5. BỐ CỤC LUẬN VĂN
2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM
2.1.1. Nguyên liệu
Vỏ cây hoa sữa (cây mù cua, mò cua) đƣợc thu hái tháng 11/2017 tại Đà Nẵng (Trƣờng Đại học Sƣ phạm ), rửa sạch, phơi, sấy khô ở nhiệt độ 50-600C rồi xay thành bột mịn (Hình 2.1) để chiết lần lƣợt với các dung môi n–hexane, chloroform, ethyl acetate và methanol.
a. Vỏ cây sau khi phơi khô b. Vỏ cây sau khi xay Hình 2.1. Vỏ cây khô xay thành bột
2.1.2. Hoá chất và thiết bị nghiên cứu
Để thực hiện đề tài này, chúng tôi sử dụng một số hoá chất chính nhƣ :
Acetone CH3COCH3 Chloroform CHCl3 Ethyl acetate CH3COOC2H5 Methanol CH3OH N- hexane C6H14 M ( g/mol ) 58.04 119.38 88.11 32.04 86.18 Độ t.khiết 99.5% 99.0% 99.5% 99.5% 97.0% tos ( 0C ) 56 61 77 65 69
Dung môi dùng để chạy cột chính ( n-hexane ) đƣợc cất lại qua cột Vigereux trƣớc khi sử dụng để loại bỏ tạp chất, chất làm mềm.
Ngoài ra còn có các hóa chất khác dùng để làm khan, pha chế thuốc thử trong định tính các lớp chất và hiện màu bản mỏng.
Sắc kí lớp mỏng (TLC): sử dụng bản mỏng tráng sẵn silicagel Merck 60F254, có độ dày 0.2 mm. Sắc kí cột thƣờng: silicagel cỡ hạt 197-400 mesh ( 0.040 – 0.063 mm).
Bộ chiết soxhlet, thiết bị cô quay chân không, tủ sấy, lò nung, cân phân tích... (phòng thí nghiệm khoa Hoá, trƣờng Đại học Sƣ phạm – Đại học Đà Nẵng), máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS100 Perkin Elmer (Trung tâm khí tƣợng thủy văn quốc gia, đài khí tƣợng thủy văn khu vực Trung Trung Bộ, 660 Trƣng Nữ Vƣơng- Đà Nẵng). Máy đo sắc kí khí kết hợp khối phổ GC-MS ( Trung tâm kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, dƣợc phẩm thành phố Huế - 17 Trƣơng Định Thành phố Huế ).
Cột sắc kí : cột thủy tinh ( có lớp lọc thủy tinh frit ) cao khoảng 45 cm, đƣờng kính trong 3 cm, 4 cm.
Đèn tử ngoại bƣớc sóng λ= 254 nm và 365 nm dùng để soi bản mỏng, máy đo điểm nóng chảy Buchi melting Point B-545 tại khoa Hóa trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Đà Nẵng.
Các thiết bị xác định cấu trúc chất:
+ Phổ khối ESI-MS đƣợc đo trên máy Agilent LC-MSD-Trap SL tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
+ Phổ cộng hƣởng từ hạt nhânNMR đƣợc ghi bằng máy Bruker Avance 500 MHz tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
+ Phổ hồng ngoại FT – IR đƣợc đo dƣới dạng viên nén KBr bằng máy
Shimadzu tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Các phƣơng pháp xác định chỉ tiêu hóa lí
a. Xác định độ ẩm
950-1100C. Tiến hành thí nghiệm với 3 mẫu bột vỏ cây khô và lấy kết quả trung bình. Chuẩn bị các chén sứ có kí hiệu sẵn, các chén sứ đƣợc rửa sạch và đƣợc sấy khô trong tủ sấy, làm nguội đến nhiệt độ phòng, đem cân lại đến khối lƣợng không đổi m1.
