xác định cầu trúc hóa học một số hợp chất từ phân đoạn methanol lá chânchim không cuống quả - Xử lý sơ bộ mẫu- Điều chế cao ethanol và các cao phân đoạn cao n-hexane, ethyl acetate.- Phâ
TONG QUAN .-o<5< 55s se Ss2sS29SE3919E391E35530591505505955 3
Mô tả thực Vat - 6-5: 1 221 123 122111121111 11 01111 111101111 1111 111g 0 0g 3
Đặc điểm của cây là không cuồng, thường mọc chùm 3-7 quả hay riêng lẻ, hình cầu (5 x 4mm), khi chín màu cam có 5 cạnh!”.
1.3 Các nghiên cứu về thành phân hóa học
Hiện chưa có bat kỳ nghiên cứu nào về thành phần hóa học của loài Schefflera sessiliflora trên thé giới. Ở Việt Nam, loài Schefflera sessiliflora cũng có 2 công trình nghiên cứu, tuy nhiên cũng chỉ dừng lại là khảo sát sơ bộ về thành phân hóa học, định lượng saponin tong va cô lập 2 sapogenin là acid oleanolic và hederagenin từ saponin tổng” Do đó, chúng tôi đã tìm hiểu thành phân hóa hoc của một vài loài khác thuộc chi Schefflera.
Năm 2006, Léon Azefack Tapondjou và các cộng sự đã cô lập 13 hop chất từ lá: acid oleanolic (1), hederagenin (2), caulosid A (3), copterosid B (4), fatsiasid C¡ (5), guaianin N (6), collinsonidin (7), ciwujianosid Ca (8), caulosid D (9), chikusetsusaponin V (10), ciwujianosid A, (11), caulosid G (12) va hederagenin 3-O- [2-D-glucopyranosyl-(1 >3)|-a-L-arabinopyranosid 28-O-[a-L-rhamnopyranosyl-
Năm 2003, Meleka F R và các cộng sự đã cô lập 9 triterpenoid từ than va lá: acid oleanolic 3-O-[a-L-rhamnopyranosyl-(14)] D-glucuronopyranosid (14), acid echinocystic 3-O-[a-L-rhamnopyranosyl-(14)]-6-D-glucuronopyranosid (15), acid oleanolic 3-O-[$-D-apiofuranosyl-(1 >4)]-6-D-glucuronopyranosid 28-O-$-D- glucopyranosid (16), acid oleanolic 3-O-[a-L-arabinopyranosyl-(1>2), ứ-L- ramnopyranosyl-(1 >4)]-6-D-glucuronopyranosid (17), acid oleanolic 3-O-[a-L- arabinopyranosyl-(1>2), a-L-rhamnopyranosyl-(14)]-6-D-glucuronopyranosid 28-
@ể-ỉ-D-glucopyranosid (18), acid oleanolic 3-ỉ-[ỉ-D-galactopyranosyl-(I^2), a-L- rhamnopyranosyl-(14)]-6-D-glucuronopyranosid (19), acid oleanolic 3-ể-|ỉ-D- galactopyranosyl-(I^2), a-l-rhamnopyranosyl-(I14)]-6-D-glucuronopyranosid 28- O-ỉ-D-glucopyranosid (20), acid oleanolic 3-O-[a-l-arabinopyranosyl-(1>2), ỉ-D- apiofuranosyl-(I>4)]-ỉ-D-glucuronopyranosd (21), acid oleanolic 3-O-[a-L- arabinopyranosyl-(1 2), 6-D-apiofuranosyl-(1 >4)]-8-D-glucuronopyranosid 28-O-f-
Năm 2006, Guo Fu-Jiang va cộng sự đã cô lập 4 triterpenoid từ than: scheffarbosid
Năm 1996, Zhu Min và các cộng sự đã cô lập 4 triterpenoid từ rễ: 28-O-[a-L- rhamopyranosyl-(l>4)-O-f-glucopyranosyl-(16)]-6-D-glucopyranosid 3/-hydroxy- isopolygalic-13(14)-en-28-acid (27), 28-O-[a-L-rhamopyranosyl-(1 >4)-£-D- glucopyranosyl-(1 6) |-8-D-glucopyranosid 3-oxo-isopolygalic-13(14)-en-28-acid (28), 28-O-[6-glucopyranosyl-(1>6)]-$-D-glucopyranosid 3$-hydroxy-isopol ygalic- 13(14)-en-28-acid (29), 28-O-[a-L-rhamopyranosyl-(1>4)-O-$-D-glucopyranosyl- (146)]-6-D-glucopyranosid 36-hydroxy-18-methyl-polygalic-13(14)-en-28-acid
Năm 1996, Zhu Min và các cộng sự đã cô lập 3 triterpenoid từ lá: acid 3-oxo-20- demethylisoaleuritolic-14(15)-en-28 ,29-dioic (31), acid 3-oxo-20- demethylisoaleuritic-14(15)-en-28,29-dioic 28-ỉ-[ứ-L-rhamnopyranosyl-(I4)-ể-ỉ- D-glucopyranosyl-(1 6) |-Ó-/6-D-glucopyranosid (32) acid 3a-hydroxyl-20- demethylisoaleuritolic-14(15)-en-28 ,30-dioic (33)”Ì.
