5. BỐ CỤC LUẬN VĂN
2.3.2. Sơ đồ điều chế các cao chiết
Các quá trình thực nghiệm đƣợc mô tả theo Hình 2.3
Hình 2.3. Sơ đồ điều chế các cao chiết
Vỏ cây hoa sữa Xử lí
Bột nguyên liệu (3kg )
Ngâm chiết với n- hexane ( 5 lần x 24h ) Dịch chiết n- hexane Cất loại dung môi Cao ( H ) n- hexane Phân lập chất Đo phổ ( IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC..để xác định cấu trúc Dịch chiết chloroform Bã rắn 1
Ngâm chiết với chloroform ( 5 lần x 24h ) Cất loại dung môi Cao ( C ) chloroform Bã rắn 2 Dịch chiết etyl acetate
Ngâm chiết với etyl acetate ( 5 lần x 24h ) Bã rắn 3 Cất loại dung môi Cao ( E ) etyl acetate
Ngâm chiết với methanol ( 5 lần x 24h ) Dịch chiết methanol Cất loại dung môi Cao ( M ) methanol
Từ 3 kg bột vỏ cây hoa sữa sau khi đƣợc ngâm chiết lần lƣợt với các dung môi n–hexane, chloroform, ethyl acetate và methanol ( rắn : lỏng = 1:2) thu đƣợc dịch chiết, rồi đuổi dung môi bằng cất quay chân không thu đƣợc các cao chiết tƣơng ứng.
2.3.3. Sơ đồ phân lập cao chiết n –hexane
Trong phạm vi của đề tài này, dựa vào % cao chiết so với mẫu bột nguyên liệu ban đầu, thành phần định danh, hoạt tính sinh học và nghiên cứu tài liệu tham khảo, chúng tôi lựa chọn cao chiết n- hexane của vỏ cây hoa sữa để phân lập và tinh chế chất.
Quá trình phân lập chất từ cao n-hexane đƣợc thể hiện ở Hình 2.4
Hình 2.4. Sơ đồ phân lập chất từ cao n-hexane
VH1 VH2 VH3 VH4 VH5 VH6 VH7 VH8 Cao n- hexane (H) (7g) SKC, silicagel, gradient HA 100:00:100, 120 lọ: 12 phân đoạn V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 V10 V11 V12 ASVH10 75 mg ASVH 300 mg SKC, silicagel, HA 20/1, 105 lọ: 10 phân đoạn
Lựa chọn dung môi chạy cột sắc ký
Để lựa chọn dung môi hay hệ dung môi chạy giải ly phù hợp chúng tôi sử dụng sắc ký bản mỏng với các bƣớc sau:
+ Hoà tan một lƣợng rất nhỏ cao chiết (H) trong dung môi n-hexane.
+ Dùng ống mao quản chấm dung dịch mẫu trên lên mỗi bản mỏng với lƣợng tƣơng đƣơng nhau.
+ Các bản mỏng đƣợc chạy với các loại dung môi có độ phân cực khác nhau: n-hexane, n-hexane /ethyl acetate (với các tỉ lệ 10/1, 15/1, 20/1, 25/1, 30/1), n- hexane /acetone (với các tỉ lệ 5/1,10/1, 15/1, 20/1, 50/1), n-hexane /đichlomethan (với các tỉ lệ 10/1, 20/1).
+ Tiếp theo hiện hình các vết trên bản mỏng bằng đèn UV và thuốc hiện màu với H2SO4 10%.
+ Sau khi thử nghiệm chấm bản mỏng với các hệ dung môi giải ly khác nhau, chúng tôi đã chọn dung môi giải ly phù hợp cho cột đầu tiên ( phá mẫu ) là n-hexane / acetone (100:00:100) và hệ dung môi n-hexane / acetone (20/1) cho cột 2.
Chuẩn bị mẫu
Phần cao n- hexane (7 g) đƣợc hoà tan hoàn toàn trong dung môi n- hexane trong bình cầu cổ 29, thêm dần dần 10.5 g silicagel Merck cỡ hạt 0.04 - 0.06 mm vào bình cầu, lắc đều sao cho hỗn hợp trong bình cầu đồng nhất, sau đó cất quay dƣới áp suất thấp đến khô hoàn toàn sao cho chất đƣợc gắn đều lên silicagel. Cạo lấy phần silicagel đã gắn mẫu rồi làm tơi mịn bằng đũa thủy tinh trƣớc khi đƣa vào cột sắc ký (Hình 2.5).
Nạp chất hấp thu vào cột
Cột đƣợc rửa thật sạch, tráng với nƣớc cất và sấy khô, tráng lại bằng acetone, kẹp cột thẳng đứng lên giá và đóng van ở phía dƣới cột lại.
Silicagel đƣợc nhồi ở dạng sệt ( huyền phù) nhƣ sau: + Silicagel sau khi đƣợc sấy ở 110o
C trong khoảng 4 giờ, đƣợc bảo quản trong bình hút ẩm.
+ Đổ silicagel vào cột để ƣớc chừng lƣợng silicagel sẽ nhồi ( khoảng tầm 2/3 chiều cao cột sắc ký), cột thứ nhất sau khi ƣớc lƣợng đổ ra đem cân khoảng 140 gam silicagel với kích thƣớc cột khoảng 45 cm – 4 cm; cột thứ hai sau khi ƣớc lƣợng đổ ra đem cân khoảng 70 gam silicagel với kích thƣớc cột khoảng 45 cm – 3 cm.
+ Dùng cốc có mỏ 250 mL, đong một lƣợng dung môi chạy cột ban đầu ( cột 1: n-hexane, cột 2: n-hexane/acetone = 20/1) gấp khoảng 1.5 lần lƣợng silicagel, sau đó rót từ từ silicagel vào cốc, từng ít một, vừa thêm vừa lắc nhẹ, sử dụng đũa thủy tinh để khuấy lên mà không làm ngƣợc lại, để yên cốc trong vòng một đêm.