Mẫu bột vỏ cây để xác định độ ẩm là mẫu đã qua xử lí. Lấy vào mỗi chén sứ khoảng 3 g bột nguyên liệu (m2) theo kí hiệu của mẫu đã ghi trên chén sứ, sấy ở nhiệt độ trên, cứ sau 5 giờ lại lấy ra để trong bình hút ẩm cho nguội đến nhiệt độ phòng rồi cân, đến khi khối lƣợng mẫu và cốc không đổi m3. Khối lƣợng ẩm của mỗi mẫu là hiệu số giữa khối lƣợng mẫu trƣớc và sau khi sấy m = (m1 + m2) – m3. Độ ẩm trung bình của các mẫu tính ra % theo khối lƣợng mẫu bột khô vỏ cây ban đầu [1, tr. 1300].
Công thức:
* Độ ẩm của mỗi mẫu
W(%) = ( ) 100% 2 3 2 1 m m m m * Độ ẩm trung bình WTB(%) = 5 (%) W 5 1 Trong đó: m1: Khối lƣợng chén sứ (g)
m2: Khối lƣợng mẫu bột khô vỏ cây hoa sữa (g) m3: Khối lƣợng chén sứ và mẫu sau khi sấy (g) W (%): Độ ẩm của mỗi mẫu
Wtb (%): Độ ẩm trung bình
b. Xác định hàm lượng tro bằng phương pháp tro hóa mẫu
Để xác định hàm lƣợng tro và các nguyên tố vô cơ trong cơ thể động vật, thực vật ngƣời ta dùng các phƣơng pháp tro hóa mẫu.
Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp tro hóa mẫu bằng phƣơng pháp khô – ƣớt kết hợp. Các mẫu (khối lƣợng m3) đã xác định độ ẩm ở trên tiếp tục đƣợc sử dụng để tro hóa. Các mẫu đựng trong chén sứ đƣợc đun trên bếp điện, than hóa sơ bộ, sau đó cho vào lò nung và tiến hành tro hoá mẫu ở nhiệt độ 500-5500C trong trong thời gian từ 4 - 6 tiếng, cho đến khi thu đƣợc tro trắng. Các chất hữu cơ bị đốt cháy, trong tro còn lại các chất vô cơ khó bay hơi. Khối lƣợng tro chính là phần chất còn lại sau khi nung [1, tr. 1301].
Lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm, cân lại mẫu đến khối lƣợng không đổi, có khối lƣợng m4.
Công thức tính: % tro = 100% 2 1 4 m m m % tro trung bình = 5 1 % 5 tro Trong đó:
m4: Khối lƣợng chén sứ và mẫu sau khi tro hoá (g)
c. Xác định hàm lượng một số kim loại trong vỏ cây hoa sữa bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử
Tro thu đƣợc sau khi nung đem hòa tan trong dung dịch HNO3 loãng, định mức bằng nƣớc cất và xác định hàm lƣợng kim loại bằng phƣơng pháp đo phổ hấp thụ nguyên tử AAS [1, tr. 1297-1298].
Trong đề tài này chúng tôi đã tiến hành trong điều kiện nhƣ sau : Mẫu sau khi tro hoá đƣợc hoà tan bằng dung dịch HNO3 loãng và định mức đến 200 mL. Lấy dung dịch đã định mức trên đem xác định hàm lƣợng một số kim loại tại Trung tâm khí tƣợng thủy văn Quốc gia - Đài khí tƣợng thủy văn khu vực Trung Trung Bộ - 660 Trƣng Nữ Vƣơng, Đà Nẵng.
2.2.2. Phƣơng pháp chiết mẫu thực vật
Có nhiều cách để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây cỏ, các kĩ thuật chiết tách đều xoay quanh hai phƣơng pháp chính là chiết lỏng –lỏng và chiết rắn - lỏng.
Trong đề tài này chúng tôi sử dụng phƣơng pháp chiết rắn – lỏng với các kĩ thuật chiết soxhlet và ngâm dầm.
Kĩ thuật chiết soxhlet [7, tr.37-40]:
Cân một lƣợng bột vỏ cây hoa sữa (khoảng 5 g/1 mẫu) cho vào bình cầu, cho vào 200 mL lần lƣợt các dung môi n-hexane, chloroform, ethyl acetate, methanol rồi tiến hành chiết soxhlet ở nhiệt độ sôi của dung môi với những thời gian khác nhau: 4h, 6h, 8h, 10h, 12h thu đƣợc các dịch chiết LH x 5, LC x 5, LE x 5, LM x 5. Rót 20 mẫu dịch chiết trên vào các cốc đã đƣợc cân khối lƣợng (mc, gam), sau đó tiến hành để bay hơi tự nhiên đến thể tích 40 mL và tiến hành cân các cốc chứa các dịch chiết ( m5, gam).
m6 = m5-mc với m6 (gam)là khối lƣợng của dịch chiết.
