5. BỐ CỤC LUẬN VĂN
2.2.3. Phƣơng pháp định tính một số lớp chất trong vỏ cây hoa sữa
a. Alkaloid
Để phát hiện sự hiện diện của alkaloid trong vỏ cây hoa sữa, chúng tôi đã áp dụng nguyên tắc thử của Webb, cách thử gồm hai phần nhƣ sau:
- Phần 1: Bột vỏ cây xay nhuyễn (5 g) đƣợc ngâm trong dung dịch Prollius là hỗn hợp gồm chloroform: ethanol 95o: NH4OH đậm đặc theo tỉ lệ thể tích là 8:8:1, môi trƣờng phải có tính base. Ngâm nguội trong 24 giờ, để ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lắc trộn. Lọc và đuổi dung môi đến cạn, thu đƣợc cặn. Hòa tan phần cặn trong dung dịch HCl 1%, đun ấm cho dễ tan. Lọc, lấy dịch lọc để thử nghiệm với hai loại thuốc thử Mayer, Wagner.
- Phần 2: Bột vỏ cây xay nhuyễn (5 g) và dung dịch nƣớc H2SO4 1% đƣợc cho vào bình tam giác và đun nhẹ, trong 1 giờ. Lọc, lấy dịch lọc để thử nghiệm với hai loại thuốc thử Mayer, Wagner.
- Pha thuốc thử và hiện tƣợng:
+ Thuốc thử Mayer : hòa tan 1.36 gam HgCl2 trong 60 mL nƣớc cất và hòa tan 5 gam KI trong 10 mL nƣớc cất. Thuốc thử Mayer gồm hỗn hợp hai dung dịch trên thêm nƣớc cất cho đủ 100 mL.
Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào mẫu dịch lọc ở trên, nếu có alcaloid sẽ xuất hiện kết tủa màu trắng hoặc vàng nhạt.
+ Thuốc thử Wagner: hòa tan 1.27 gam iod I2 và 2 gam KI trong 20 mL nƣớc cất. Thêm nƣớc cho đủ 100 mL.
Nhỏ vài giọt thuốc thử Wagner vào mẫu dịch lọc ở trên, nếu có alkaloid sẽ xuất hiện kết tủa màu nâu.
b. Flavonoid
Cân 5 gam bột vỏ cây hoa sữa cho vào bình tam giác 100 mL có nắp đậy, thêm 50 mL cồn 90˚, đậy kín. Đun cách thủy trong 10 phút, lọc nóng lấy dịch lọc. Cho 1mL dịch chiết vào ống nghiệm rồi đem đi thử với các phản ứng sau: dung dịch NaOH 10%; dung dịch H2SO4 đặc; FeCl3 5%.
Tác dụng với dung dịch H2SO4 đậm đặc: Thêm vài giọt dung dịch H2SO4 đậm đặc vào ống nghiệm chứa dịch lọc. Nếu là flavon, flavonol cho màu vàng đậm đến màu cam và có phát huỳnh quang đặc biệt; nếu là chalcon, auron cho màu đỏ hoặc xanh dƣơng - đỏ; nếu là flavonon cho màu từ cam đến đỏ .
Tác dụng với dung dịch NaOH 1%: Thêm vài giọt dung dich NaOH 1% vào ống nghiệm chứa dịch lọc sẽ có màu từ vàng đến cam - đỏ. Nếu là flavon, isoflavon, chalcon, isoflavanon, flavanon, leucoantocyanidin sẽ có màu vàng. Flavonol cho màu từ vàng đến cam. Auron cho màu tím đến đỏ tím.
Tác dụng với dd FeCl3 5% : hợp chất flavonoid có màu khác nhau từ xanh lục đến xanh đen.
c. Coumarin
Cân 5 gam bột vỏ cây hoa sữa cho vào bình nón 100ml có nắp đậy, thêm 50 mL cồn 90˚, đậy kín. Đun cách thủy trong 5 phút, lọc nóng qua bông, giữ lấy phần dịch. Dịch lọc thu đƣợc đem thử nghiệm với phản ứng mở đóng vòng lacton:
Cho vào 2 ống nghiệm bằng nhau mỗi ống 1ml dịch chiết: + Ống 1: thêm 0.5 mL dung dịch NaOH 10%.
+ Ống 2: để nguyên.
Đun cả 2 ống nghiệm cho đến sôi, để nguội quan sát hiện tƣợng : nếu ống 1 trong hơn ống 2 nhƣng sau đó axit hóa bằng dung dịch H2SO4 loãng mà ống 1 đục hơn ống 2 thì có coumarin.
d. Saponin
Cân 0.1 gam bột vỏ cây hoa sữa cho vào trong ống nghiệm lớn, thêm 5 mL ethanol đun cách thủy 5 phút lọc lấy dịch để thử nghiệm.