+ Rót dung môi vào khoảng 1/3 dung tích cột.
+ Rót hỗn hợp sệt vào cột nhờ một phễu lọc có đuôi dài, vừa mở nhẹ khóa ở bên dƣới cột để cho dung môi chảy ra, hứng vào một cốc trống ở bên dƣới để rót trả lại lên đầu cột. Vừa rót vừa dùng thanh cao su gõ nhẹ vào cột để bột khí thoát ra và silicagel lắng xuống. Tiếp tục đổ hỗn hợp sệt vào cột đến khi hết. Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy ra và rót trở lại đầu cột ( kết hợp rửa thành cột) khoảng 3 lần để cột đƣợc nạp chặt chẽ, đồng nhất [7, tr. 185-187]. Đóng van khóa ở dƣới để yên để cột ổn định.
Lƣu ý:
+ Không đƣợc để đầu cột bị khô, tức là trên đầu cột luôn có dung môi.
+ Mặt thoáng silicagel ở đầu cột phải nằm ngang, nếu mặt thoáng không nằm ngang thì cho thêm dung môi, dùng đũa thủy tinh khuấy đảo nhẹ phần dung môi gần sát mặt thoáng làm xáo một phần silicagel ở trên đầu cột, để yên, silicagel lắng xuống từ từ tạo đƣợc mặt thoáng bằng phẳng. Nếu cột xuất hiện bột khí thì dùng bông tẩm methanol quấn quanh thành cột tại điểm có bột khí.
Nạp mẫu vào cột
Trong đề tài này, chúng tôi nạp mẫu ở dạng bột khô nhƣ sau [7, tr. 187-188]: + Để lƣợng dung môi trong cột cao hơn mặt thoáng silicagel khoảng 2-3 cm, đổ thật chậm silicagel khô đã bão hòa mẫu vào cột và để nó lắng xuống, phải đảm bảo mức dung môi luôn ở phía trên của silicagel, để ý xử lí bột khí ( nếu có ).
+ Sau khi cho xong mẫu lên đầu cột, nhẹ nhàng cho một lớp cát vào khoảng 3- 6 mm để tránh cho bề mặt của lớp silicagel bị ảnh hƣởng khi thêm dung môi.
+ Sử dụng pipet thêm từ từ dung môi vào cột để mức dung môi đạt khoảng 10 mm phía trên lớp cát. Để dung môi chảy xuống tới khi mức dung môi còn lại khoảng 1-2 mm trên lớp cát, lặp lại khoảng 2 lần để đảm bảo toàn bộ mẫu đã đƣợc hấp thụ lên silicagel. Cuối cùng thêm lƣợng dung môi vào đầu cột và bắt đầu chạy cột ( Hình 2.6).
Hình 2.6. Cột sắc ký sau khi nạp mẫu
Chạy cột silicagel với hệ dung môi rửa giải gradient n-hexane: acetone (100:00:100) thu đƣợc 120 lọ kí hiệu từ 1 đến 120, mỗi phân đoạn khoảng 15 ml. Các phân đoạn này đƣợc kiểm tra trên sắc ký bản mỏng và đƣợc gộp thành 12 phân đoạn lớn :
V1 = (1 - 9) V7 = (53-62) V2 = (10-17) V8 = (63-79)
b = 10 cm
V3 = (18-22) V9 = (80-90) V4 = (23-30) V10 = (91-102)
V5 = (31-38) V11 = (103-110)
V6 = (39-52) V12 = (111-120)
Các phân đoạn đƣợc kiểm tra trên sắc ký bản mỏng với hệ dung môi n- hexane/aetone = 20/1 cho thấy phân đoạn V8 cho các vệt rõ ràng ( Bảng 2.2). Các phân đoạn còn lại cho vệt sát nhau, Rf hỗn hợp.Vì vậy chúng tôi chọn phân đoạn V8 để tiếp tục tinh chế.
Bảng 2.1. Sắc ký bản mỏng V8
Kí hiệu V8 là ASVH, cho bay hơi tự nhiên thu đƣợc chất rắn màu vàng nhạt, 300 mg ( Hình 2.7).
Hình 2.7. Mẫu rắn ASVH
Tiếp tục chạy cột thứ hai với phân đoạn ASVH (300 mg). Mẫu đƣợc nạp bằng phƣơng pháp bột khô ( 300 mg mẫu + 600 mg silicagel). Hệ dung môi rửa giải là n- hexane/acetone = 20/1. Tiến hành tƣơng tự nhƣ cột thứ nhất thu đƣợc 105 lọ. Các phân đoạn tiếp tục đƣợc kiểm tra trên sắc kí bản mỏng và gộp đƣợc 8 phân đoạn.
Sắc ký bản mỏng Nhóm chất 1 2 3 Rf = ai /b [7, tr. 160- 161] 0.3 0.5 0.8 a1 = 0.3 cm a2 = 0.5 cm a3 = 0.8 cm
VH1 = (1- 15) VH5 = (66-75) VH2 = (16-37) VH6 = (76-82) VH3 = (38-50) VH7 = (83-90)
VH4 = (51-65) VH8 = (91-105)
Trong đó phân đoạn VH4 chấm bản mỏng với các hệ dung môi khác nhau cho một vệt dƣới đèn UV và thuốc thử ( Hình 2.8). Hình 2.8. Sắc ký bản mỏng VH4 UV H/ A 50/ H/A 25/ 1 H/A 20/ 1 H/C 1/1 H/A 15/ 1 H/E 90/10 MeO H
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN