Luận văn thạc sĩ Kỹ thuật hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cùa tinh dầu lá chi Citrus

- Phân tích định tính và định lượng thành phần hóa học của các mẫu tinh dầu thu được bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS.. - Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của các mẫu tinh

-o0o -

LÊ HỮU THÀNH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ

HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA TINH DẦU LÁ CHI Citrus

Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, 07/2019

-o0o -

LÊ HỮU THÀNH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ

HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA TINH DẦU LÁ CHI Citrus

Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, 07/2019

Cán bộ hướng dẫn khoa học : PGS.TS NGUYỄN THỊ LAN PHI

2 ….PGS.TS Nguyễn Thị Phương Phong 3 ….PGS.TS Trần Ngọc Quyển 4 ……….TS Hà Cẩm Anh 5 ……….TS Lê Vũ Hà

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

KHOA

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: … LÊ HỮU THÀNH MSHV:….1570181 Ngày, tháng, năm sinh: ……15/09/1992 Nơi sinh:….Đồng Nai Chuyên ngành: ……Kỹ thuật Hóa học Mã số : 60520301

I TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC

CỦA TINH DẦU LÁ CHI Citrus

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Tách chiết tinh dầu lá thuộc chi Citrus bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi

nước - Phân tích định tính và định lượng thành phần hóa học của các mẫu tinh dầu thu được

bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) - Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của các mẫu tinh dầu bằng phương pháp sử dụng

DPPH và FTC - Khảo sát khả năng kháng khuẩn của các mẫu tinh dầu

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ :……… 13/08/2018 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:………… 02/06/2019 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN :…… PGS.TS Nguyễn Thị Lan Phi

Tp HCM, ngày tháng năm 2019

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Họ tên và chữ ký)

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên và chữ ký)

TRƯỞNG KHOA….………

Trước tiên, con xin cảm ơn gia đình thân yêu, đặc biệt con xin bày tỏ niềm kính yêu sâu sắc đến cha mẹ - người luôn đứng sau âm thầm che chở, nâng đỡ con về mặt tinh thần cũng như vật chất để cho con cón được ngày hôm nay

Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới PGS.TS Nguyễn Thị Lan Phi – người cô luôn hết lòng tận tụy với sinh viên Cô đã dẫn dắt, cho em những lời khuyên quý báu, luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện trong suốt quá trình thực hiện đề tài để hoàn thành tốt bài luận văn này

Các thầy cô khoa Kỹ thuật Hóa Học đã giúp đỡ cho em nắm vững hơn về các phương pháp thí nghiệm và truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích cả về lý thuyết lẫn thực hành

Cảm ơn các bạn làm việc chung đã chia sẻ, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các anh chị và bạn bè đã quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Chân thành cảm ơn Tp HCM, tháng 07 năm 2019

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Trong nghiên cứu này, tinh dầu lá chi Citrus từ ba miền đất nước Việt Nam được chiết

xuất bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Mỗi loại tinh dầu có đặc trưng riêng về thành phần hóa học, khả năng kháng oxy hóa và khả năng kháng khuẩn Phân tích thành phần hóa học của các loại tinh dầu bằng GC-MS cho thấy sự hiện diện của nhiều hợp chất, trong đó có các hợp chất chính như α-pinene (0,31 – 1,79%), β-pinene (1,69 – 19,27%), myrcene (0,32 – 4,73%), limonene (2,21 – 30,11%), γ-terpinene (0,24 – 4,34%), β-caryophyllene (0,30 – 6,77%), citronellal (0,51 – 32,38%), neral (0,08 – 11,55%), geranial (1,31 – 17,73%) và linalool (1,176 – 5,23%) Cả tám loại tinh dầu đều cho thấy khả năng kháng oxy hóa và kháng khuẩn mạnh Thử nghiệm khả năng kháng oxy hóa sử dụng hai phương pháp DPPH và FTC đều cho thấy tinh dầu lá chanh Long An cho khả năng kháng oxy hóa mạnh nhất với giá trị IC50 lần lượt là 1,21mg/ml với phương pháp DPPH và 30,65±0.201mg/ml với phương pháp FTC , tiếp đến là tinh dầu lá cam xoàn và bưởi Tân Triều Đối với khả năng kháng khuẩn, tinh dầu lá bưởi Đoan Hùng có khả năng khuáng khuẩn cao nhất trên các chủng vi khuẩn

thử nghiệm, đường kính vòng kháng khuẩn đối với S.aureus, B.cereus, S typhimurium,

P.aeruginosa lần lượt là 20,17±0,29mm, 40,17±0,29mm, 30,33±0,29mm, 45,17±0,29mm, và giá trị MIC lần lượt là 21mg/ml, 1,31mg/ml, 1,31mg/ml,

1,31mg/ml Kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng ứng dụng của tinh dầu lá chi Citrus

trong công nghiệp vào các lĩnh vực như hương liệu, chất bảo quản công nghiệp hay mỹ phẩm và dược phẩm

ABSTRACT

In this study, Citrus leaf oil from three regions of Viet Nam was extracted by

hydro-distillation method The essential oils were characterized for their chemical compositions, antioxidant and antimicrobial activities GC-MS analysis of the chemical compositions of the isolated essential oils revealed the presence of many compounds including α-pinene (0,31 – 1,79%), β-pinene (1,69 – 19,27%), myrcene (0,32 – 4,73%), limonene (2,21 – 30,11%), γ-terpinene (0,24 – 4,34%), β-caryophyllene (0,30 – 6,77%), citronellal (0,51 – 32,38%), neral (0,08 – 11,55%), geranial (1,31 – 17,73%) and linalool (1,176 – 5,23%) All eight essential oils show strong antioxidant and antimicrobial activities For antioxidant capacity, two methods DPPH and FTC was used, both methods showed that Long An’s lemon leaf oil gave the strongest antioxidant with IC50 values of 1.21mg/ml with DPPH method and 30,65 ± 0.201mg/ml with FTC method, followed by Xoan’s orange and Tan Trieu’s pomelo leaf oils For antimicrobial capacity, Doan Hung’s pomelo leaf oil gave the strongest

antimicrobial on strains tested, antimicrobial diameters for S.aureus, B.cereus, S

typhimurium, P.aeruginosa are 20,17±0,29mm, 40,17±0,29mm, 30,33±0,29mm,

45,17±0,29mm and the minimal inhibition capacity (MIC) are 21mg/ml, 1,31mg/ml,

1,31mg/ml, 1,31mg/ml The results of this study show that the citrus leaf oils could be

widely used as flavoring and preservatives in food, cosmetic and pharmaceutical industries

LỜI CAM ĐOAN

Luận văn này là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Nguyễn Thị Lan Phi Các số liệu, những kết luận nghiên cứu được trình bày trong luận văn này hoàn toàn trung thực