Năm 1996, Zhu Min và các cộng sự đã cô lập 4 triterpenoid từ rễ: bodinitins A (34), bodinitins B (35), bodinitins C (36), bodinitins D (37)? ”.
Nam 1989, Santosh K Srivastava đã cô lập 1 saponin từ vỏ va thân: hederagenin-
Năm 1989, S K Srivastava và D C Jain đã cô lập 2 triterpenoid từ vỏ và thân: acid 3/,23-dihydrours-[2-en-28-oIc 3-ể-ỉ-]D-glucuronopyranosid 6’-O-methyl ester
Năm 2012, Zhang Qiao và cộng sự đã cô lập 10 hop chất từ thân: staunosid C (41), taurosid St-H, (42), saponin HCS-B (43), kalopanaxsaponin B (44), hederagenin 3-O- [6-D-xylopyranosyl-(1—3)-O-a-L-rhamnopyranosyl-(1—2) |-O-a-L-arabinopyranosid 28-O-[a-L-rhamnopyranosyl-(1—4)-$-D-glucopyranosyl-(1—6) |-O-6-D- glucopyranosid (45), scheffarbosid D (26), kalopanaxsaponin G (46), scheffarbosid C (25), acid oleanolic 3-O-[f-D-glucopyranosyl-(1—4)-O-6-D-xylopyranosyl-(1—3)-O- a-L-rhamnopyranosy-(1—2)|-O-a-L-arabinopyranosid 28-O-[a-L-rhamnopyranosy]l- (1—4)-O-$-D-glucopyranosyl-(1—6)|-O-f-D-glucopyranosid (47), acid oleanolic 3- O-[6-D-glucopyranosyl-(1—4)-O-6-D-xylopyranosyl-(1—3)-O-a-L- rhamnopyranosyl-(1—2)|-O-a-L-arabinopyranosid 28-O-[a-L-rhamnopyrnosyl-
(1—>4)-O-6-O-acetyl-ỉ-D-glucopyranosyl-(1—>6)]-O-ỉ-D-glucopyranosid (48)!'°'!. Năm 2013, Wang Ying và các cộng sự đã cô lập 8 triterpenoid từ phần trên mặt đất: schefflesid A (49), schefflesid B (50), schefflesid C (51), schefflesid D (52), schefflesid E (53), schefflesid F (54), schefflesid G (55), schefflesid H (56)! !.
Năm 1996, Orasa Pancharoen và cộng sự đã cô lập 3 chất từ lá: acid betulinic 3-O-
[œ-L-rhamnopyranosyl-(I2)-ỉ-D-glucopyranosyl-(I>2)] D-glucuronopyranosid (57), acid betulinic 3-Ó-[a-L-rhamnopyranosyl-(I^>2)-6-D-xylopyranosyl-(I2)]-/6- D-glucuronopyranosid (58), acid oleanolic 3-O-[a-L-rhamnopyranosyl-(12) D- glucopyranosyl-(1>2)]-6-D-glucuronopyranosid (59)!!!
