ellipatamine và ditamine, với hoạt tính kháng sinh đáng kể.
4 Cetylpyridinium 5 Ellipatamine 6 Ditamine 1.2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
In 2004, a study conducted by Angela A Salim, Mary J Garson, and David J Craik from The University of Queensland, Brisbane, Australia, reported the isolation of a new indole alkaloid named akuammiginone from the bark extract of the Alstonia scholaris tree.
The study identifies a new indole glycosidic alkaloid, echitamidine-N-oxide 19-O-β-D-glucopyranoside, alongside five known alkaloids: echitaminic acid, echitamidine N-oxide, Nb-demethylalstogustin N-oxide, akuammicine N-oxide, and Nb-demethylalstogustin These compounds exhibit significant antibiotic activity.
Năm 2006, nghiên cứu của Nilubon Jong-Anurakkun, Megh Raj Bhandari và Jun Kawabata tại Nhật Bản đã phát hiện từ lá cây hoa sữa (Alstonia scholaris) thu hái ở Thái Lan ba hợp chất ức chế enzyme a-Glucosidase Các hợp chất này bao gồm một glycoside flavonoid là quercetin 3-O-β-D-xylopyranosyl (1’’’→2’’)-β-D-galactopyranoside và hai glucoside linan là (-)-lyoniresinol 3a-O-β-D-glucopyranoside cùng (+)-lyoniresinol 3a-O-β-D-glucopyranoside Những hợp chất này cho thấy khả năng ức chế tăng đường huyết, đặc biệt hữu ích trong điều trị bệnh tiểu đường loại 2.
In 2008, researchers P Steve Thomas, Anil Kanaujia, Dipankar Ghosh, Rajeev Duggar, and Chandra Kant Katiya from India discovered a new secoiridoid glucoside named alstonoside (17) from the bark of the Alstonia scholaris tree They also identified two isoflavone apioglucosides: formononetin 7-O-β-D-apiofuranosyl-(1 → 6)-β-D-glucopyranoside (18) and biochanin A 7-O-β-D-apiofuranosyl-(1 → 6)-β-D-glucopyranoside (19).
Vào năm 2008, nghiên cứu của Tao Feng, Xiang-Hai Cai, Zhi-Zhi Dua và Xiao-Dong Luo tại Trung Quốc đã phân lập được bốn hợp chất iridoid mới, được gọi là scholareins (A-D1), cùng với ba chất tương tự đã được biết đến, bao gồm isoboonein, alyxialactone và loganin.
Năm 2009, nhóm nghiên cứu Tao Feng, Xiang-Hai Cai, Pei-Ji Zhao, Zhi-Zhi
Du, Wei-Qi Li và Xiao-Dong Luo đã nghiên cứu từ thân cây hoa sữa (Alstonia scholaris) và phân lập được 21 alkaloid indo monoterpenoid Trong số đó, có 6 hợp chất mới được phát hiện, bao gồm picrinine (1), leuconoxine (33), 5-methoxylstrictamine (34), (Z)-16-formyl-5α-methoxystrictamine (35), 19-epi-ajmalicine (36) và akuammidine (37) Các hợp chất còn lại đã được biết đến trước đây như picralinal (38), 19(E)-vallesamine (2), 20-epi-19-oxodihydroakuammicine (39), echitamidine (40), 19-epi-scholaricine (41), nareline (42), N(4)-demethylechitamine (43), 3-epi-dihydrocorymine và 17-acetate.
In 2013, a research team led by Ashutosh Sharma and colleagues in Jaipur isolated a new steroid, 3-hydroxy adiantulanosterol, from the chloroform extract of the bark of the Alstonia scholaris tree Alongside this discovery, they also identified four known compounds: lupeol acetate, lupeol, α-amyrin acetate, and β-amyrin acetate.
49 α-amyrin acetate 48 Lupeol 50 β-amyrin acetate
In 2017, a research team from Taiwan, including Chao-Min Wang, Kuei-Lin Yeh, Shang-Jie Tsai, Yun-Lian Jhan, and Chang-Hung Chou, isolated eight triterpenoids and five sterols from n-hexane extracts of Alstonia scholaris leaves The identified compounds included ursolic acid, oleanolic acid, betulinic acid, betulin, 2β, 3β, 28-lup-20 (29)-ene-triol, lupeol, β-amyrin, α-amyrin, poriferasterol, epicampesterol, β-sitosterol, 6-β-hydroxy-4-stigmasten-3-one, and ergosta-7,22-diene-3β, 5α, 6β-triol.
Axit ursolic, axit betulinic, betulin, và 2β, 3β, 28-lup-20 (29)-ene-triol có tiềm năng ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư phổi NSCLC, tạo thành nhóm tác nhân trị liệu giá trị cho tương lai Đặc biệt, axit ursolic thể hiện hoạt tính chống ung thư mạnh mẽ đối với ung thư tuyến tiền liệt, vú, tuyến tụy và bàng quang Ngoài ra, một số hợp chất sterol có khả năng giảm hấp thụ cholesterol ở người, trong khi hợp chất (60) cho thấy khả năng ức chế tế bào NSCLC, làm giảm 20% khả năng sống sót của tế bào.
Cây hoa sữa (Alstonia scholaris) đã được nghiên cứu rộng rãi trên thế giới, chứng tỏ tầm quan trọng của nó trong ngành thảo dược Mặc dù các quốc gia có nền y học cổ truyền lâu đời như Trung Quốc và Ấn Độ đã sử dụng cây này phổ biến, nhưng Việt Nam vẫn còn hạn chế trong việc khai thác tiềm năng của nó Với nền y học cổ truyền phát triển và khí hậu thuận lợi, nếu cây hoa sữa được nghiên cứu và ứng dụng hiệu quả, nó có thể trở thành nguồn thảo dược quý giá cho y học cổ truyền và trong việc chế tạo dược phẩm điều trị bệnh ung thư, HIV.