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này

Học viên

Lê Hữu Thành

1.1.2 Phân loại và phân bố chi Citrus - 4 -

1.1.3 Tình hình sản xuất chi Citrus ở Việt Nam và trên thế giới - 7 -

1.1.4 Ứng dụng của tinh dầu thuộc chi Citrus – họ Rutaceae - 8 -

1.2 Tinh dầu lá chi Citrus - 10 -

1.3.5 Các phương pháp mới - 17 -

1.4 Phương pháp phân tích - 18 -

1.4.1 Phương pháp phân tích sắc ký khí (GC) - 18 -

1.4.2 Phương pháp phân tích sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) - 19 -

1.4.3 Phương pháp quang phổ hấp thu UV-VIS - 20 -

1.5 Gốc tự do và hoạt tính chống oxy hóa của tinh dầu - 21 -

1.5.1 Khái niệm gốc tự do - 21 -

1.5.2 Tác động của gốc tự do lên con người - 21 -

1.5.3 Chất chống oxy hóa - 22 -

1.5.4 Phương pháp sử dụng DPPH - 23 -

1.5.5 Phương pháp sử dụng Ferric Thiocyanat (FTC) - 24 -

1.6 Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu - 24 -

1.6.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu - 24 -

2.3 Chiết tách tinh dầu từ lá - 31 -

2.4 Xác định tỉ trọng của tinh dầu - 32 -

2.5 Phân tích thành phần hóa học của tinh dầu - 33 -

2.6 Đánh giá khả năng kháng oxy hóa của tinh dầu - 35 -

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN - 41 -

3.1 Khảo sát khả năng tách chiết tinh dầu từ lá chanh bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước - 41 -

3.2 Tỉ trọng của tinh dầu lá chi Citrus - 42 -

3.3 Thành phần hóa học của tinh dầu lá chi Citrus - 42 -

3.3.1 Thành phần hóa học thuộc nhóm Monoterpene - 42 -

3.3.2 Thành phần hóa học thuộc nhóm Sesquiterpene - 45 -

-DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Tóm tắt các đặc điểm chính để phân loại các loài Citrus 6

Bảng 1.2 Các chỉ số hóa lý của tinh dầu 11

-Bảng 1.3 Các thành phần dễ bay hơi chính từ lá chanh (Citrus limetta), cam (Citrus sinensis) và bưởi (Citrus maxima) - 12 -

Bảng 1.4 Thành phần hóa học tinh dầu lá chanh (Citrus aurantifolia) 12

Bảng 2.1 Các loại lá cam, chanh, bưởi và ký hiệu 29

Bảng 2.2 Các hóa chất đã sử dụng 30

Bảng 2.3 Thể tích dung dịch BHT 1000µM 36

Bảng 3.1 Tỉ trọng tinh dầu các loại lá thuộc chi Citrus 42

Bảng 3.2 Thành phần hóa học thuộc nhóm monoterpene 43

Bảng 3.3 Thành phần hóa học thuộc nhóm Sesquiterpene 45

Bảng 3.4 Thành phần hóa học thuộc nhóm Aldehyde 46

Bảng 3.5 Thành phần hóa học thuộc nhóm Alcohol 47

Bảng 3.6 Thành phần hóa học thuộc nhóm Esters 48

Bảng 3.7 Thành phần hóa học thuộc nhóm Oxide 48

Bảng 3.8 Khảo sát đường chuẩn ở độ hấp thu cực đại 513nm 50

-Bảng 3.9 Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) và MIC (mg/ml) của tinh dầu lá chi Citrus đối với S.aureus - 54 -

Bảng 3.10 Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) và MIC (mg/ml) của tinh dầu lá chi Citrus đối với B.cereus - 55 -

Bảng 3.11 Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) và MIC (mg/ml) của tinh dầu lá chi Citrus đối với S typhimurium - 56 -

Bảng 3.12 Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) và MIC (mg/ml) của tinh dầu lá chi

Citrus đối với P.aeruginosa 57

-DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Sản lượng các loại trái cây trên toàn thế giới 7

Hình 1.2 Sản lượng trái cây thuộc chi Citrus của các quốc gia năm 2009 8

Hình 1.3 Thiết bị sắc ký khí 19

Hình 1.4 Cơ chế phản ứng của gốc tự do DPPH và chất kháng oxy hóa 23

Hình 2.1 Quy trình thí nghiệm 28

Hình 2.2 Thiết bị chưng cất lôi cuốn hơi nước sử dụng ống Clavenger 32

Hình 2.3 Sắc ký đồ của dãy ankan và cấu tử đang xét đến chỉ số lưu 34

Hình 2.4 Quy trình khảo sát khả năng kháng oxy hóa của tinh dầu 35

Hình 3.1 Hiệu suất tách chiết tinh dầu theo thời gian 41

Hình 3.2 Độ hấp thu của dung dịch DPPH tại các bước sóng từ 380 800nm 49

Hình 3.3 Khảo sát đường chuẩn ở độ hấp thu cực đại của DPPH ở 513nm 50

Hình 3.4 Nồng độ tinh dầu ức chế 50% lượng chất oxy hóa 51

Hình 3.5 Nồng độ tinh dầu ức chế 50% lượng chất oxy hóa 53

-DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

UV – VIS Quang phổ tử ngoại – khả kiến

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Các hợp chất tự nhiên nói chung, các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học nói riêng đang đóng vai trò ngày càng quan trọng trong đời sống, là nguồn cung cấp nguyên liệu phong phú cho các ngành công nghiệp, nông nghiệp, mỹ phẩm, thực phẩm,… đặc biệt là trong y học, chúng đang là mục tiêu nghiên cứu và phát triển của ngành công nghiệp dược vì nó có nhiều tác dụng tốt trong việc điều trị bệnh và hầu như không có các phản ứng phụ sau sử dụng như một số thuốc tổng hợp khác

Việt Nam với điều kiện thiên nhiên nhiệt đới rất thuận lợi cho việc hình thành và phát

triển các hệ thực vât, trong đó các loại cây có chứa tinh dầu Họ Rutaceae (họ Cam

quýt) là một họ thực vật lớn, chứa rất nhiều vitamin, có tiềm năng lớn về tinh dầu Các thành phần của tinh dầu chủ yếu là thuộc nhóm monoterpene hay sesquiterpene [18,54] Tinh dầu được chiết xuất từ nhiều bộ phận của cây như: hoa, lá, thân, quả của cây, được sử dụng nhiều trong thực phẩm, vệ sinh, mỹ phẩm và dược phẩm cho khả năng kháng nấm, kháng khuẩn, chống ung thư, chống oxy hóa [41,55] Song các thực

vật thuộc chi Citrus chưa được khai thác triệt để và hầu như chỉ sử dụng múi của các

loại quả này để ăn, còn các bộ phận khác như vỏ, hoa, lá chưa được sử dụng nhiều Vì vậy, hàng năm chúng ta còn phải nhập một lượng tinh dầu khá lớn để đáp ứng nhu cầu tiêu thụ Ngày nay, trước sự phát triển của khoa học kĩ thuật, thì việc tận dụng những

bộ phận dư thừa này đang được chú ý đến Lá cây thuộc chi Citrus có nhiều công dụng

chữa bệnh như: thuốc trị sốt rét, cảm cúm, hen phế quản, ho gà, các bệnh ngoài da,…

Một số nghiên cứu gần đây cho thấy trong lá cây thuộc chi Citrus có nhiều hợp chất tự

nhiên có hoạt tính hóa học cũng như sinh học như khả năng chống oxy hóa, kháng ung thư, kháng nấm, kháng vi sinh vật,…Ở Việt Nam những nghiên cứu về tinh dầu ở lá

Citrus chưa nhiều, chủ yếu là những nghiên cứu về tinh dầu vỏ

Xuất phát từ thực tiễn trên, tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt

tính sinh học của tinh dầu lá chi Citrus”, nhằm cung cấp thêm các kiến thức căn bản

trong nghiên cứu tinh dầu lá chi Citrus, góp phần định hướng sử dụng các sản phẩm từ tinh dầu lá chi Citrus vào thực tiễn, phục vụ đời sống

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Nghiên cứu định tính và định lượng thành phần hóa học của các mẫu tinh dầu lá các

loại cây thuộc chi Citrus

- Nghiên cứu khả năng kháng oxy hóa của các mẫu tinh dầu lá các loại cây thuộc chi

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Khảo sát các điều kiện tách tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước - Tách tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước sử dụng ống

Clevenger ở điều kiện tối ưu - Phân tích và so sánh thành phần hóa học của các mẫu tinh dầu lá bằng phương pháp

sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) - Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của các mẫu tinh dầu bằng phương pháp DPPH và

FTC - Khảo sát khả năng kháng khuẩn của các mẫu tinh dầu bằng phương pháp pha loãng

và phương pháp khuếch tán

4 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu tinh dầu lá các loại cây thuộc chi Citrus trồng ở các tỉnh miền Bắc, Trung, Nam

Việt Nam

Bảng Các loại lá cam, chanh, bưởi

Chanh Long An Citrus aurantifolia Swingle Huyện Bến Lức, tỉnh Long An

Chanh Đà Lạt Citrus limonia Osbeck Thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng Chanh Đào Citrus hybrid – Citrus spp Thành phố Thái Bình, tỉnh Thái Bình

Cam xoàn Citrus sinesis Osbeck Tỉnh Vĩnh Long Cam Vinh Citrus sinesis Osbeck Huyện Quỳ Hợp, tỉnh Nghệ An Bưởi Tân Triều Citrus grandis Osbeck Huyện Vĩnh Cửu, tỉnh Đồng Nai

Bưởi Thanh Trà Citrus grandis Osbeck Quận Thủy Biều, thành phố Huế

Bưởi Đoan Hùng Citrus grandis Osbeck Huyện Đoan Hùng, tỉnh Phú Thọ

5 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước sử dụng ống Clevenger để tách tinh dầu lá

các cây thuộc chi Citrus

- Phân tích một số thành phần chính trong tinh dầu bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS), định tính bằng việc so sánh chỉ số lưu, định lượng bằng phương pháp nội chuẩn Từ đó so sánh về thành phần tinh dầu các loại và đưa ra nhận xét và kiến nghị

- Hoạt tính kháng oxy hóa được xác định bằng phương phấp DPPH và Ferric Thiocyanate, so sánh khả năng kháng oxy hóa của các mẫu tinh dầu và đưa ra nhận xét, kiến nghị

- Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn các loại tinh dầu bằng phương pháp khuếch tán và pha loãng tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu sơ lược về chi Citrus – họ Rutaceae

Họ Rutaceae còn gọi là họ Cam – quýt hay Cửu lý hương, tên thường gọi của các loài

cây có múi Cây bụi hoặc gỗ, lá đơn hoặc lá kép (có khi chỉ có một lá chét), mọc cách hay mọc đối Họ Rutaceae rất gần với họ Xoài (Anacardiaceae) và họ Thanh thất (Simaroubaceae) Hoa thường lưỡng tính [1]

xốp, vỏ quả trong mỏng và dai; từ vỏ quả trong mọc ra nhiều lông chứa đầy nước

ngọt Hạt đôi khi có nội nhũ, hạt đa phôi ở Citrus [4]

- Cơ cấu học: Túi tiết tinh dầu kiểu tiêu ly bào trong tất cả các mô, nhất là phiến lá,

vách bầu, vỏ quả [4] 1.1.2 Phân loại và phân bố chi Citrus

Họ Rutaceae là họ thực vật lớn trên thế giới với khoảng 160 chi và 1650 loài, được

phân bố rộng rãi trong các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và các vùng khí hậu ôn hòa ấm áp, đặc biệt có nhiều ở Nam Phi, Australia, Malaysia, Nhật, Trung Quốc, Ấn Độ,… [51]

Ở Việt Nam họ Rutaceae có gần 30 chi và 110 loại [2]:

- Cam chanh (Citrus aurantium L) - Cam sành (Citrus nobilis Lour.) - Quýt (Citrus reticulata Blco.) - Bưởi (Citrus grandis (Linn.) Osbeck) - Chanh (Citrus aurantifolia (Christm, & Panz.) Sw.) - Phật thủ (Citrus medica L var digitata Riss)

- Thanh yên (Citrus medica subsp bajoura Bonavia) - Quất (Citrus japonica Thunb)

Chi Citrus phân bố rộng rãi trên toàn thế giới Theo Iwamasa, chi Citrus có nguồn gốc

gần Assam ở Ấn Độ khoảng 30 đến 40 triệu năm trước [35] Những trái cây thuộc chi

Citrus trải dài từ phía Tây, lan sang khu vực Trung Đông và Địa Trung Hải, vượt qua

Đại Tây Dương và cuối cùng tới Mỹ và các nước thuộc vùng Tây Ấn Một phần lan rộng về phía Đông, qua Thái Lan, Malaysia, Trung Quốc và các nước Đông Nam Á

khác Ngày nay, hầu hết các loại trái cây thuộc chi Citrus được trồng rộng rãi ở các

vùng ôn đới và nhiệt đới ở cả hai nửa bán cầu

Các loại thực vật thuộc chi Citrus có thể nhân giống và tạo ra giống mới bằng nhân

giống vô tính hay cây con tự nhiên, bằng sự lai giống và đột biến Ngoài những hình thức di truyền tự nhiên, nhiều giống lai nhân tạo mới được tạo ra bởi những nhà nhân

giống Citrus Chi Citrus gồm khoảng trên dưới 20 loài Việc phân loài trong chi Citrus

hiện nay khá phức tạp và ngày càng mơ hồ

Các nguyên tắc phân loại chi Citrus được biết đến nhiều nhất là của Swingle và Tanaka Theo Swingle, chuyên gia nổi tiếng về Citrus, cho rằng giống Citrus gồm 16

loài và 8 chủng loại khác nhau bắt nguồn từ vùng New Guinea – Melanesia [62], nhưng lại có một sự khác biệt về số loài được phân loại theo Tanaka là 159 loài [64,65] Đến nay người ta đã biết có rất nhiều phân loài, nhiều dạng trung gian gữa các loài và nhiều giống lai tạo

Thực vật thuộc chi Citrus ở Việt Nam theo Phạm Hoàng Hộ mô tả khoảng 24 loài [5], còn theo danh mục các loài thực vật Việt Nam thì chi Citrus có 15 loài [7], phân bố ở

khắp nơi trong cả nước

Ở Việt Nam điều kiện khí hậu và đất đai rất thuận lợi cho việc phát triển các loại Citrus

nên được trồng rộng rãi khắp các vùng trung nước Các loại chính đều có ở Việt Nam Trong đó cam sành, cam chanh, bưởi, quýt được trồng nhiều ở Việt Nam suốt từ Bắc đến Nam Trong các gia đình nông thôn ở Việt Nam hay trong các nông trường lớn thuộc các vùng như Bố Hạ (Hà Bắc), Hòa Bình, Hà Tây, Nghệ An, Hà Tĩnh, Nha Trang, vùng đồng bằng sông Cửu Long,…

Bảng 1.1 Tóm tắt các đặc điểm chính để phân loại các loài Citrus

Phật thủ Trên trắng dưới đỏ To, cành Có ngón Vàng

1.1.3 Tình hình sản xuất chi Citrus ở Việt Nam và trên thế giới

Bốn loại trái cây được phổ biến rộng rãi trên toàn thế giới bao gồm trái cây thuộc chi

Citrus, chuối, táo và nho Năm 1991, trái cây thuộc chi Citrus đã thống trị trên thị

trường trái cây thế giới Hiện nay có khoảng 1,6 triệu hecta diện tích đất trồng cam

quýt thuộc 49 nước trên thế giới Tổng sản lượng trái cây thuộc chi Citrus năm 2008 là

79,6 triệu tấn Trong đó chiếm sản lượng cao nhất là Trung Quốc, tiếp đến là Brazil,

Mỹ, EU,… Tinh dầu thuộc chi Citrus cũng là nguồn nguyên liệu phổ biến cho nước

hoa [55]

Hình 1.1 Sản lượng các loại trái cây trên toàn thế giới

Hình 1.2 Sản lượng trái cây thuộc chi Citrus của các quốc gia năm 2009

Theo thống kê của Hiệp hội trái cây Việt Nam năm 2003, nước ta có diện tích trồng

cây thuộc chi Citrus là 78.649 hecta, đạt sản lượng 497.326 tấn/năm Đến năm 2005,

sản lượng tăng đến 109.813,55 tấn/năm

1.1.4 Ứng dụng của tinh dầu thuộc chi Citrus – họ Rutaceae

Hoạt tính sinh học của tinh dầu bao gồm: hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng sâu, kháng oxi hóa, kháng tế bào, … đã được nghiên cứu rất nhiều, trên nhiều lại tinh dầu khác nhau [12]

Nước trái cây cô đặc thường bị mất mùi sau quá trình chế biến vì thế nhà sản xuất thường cho thêm hương vỏ quả và phần hương thu hồi trong nước quả để nước trái cây đạt được chất lượng như nước trái cây tự nhiên Hiện nay nhiều nước trên thế giới đã

sử dụng tinh dầu Citrus như cam, chanh trong công nghiệp sản xuất nước uống như

soda, xiro Rượu cam, rượu chanh, rượu quýt có tác dụng kích thích khẩu vị, hiện nay rất phổ

biến, vì thế nên tinh dầu chi Citrus đã được dùng ngày càng phổ biến trong công nghiệp sản xuất rượu Ngoài ra, tinh dầu chi Citrus cũng được sửu dụng trong các

ngành công nghiệp sản xuất bánh, kẹo, kem, chè nhằm làm tăng hương vị sản phẩm, giúp cho sản phẩm có hương bị đặc trưng và hấp dẫn hơn

Quả cam, chanh là một phần quen thuộc trong chế độ ăn của con người Chúng chứa nhiều vitamin C và các thành phần dinh dưỡng như kali, acid folic, pectin và chất xơ là rất quan trọng cho sức khoẻ của con người [63] Trong dân gian, quả chanh được dùng làm thuốc giải nhiệt, giúp ăn ngon miệng, lợi tiêu hoá, còn dùng làm thuốc trị ho, long đờm, trị nôn ra mật Lá chanh dùng làm gia vị và cũng được dùng làm thuốc trị sốt rét dai dẳng, cảm cúm, hen phế quản, ho gà và trị bệnh ngoài da, rắn cắn Người ta dùng

nước hãm lá uống để trị cao huyết áp, còn lá dùng làm thuốc trị giun Loài cam (Citrus

sinensis) cũng được dùng giải nhiệt, trị sốt, điều trị chứng xuất tiết và giúp ăn ngon

miệng Chỉ ăn toàn cam trong 3 ngày liền có tác dụng như một liều thuốc tẩy độc rất tốt Uống nước vỏ cam nấu chín có tác dụng kích thích nội tiết nước mật, làm tăng nhu động ruột, chống bệnh táo bón [2]

Năm 1983, Wattenberg [68] trong thử nghiệm trên chuột chủng Sprague – Dawley có sử dụng tinh dầu vỏ cam với 5% limonene đã xác định khả năng ức chế sự phát triển khối u của ung thư vú khi cho sử dụng DMBA (7,12-Dimethylbenz(a) anthracene) hóa chất gây khối u vú Ngoài ra khi sử dụng khẩu phần ăn trên động vật có chứa limonene trong tinh dầu vỏ cam, các nhà khoa học đã chứng minh sự tác động ức chế phát triển của dòng tế bào ung thư tụy trên chuột túi má Syruan, ức chế phát sinh ung thư gan và phổi cả ở giai đoạn khởi đầu và phát triển, ức chế sự phát triển khối u và canxinôm trên chuột cái chủng A/J khu luồn ống qua miệng cho chuột tinh dầu có chứa limonene 1

giờ trước khi sử dụng NDEA (N-nitrosodiethylamine)

Fatima Alaba Ibrahim và các cộng sự để thử nghiệm khả năng làm giảm đường huyết

khi sử dụng tinh dầu lá Citrus aurantifolia trên chuột Cụ thể sử dụng tinh dầu Citrus

aurantifolia trong màng bụng (100 mg / Kg b.wt.) cho chuột bị tăng đường huyết trong

14 ngày làm giảm đáng kể lượng đường máu và gan, trong khi nồng độ glycogen ở gan tăng đáng kể [34]

1.2 Tinh dầu lá chi Citrus

Tinh dầu là những hỗn hợp khác nhau của các chất bay hơi có nguồn gốc chủ yếu từ thực vật Các chất này thường có mùi thơm và thành phần hóa học, cấu tạo, tính chất, điểm chảy, điểm sôi, độ tan trong nước hay trong các dung môi rất khác nhau; phần lớn không tan, chính xác là ít hay rất ít tan trong nước Các thành phần của tinh dầu hòa tan lẫn nhau Nếu một tinh dầu nào đó là một khối đồng nhất (một pha) sẽ bắt đầu sôi ở một nhiệt độ phụ thuộc thành phần và tỷ lệ các hợp chất có trong nó [12]