1.3.7 Chan chim (Schefflera octophylla (Lour.) Harms.)
Năm 1982, Adam G và cộng sự đã cô lập từ lá acid 3a-hydroxylup-20(29)-en-
Năm 1991, T V Sung, Peter-Katalinic J và Adam G., đã cô lập từ lá cây chân chim acid oleanonic (61), acid 3-epi-betulinic 3-ể-ỉ-D-glucopyranosid 28-O-[a-L- rhamnopyranosyl-(1->4)-ể-ỉ-D-glucopyranosyl-(I6)|-ứ-D-glucopyranosid (62) va 1 trisaccharid là a-L-rhamnopyranosyl-(1>4)-O-6-D-glucopyranosyl-(1>6)-6-D- glucopyranosid (63)!'°),
Năm 1992, T V Sung va Adam G đã cô lập từ lá | triterpenoid: acid 3-epi- betulinic 3-O-$-D-6’-acetylglucopyranosid 28-O-[a-L-rhamnopyranosyl-(1>4)-O-/-
Năm 1992, T V Sung và cộng su đã cô lập từ vỏ cây chân chim 2 triterpenoid: asiaticosid (65), acid 3a-hydroxyurs-12-en-23 ,28-dioic (60), acid 3a-hydroxyurs-12- en-23 ,28-dioic 28-O-[a-L-rhamnopyranosyl (1>4)-O-6-D-glucopyranosyl (1>6)]-/-
Nam 1994, Chizuko Maeda, Kazuhiro Ohtani, Ryoji Kasai, Kazuo Yamasaki,
Nguyễn Minh Đức, Nguyễn Thời Nhâm, Nguyễn Khắc Quynh Cứ, đã cô lập 12 triterpenoid từ vỏ cây là asiaticosid (65), scheffoleosid A (67), cheffursosid B (68), scheffoleosid B (69), scheffursosid C (70), caulosid D (9), scheffursosid D (71), scheffoleosid D (72), scheffursosid E (73), scheffoleosid E (74), scheffursosid F (75), scheffoleosid F (76)!”1.
Trang 7 hât đ Lạ a cô lập từ c hi Schefflera
4 hóa học của các c 2 ông thức C
Min, So 29 tu ES OH
1.4 Các nghiên cứu về tác dụng dược lý
Năm 2001, Trần Công Luận và cộng sự đã thử tác dụng tăng lực trên cả 3 bộ phận lá, thân, vỏ thân Đối với lá và vỏ thân liều 1 g/kg cho tác dụng rõ, đạt ý nghĩa thống kê với độ tin cây 99%; đã thử khả năng chịu đựng stress nóng mạnh ở liều 200 mg/kg đối với mẫu thân!”
Năm 2004, Trần Công Luận và công sự đã thử khả năng tăng lực khi phối hợp cao thân với cao hồng sâm tỉ lệ 1 : 1 ở liều 400 mg/kg thời gian sống trung bình của chuột dài hơn cả lô sử dụng hồng sâm!”'””Ì: đã thử độ độc tính cấp đường uống cao thân với LDso = 1255 g/kg (đối với dược liệu) và LD5, = 277.92 g/kg (khi phối hợp với hong sâm) 11,
Năm 2008, Võ Duy Huan, Nguyễn Thị Thu Huong, Trần Công Luận, Huỳnh Thị Cam Hong đã thử tác dụng chống oxy hóa in vitro của các mẫu cao chiết và các genin băng phương pháp DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl); đã thử khả năng ức chế peroxy hóa lipid bang phương pháp MDA (malonyl dialdehyd)!”!.
Năm 2012, Trần Mỹ Tiên, Đặng Thị Thanh Nhàn, Trần Công Luận, Nguyễn Thị Thu Hương đã thử tác dụng kiểu androgen trên chuột đực giảm năng sinh dục của cao lá và cao than!*"!.
CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU,
HÓA CHÁT VÀ THIẾT BỊ
+ Phương pháp cô quay áp suất thấp!”
