5. BỐ CỤC LUẬN VĂN
2.2.5. Phƣơng pháp thăm dò hoạt tính sinh học
Trong phạm vi của đề tài, chúng tôi lựa chọn cao chiết n- hexane để thăm dò hoạt tính sinh học tại Viện Hàn Lâm Khoa Học & Công Nghệ VN–Viện Hóa Sinh Biển.
Các mẫu các hợp chất này đƣợc pha thành dung dịch gốc với nồng 100 mg/mL (đối với cặn chiết) hoặc 100 mM (đối với chất sạch) trong DMSO, sau đó pha loãng ở các nồng độ khác nhau.
a. Phương pháp thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH
Nguyên lý: 1,1- diphenyl 1-2 picrylhydrazyl (DPPH) là một gốc tự do bền, có màu tím và có độ hấp thụ cực đại ở bƣớc sóng 51 nm. Khi có mặt chất chống oxi hóa, nó sẽ bị khử thành 2,2- diphenyl-1-1picryhydrazine (DPPH-H) có màu vàng. Đo độ giảm hấp thụ ở bƣớc sóng 517 nm để xác định khả năng khử gốc DPPH của chất chống oxi hóa.
DPPH màu tím + R꞉H DPPH-H + R•
Mẫu thử đƣợc pha trong DMSO. DPPH pha loãng trong MeOH với nồng độ thích hợp. 10 μL mẫu thử đƣợc ủ với 190 μL dung dịch DPPH, ủ ở nhiệt độ 37oC trong 20 phút và đo trên máy ELISA ở bƣớc sóng 517 nm. Chất đối chứng Ascorbic đƣợc dùng để kiểm soát độ ổn định và đánh giá hoạt tính ức chế tƣơng đƣơng [16], [18] . Các phép thử đƣợc lặp lại 3 lần.
Kết quả đƣợc tính theo công thức sau:
% ức chế = 100 – [(ODs) / (ODc) x 100] + ODs: Mật độ quang trung bình của mẫu thử
+ ODc: Mật độ quang trung bình của mẫu control (không có mẫu thử, chỉ có DPPH, coi nhƣ giá trị ức chế 0%)
b. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm
Nguyên lý: Gốc tự do nitric oxide (•NO) đƣợc sản sinh ở nhiều loại tế bào khác nhau. Dạng •NO xuất tiết có mặt ở các tế bào nhƣ đại thực bào, nguyên bào sợi hay tế bào gan thƣờng đƣợc sản sinh với lƣợng lớn khi xuất hiện các đáp ứng viêm [20].
Một phƣơng pháp đƣợc sử dụng để xác định gián tiếp •NO là đo màu các thành phần sản phẩm của nó (nitrate và nitrite). Phản ứng này đòi hỏi rằng nitrate (NO3) đầu tiên đƣợc giảm thành nitrite (NO2), do tác động của nitrate reductase.
Nitrite đƣợc phát hiện và phân tích bằng cách hình thành một màu hồng đỏ khi mẫu thử có chứa NO2- với thuốc thử Griess.
Khi thêm axit sulphanilic, nitrite tạo thành muối diazonium, sau đó các thuốc nhuộm azo (N-alpha-naphthyl-ethylenediamine) đƣợc thêm vào để tạo màu hồng.
Sulphonamide form Pink color
Phƣơng pháp MTT (3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) là một phƣơng pháp so màu, đo độ suy giảm màu để đánh giá khả năng sống sót của tế bào. Ở các tế bào sống, hệ enzym oxidoreductase hoạt động mạnh, những enzyme này có khả năng phân giải MTT thành dạng formazan không hoà tan, màu tím đậm. Do vậy, tỉ lệ tế bào sống sót đƣợc suy ra từ lƣợng formazan tạo thành từ MTT. Lƣợng formazan tạo thành đƣợc hoà tan bởi dung môi hữu cơ (DMSO, propanol) và đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 570 mm. Khả năng gây độc tế bào của các mẫu thử nghiệm đƣợc suy ra từ việc đánh giá khả năng sống sót của tế bào [11].
Tế bào RAW264.7 đƣợc nuôi cấy 48 giờ trong môi trƣờng DMEM ở 37oC, 5% CO2 với 10% FBS, penicillin và streptomycin sulphate. Sau đó chúng đƣợc nuôi cấy trong giếng phiến 96 với mật độ 2.5 x 105 tế bào/giếng. Tế bào đƣợc kích thích với LPS trong 24 giờ với sự có mặt của các hợp chất thử ở nhiều nồng độ khác nhau, đƣợc pha sẵn trong DMSO. Dịch nổi của tế bào phản ứng với thuốc thử
Griess. NaNO2 ở các nồng độ khác nhau đƣợc sử dụng để xây dựng đƣờng chuẩn. Độ hấp thụ đƣợc đo ở 570 nm. Cardamonin đƣợc sử dụng làm mẫu đối chứng [13].