Tinh dầu từ lâu đã được loài người biết đến, ngay từ thời thượng cổ người ta đã biết đến và sử dụng các loại cây có tinh dầu ở dạng phơi khô, thời kỳ trung cổ khoảng thế kỷ thứ 15 tinh dầu ngày càng phổ biến, từ thế kỷ thứ 15 đến thế kỷ thứ 17 tinh dầu đã được sử dụng để làm thơm cho tóc và da mặt, dùng để chữa bệnh và dùng trong đời sống hàng ngày của con người Từ thế kỷ thứ 17 đến thế kỷ thứ 19, tinh dầu được dùng nhiều để trang điểm, làm thuốc và dùng trong công nghiệp với phạm vi rộng hơn Từ thế kỷ 20 đến những năm đầu của thế kỷ 21, cùng với sự tiến bộ của nhân loại và sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, nghành công nghiệp sản xuất tinh dầu đã dần phát triển, tinh dầu đã trở thành một sản phẩm không thể thiếu trong đời sống của con người và được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp như hương liệu, thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm [9]

Hầu như tất cả các loài thuộc chi Citrus đều có chứa tinh dầu trong vỏ quả, trong lá và

hoa Hàm lượng tinh dầu trong vỏ quả thường khá cao (thay đổi thừ 1,5-6,5% so với sinh khối tươi của vỏ), trong lá và hoa thường ít hơn Trong lá chanh tươi chứa 0,2-

0,3% tinh dầu, trong lá bưởi tươi có hàm lượng tinh dầu từ 0,1-0,3% còn hàm lượng

tinh dầu trong vỏ quả của loài cam Thanh Yên (Citrus medica) lại rất cao (6,5-9,0%) so

với trọng lượng vỏ tươi [9] Trên thế giới [20, 30] và trong nước [10] đã có nhiều công trình nghiên cứu về hàm lượng tinh dầu và thành phần hoá học của tinh dầu các loài

thuộc chi Citrus nhưng chủ yếu là tinh dầu từ vỏ quả

1.2.1 Tính chất hóa lý

Tinh dầu thường tồn tại dạng thể lỏng ở nhiệt độ thường, mùi thơm, ít khi có màu trừ tinh dầu chứa aluzen có màu xanh.Tinh dầu có tỉ trọng thấp so với nước, chỉ số khúc xạ cao Tinh dầu bay hơi được, ít tan trong nước nhưng làm cho nước có mùi thơm, tinh dầu là hỗn hợp nên không có nhiệt độ sôi nhất định, tinh dầu tan trong cồn, ete, dung môi hữu cơ và các chất béo [4]

Bảng 1.2 Các chỉ số hóa lý của tinh dầu [6]

Tính chất Tinh dầu cam Tinh dầu chanh Tinh dầu bưởi

Cảm quan

Chất lỏng vàng đến vàng nâu, mùi thơm, vị không đắng

Chất lỏng vàng, mùi thơm chanh

Chất lỏng vàng, mùi thơm

Tỉ trọng (15o/15o) 0,848 – 0,853 0,8548 – 0,8550 0,835 – 0,845

Góc quay cực 20o +91,30 - +99,00 +56,00 - +69,62 +84,36 - +99,00

Chỉ số khúc xạ 20o 1,473 – 1,475 1,4730 – 1,4733 1,4730 – 1,4795

1.2.2 Thành phần hóa học

Thành phần chính trong hầu hết các nghiên cứu về tinh dầu vỏ cũng như lá các cây

thuộc chi Citrus là limonene [25] , geranial và neral [47] Bảng 1.3 cho thấy các thành phần dễ bay hơi chính của lá cây thuộc chi Citrus [39]

Bảng 1.3 Các thành phần dễ bay hơi chính từ lá chanh (Citrus limetta), cam (Citrus

sinensis) và bưởi (Citrus maxima)

M L Lota và các cộng sự đã khảo sát thành phần hóa học tinh dầu các loại lá chanh

Citrus aurantifolia khác nhau ở cùng điều kiện Kết quả phân tích GC/MS đưa ra một

số thành phần chính các mẫu tinh dầu lá chanh được trình bày trong Bảng 1.4

Bảng 1.4 Thành phần hóa học tinh dầu lá chanh (Citrus aurantifolia)

Cơ chế dẫn tới các hoạt tính của thành phần hóa học của tinh dầu chưa được nghiên cứu đầy đủ Các nghiên cứu trước đây cho rằng linalool thể hiện khả năng ức chế peroxy và giúp cho tinh dầu có hoạt tính chống oxy hóa [33] Ngoài ra, cũng có nhiều nghiên cứu cho thấy limonene đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính chống oxy hóa

của tinh dầu chi Citrus Trong các nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn, một số nghiên

cứu cũng cho thấy sự hiện diện của terpenes trong tinh dầu dẫn đến hoạt tính kháng

khuẩn của tinh dầu chi Citrus Các cấu tử này vượt qua màng tế bào, thâm nhập vào

bên trong của tế bào và tương tác với các cơ quan bên trong [24] Một số tác giả khác cho thấy sự hiện diện của D-limonene có độc tính tiếp xúc mạnh với một số loại côn

trùng [19], linalool hay citral làm cho tinh dầu chi Citrus có hoạt tính kháng nấm [16]

Citral có thể hình thành một phức hợp chuyển điện tử, với một electron được chuyển cho tế bào nấm, làm chết tế bào nấm [40]

1.3 Các phương pháp chiết tách tinh dầu [3,11,12]

1.3.1 Phương pháp cơ học

Phương pháp cơ học bao gồm: vắt, bóp, bào, nạo, xắt, ép, tương đối đơn giản dùng để tách tinh dầu ở dạng tự do bằng cách tác dụng lực cơ học lên nguyên liệu Phương pháp

cơ học chủ yếu dùng để tách tinh dầu trong các loại vỏ quả thuộc họ Rutaceae như

cam, chanh, quýt, bưởi, tắc vì ở những loại nguyên liệu này tinh dầu thường phân bố chủ yếu ở lớp tế bào mỏng trong biểu bì Khi dùng lực cơ học tác dụng vào vỏ quả, các tế bào này sẽ vỡ ra và giải phóng tinh dầu Có thể ép tinh dầu bằng tay hoặc sử dụng máy

- Vắt, bóp: Quả được cắt đôi hoặc cắt, ngâm, tách thịt quả, ngâm vỏ vào nước thường hoặc nước muối 5% Dùng lực cơ học vắt bóp cho tinh dầu thoát ra thấm vào bông hoặc bọt bể, khi bông đã bão hòa tinh dầu, vắt ráo miếng bông để lấy tinh dầu Sau cùng đem lọc, lắng, sấy thu được tinh dầu thành phẩm