Nham loại dung môi ra khỏi dung dịch, dung dịch được chứa trong bình thủy tinh ở điều kiện áp suất thấp Dun nóng dung dịch dé thúc day quá trình bay hơi Hơi dung môi trong điều kiện áp suất thấp sẽ đi qua hệ thống làm lạnh, ngưng tụ Kết quả loại được dung môi ra khỏi dung dịch Nhờ tiễn hành quá trình bay hơi ở áp suất thấp nên nhiệt độ bay hơi của dung môi giảm, là một ưu điểm đối với các mẫu kém bên nhiệt.
Là phương pháp chiết ngâm dâm cổ điển kết hợp với phương pháp siêu âm.
Mẫu được ngâm trong một bình chứa bang thủy tinh hoặc bang thép không rỉ, bình có nắp đậy Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hòa tan một ít nhựa, gây nhằm lẫn là hợp chất đó có chứa trong cây Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của mẫu Đặt bình chứa vào máy siêu âm, giữ ở nhiệt độ 60° trong 30 phút để dung môi xuyên thắm vào cau trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chat tự nhiên Sau đó, dung dịch chiết được lọc ngang qua giấy lọc va được cô quay áp suất thấp dé thu hồi dung môi Tiếp tục rót dung môi mới vào phan căn còn lại trong bình chứa và tiếp tục quá trình chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu Dung môi thu hồi có thể được tiếp tục sử dụng cho các lần chiết sau.
Sử dụng phương pháp trích ly rắn — lỏng và lỏng — lỏng để phân chia cao alcol thô ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau để phân nhóm tương đối các hợp chất Theo do, dung môi không phân cực sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính không phân cực, dung môi phân cực trung bình hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình và dung môi phân cực mạnh hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực mạnh Phương pháp này giúp cho quá trình cô lập các chất được dễ dàng hơn.
2.1.2 Phương pháp phân lập các hợp chất
Sắc ký là phương pháp vật lý dùng để tách một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất ra riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại chất đối với một hệ thống (hệ thống gồm hai pha: một pha động và một pha tĩnh) Phương pháp này được sử dụng để phân lập các hợp chất từ hỗn hợp nhiều chất Có nhiều loại sắc ký:
- Sắc ký lớp mỏng (TLC) !°Ì
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 Fys4 (Merck 1,05715), độ dày lớp hap phụ 0,2 mm
Các nghiên cứu về tác dụng dược LY . .- ¿2-5 25225 e+t+xeeecrerererrerered 17 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CUU -5- 5s <sesscssss 18
Năm 2001, Trần Công Luận và cộng sự đã thử tác dụng tăng lực trên cả 3 bộ phận lá, thân, vỏ thân Đối với lá và vỏ thân liều 1 g/kg cho tác dụng rõ, đạt ý nghĩa thống kê với độ tin cây 99%; đã thử khả năng chịu đựng stress nóng mạnh ở liều 200 mg/kg đối với mẫu thân!”
Năm 2004, Trần Công Luận và công sự đã thử khả năng tăng lực khi phối hợp cao thân với cao hồng sâm tỉ lệ 1 : 1 ở liều 400 mg/kg thời gian sống trung bình của chuột dài hơn cả lô sử dụng hồng sâm!”'””Ì: đã thử độ độc tính cấp đường uống cao thân với LDso = 1255 g/kg (đối với dược liệu) và LD5, = 277.92 g/kg (khi phối hợp với hong sâm) 11,
Năm 2008, Võ Duy Huan, Nguyễn Thị Thu Huong, Trần Công Luận, Huỳnh Thị Cam Hong đã thử tác dụng chống oxy hóa in vitro của các mẫu cao chiết và các genin băng phương pháp DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl); đã thử khả năng ức chế peroxy hóa lipid bang phương pháp MDA (malonyl dialdehyd)!”!.
Năm 2012, Trần Mỹ Tiên, Đặng Thị Thanh Nhàn, Trần Công Luận, Nguyễn Thị Thu Hương đã thử tác dụng kiểu androgen trên chuột đực giảm năng sinh dục của cao lá và cao than!*"!.
CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU,
HÓA CHÁT VÀ THIẾT BỊ
Phương pháp nghién CỨU - - ( << G5 1990010119 9n re 18
+ Phương pháp cô quay áp suất thấp!”
Nham loại dung môi ra khỏi dung dịch, dung dịch được chứa trong bình thủy tinh ở điều kiện áp suất thấp Dun nóng dung dịch dé thúc day quá trình bay hơi Hơi dung môi trong điều kiện áp suất thấp sẽ đi qua hệ thống làm lạnh, ngưng tụ Kết quả loại được dung môi ra khỏi dung dịch Nhờ tiễn hành quá trình bay hơi ở áp suất thấp nên nhiệt độ bay hơi của dung môi giảm, là một ưu điểm đối với các mẫu kém bên nhiệt.
Là phương pháp chiết ngâm dâm cổ điển kết hợp với phương pháp siêu âm.
Mẫu được ngâm trong một bình chứa bang thủy tinh hoặc bang thép không rỉ, bình có nắp đậy Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hòa tan một ít nhựa, gây nhằm lẫn là hợp chất đó có chứa trong cây Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của mẫu Đặt bình chứa vào máy siêu âm, giữ ở nhiệt độ 60° trong 30 phút để dung môi xuyên thắm vào cau trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chat tự nhiên Sau đó, dung dịch chiết được lọc ngang qua giấy lọc va được cô quay áp suất thấp dé thu hồi dung môi Tiếp tục rót dung môi mới vào phan căn còn lại trong bình chứa và tiếp tục quá trình chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu Dung môi thu hồi có thể được tiếp tục sử dụng cho các lần chiết sau.
Sử dụng phương pháp trích ly rắn — lỏng và lỏng — lỏng để phân chia cao alcol thô ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau để phân nhóm tương đối các hợp chất Theo do, dung môi không phân cực sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính không phân cực, dung môi phân cực trung bình hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình và dung môi phân cực mạnh hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực mạnh Phương pháp này giúp cho quá trình cô lập các chất được dễ dàng hơn.
2.1.2 Phương pháp phân lập các hợp chất
Sắc ký là phương pháp vật lý dùng để tách một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất ra riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại chất đối với một hệ thống (hệ thống gồm hai pha: một pha động và một pha tĩnh) Phương pháp này được sử dụng để phân lập các hợp chất từ hỗn hợp nhiều chất Có nhiều loại sắc ký:
- Sắc ký lớp mỏng (TLC) !°Ì
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 Fys4 (Merck 1,05715), độ dày lớp hap phụ 0,2 mm
Pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi di chuyển cham chậm dọc theo tam bản mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó Dung môi di chuyển lên cao nhờ vào tính mao quản Mỗi thành phan của mẫu chất sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau, đi phía sau mức dung môi Vận tốc di chuyển này tùy thuộc vào hiện tượng hấp thu của pha tĩnh và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi.
Mau cần phân tích thường là hỗn hop gồm nhiều hợp chất với độ phân cực khác nhau Sử dụng khoảng 1uL dung dịch mẫu với nồng độ loãng 2-5%, nhờ một vi quản để cham mẫu thành một điểm gọn trên pha tinh, ở vị trí phía trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình.
Phỏt hiện chất bằng thuốc thử là dung dịch HằSO, 10% (pha trong EtOH 50%) ho nóng hiện hình bản mỏng.
Sắc ký cột hở cô điển gồm một ống hình trụ đặt dựng đứng với đầu trên hở va đầu dưới có gan một khóa Pha tinh ran được nhồi vào ống trụ Mẫu cần tách được đặt lên trên bé mặt của pha tĩnh Pha động là dung môi được rót liên tục vào đầu cột nhờ trọng lực, dung môi di chuyển từ trên đầu cột xuống dưới cột, xuyên ngang qua pha tĩnh, rồi ra khỏi cột và được hứng trong ống nghiệm, mỗi ông nghiệm với một thể tích như nhau.
Sac ký cột được tiễn hành với chất hap phụ là Silica gel pha thường, pha đảo và hạt nhựa hấp phụ Diaion HP-20.