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM
Vỏ cây hoa sữa (cây mù cua, mò cua) được thu hái vào tháng 11 năm 2017 tại Đà Nẵng (Trường Đại học Sư phạm) Sau khi rửa sạch, vỏ cây được phơi khô và sấy ở nhiệt độ từ 50-60 độ C, sau đó xay thành bột mịn Vỏ cây này được chiết xuất lần lượt bằng các dung môi n-hexane, chloroform, ethyl acetate và methanol.
Hình 2.1 Vỏ cây khô xay thành bột
2.1.2 Hoá chất và thiết bị nghiên cứu Để thực hiện đề tài này, chúng tôi sử dụng một số hoá chất chính nhƣ :
Dung môi dùng để chạy cột chính ( n-hexane ) đƣợc cất lại qua cột Vigereux trước khi sử dụng để loại bỏ tạp chất, chất làm mềm
Ngoài ra còn có các hóa chất khác dùng để làm khan, pha chế thuốc thử trong định tính các lớp chất và hiện màu bản mỏng
Sắc kí lớp mỏng (TLC): sử dụng bản mỏng tráng sẵn silicagel Merck 60F 254 , có độ dày 0.2 mm Sắc kí cột thường: silicagel cỡ hạt 197-400 mesh ( 0.040 – 0.063 mm)
Bộ chiết soxhlet, thiết bị cô quay chân không, tủ sấy, lò nung và cân phân tích là những thiết bị quan trọng tại phòng thí nghiệm khoa Hóa, trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng Trung tâm khí tượng thủy văn quốc gia sử dụng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS100 Perkin Elmer, trong khi Trung tâm kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, dược phẩm thành phố Huế áp dụng máy đo sắc kí khí kết hợp khối phổ GC-MS Cột sắc kí thủy tinh cao khoảng 45 cm với đường kính trong 3 cm và 4 cm cùng với đèn tử ngoại bước sóng λ= 254 nm và 365 nm được sử dụng để soi bản mỏng Ngoài ra, máy đo điểm nóng chảy Buchi melting Point B-545 cũng được trang bị tại khoa Hóa của trường.
Các thiết bị xác định cấu trúc chất:
+ Phổ khối ESI-MS đƣợc đo trên máy Agilent LC-MSD-Trap SL tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhânNMR được ghi bằng máy Bruker Avance 500 MHz tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
+ Phổ hồng ngoại FT – IR được đo dưới dạng viên nén KBr bằng máy Shimadzu tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Các phương pháp xác định chỉ tiêu hóa lí a Xác định độ ẩm Để xác định độ ẩm tiến hành sấy mẫu trong tủ sấy ở nhiệt độ trong khoảng
Tiến hành thí nghiệm ở nhiệt độ 95-110 độ C với ba mẫu bột vỏ cây khô, sau đó lấy kết quả trung bình Chuẩn bị các chén sứ đã được rửa sạch, sấy khô trong tủ sấy và làm nguội đến nhiệt độ phòng, rồi cân lại cho đến khi đạt khối lượng không đổi.
Mẫu bột vỏ cây để xác định độ ẩm là mẫu đã qua xử lý, được lấy khoảng 3 g bột nguyên liệu vào mỗi chén sứ theo ký hiệu đã ghi Sau khi sấy ở nhiệt độ quy định, mẫu được để trong bình hút ẩm để nguội đến nhiệt độ phòng và cân, cho đến khi khối lượng mẫu và cốc không thay đổi Khối lượng ẩm của mỗi mẫu được tính bằng hiệu số giữa khối lượng trước và sau khi sấy Độ ẩm trung bình của các mẫu được tính theo tỷ lệ phần trăm dựa trên khối lượng bột khô vỏ cây ban đầu.
* Độ ẩm của mỗi mẫu
Trong đó: m 1 : Khối lƣợng chén sứ (g) m 2 : Khối lƣợng mẫu bột khô vỏ cây hoa sữa (g) m 3 : Khối lƣợng chén sứ và mẫu sau khi sấy (g)
W (%): Độ ẩm của mỗi mẫu
Để xác định hàm lượng tro và các nguyên tố vô cơ trong cơ thể động vật và thực vật, người ta sử dụng phương pháp tro hóa mẫu Phương pháp này giúp xác định độ ẩm trung bình W tb (%) và hàm lượng tro một cách chính xác.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi áp dụng phương pháp tro hóa mẫu bằng kỹ thuật khô - ướt kết hợp Các mẫu đã được xác định độ ẩm sẽ tiếp tục được tro hóa trong chén sứ Quá trình này bao gồm việc đun nóng trên bếp điện, thực hiện than hóa sơ bộ, sau đó nung trong lò ở nhiệt độ từ 500-550°C trong khoảng thời gian 4-6 giờ cho đến khi thu được tro trắng Qua quá trình này, các chất hữu cơ sẽ bị đốt cháy, trong khi các chất vô cơ khó bay hơi sẽ còn lại trong tro Khối lượng tro thu được chính là phần chất còn lại sau khi nung.
Lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm, cân lại mẫu đến khối lƣợng không đổi, có khối lƣợng m 4
Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định khối lượng chén sứ và mẫu sau khi tro hóa (g) để phân tích Đồng thời, chúng tôi cũng áp dụng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử để xác định hàm lượng một số kim loại trong vỏ cây hoa sữa.
Sau khi nung tro thu được, hòa tan trong dung dịch HNO3 loãng và định mức bằng nước cất, hàm lượng kim loại được xác định bằng phương pháp đo phổ hấp thụ nguyên tử AAS.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thực hiện các thí nghiệm trong điều kiện mẫu tro hoá được hòa tan bằng dung dịch HNO3 loãng và định mức đến 200 mL Sau đó, dung dịch đã định mức được sử dụng để xác định hàm lượng một số kim loại tại Trung tâm khí tượng thủy văn Quốc gia, Đài khí tượng thủy văn khu vực Trung Trung Bộ.