- Bào, nạo: Dùng nguyên quả rồi xát mặt ngoài của vỏ vào bề mặt nhám, túi tinh dầu sẽ vỡ ra, tinh dầu thoát ra ngoài, sau đó người ta dội nước cho trôi tinh dầu xuống bình hứng Lớp gai của bàn xát phải vừa để tránh đâm thủng ruột quả, nếu ruột quả bị thủng sẽ gây khó khăn vì tinh dầu sẽ bị lẫn nước quả và lớp cùi bên trong bị nạo rách sẽ hút mất một ít tinh dầu Phương pháp này cũng như phương pháp trên gây tổn thất nhiều tinh dầu nhưng phương pháp này có thể cơ khí hóa

- Ép: Vỏ quả được dùng lực cơ học để phá vỡ các túi tinh dầu, lúc đó tinh dầu sẽ chảy ra Trong khi ép, nên vừa ép vừa phun nước hoặc nước muối để hỗ trợ tinh dầu trôi ra và lúc ngừng ép, bả vỏ sẽ không hút tinh dầu trở lại Có thể ép nguyên quả bằng những máy ép đặc biệt Sau khi ép ta được hỗn hợp gồm nước quả, tinh dàu, mô và thịt quả Để tách tinh dầu ra, cần phải lọc để loại bớt tạp chất, sau đó dùng máy li tâm có tốc độ 15000-20000 vòng/phút để tách tinh dầu

Ưu điểm: - Tinh dầu giữ nguyên được mùi vị thiên nhiên ban đầu vì thành phần tinh dầu ít

bị thay đổi do những hiện tượng este hóa, xà phòng hóa, terpen hóa nhựa trong quá trình chưng cất

- Các thành phần trong tinh dầu ít bị biến đổi - Thiết bị nhỏ gọn và đơn giản

- Phù hợp cho quá trình nghiên cứu trên quy mô nhỏ Nhược điểm:

- Hiệu suất thấp - Tinh dầu bị vẫn đục, phải tinh chế lại, thường lẫn vào tinh dầu nhiều chất nhầy,

những mô và tạp chất khác

1.3.2 Phương pháp chưng cất

1.3.2.1 Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp

Nguyên liệu và nước được cho vào trong cùng một thiết bị, đun sôi, hơi nước bay hơi sẽ lôi cuốn theo hơi tinh dầu, sau đó làm lạnh ngưng tụ hơi, ta sẽ thu được tinh dầu sau khi phân ly tách nước

Ưu điểm: - Thiết bị đơn giản, rẻ tiền, phù hợp với quy mô sản xuất nhỏ Nhược điểm:

- Chất lượng tinh dầu sản phẩm không cao - Nguyên liệu dễ bị cháy, khét, do bị thiếu nước, bị dính vào thành thiết bị - Khó điều chỉnh các thông số kỹ thuật, thời gian chưng cất kéo dài

- Tiêu tốn nhiều năng lượng

1.3.2.2 Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước gián tiếp

Phương pháp chưng cất gián tiếp sử dụng nồi bốc hơi riêng hoặc sử dụng chung hệ thống hơi nước từ một lò hơi chưng cho thiết bị khác

Ưu điểm: - Khắc phục được tình trạng nguyên liệu bị khê khét, màu sắc và phẩm chất của

tinh dầu thu được tốt hơn do bộ phận chưng cất không bị gia nhiệt trực tiếp - Dễ dàng khống chế và điều chỉnh các yếu tố như lưu lượng, áp suất cho phù hợp

với từng loại nguyên liệu, nâng cao hiệu suất cũng như chất lượng tinh dầu - Thiết bị gọn nhẹ, dễ chế tạo

- Nâng cao hàm lượng hoặc tách riêng từng cụm cấu tử trong hỗn hợp hơi - Có thể tiến hành sử dụng đồi với các cấu tử có nhiệt độ cao hơn 100oC Nhược điểm:

- Chỉ sử dụng khi nguyên liệu có hàm lượng tinh dầu cao - Một số cấu tử có thể bị phân hủy trong quá trình chưng cất - Lượng tinh dầu hòa tan trong nước khá lớn và rất khó tách riêng - Tiêu tốn một lượng nước ngưng tụ lớn

- Phương pháp tẩm trích bằng dung môi dễ bay hơi có nhiều ưu điểm vì tiến hành ở nhiệt độ phòng nên thành phần hóa học của tinh dầu ít bị thay đổi Phương pháp này không những được áp dụng để trích li concrete từ hoa mà dùng để tận trích khi các phương pháp khác không li trích hết hoặc dùng để trích li các loại nhựa dầu gia vị

1.3.4 Phương pháp hấp phụ

Phương pháp hấp phụ gồm phương pháp ướp và phương pháp hấp phụ động học Phương pháp ướp: một số loài hoa như lài, hoa huệ,… có khả năng đặc biệt là sau khi thu hái khỏi cây vẫn còn tiếp tục tạo ra tinh dầu Đồng thời, dựa vào tính chất của các chất béo động vật và thực vật có khả năng hấp thụ những hợp chất dễ bay hơi trên bề mặt của chúng Do đó, khi cho hoa tiếp xúc với các chất béo trong khoảng thời gian nhất định, hương thơm do hoa tiết ra sẽ được chất béo hấp thụ

Phương pháp hấp phụ động học: Khi thổi không khí vào giữa các lớp hoa, tinh dầu trong hoa sẽ bốc hơi bay theo không khí Nếu không khí này được dẫn ngang qua một cột chứa than hoạt tính (than gỗ hoặc than xương), hơi tinh dầu sẽ bị hấp phụ Thường xác hoa sau đó được tẩm trích tiếp bằng dung môi hữu cơ (để lấy thêm những cấu tử khó bay hơi)

1.3.5 Các phương pháp mới

1.3.5.1 Phương pháp trích ly bằng CO2 siêu tới hạn

Hiện nay CO2 lỏng được sử dụng như một dung môi dùng để ly trích tinh dầu Phương pháp này lợi dụng tính chất khí CO2 có thể hóa lỏng ở áp suất cao, dùng CO2 lỏng tách chiết tinh dầu ra khỏi nguyên liệu Sau đó trả lại chất khí CO2 ở áp suất bình thường và thu được tinh dầu Khí CO2 được thu hồi lại và tiếp tục nén hóa lỏng để chiết tinh dầu tạo qui trình khép kín

Ưu điểm: - Dung môi CO2 có tính chọn lọc tốt, nhất là với nhựa có trong nguyên liệu - CO2 không có tác dụng độc hại đối với con người như các loại dung môi khác - Dễ loại và không để lại vết trong dung môi

- Khi loại dung môi không cần sử dụng nhiệt, vì vậy giữ được mùi thơm của tinh dầu mà không sợ tinh dầu bị phá hủy

- Quá trình kín ít bị hao tổn

Nhược điểm: - Đòi hỏi các thiết bị phức tạp có áp lực cao, giá thành thiết bị cao - Chi phí cho CO2 lỏng còn đắt, chưa được phổ biến