* Silica gel pha thường có cỡ hạt là 40-63 um (230-400 mesh) Trên bề mặt những hạt này có mang nhiều nhóm —OH có tính rất phân cực có thể tạo nối hydrogen mạnh với những hợp chat được sắc ky Do tinh chất hấp phụ và tốc độ dịch chuyền của từng chất trong dung dịch cần tách là khác nhau nên các cau tử của hỗn hợp được giữ lại ở các vị trí khác nhau trên cột, những hợp chất phân cực có khả năng tạo nỗi hydrogen mạnh bi silica gel giữ chặt lại trong cột và bị giải ly ra sau những chất khác có tính kém phân cực hơn Kết quả là trong quá trình pha động di chuyền, các chất sẽ tách ra khỏi nhau.
* Silica gel pha đảo cỡ hat 30-50 um, là những hạt silica gel được chế hóa thành chất hấp thu có tính không phân cực với mach carbon day dài C18, nên có ái lực mạnh với các hợp chất kém phân cực Như thế khi dung môi phân cực đi qua các hợp chất phân cực sẽ ra tách ra trước.
* Hạt nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 là polymer của phản ứng đồng trùng hop styrene và divinylbenzene, cỡ hạt 250-850 um Chat nay có khả năng hấp phụ các chất ky nước, vừa dùng để loại muối vừa dùng dé tinh chế hợp chất glucoside như các triterpene saponin?”
2.1.3 Phương pháp thir nghiệm hoạt tinh ức chế enzyme Z-glucosidase!?iÌ
Phương pháp nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme a-glucosidase trong điều trị bệnh đái tháo đường loại II dựa trên nguyên tắc:
- Enzyme œ-glucosidase khi gặp nối a-D-glucose sẽ cắt đứt liên kết để giải phóng đường D-glucose.
- Sử dụng chất nền có liên kết @ với đường D-glucose như p-nitrophenyl-z-D- ứlucopyranoside, dưới tac dung cua enzyme a-glucosidase sẽ bị thuỷ phõn cho ra đường D-glucose và p-nitrophenol.
- p-nitrophenol hap thu trong ánh sáng nhìn thay được nên tiễn hành do độ hap thu
A ở bước sóng À= 405nm Từ đó xác định lượng D-glucose sinh ra.
HO Oo HO ot—glucosidase _ HO + O OH y aa
Theo phan ứng lượng glucose sinh ra tỉ lệ với p-nitrophenol Vi vậy có thé đo độ hấp thu A của p-nitrophenol khi đọc trên máy đo mật độ quang ở bước sóng 405nm để xác định lượng glucose sinh ra So sánh hàm lượng glucose sinh ra giữa mẫu ức chế và không ức chế dé xác định % ức chế Dựng đường biểu diễn giữa % ức chế và nông độ chat ức chê dé xác định chỉ sô [Csp.
Phương tiện nghiÊn CUU (<0 000g re 21
- Silica gel pha dao Cig (Merck).
- Hat nhua Diaion HP-20 (Mitsubishi Chem Ind Co).
+ Thiết bi dùng dé phân lập và tinh chế các chat
- Ban nhôm silica gel Merck-GF60Essx trang san, kích thước 20x20 m, độ dày lớp hấp phụ 0,2 mm (Merck, Germany).
- Bình sắc ký có nắp đậy và các ống vi quan.
- Cột sắc ký thủy tinh đường kính từ 2-5,5 cm.
- Máy cô quay chân không Buchi EY ELA OIL BATH OSB-2000.
- Máy siêu âm (Elma S 100 H, Elmasonic, USA).
- Can phan tich AND HR-200.
+ Thiết bị dùng để xác định cau trúc các chat
- Phố hồng ngoại IR đo trên máy Bruker Tensor 27 FT-IR, Trường Đại học Khoa hoc Tự nhiên Thành phó Hồ Chí Minh.
- Phố UV-VIS được đo trên hệ máy HPLC-UV Aglilent 1260, Viện Công nghệ Hóa học.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được đo trên máy Bruker AM500 FTI-
- Phố khối lượng phun mù điện tử phân giải cao (HR-ESI-MS) đo trên máy Bruker MicrOTOF-QII, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phó Hồ Chí Minh.