Phần tế bào còn lại sau khi đã sử dụng để đánh giá các hoạt tính invitro đƣợc bổ sung dung dịch MTT (0.5 mg/ml pha trong PBS), ủ 4 giờ ở 37oC và 5% CO2. Sau đó hút bỏ hết môi trƣờng trên bề mặt, kết tủa formazan đƣợc hòa tan trong isopropanol. Độ hấp thụ đƣợc đo ở 570 nm.
c. Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Các chủng vi sinh vật kiểm định chuẩn quốc tế ATCC: 3 chủng vi khuẩn Gram – (Escherichia coli ATCC25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, Salmonella. enterica ATCC12228), 3 chủng Gram + (Enterococcuc. faecalis ATCC13124, Stapphylococus aureus ATCC25923, Bacillus cereus ATCC 13245), 1 chủng Nấm men Candida albicans ATCC10231 đƣợc cung cấp bởi viện Kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm quốc gia.
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định đƣợc thực hiện dựa trên phƣơng pháp pha loãng đa nồng độ [12]. Đây là phƣơng pháp thử hoạt tính kháng VSVKĐ và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC (nồng độ ức chế tối thiểu).
Tiến hành thử: lấy 5.12 L dung dịch mẫu thử có nồng độ 10 mg/mL vào hàng đầu tiên có chứa 100 L môi trƣờng LB rồi pha loãng nối tiếp giảm ½ nồng độ vào các hàng có chứa 50 L cho đến khi đạt đƣợc nồng độ là 2 g/ml, thêm 50 L dung dịch vi khuẩn và nấm ở nồng độ 2×104 CFU/mL, ủ ở 37oC. Sau 24 giờ, xác định sơ bộ giá trị MIC bằng quan sát. Giá trị MIC đƣợc xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất gây ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật sau 24 giờ nuôi cấy và đƣợc xác định chính xác dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy quang phổ Bioteck và phần mềm Raw data. Chất đối chứng là kháng sinh Streptomycin và Kanamycin cho các chủng vi khuẩn. Nistatin và cyclohexamide cho nấm.
d.Phương pháp đánh giá độc tế bào
Nguyên lý: Phƣơng pháp MTT (3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) là một phƣơng pháp so màu, đo độ giảm màu vàng của MTT. MTT tham gia phản ứng oxy hoá khử với ty thể của tế bào và tạo thành các formazan dạng tinh thể. Có thể dùng một số dung môi hữu cơ (isopropanol) để vừa phá huỷ màng tế bào và hoà tan các tinh thể formazan, sau đó đo độ hấp thụ quang học của cácdung dịch này ở 570 nm.
- Tính kết quả:
Tính giá trị CS % (% Cell Survival) Giá trị CS (%) đƣợc tính theo công thức:
[ – – ] Trong đó: OD: mật độ quang σ: độ lệch tiêu chuẩn σ đƣợc tính theo công thức: √ ∑ ̅ Trong đó:
xi : giá trị OD tại giếng i ̅: giá trị OD trung bình n: số giếng thử lặp lại
Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ ban đầu của mẫu thử, mẫu nào cho giá trị CS ≤ 50% thì đƣợc đánh giá là có hoạt tính. Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS ≤ 50% ± σ) sẽ đƣợc chọn ra cho thử nghiệm bƣớc tiếp theo hòa tan trong isopropanol.
- Các bƣớc tiến hành:
Tế bào đƣợc nuôi cấy 48 giờ trong môi trƣờng RPMI 1640 hoặc DMEM ở 37oC, 5% CO2 với 10% FBS, penicillin (100 units/mL) và streptomycin sulphate (100 µg/mL). Sau đó chúng đƣợc nuôi cấy trong giếng phiến 96 với thể tích là 200 µL, mật độ 2-5 x 105 tế bào/giếng (tuỳ từng loại tế bào) [14].
Sau 24 giờ, chúng đƣợc thử với hợp chất pha sẵn ở các nồng độ khác nhau trong DMSO.
Sau 72 giờ, cho phản ứng với 0.5 mg/mL µL MTT, ủ 4 giờ ở 37oC và 5% CO2. Sau đó hút bỏ hết môi trƣờng trên bề mặt, kết tủa formazan đƣợc hòa tan trong isopropanol. Độ hấp thụ đƣợc đo ở 570 nm.
Camptothecin đƣợc sử dụng làm đối chứng dƣơng.