660 Trưng Nữ Vương, Đà Nẵng
2.2.2 Phương pháp chiết mẫu thực vật
Có nhiều phương pháp để chiết tách hợp chất hữu cơ từ cây cỏ, chủ yếu tập trung vào hai kỹ thuật chính: chiết lỏng-lỏng và chiết rắn-lỏng.
Trong đề tài này chúng tôi sử dụng phương pháp chiết rắn – lỏng với các kĩ thuật chiết soxhlet và ngâm dầm
Kĩ thuật chiết soxhlet [7, tr.37-40]:
Cân khoảng 5 g bột vỏ cây hoa sữa cho vào bình cầu, sau đó thêm 200 mL các dung môi n-hexane, chloroform, ethyl acetate, methanol và tiến hành chiết soxhlet ở nhiệt độ sôi của dung môi trong các khoảng thời gian khác nhau: 4h, 6h, 8h, 10h, 12h, thu được các dịch chiết L H x 5, L C x 5, L E x 5, L M x 5 Tiếp theo, rót 20 mẫu dịch chiết vào các cốc đã được cân khối lượng (m c, gam), để bay hơi tự nhiên đến thể tích 40 mL và cân các cốc chứa dịch chiết (m 5, gam) Tính khối lượng dịch chiết bằng công thức m 6 = m 5 - m c, với m 6 (gam) là khối lượng của dịch chiết.
Sử dụng phương pháp trọng lượng để khảo sát sự tăng khối lượng (∆m) của các dịch chiết sau mỗi 2 giờ chiết, nhằm xác định thời gian tối ưu cho việc chiết xuất tối đa các chất với từng loại dung môi.
Kĩ thuật chiết ngâm dầm [7,tr 35-36]:
Ngâm bột cây trong bình thủy tinh hoặc thép không gỉ có nắp, sau đó rót dung môi vào cho đến khi xấp xấp bề mặt bột Để yên ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ để dung môi thấm vào và hòa tan các hợp chất tự nhiên Sau đó, lọc dung dịch qua giấy lọc để thu hồi cao chiết Tiếp tục rót dung môi vào bột cây và lặp lại quá trình chiết cho đến khi mẫu cây kiệt Tăng hiệu quả chiết bằng cách đảo trộn bột cây thường xuyên, mỗi lần ngâm chỉ cần 24 giờ do dung môi đạt đến mức bão hòa.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành chiết xuất bột cây khô bằng nhiều loại dung môi khác nhau Đầu tiên, bột cây được chiết với n-hexane, thu hồi dung môi để thu được cao n-hexane chứa các hợp chất không phân cực hoặc rất ít phân cực Tiếp theo, bột cây được chiết với chloroform, tạo ra cao chloroform với các hợp chất có tính phân cực trung bình Sau đó, bột cây tiếp tục được chiết với ethyl acetate, cho ra cao ethyl acetate chứa các hợp chất có tính khá phân cực Cuối cùng, bột cây được chiết với methanol, thu được cao methanol chứa các hợp chất có tính phân cực mạnh Mỗi loại dung môi được sử dụng để chiết xuất nhiều lần.
2.2.3 Phương pháp định tính một số lớp chất trong vỏ cây hoa sữa a Alkaloid Để phát hiện sự hiện diện của alkaloid trong vỏ cây hoa sữa, chúng tôi đã áp dụng nguyên tắc thử của Webb, cách thử gồm hai phần nhƣ sau:
Bột vỏ cây xay nhuyễn (5 g) được ngâm trong dung dịch Prollius, bao gồm chloroform, ethanol 95° và NH4OH đậm đặc theo tỷ lệ 8:8:1 trong môi trường kiềm Quá trình ngâm diễn ra trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lắc trộn Sau khi lọc và loại bỏ dung môi, thu được cặn, sau đó hòa tan cặn trong dung dịch HCl 1% và đun ấm để dễ tan Cuối cùng, lọc dịch và sử dụng để thử nghiệm với thuốc thử Mayer và Wagner.
Phần 2: Cho 5 g bột vỏ cây xay nhuyễn vào bình tam giác cùng với dung dịch H2SO4 1% và đun nhẹ trong 1 giờ Sau đó, tiến hành lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm với hai loại thuốc thử Mayer và Wagner.
- Pha thuốc thử và hiện tƣợng:
CÁC SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM
2.3.1 Sơ đồ khảo sát sơ bộ một số yếu tố
Các quá trình khảo sát đƣợc mô tả theo Hình 2.2
Hình 2.2 Sơ đồ khảo sát sơ bộ một số yếu tố
Thử hoạt tính sinh học
Bột nguyên liệu Độ ẩm
Xác định các chỉ tiêu hóa lí
Kim loại nặng Định tính các lớp chất
Chiết soxhlet ( Khảo sát thời gian )
2.3.2 Sơ đồ điều chế các cao chiết
Các quá trình thực nghiệm đƣợc mô tả theo Hình 2.3
Hình 2.3 Sơ đồ điều chế các cao chiết
Xử lí Bột nguyên liệu (3kg )
Phân lập chất Đo phổ ( IR, MS, 1 H-NMR,
HSQC để xác định cấu trúc
Ngâm chiết với etyl acetate
Cất loại dung môi Cao ( M ) methanol
Từ 3 kg bột vỏ cây hoa sữa sau khi đƣợc ngâm chiết lần lƣợt với các dung môi n–hexane, chloroform, ethyl acetate và methanol ( rắn : lỏng = 1:2) thu đƣợc dịch chiết, rồi đuổi dung môi bằng cất quay chân không thu được các cao chiết tương ứng
2.3.3 Sơ đồ phân lập cao chiết n –hexane
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chọn chiết xuất n-hexane từ vỏ cây hoa sữa để phân lập và tinh chế chất, dựa trên tỷ lệ chiết xuất cao so với mẫu bột nguyên liệu ban đầu, thành phần định danh và hoạt tính sinh học, cùng với việc tham khảo tài liệu.
Quá trình phân lập chất từ cao n-hexane đƣợc thể hiện ở Hình 2.4
Hình 2.4 Sơ đồ phân lập chất từ cao n-hexane
VH1 VH2 VH3 VH4 VH5 VH6 VH7 VH8
SKC, silicagel, gradient HA 100:00:100, 120 lọ: 12 phân đoạn
Để chọn dung môi hoặc hệ dung môi phù hợp cho quá trình sắc ký cột, chúng tôi áp dụng phương pháp sắc ký bản mỏng với các bước cụ thể.
+ Hoà tan một lƣợng rất nhỏ cao chiết (H) trong dung môi n-hexane
+ Dùng ống mao quản chấm dung dịch mẫu trên lên mỗi bản mỏng với lƣợng tương đương nhau
Các bản mỏng được thực hiện với nhiều loại dung môi có độ phân cực khác nhau, bao gồm n-hexane, n-hexane/ethyl acetate với các tỉ lệ 10/1, 15/1, 20/1, 25/1, 30/1, n-hexane/acetone với các tỉ lệ 5/1, 10/1, 15/1, 20/1, 50/1, và n-hexane/dichloromethane với các tỉ lệ 10/1, 20/1.
+ Tiếp theo hiện hình các vết trên bản mỏng bằng đèn UV và thuốc hiện màu với H 2 SO 4 10%
Sau khi tiến hành thử nghiệm với các hệ dung môi khác nhau, chúng tôi đã lựa chọn dung môi n-hexane và acetone (tỉ lệ 100:0 đến 0:100) cho cột đầu tiên (phá mẫu) Đối với cột thứ hai, dung môi n-hexane và acetone với tỉ lệ 20/1 đã được chọn làm hệ dung môi phù hợp.
Trong quá trình chuẩn bị mẫu, 7 g n-hexane được hòa tan hoàn toàn trong dung môi n-hexane trong bình cầu cổ 29 Tiếp theo, 10.5 g silicagel Merck cỡ hạt 0.04 - 0.06 mm được thêm dần vào bình cầu và lắc đều để tạo thành hỗn hợp đồng nhất Sau đó, hỗn hợp này được cất quay dưới áp suất thấp cho đến khi khô hoàn toàn, đảm bảo chất được gắn đều lên silicagel Cuối cùng, phần silicagel đã gắn mẫu được cạo ra và làm tơi mịn bằng đũa thủy tinh trước khi đưa vào cột sắc ký.
Nạp chất hấp thu vào cột
Cột được rửa thật sạch, tráng với nước cất và sấy khô, tráng lại bằng acetone, kẹp cột thẳng đứng lên giá và đóng van ở phía dưới cột lại
Silicagel đƣợc nhồi ở dạng sệt ( huyền phù) nhƣ sau:
+ Silicagel sau khi đƣợc sấy ở 110 o C trong khoảng 4 giờ, đƣợc bảo quản trong bình hút ẩm
Để chuẩn bị cột sắc ký, hãy đổ silicagel vào cột cho đến khi đạt khoảng 2/3 chiều cao của cột Cột đầu tiên sẽ chứa khoảng 140 gam silicagel với kích thước 45 cm x 4 cm, trong khi cột thứ hai sẽ chứa khoảng 70 gam silicagel với kích thước 45 cm x 3 cm.
+ Dùng cốc có mỏ 250 mL, đong một lƣợng dung môi chạy cột ban đầu ( cột
1: n-hexane, cột 2: n-hexane/acetone = 20/1) gấp khoảng 1.5 lần lƣợng silicagel, sau đó rót từ từ silicagel vào cốc, từng ít một, vừa thêm vừa lắc nhẹ, sử dụng đũa thủy tinh để khuấy lên mà không làm ngƣợc lại, để yên cốc trong vòng một đêm + Rót dung môi vào khoảng 1/3 dung tích cột
Rót hỗn hợp sệt vào cột qua phễu lọc dài, mở nhẹ khóa dưới cột để dung môi chảy ra và hứng vào cốc trống dưới đáy, sau đó rót lại lên đầu cột Trong quá trình rót, dùng thanh cao su gõ nhẹ vào cột để bột khí thoát ra và silicagel lắng xuống Tiếp tục đổ hết hỗn hợp sệt vào cột, sau đó cho dung môi chảy ra và rót trở lại đầu cột khoảng 3 lần để đảm bảo cột được nạp chặt chẽ và đồng nhất Cuối cùng, đóng van khóa dưới cột để giữ cho cột ổn định.
+ Không đƣợc để đầu cột bị khô, tức là trên đầu cột luôn có dung môi
Mặt thoáng silicagel ở đầu cột cần được giữ nằm ngang; nếu không, hãy thêm dung môi và sử dụng đũa thủy tinh để khuấy nhẹ gần mặt thoáng, giúp xáo trộn silicagel và tạo mặt thoáng phẳng khi silicagel lắng xuống Trong trường hợp cột xuất hiện bột khí, hãy quấn bông tẩm methanol quanh thành cột tại vị trí có bột khí.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện nạp mẫu ở dạng bột khô Để đảm bảo hiệu quả, lượng dung môi trong cột cần cao hơn mặt thoáng silicagel khoảng 2-3 cm Sau đó, đổ từ từ silicagel khô đã bão hòa mẫu vào cột và để cho nó lắng xuống Cần chú ý giữ mức dung môi luôn ở phía trên silicagel và xử lý bột khí nếu có.
+ Sau khi cho xong mẫu lên đầu cột, nhẹ nhàng cho một lớp cát vào khoảng 3-
6 mm để tránh cho bề mặt của lớp silicagel bị ảnh hưởng khi thêm dung môi
Sử dụng pipet, từ từ thêm dung môi vào cột cho đến khi mức dung môi đạt khoảng 10 mm phía trên lớp cát Để dung môi chảy xuống cho đến khi còn lại khoảng 1-2 mm trên lớp cát, lặp lại quá trình này khoảng 2 lần để đảm bảo toàn bộ mẫu đã được hấp thụ vào silicagel Cuối cùng, thêm dung môi vào đầu cột và bắt đầu chạy cột (Hình 2.6).
Hình 2.6 Cột sắc ký sau khi nạp mẫu
Chạy cột silicagel với hệ dung môi rửa giải gradient n-hexane: acetone (100:00:100) thu được 120 lọ, mỗi lọ có dung tích khoảng 15 ml Các phân đoạn này được kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng và sau đó được gộp thành 12 phân đoạn lớn.
Các phân đoạn được kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng với hệ dung môi n-hexane/aetone tỉ lệ 20/1 cho thấy phân đoạn V8 tạo ra các vệt rõ ràng, trong khi các phân đoạn còn lại có vệt sát nhau với Rf hỗn hợp Do đó, chúng tôi đã chọn phân đoạn V8 để tiếp tục quá trình tinh chế.
Bảng 2.1 Sắc ký bản mỏng V8
Kí hiệu V8 là ASVH, cho bay hơi tự nhiên thu đƣợc chất rắn màu vàng nhạt,
Tiếp tục thực hiện quá trình tách chiết với cột thứ hai sử dụng phân đoạn ASVH (300 mg) Mẫu được nạp bằng phương pháp bột khô, bao gồm 300 mg mẫu và 600 mg silicagel Hệ dung môi rửa giải được sử dụng là n-hexane/acetone với tỷ lệ 20/1 Quy trình được thực hiện tương tự như cột thứ nhất, thu được tổng cộng 105 lọ Các phân đoạn sau đó được kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng, dẫn đến việc gộp thành 8 phân đoạn.
Sắc ký bản mỏng Nhóm chất 1 2 3
VH1 = (1- 15) VH5 = (66-75) VH2 = (16-37) VH6 = (76-82) VH3 = (38-50) VH7 = (83-90)
VH4 = (51-65) VH8 = (91-105) Trong đó phân đoạn VH4 chấm bản mỏng với các hệ dung môi khác nhau cho một vệt dưới đèn UV và thuốc thử ( Hình 2.8)
Hình 2.8 Sắc ký bản mỏng VH4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ SỐ VẬT LÝ
Kết quả khảo sát độ ẩm của mẫu bột thí nghiệm đƣợc trình bày qua Bảng 3.1
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát độ ẩm của mẫu bột nguyên liệu khô
Trong đó: m 1 : Khối lƣợng chén sứ m 2 : Khối lƣợng bột nguyên liệu m 3 : Khối lƣợng chén sứ và bột nguyên liệu sau khi sấy
W (%) : Độ ẩm của mỗi mẫu
W tb (%) : Độ ẩm trung bình
Độ ẩm trung bình của bột nguyên liệu là khoảng 10.20%, giúp bảo quản nguyên liệu trong quá trình thực nghiệm mà không bị nấm mốc hay hư hại Mức độ ẩm này nằm trong khoảng an toàn cho dược liệu vỏ thân cây, từ 10-12% [1, tr 937].
Tro toàn phần là khối lƣợng cặn còn lại sau khi nung hoàn toàn một mẫu thử trong điều kiện nhất định
Kết quả khảo sát hàm lƣợng tro của mẫu bột thí nghiệm đƣợc trình bày ở Bảng 3.2
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát hàm lượng tro trong mẫu bột thí nghiệm
Trong đó: m 1 : khối lƣợng cốc m 2 : khối lƣợng mẫu m 4 : khối lƣợng cốc và mẫu sau tro hoá
% tro : hàm lƣợng tro trong bột vỏ cây hoa sữa
Hàm lượng tro trung bình của mẫu bột vỏ cây hoa sữa khoảng 8.8%, giá trị này tương đương với nhiều loại dược liệu từ vỏ thân được sử dụng trong dân gian, đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng.
Kết quả khảo sát hàm lƣợng một số kim loại nặng trong bột nguyên liệu đƣợc trình bày ở Bảng 3.3
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát hàm lượng một số kim loại nặng trong mẫu bột thí nghiệm
Kim loại Zn Cu Pb As Cd
Theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) về vệ sinh thực phẩm (Thông tư số 02/2011/TT-BYT), hàm lượng kim loại nặng tối đa cho phép trong rau quả sấy khô là Pb: 2 mg/l, Zn: 40 mg/l, Cu: 30 mg/l, As: 1 mg/l, và Cd: 0.1 mg/l Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng kim loại nặng trong vỏ cây hoa sữa thấp hơn nhiều so với mức tối đa cho phép, cho thấy rằng việc sử dụng vỏ cây hoa sữa làm dược phẩm là an toàn cao.
Hàm lƣợng tro trung bình 8.769
XÁC ĐỊNH THỜI GIAN CHIẾT
Kết quả khảo sát thời gian chiết mẫu bột thí nghiệm theo phương pháp trọng lƣợng đƣợc trình bày ở Bảng 3.4
Bảng 3.4 Kết quả khảo sát thời gian chiết với các dung môi chiết
Dung môi gam 4h 6h 8h 10h 12h V(ml) m c (g) n-hexane
40 41.79 m 6 44.17 45.41 45.20 45.42 45.39 Trong đó: m c : khối lƣợng cốc m 5 : khối lƣợng cốc và dịch chiết m 6 : khối lƣợng dịch chiết
Nhận xét: Từ số liệu thu đƣợc ở Bảng 3.4, ta thấy:
Thời gian chiết tối ưu cho dung môi n-hexane là 6 giờ, vì tại thời điểm này, lượng chất thu được là cao nhất, với sự gia tăng không đáng kể (0.03 gam) khi kéo dài thêm đến 10 giờ Đối với dung môi chloroform, thời gian chiết tối ưu là 8 giờ, bởi sau thời gian này, mặc dù có giảm lượng chất thu được, nhưng sự thay đổi không đáng kể có thể do sai số trong thí nghiệm Cuối cùng, dung môi ethyl acetate đạt hiệu quả tối ưu ở 4 giờ chiết, với sự gia tăng chỉ 0.04 gam khi kéo dài đến 12 giờ, không đáng kể so với thời gian chiết 8 giờ.
Thời gian chiết tối ưu với dung môi methanol là 6 giờ, vì trong khoảng thời gian này, lượng chất thu được là nhiều nhất và hiệu quả nhất Mặc dù sau 10 giờ lượng chất thu được nhiều hơn 6 giờ chỉ 0.01 gam, sự khác biệt này không đáng kể so với thời gian chiết trên 4 giờ.
XÁC ĐỊNH CÁC LỚP CHẤT TRONG VỎ CÂY HOA SỮA
Kết quả định tính các lớp chất thiên nhiên trong vỏ cây hoa sữa đƣợc trình bày ở Bảng 3.5
Bảng 3.5 Kết quả định tính các lớp chất thiên nhiên trong vỏ cây hoa sữa
Lớp chất Thuốc thử Hiện tƣợng đầu Kết quả Kết luận
Dung dịch màu vàng trong suốt
Xuất hiện kết tủa màu vàng nhạt
Xuất hiện kết tủa màu nâu (+++)
Dung dịch màu cam đậm
Dung dịch màu cam đậm
Dung dịch màu nâu đỏ (+++) Dung dịch
Dung dịch màu cam đậm
Dịch chuyển qua màu xanh đen (+++)
Dung dịch màu vàng Màu đục hơn (++) Có
Không có bột Có bột (+) Có
Xuất hiện vết đen xậm (+++) Có
Chuyển thành màu đỏ đậm (+++) Có
Lớp chất Thuốc thử Hiện tƣợng đầu Kết quả Kết luận
7 Axit hữu cơ Na 2 CO 3tt Dung dịch màu nâu
Có bột khí thoát ra
8 Chất béo Ether dầu hỏa
Giấy lọc có vết mờ
Dung dịch xanh lá nhạt (++) Có
Dung dịch trong suốt Ống 1 đậm hơn ống
Dung dịch xanh dương (+++) Có
Thêm 2 giọt dung dịch FeCl 3 5%
Dung dịch màu vàng nâu, vành trên cùng màu xanh thẫm, lắc nhẹ thấy màu xanh và các hạt nhỏ màu xanh thẫm (++)
Xuất hiện kết tủa bông vàng (++)
Ghi chú: (+++) : Phản ứng rất rõ (++) : Phản ứng rõ (+) : Có phản ứng
Kết quả từ Bảng 3.5 cho thấy rằng trong 12 lớp chất được khảo sát từ vỏ cây hoa sữa, tất cả đều hiện diện với các thuốc thử tương ứng như alkaloid, flavonoid, steroid, đường khử, polyphenol, sterol, coumarin, saponin, polysaccharid, carotene, chất béo và iridoid.
XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG CÁC DỊCH CHIẾT BẰNG PHƯƠNG PHÁP GC – MS
3.4.1 Định danh một số cấu tử trong dịch chiết n-hexane
Sắc ký đồ GC-MS của dịch chiết n-hexane đƣợc đƣợc trình bày ở Hình 3.1
Kết quả định danh một số thành phần hóa học của vỏ cây hoa sữa trong dịch chiết n– hexane đƣợc tổng hợp ở Bảng 3.6
Hình 3.1 Sắc ký đồ GC-MS dịch chiết n-hexane của vỏ cây hoa sữa
Bảng 3.6 Một số thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexane
STT Tên hoạt chất RT Area % Công thức cấu tạo
STT Tên hoạt chất RT Area % Công thức cấu tạo
STT Tên hoạt chất RT Area % Công thức cấu tạo
2-Decenoic acid, 5- hydroxy-.delta.-lactone
Kết quả (% diện tích) thể hiện tỷ lệ diện tích của đỉnh Peak thành phần trên sắc ký đồ GCMS so với tổng diện tích của các đỉnh Peak liên quan trong sắc ký đồ đã được chọn.
Kết quả từ Bảng 3.6 cho thấy phương pháp GC-MS đã xác định được 22 cấu tử trong dịch chiết n-hexane từ vỏ cây hoa sữa, bao gồm các hidrocacbon no mạch hở và các hợp chất sinh học có hoạt tính như Lupenol, Lupenyl acetate, α-amyrin và β-amyrin Những hợp chất này cũng đã được phân lập từ lá cây hoa sữa (Alstonia Scholaris) [21], [23], [30].
3.4.2 Định danh một số cấu tử trong dịch chiết chloroform
Sắc ký đồ GC-MS của dịch chiết chloroform được thể hiện ở Hình 3.2, cho thấy sự hiện diện của nhiều hợp chất hóa học trong vỏ cây hoa sữa Kết quả định danh các thành phần này được tổng hợp chi tiết trong Bảng 3.7.
Hình 3.2 Sắc ký đồ GC-MS GC-MS dịch chiết chloroform của vỏ cây hoa sữa
Bảng 3.7 Một số thành phần hóa học trong dịch chiết chloroform
STT Tên hoạt chất RT Area % Công thức cấu tạo
Kết quả từ Bảng 3.7 cho thấy phương pháp GC-MS đã xác định được 6 cấu tử trong dịch chiết chloroform của vỏ cây hoa sữa Trong số này, một số cấu tử có hàm lượng lớn như Cyclododecan (10.93%), 5-Hydroxy-2-Decenoic acid lactone (15.51%), Tetrahydroactinidiolide (39.05%) và Phenol, 4-(3-hydroxy-1-propenyl)-2-methoxy (27.65%) Đặc biệt, hai hợp chất Phenol, 4-(3-hydroxy-1-propenyl)-2-methoxy và 5-Hydroxy-2-Decenoic có hàm lượng cao và hoạt tính chống oxy hóa tốt.