- Lượng nguyên liệu sử dụng còn hạn chế

1.3.5.2 Phương pháp trích ly hỗ trợ vi sóng

Phương pháp này dùng kỹ thuật vi sóng nhằm tăng động năng cho các phân tử tinh dầu, đồng thời tăng quá trình khuếch tán của tinh dầu ra bề mặt mà không sử dụng nhiệt độ Nhiệt tạo ra trong quá trình phá vỡ các túi tinh dầu nhỏ, thời gian thực hiện ngắn nên không gây ra phân hủy tinh dầu Tuy nhiên, ở Việt Nam phương pháp này chủ yếu vẫn đang ở quy mô phòng thí nghiệm

1.4 Phương pháp phân tích

1.4.1 Phương pháp phân tích sắc ký khí (GC)

Sắc ký khí là phương pháp sắc ký mà pha động là một dòng khí liên tục chạy qua pha tĩnh Dòng khí mang làm nhiệm vụ lôi cuốn các chất trong pha hơi chạy dọc theo pha tĩnh, tương tác với pha tĩnh sau đó được tách ra khỏi hỗn hợp tùy thuộc vào các tương tác khác nhau của chúng với pha tĩnh Nhiệt độ đóng vai trò quan trọng trong quá trình tách các chất trong kỹ thuật sắc ký khí Các chất có nhiệt độ sôi khác nhau sẽ bị lưu giữ hay bị lôi cuốn bởi dòng khí mang khác nhau

Hình 1.3 Thiết bị sắc ký khí

Mẫu sẽ được bơm vào bên trong theo dòng khí mang (thường là N2 hoặc He), đưa đến cột sắc ký (pha tĩnh) Mẫu khí qua cột sắc ký sẽ được hấp phụ lên trên pha tĩnh, sau đó các chất sẽ được lần lượt tách khỏi cột và theo dòng khí ra ngoài, được ghi nhận bởi đầu dò Từ các tín hiệu nhận được máy tính sẽ xử lý và biểu hiện kết quả bằng sắc ký đồ Các chất sẽ được định tính nhờ giá trị thời gian lưu và định lượng dựa vào chiều cao hoặc diện tích peak trên sắc ký đồ

1.4.2 Phương pháp phân tích sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS)

Sắc ký khí khối phổ (GC-MS) là một trong những phương pháp sắc ký hiện đại nhất hiện nay với độ nhạy và độ đặc hiệu cao được sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp dựa trên nguyên tắc của GC kết hợp với khối phổ để xác định các chất khác nhau trong mẫu Thiết bị GC-MS được cấu tạo gồm 2 phần: phần sắc ký khí (GC) dùng để phân tích hỗn hợp các chất và tìm ra chất cần phân tích, phần khối phổ (MS) mô tả các hợp phần riêng lẻ bằng cách mô tả số khối Ngày nay, người ta ứng dụng kỹ

thuật GC-MS rất nhiều và sử dụng rộng rãi trong các ngành như y học, môi trường, nông sản, kiểm nghiệm thực phẩm do tính nhạy và độ chính xác cao

Phương pháp khối phổ là một kĩ thuật dùng để đo đạc tỉ lệ khối lượng trên điện tích của ion bằng cách đo chính xác khối lượng phân tử của chất đó Chất nghiên cứu trước tiên được chuyển thành trạng thái hơi sau đó được đưa vào nghiên cứu trong bộ phận phân tích của máy khối phổ kế Tuỳ theo loại điện tích của ion đem nghiên cứu mà người ta phân biệt máy khối phổ ion dương hoặc ion âm Loại máy khối phổ làm việc với ion dương cho nhiều thông tin hơn về ion nghiên cứu nên được dùng phổ biến hơn Người ta có thể dùng phương pháp khối phổ để nghiên cứu tất cả các nguyên tố hay hợp chất có thể biến thành dạng khí hay hơi Đối với hợp chất vô cơ, phương pháp phân tích khối phổ thường được dùng để nghiên cứu thành phần đồng vị hoặc để xác định vết các chất nghiên cứu Đối với hợp chất hữu cơ, phương pháp phân tích khối phổ thường được dùng trong quá trình đồng nhất chất hoặc phân tích cấu trúc

Nhiều nhà nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật phân tích sắc ký khí ghép khối phổ để xác định thành phần các hợp chất có trong tinh dầu Kirbaslar và các cộng sự đã sử dụng kỹ

thuật phân tích này xác định được có 67 hợp chất có trong tinh dầu Citrus hystrix [38] Tinh dầu vỏ Citrus sinensis (L.) Osbeck sử dụng kỹ thuật phân tích này xác định được

10 hợp chất [56] Hầu hết các nghiên cứu đã chọn cột mao quản có chiều dài hơn 50 m để có được sự phân tách tốt hơn Sokovic và cộng sự đã phân tích 88 hợp chất có trong

tinh dầu Citrus limon và Citrus aurantium thông qua GC-MS với cột mao quản (50m x

0,2mm, bề dày phim 0,5µm)

1.4.3 Phương pháp quang phổ hấp thu UV-VIS

Các nguyên tử ở trạng thái bình thường thì chúng không hấp thu và cũng không phát ra năng lượng dưới dạng bức xạ, lúc này nguyên tử tồn tại ở trạng thái cơ bản (E0), đó là trạng thái bền vững và nghèo năng lượng nhất của nguyên tử Nhưng khi chúng ở trạng thái tự do dưới dạng những đám hơi nguyên tử, nếu ta chiếu một chùm tia sáng có những bước sóng (tần số) xác định vào đám hơi nguyên tử đó thì chúng sẽ hấp thu và

bức xạ năng lương Mỗi nguyên tử chỉ hấp thu những bức xạ nhất định tương ứng với những bức xạ mà chúng có thể phát ra trong quá trình phát xạ của chúng Khi nguyên tử nhận năng lượng chúng chuyển lên mức năng lượng cao hơn, quá trình đó là quá trình hấp thu năng lượng của nguyên tử tự do ở trạng thái hơi và tạo ra phổ nguyên tử đó Vì thế nên khi chiếu một chùm bức xạ điện từ tác động lên khối vật chất thì sự hấp thụ của khối vật chất đó phụ thuộc vào bản chất của nó, như vậy đo lượng tia bức xạ bị hấp thụ ta có thể xác định được tính chất của vật liệu

1.5 Gốc tự do và hoạt tính chống oxy hóa của tinh dầu

1.5.1 Khái niệm gốc tự do

Gốc tự do là bất cứ phân tử hóa học nào có một điện tử duy nhất (electron mang điện tích âm) hay một số lẻ điện tử Những điện tử này làm cho gốc tự do có khả năng oxy hóa rất cao Các gốc tự do không bền với thời gian nên nó phải nhận điện tử từ các phân tử khác để đạt được cấu trúc bền vững Quá trình này tạo thành một dây chuyền phản ứng với các phân tử chung quanh nó, do đó gây tổn thương và làm thay đổi giá trị sinh học của các đại phân tử sinh học như ADN, protein, lipid [15]