+ Ống 1: 5 mL HCl 0.1N (pH=1) + 3giọt dịch chứa mẫu thử + Ống 2: 5 mL NaOH 0.1N (pH=13) + 3 giọt dịch chứa mẫu thử
Bịt miệng 2 ống nghiệm và lắc mạnh cả 2 ống nghiệm trong 1 phút và để yên, quan sát các cột bột bong bóng ở cả 2 ống nghiệm:
Nếu cột bột trong cả 2 ống nghiệm cao bằng nhau và bột có độ bền nhƣ nhau, có thể có saponin triterpenoid. Nếu ống 2 có cột bột cao hơn nhiều so với ống 1 thì có saponin steroid.
e.Đường khử
Cao chiết vỏ cây hoa sữa đƣợc chấm trên một tấm sắc ký lớp mỏng, giải ly. Dung dịch nƣớc 0.1 N AgNO3 (1 mL ), dung dịch 5N NH4OH (5 mL ), phun xịt dung dịch lên bảng mỏng, sấy bản 5-10 phút ở 105oC.
Nếu bản mỏng xuất hiện vết đen xậm thì chứng tỏ có đƣờng khử.
g. Steroid
Để phát hiện sự hiện diện của steroid trong vỏ cây hoa sữa, chúng tôi đã dùng phản ứng Salkowski nhƣ sau:
Hoà tan 2 mg cao chiết clorofom trong cloroform (2 mL ) và nhỏ H2SO4 đậm đặc (1 mL), phản ứng dƣơng tính là dung dịch đổi thành màu đỏ đậm, xanh, xanh-tím.
h. Axit hữu cơ
Cân khoảng 3 gam bột vỏ cây hoa sữa cho vào ống nghiệm to, thêm 10 mL nƣớc cất rồi đem đun sôi trực tiếp 10 phút. Để nguội rồi lọc qua giấy lọc gấp nếp, giữ lấy phần dịch. Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng 2 mL dịch lọc, thêm một ít tinh thể Na2CO3. Quan sát hiện tƣợng, nếu có bọt khí thoát ra có axit hữu cơ.
i. Chất béo
Cân 3 gam bột vỏ cây hoa sữa cho vào bình tam giác 100 mL có nút đậy, thêm 10 mL ether dầu hỏa, đậy nắp, ngâm trong 1 giờ. Lọc qua giấy lọc gấp nếp, giữ lấy phần dịch lọc. Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên mảnh giấy lọc, sấy nhẹ cho bay hơi hết dung môi. Quan sát hiện tƣợng nếu có vết mờ trên giấy có chất béo.
k. Carotene
dịch lọc và cho 2 mL dịch lọc vào ống nghiệm, đun cách thủy thu lấy cặn, sau đó nhỏ vài giọt H2SO4 đậm đặc lắc nhẹ, thấy xuất hiện màu xanh lá thì có carotene.
l. Polysaccairid
Cân 3 gam bột vỏ cây hoa sữa cho vào bình tam giác 100 mL, thêm 20 mL nƣớc cất, đun sôi trong vài phút. Lọc qua giấy lọc vào một cốc thủy tinh 100 mL, thu lấy phần dịch lọc và đem đi định tính bằng cách chia dịch chiết vào 3 ống nghiệm:
+ Ống 1: 2 mL dịch chiết + 5 giọt thuốc thử Lugol. + Ống 2: 2 mL nƣớc cất + 5 giọt thuốc thử Lugol. + Ống 3: 2 mL dịch chiết.
- Pha thuốc thử và hiện tƣợng:
Thuốc thử Lugol: hòa tan 0.5 gam KI + 1 gam I2 trong 5 mL nƣớc cất, lắc cho tan hết rồi chuyển toàn bộ vào bình định mức 100 mL và thêm nƣớc cất đến vạch 100 mL
Nếu ống 1 đậm hơn ống 2 và 3 thì có polysaccarid.
m. Iridoid
Cân 3 gam bột vỏ cây hoa sữa ngâm trong 30 mL dung dịch HCl 1% trong 5 giờ. Lọc, lấy dịch lọc thử nghiệm với thuốc thử Trim-Hill.
Thuốc thử Trim-Hill: CH3COOH (10 mL), dung dịch nƣớc 0.2% CuSO4 (1 mL), HCl đặc (0.5 L).
Lấy 1 mL dịch lọc cho vào ống nghiệm, nhỏ 2-3 giọt thuốc thử Trim-Hill. Kết quả dƣơng tính là khi đun nhẹ sẽ xuất hiện màu xanh dƣơng.
n. Polyphenol
Cân 1 gam bột vỏ cây hoa sữa cho vào bình tam giác dung tích 50 mL, thêm 20 mL nƣớc cất. Đun sôi trong 2 phút. Để nguội rồi đem lọc thu đƣợc dịch đem thử nghiệm với dung dịch FeCl3 5% và chì axetat 10%.
+ Lấy 2 mL dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5% nếu dung dịch chuyển sang màu xanh thẫm thì có polyphenol.
+ Lấy 2 mL dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch chì axetat 10% nếu xuất hiện kết tủa bông vàng thì có polyphenol.