3.4.3 Định danh một số cấu tử trong dịch chiết ethyl acetate
Sắc ký đồ GC-MS của dịch chiết ethyl acetate được trình bày trong Hình 3.3, cho thấy sự hiện diện của các thành phần hóa học trong vỏ cây hoa sữa Kết quả định danh các thành phần này được tổng hợp chi tiết trong Bảng 3.8.
Hình 3.3 Sắc ký đồ GC-MS dịch chiết ethyl acetate của vỏ cây hoa sữa
Bảng 3.8 Một số thành phần hóa học trong dịch chiết ethyl acetate
STT Tên hoạt chất RT Area % Cấu tạo phân tử
STT Tên hoạt chất RT Area % Cấu tạo phân tử
Methyl-1-Propene-3- yl)-2h-Pyran-2-one
Kết quả (% diện tích) được tính bằng tỷ lệ diện tích của đỉnh Peak thành phần trên sắc ký đồ GCMS so với tổng diện tích đỉnh Peak của các chất liên quan đã được lựa chọn trong sắc ký đồ.
Bảng 3.8 cho thấy rằng phương pháp GC-MS đã xác định được 9 cấu tử trong dịch chiết ethyl acetate từ vỏ cây hoa sữa.
Nine identified compounds include several with significant concentrations: 5-Hydroxy-2-Decenoic acid lactone at 9.10%, Cyclododecane at 17.42%, Tetrahydro-4-(2-Methyl-1-Propene-3-yl)-2h-Pyran-2-one at 22.54%, and Tetrahydroactinidiolide at 35.76% Notably, the compound Phenol, 4-(3-hydroxy-1-propenyl)-2-methoxy, also exhibits good antioxidant activity at 9.10%.
3.4.4 Định danh một số cấu tử trong dịch chiết methanol
Hình 3.4 trình bày sắc ký đồ GC-MS của dịch chiết methanol, trong khi Bảng 3.9 tổng hợp kết quả định danh một số thành phần hóa học có trong vỏ cây hoa sữa từ dịch chiết này.
Hình 3.4 Sắc ký đồ dịch chiết methanol của vỏ cây hoa sữa
Bảng 3.9 Một số thành phần hóa học trong dịch chiết methanol
STT Tên hoạt chất RT Area % Công thức cấu tạo
STT Tên hoạt chất RT Area % Công thức cấu tạo
Kết quả từ Bảng 3.9 cho thấy phương pháp GC-MS đã xác định được 14 hợp chất có trong dịch chiết methanol từ vỏ cây hoa sữa.
Fourteen identified compounds include significant constituents such as β-amyrin (12.05%), Tetrahydroactinidiolide (16.33%), and Lupenyl acetate (12.37%) Notably, Tetrahydroactinidiolide appears in two measurements at 17.36% and 11.87% Many of these compounds, including α-amyrin, β-amyrin, Lupenyl acetate, β-Stigmasterol, β-Sitosterol, α-Lupenone, and β-Lupenone, demonstrate high potential for cancer-fighting properties.
3.4.5 Tổng hợp thành phần hóa học đƣợc định danh trong các dịch chiết
Các cấu tử trong bốn dịch chiết n-hexane, chloroform, ethyl acetate và methanol được định danh bằng phương pháp GC-MS được trình bày trên Bảng 3.10
Bảng 3.10 Tổng hợp thành phần hóa học được định danh trong các dịch chiết
Area(%) n-hexane Chloro form ethyl acetate methan ol
Area(%) n-hexane Chloro form ethyl acetate methan ol
Tổng số cấu tử đƣợc định danh 22 6 9 14
Bằng phương pháp GC-MS, 35 cấu tử đã được định danh trong dịch chiết từ vỏ cây hoa sữa, bao gồm ankan, xicloankan, acid hữu cơ, ether, ester, steroid, dẫn xuất phenol, triterpene, ancol, aldehydrit acid và xetone vòng Trong số đó, các hoạt chất quý như β-stigmasterol, β-sitosterol, α-amyrin, β-amyrin, lupenol, lupenone, lupenyl acetate và β-amirenone có khả năng chống ung thư cao Nghiên cứu của nhóm Tây Ban Nha và Mexico, do Liliana Hernández Vázquez, Javier Palazon và Arturo Navarro-Oca thực hiện, đã chỉ ra rằng α- và β-amyrin có khả năng chống vi khuẩn, chống viêm và nhiều hoạt động sinh học khác Amyrin cũng tham gia vào quá trình tổng hợp sinh tổng hợp, và việc phát triển các hệ thống biến đổi sinh học để chuyển đổi amyrin thành các hợp chất mới sẽ mở ra cơ hội sử dụng α- và β-amyrin như nguồn chất chuyển hóa thứ cấp quý giá.
HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO CHIẾT N-HEXANE
Từ những nghiên cứu về ứng dụng phổ biến của vỏ cây hoa sữa, chúng tôi tiến hành thử các hoạt tính sinh học của dịch chiết n- hexane
3.5.1 Hoạt tính chống oxi hóa
Kết quả đánh giá hoạt tính kháng viêm của cao chiết n –hexane đƣợc thể hiện ở Bảng 3.11
Bảng 3.11 Kết quả sàng lọc hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cặn n-hexane
Mẫu Nồng độ (àg/mL) % Inhibition
*Ascorbic acid được dùng làm chuẩn dương để so sánh mức độ ổn định của phương pháp
Kết quả từ Bảng 3.11 cho thấy mẫu cặn chiết n-hexane không có hoạt tính chống oxy hóa quột gốc tự do DPPH ở hai nồng độ thử nghiệm là 100 µg/mL và 500 µg/mL.