Dùng phƣơng pháp trọng lƣợng khảo sát độ tăng khối lƣợng (∆m) của các dịch chiết sau mỗi 2h chiết để chọn đƣợc thời gian tối ƣu chiết đƣợc nhiều chất nhất với mỗi dung môi chiết.
Kĩ thuật chiết ngâm dầm [7,tr. 35-36]:
Ngâm bột cây trong một bình bằng thủy tinh hoặc bằng thép không rỉ, bình có nắp đậy. Rót dung môi vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của bột cây, giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một ngày hoặc một đêm để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên. Sau đó dung dịch chiết đƣợc lọc qua giấy lọc, thu hồi dung môi sẽ có cao chiết. Tiếp theo, rót dung môi vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết đến khi chiết kiệt mẫu cây. Có thể tăng hiệu quả chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xốc đều lớp bột cây. Mỗi lần ngâm dung môi, chỉ cần 24 giờ là đủ. Vì với một lƣợng dung môi cố định, mẫu chất chỉ hòa tan vào dung môi đạt đến mức bão hòa, không thể hòa tan thêm nhiều hơn.
Trong phạm vi đề tài, chúng tôi thực hiện việc chiết mẫu nhƣ sau: bột cây khô đƣợc chiết với dung môi n–hexane. Dung dịch chiết này đƣợc gộp chung lại, thu hồi dung môi sẽ đƣợc cao n – hexane thƣờng chứa các hợp chất không phân cực hoặc rất ít phân cực. Bột cây còn lại đƣợc chiết tiếp với chloroform, gộp dung dịch chiết
và thu hồi dung môi đƣợc cao chloroform chứa các hợp chất có tính phân cực trung bình. Tiếp theo, bột cây đƣợc chiết tiếp với ethyl acetate thu đƣợc cao ethyl acetate chứa các hợp chất có tính khá phân cực. Cuối cùng, bột cây đƣợc chiết với methanol thu cao methanol chứa các hợp chất có tính phân cực mạnh. Mỗi loại dung môi đƣợc chiết vài lần.
2.2.3. Phƣơng pháp định tính một số lớp chất trong vỏ cây hoa sữa
a. Alkaloid
Để phát hiện sự hiện diện của alkaloid trong vỏ cây hoa sữa, chúng tôi đã áp dụng nguyên tắc thử của Webb, cách thử gồm hai phần nhƣ sau:
- Phần 1: Bột vỏ cây xay nhuyễn (5 g) đƣợc ngâm trong dung dịch Prollius là hỗn hợp gồm chloroform: ethanol 95o: NH4OH đậm đặc theo tỉ lệ thể tích là 8:8:1, môi trƣờng phải có tính base. Ngâm nguội trong 24 giờ, để ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lắc trộn. Lọc và đuổi dung môi đến cạn, thu đƣợc cặn. Hòa tan phần cặn trong dung dịch HCl 1%, đun ấm cho dễ tan. Lọc, lấy dịch lọc để thử nghiệm với hai loại thuốc thử Mayer, Wagner.
- Phần 2: Bột vỏ cây xay nhuyễn (5 g) và dung dịch nƣớc H2SO4 1% đƣợc cho vào bình tam giác và đun nhẹ, trong 1 giờ. Lọc, lấy dịch lọc để thử nghiệm với hai loại thuốc thử Mayer, Wagner.
- Pha thuốc thử và hiện tƣợng:
+ Thuốc thử Mayer : hòa tan 1.36 gam HgCl2 trong 60 mL nƣớc cất và hòa tan 5 gam KI trong 10 mL nƣớc cất. Thuốc thử Mayer gồm hỗn hợp hai dung dịch trên thêm nƣớc cất cho đủ 100 mL.
Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào mẫu dịch lọc ở trên, nếu có alcaloid sẽ xuất hiện kết tủa màu trắng hoặc vàng nhạt.
+ Thuốc thử Wagner: hòa tan 1.27 gam iod I2 và 2 gam KI trong 20 mL nƣớc cất. Thêm nƣớc cho đủ 100 mL.
Nhỏ vài giọt thuốc thử Wagner vào mẫu dịch lọc ở trên, nếu có alkaloid sẽ xuất hiện kết tủa màu nâu.
b. Flavonoid
Cân 5 gam bột vỏ cây hoa sữa cho vào bình tam giác 100 mL có nắp đậy, thêm 50 mL cồn 90˚, đậy kín. Đun cách thủy trong 10 phút, lọc nóng lấy dịch lọc. Cho 1mL dịch chiết vào ống nghiệm rồi đem đi thử với các phản ứng sau: dung dịch NaOH 10%; dung dịch H2SO4 đặc; FeCl3 5%.
Tác dụng với dung dịch H2SO4 đậm đặc: Thêm vài giọt dung dịch H2SO4 đậm đặc vào ống nghiệm chứa dịch lọc. Nếu là flavon, flavonol cho màu vàng đậm đến màu cam và có phát huỳnh quang đặc biệt; nếu là chalcon, auron cho màu đỏ hoặc xanh dƣơng - đỏ; nếu là flavonon cho màu từ cam đến đỏ .
Tác dụng với dung dịch NaOH 1%: Thêm vài giọt dung dich NaOH 1% vào ống nghiệm chứa dịch lọc sẽ có màu từ vàng đến cam - đỏ. Nếu là flavon, isoflavon, chalcon, isoflavanon, flavanon, leucoantocyanidin sẽ có màu vàng. Flavonol cho màu từ vàng đến cam. Auron cho màu tím đến đỏ tím.
Tác dụng với dd FeCl3 5% : hợp chất flavonoid có màu khác nhau từ xanh lục đến xanh đen.
c. Coumarin
Cân 5 gam bột vỏ cây hoa sữa cho vào bình nón 100ml có nắp đậy, thêm 50 mL cồn 90˚, đậy kín. Đun cách thủy trong 5 phút, lọc nóng qua bông, giữ lấy phần dịch. Dịch lọc thu đƣợc đem thử nghiệm với phản ứng mở đóng vòng lacton:
Cho vào 2 ống nghiệm bằng nhau mỗi ống 1ml dịch chiết: + Ống 1: thêm 0.5 mL dung dịch NaOH 10%.
+ Ống 2: để nguyên.
Đun cả 2 ống nghiệm cho đến sôi, để nguội quan sát hiện tƣợng : nếu ống 1 trong hơn ống 2 nhƣng sau đó axit hóa bằng dung dịch H2SO4 loãng mà ống 1 đục hơn ống 2 thì có coumarin.
d. Saponin
Cân 0.1 gam bột vỏ cây hoa sữa cho vào trong ống nghiệm lớn, thêm 5 mL ethanol đun cách thủy 5 phút lọc lấy dịch để thử nghiệm.
+ Ống 1: 5 mL HCl 0.1N (pH=1) + 3giọt dịch chứa mẫu thử + Ống 2: 5 mL NaOH 0.1N (pH=13) + 3 giọt dịch chứa mẫu thử
Bịt miệng 2 ống nghiệm và lắc mạnh cả 2 ống nghiệm trong 1 phút và để yên, quan sát các cột bột bong bóng ở cả 2 ống nghiệm:
Nếu cột bột trong cả 2 ống nghiệm cao bằng nhau và bột có độ bền nhƣ nhau, có thể có saponin triterpenoid. Nếu ống 2 có cột bột cao hơn nhiều so với ống 1 thì có saponin steroid.
e.Đường khử
Cao chiết vỏ cây hoa sữa đƣợc chấm trên một tấm sắc ký lớp mỏng, giải ly. Dung dịch nƣớc 0.1 N AgNO3 (1 mL ), dung dịch 5N NH4OH (5 mL ), phun xịt dung dịch lên bảng mỏng, sấy bản 5-10 phút ở 105oC.
Nếu bản mỏng xuất hiện vết đen xậm thì chứng tỏ có đƣờng khử.
g. Steroid
Để phát hiện sự hiện diện của steroid trong vỏ cây hoa sữa, chúng tôi đã dùng phản ứng Salkowski nhƣ sau:
Hoà tan 2 mg cao chiết clorofom trong cloroform (2 mL ) và nhỏ H2SO4 đậm đặc (1 mL), phản ứng dƣơng tính là dung dịch đổi thành màu đỏ đậm, xanh, xanh-tím.
h. Axit hữu cơ
Cân khoảng 3 gam bột vỏ cây hoa sữa cho vào ống nghiệm to, thêm 10 mL nƣớc cất rồi đem đun sôi trực tiếp 10 phút. Để nguội rồi lọc qua giấy lọc gấp nếp, giữ lấy phần dịch. Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng 2 mL dịch lọc, thêm một ít tinh thể Na2CO3. Quan sát hiện tƣợng, nếu có bọt khí thoát ra có axit hữu cơ.
i. Chất béo
Cân 3 gam bột vỏ cây hoa sữa cho vào bình tam giác 100 mL có nút đậy, thêm 10 mL ether dầu hỏa, đậy nắp, ngâm trong 1 giờ. Lọc qua giấy lọc gấp nếp, giữ lấy phần dịch lọc. Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên mảnh giấy lọc, sấy nhẹ cho bay hơi hết dung môi. Quan sát hiện tƣợng nếu có vết mờ trên giấy có chất béo.
k. Carotene
dịch lọc và cho 2 mL dịch lọc vào ống nghiệm, đun cách thủy thu lấy cặn, sau đó nhỏ vài giọt H2SO4 đậm đặc lắc nhẹ, thấy xuất hiện màu xanh lá thì có carotene.
l. Polysaccairid
Cân 3 gam bột vỏ cây hoa sữa cho vào bình tam giác 100 mL, thêm 20 mL nƣớc cất, đun sôi trong vài phút. Lọc qua giấy lọc vào một cốc thủy tinh 100 mL, thu lấy phần dịch lọc và đem đi định tính bằng cách chia dịch chiết vào 3 ống nghiệm:
+ Ống 1: 2 mL dịch chiết + 5 giọt thuốc thử Lugol. + Ống 2: 2 mL nƣớc cất + 5 giọt thuốc thử Lugol. + Ống 3: 2 mL dịch chiết.
- Pha thuốc thử và hiện tƣợng:
Thuốc thử Lugol: hòa tan 0.5 gam KI + 1 gam I2 trong 5 mL nƣớc cất, lắc cho tan hết rồi chuyển toàn bộ vào bình định mức 100 mL và thêm nƣớc cất đến vạch 100 mL
Nếu ống 1 đậm hơn ống 2 và 3 thì có polysaccarid.
m. Iridoid
Cân 3 gam bột vỏ cây hoa sữa ngâm trong 30 mL dung dịch HCl 1% trong 5 giờ. Lọc, lấy dịch lọc thử nghiệm với thuốc thử Trim-Hill.
Thuốc thử Trim-Hill: CH3COOH (10 mL), dung dịch nƣớc 0.2% CuSO4 (1 mL), HCl đặc (0.5 L).
Lấy 1 mL dịch lọc cho vào ống nghiệm, nhỏ 2-3 giọt thuốc thử Trim-Hill. Kết quả dƣơng tính là khi đun nhẹ sẽ xuất hiện màu xanh dƣơng.
n. Polyphenol
Cân 1 gam bột vỏ cây hoa sữa cho vào bình tam giác dung tích 50 mL, thêm 20 mL nƣớc cất. Đun sôi trong 2 phút. Để nguội rồi đem lọc thu đƣợc dịch đem thử nghiệm với dung dịch FeCl3 5% và chì axetat 10%.
+ Lấy 2 mL dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5% nếu dung dịch chuyển sang màu xanh thẫm thì có polyphenol.
+ Lấy 2 mL dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch chì axetat 10% nếu xuất hiện kết tủa bông vàng thì có polyphenol.