Trong cơ thể người và động vật, thường xuyên có sự hình thành các gốc tự do, phát sinh trong quá trình chuyển hóa hay là sản phẩm của phản ứng khử độc đối với một số chất hoặc yếu tố ngoại lai trong hệ thống lưới nội bào Ngoài ra chúng có thể được sinh ra do một số tác nhân bên ngoài như tia tử ngoại, nhiễm độc lân hữu cơ, hay bệnh lý gây ra bởi stress như chấn thương, bỏng….[15]

1.5.2 Tác động của gốc tự do lên con người

Gốc tự do có nhiều tác hại với sức khỏe cơ thể Khi có sự gia tăng hình thành gốc tự do, làm mất cân bằng hệ thống oxy hóa, kết quả làm tổn thương cấu trúc phân tử của tế bào như lipid, ADN, protein… dẫn đến thay đổi chức năng hoạt động của tế bào, rối loạn và gây chết tế bào [15]

Số lượng của gốc tự do tích lũy theo tuổi và tác hại ngày càng nghiêm trọng Dù vậy, ngay từ khi sinh ra, cơ thể con người đã phải đối mặt với gốc tự do Tuổi tác ngày càng tăng thì số lượng gốc tự do cũng không ngừng sản sinh, tấn công vào nhiều bộ phận của cơ thể Đáng chú ý, khi cuộc sống căng thẳng cũng là lúc “đội quân” gốc tự do “thừa cơ” gia tăng nhanh chóng, thúc đẩy sự lão hóa và làm các bệnh lý sớm phát triển Ước tính, mỗi tế bào phải hứng chịu khoảng 10.000 gốc tự do tấn công mỗi ngày Vì vậy, trong cuộc đời của một người sống tới 70 tuổi, thì có chừng 17 tấn gốc tự do được tạo ra [69]

1.5.3 Chất chống oxy hóa

Nguyên tắc chung của một chất chống oxy hóa là những chất làm vô hiệu hóa tác động của gốc tự do Cụ thể hơn, chất oxy hóa có electron dƣ thừa để cung cấp cho gốc tự do, nhờ vậy làm vô hiệu hóa tác hại của gốc tự do

Để kéo dài độ bền của thực phẩm hoặc làm tăng chất lượng của sản phẩm bằng cách trì hoãn quá trình oxy hóa trong thực phẩm, các hợp chất phenolic, butylated hydroxyanisole như (BHA), butylated hydroxyl toluence (BHT) đã được sử dụng rộng rãi như là chất chống oxy hóa tổng hợp trong ngành công nghiệp thực phẩm Tuy nhiên, trong hai thập kỷ qua, dư luận quan tâm rất lớn về sự an toàn của chất chống oxy hóa trong bảo quản thực phẩm, cũng như những tác động đến sức khỏe [66] Tuy nhiên, một số nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng các chất chống oxy hóa tổng hợp tích lũy trong cơ thể có thể dẫn đến tổn thương gan và các chấy gây ưng thư Do đó, các nghiên cứu gần đây quan tâm đến việc phát triển các chất chống oxy hóa có nguồn gốc tự nhiên và các hợp chất kháng khuẩn từ thực vật được ứng dụng đặc biệt trong thực phẩm và các lĩnh vực y sinh học [44] Tinh dầu và dịch chiết từ các loài thực vật được biết đến là có mức độ chống oxy hóa khác nhau Các công bố gần đây cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của tinh dầu và dịch chiết là có hiệu quả hơn so với các chất chống oxy hóa tổng hợp

1.5.4 Phương pháp sử dụng DPPH

Khả năng chống điện tử sử dụng DPPH là phương pháp phổ biến nhất dùng để xác định khả năng loại bỏ gốc tự do và các nhóm cho hydro, phương pháp này cũng được sử dụng để định lượng các chất oxy hóa trong hệ thống sinh học phức tạp ngày nay [14] DPPH là một gốc tự do bền, có màu tím và có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 517nm Khi có mặt chất chống oxy hóa, nó sẽ bị khử thành DPPH-H, hợp chất sẽ chuyển từ màu tím sang màu vàng tương ứng với lượng điện tử kết hợp với DPPH [50] Độ giảm độ hấp thu ở bước sóng 517nm có ý nghĩa như là khả năng khử gốc DPPH của chất chống oxy hóa Ngày nay DPPH được sử dụng phổ biến để khảo sát khả năng chống oxy hóa do phương pháp này rất hữu hiệu, đơn giản, nhanh chóng và dễ ổn định

Hình 1.4 Cơ chế phản ứng của gốc tự do DPPH và chất kháng oxy hóa

1.5.5 Phương pháp sử dụng Ferric Thiocyanat (FTC)

Khả năng chống oxy hóa của tinh dầu sử dụng phương pháp FTC dựa trên việc khử Fe3+ thành Fe2+ Acid linoleic được thêm vào hỗn hợp tinh dầu đó là các lipid không bão hòa (LH) Sau đó, các lipid này bị oxi hóa bới không khí, nhiệt độ tạo thành gốc tự do lipid (L-), các gốc tự do này phản ứng với oxy tạo thành các gốc peroxy (LOO-), LOO- sau đó phản ứng với LH tạo thành hydroperoxid lipid (LOOH) là sản phẩm chính của quá trình [28]

𝐹𝑒2++ 𝐿𝑂𝑂𝐻 → 𝐹𝑒3++ 𝐿𝑂∎+ 𝑂𝐻−

𝐹𝑒3++ 𝑆𝐶𝑁− → 𝐹𝑒(𝑆𝐶𝑁)3Sắt (II) clorua và amonium thiocyanate phản ứng với nhau để tạo ra ferric thiocyanate (màu đỏ) nhờ hydroperoxide, phức chất này có màu đỏ và có độ hấp thu cực đại ở 500nm

1.6 Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu

1.6.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu

Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu đã được nghiên cứu rất nhiều đối với nhiều loại tinh dầu khác nhau [12] Có hai kỹ thuật cơ bản để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu [36]:

- Phương pháp khuếch tán (đĩa giấy hoặc giếng): phương pháp này thường được sử dụng để kiểm tra sơ bộ và để lựa chọn hiệu quả của các loại tinh dầu Đĩa Petri đường kính 5-12cm thường được sử dụng (thông thường là đĩa Petri đường kính 9cm) được đổ đầy 10-20ml môi trường thạch và chủng vi sinh cần kiểm định Tinh dầu có thể được khuếch tán trên đĩa giấy hoặc giếng của môi trường thạch [49,57] Khi tinh dầu được tẩm lên giấy hoặc giếng của môi trường, tinh dầu sẽ khuếch tán từ từ ra xung quanh môi trường Nếu vi sinh vật được trải trên mặt thạch không phát triển được ở khu vực có sự khuếch tán của tinh dầu được gọi là “vùng ức chế” [36]