Kết quả đánh giá hoạt tính kháng viêm của cao chiết n –hexane đƣợc thể hiện ở Bảng 3.12
Bảng 3.12 Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định a Chất đối chứng cho các chủng vi khuẩn b Chất đối chứng cho nấm
Nhận xét: Kết quả Bảng 3.12 cho thấy mẫu cặn chiết n-hexane không biểu hiện hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Enter ococc us faeca lis
Kết quả đánh giá hoạt tính kháng viêm của cao chiết n –hexane đƣợc thể hiện ở Bảng 3.13
Bảng 3.13 Kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxide (NO) trên tế bào RAW264.7 của mẫu
Tên mẫu Nồng độ % Ức chế Sai số % Tế bào sống Sai số
* Cardamonin: được sử dụng làm chất chuẩn dương
Kết quả từ Bảng 3.13 chỉ ra rằng mẫu cặn chiết HS-hexane có khả năng ức chế NO ở nồng độ thử nghiệm 100 µg/mL mà không gây độc cho tế bào Phát hiện này hoàn toàn nhất quán với nghiên cứu của Angela A Salim và Mary.
3.5.4 Hoạt tính gây độc tế bào
Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của cao chiết n –hexane đƣợc thể hiện ở Bảng 3.14
Bảng 3.14 Kết quả sàng lọc thử độc tế bào của mẫu
*Camptothecin: đƣợc sử dụng làm chất chuẩn
Kết quả từ Bảng 3.14 chỉ ra rằng mẫu cặn chiết HS-hexane có khả năng gây độc mạnh đối với tế bào ung thư gan người Hep3B và tế bào ung thư phổi người A549 ở nồng độ thử nghiệm 100 µg/mL.
- Mẫu cặn chiết HS-hexane không biểu hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ vú người MDA-MB
→ Kết quả này hoàn toàn phù hợp với những nghiên cứu trước đây về hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết n-hexane từ cây hoa sữa [10], [18], [30].
HÀM LƢỢNG CÁC CAO CHIẾT SO VỚI MẪU KHÔ
Hàm lƣợng các cao chiết thu đƣợc từ 3 kg bột nguyên liệu khô ban đầu đƣợc thể hiện qua Bảng 3.15
Bảng 3.15 Hàm lượng % các cao chiết so với mẫu khô
Mẫu vỏ cây hoa sữa (khô) thu hái tại Đà Nẵng (3 kg) Cao chiết n-hexane chloroform ethyl acetate methanol
% so với mẫu khô ban đầu 12.83 2.17 2.57 2.70
Nhƣ vậy, hàm lƣợng cao chiết n-hexane lớn hơn rất nhiều so với ba loại cao chiết còn lại.
XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT TÁCH ĐƢỢC ASVH10
3.7.1 Hằng số vật lí và các số liệu phổ của hợp chất tách đƣợc
The compound ASVH10 is extracted from the n-hexane fraction of the bark of the Alstonia scholaris tree, appearing as a solid white substance It exhibits good solubility in n-hexane, chloroform, acetone, and methanol, with an Rf value of 0.4 in a silica gel system using a hexane/acetone (H/A) ratio of 20/1, and an Rf value of 0.5 in a hexane/ethyl acetate (H/E) system.
90/10); hiện vệt màu hồng tím với axit H 2 SO 4 10% (115 o C, 3 phút); khối lƣợng 75 mg; nhiệt độ nóng chảy 189.9 o C ( Hình 3.5b) a Mẫu rắn b Nhiệt độ nóng chảy
Phổ FT-IR : các tín hiệu trên phổ FT- IR ( Hình 3.6 ) cho phép dự đoán các nhóm chức của chất ASVH10 nhƣ đƣợc trình bày tại Bảng 3.16
Hình 3.6 Phổ hồng ngoại (FT - IR) của chất ASVH10
Bảng 3.16 Phân tích phổ hồng ngoại (FT - IR) của chất ASVH10
STT ν (cm -1 ) của chất ASVH10 ν (cm- 1 ) theo tài liệu [8]
Phổ khối : m/z : Phổ khối của chất ASVH10 cho peak ion phân tử [M+H] + có m/z 427.3, 409.2 ( mạnh ), 298.9, 259.0, 231.0, 203.0, 177.0, 120.9
In the 1 H-NMR spectrum, the signal for one olefinic proton appears at δ 5.18 (1H, t, 3.5), while an oxymethine group is noted at δ H 3.20 (1H, dd, J = 11.0, 4.5 Hz, H-3) Additionally, eight tertiary methyl groups are identified at δH values of 0.73, 0.79, 0.83, 0.87 (x2), 0.94, 0.97, 1.00, and 1.14 Furthermore, protons from ten methylene groups are recorded within the range of δ 1.00-1.90 The 1 H-NMR data is detailed in Table 3.17.
Bảng 3.17 Dữ liệu phổ 1 H-NMR của chất ASVH10 Độ dịch chuyển hóa học của các mũi cộng hưởng ( (J,Hz), ppm)
Vị trí proton Độ dịch chuyển hóa học của các mũi cộng hưởng ( (J,Hz), ppm)
H-15 Độ dịch chuyển hóa học của các mũi cộng hưởng ( (J,Hz), ppm)
Vị trí proton Độ dịch chuyển hóa học của các mũi cộng hưởng ( (J,Hz), ppm)
Phổ 13 C-NMR và DEPT, HSQC : Hình 3.10→ 3.14
Phổ 13 C -NMR và HSQC chỉ ra tín hiệu của 2 cacbon olefinic ở 145.22 và 121.75 Ngoài ra, tín hiệu tại δ C 79.07 thuộc về nhóm oxymethine (C-3) Dữ liệu phổ 13 C-DEPT cho thấy ASVH10 có 8 nhóm –CH 3 , 10 nhóm >CH 2 , 3 nhóm >CH–,
1 nhóm –CH=, 1 nhóm –CH–OH, 7 carbon bậc 4 (nhóm >C