+ Thiết bi dùng dé thử hoạt tính ức chế enzyme a-glucosidase
- Máy do mật độ quang Shimadzu UV 1800.
Chuẩn bị nguyên liệu - ¿255% E E2 E2 EE2E£ESEEEEEEEEEEEEE5 211115121 E xe, 22
Nguyên liệu là lá chân chim không cuống quả Schefflera sessiliflora De P V được cung cấp bởi Trung tâm trông và chế biến cây thuốc Đà Lạt, số 18 Hoang Văn Thụ, Thành phố Đà Lạt Định danh bởi cố TS Phan Văn Đệ, Bộ môn Tài nguyên Dược liệu, Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM, tiêu bản được lưu giữ tại Viện Công nghệ hóa học Phan lá thu được, rửa sạch, phơi khô.
Quá trình trích ly các cao chiẾt ¿-¿- ¿5222222 Sex EEEEkrkerrkrrrrerred 22
Lá chân chim không cuống quả (5 kg) được trích kiệt bang phương pháp ngâm dam và chiết siêu âm với 75 L ethanol 96%, lọc bã, dịch chiết dem cô quay áp suất thấp loại dung môi thu được 890 g cao thô EtOH.
Hình 4.1: Mẫu ngâm lá chân chim không cuống quả.
Cao thé ethanol được thêm nước, chiết lỏng — lỏng lần lượt với các dung môi n- hexane, ethyl acetate, methanol.
Dịch chiết n-hexane thu được đem cô quay loại dung môi thu được 300 g cao n- hexane, tương tự tiếp tục chiết lỏng — lỏng phan căn với ethyl acetate, cô quay áp suất thấp thu hồi dung môi thu được 15 g cao ethyl acetate Dịch nước còn lại tiếp tục đem đi sắc ký.
Dịch nước thu được cho qua cột hấp phụ Dianion HP-20 rửa giải với nước, MeOH 25%, MeOH 50%, MeOH 75%, MeOH 100%, thu được 5 phân đoạn chính đánh số tỪ
Sơ đồ 3.1: Sơ đồ trích ly các loại cao chiết
5 kg Chiết siêu âm với ethanol 96%
Dich chiét Ethanol Phan ba
Cô quay thu hôi ethanol
Chiết lỏng-lỏng với n-hexane Ỷ
Dịch chiết Phan còn lại n-hexane ;
Chiét siêu âm với ethyl acetate
Cô quay thu hồi n-hexane Dich chiét
Cao n-hexane Cao Ethyl acetate Dich nước
Sơ đồ 3.2: Sơ đồ rửa giải cao Methanol
Nước Nước-MeOH Nước-MeOH |Nước-MeOH |MeOhH 100% 75:25 50:50 2:5 100%
Phân đoạn Phân đoạn Phân đoạn Phân đoạn Phân đoạn
Quá trình sắc ký phân lập các hợp chất - + s+c+cecs+xsesrseree 24
Kiểm tra sơ bộ các phân đoạn thu được từ cột diaion bang sắc ký bản mỏng TLC trước khi tiến hành sac ký cột, các phân đoạn của các vét có R¿ như nhau được gom chung lại.
- Từ phân đoạn V (85 g) tiến hành sắc ký cột pha thường rửa giải với hệ dung môi tăng dần độ phân cực n-hexane-EtOAc-MeOH thu được 6 phan đoạn đánh số tương ứng từ V.1-V.6.
Quá trình sắc ký cột phân đoạn V thu được 6 phân đoạn được tốm tắt như sau:
Bảng 3.1: Kết quả cột thường phân đoạn V Phân đoạn Hệ dung môi Khối lượng
Tại phan đoạn V.2 (24 g) tiếp tục tiễn hành sắc ký cột pha thường với hệ dung môi tăng dần CHCI;-MeOH thu được 4 phân đoạn đánh số tương ứng từ V.2.1-V.2.4
Tại phân đoạn V.2.1 (8 g) tiếp tục tiến hành sắc ký cột nhiều lần pha thường với dung môi CHC]: 100% thu được SSL01 (8 mg).
Bang 3.2: Kết quả cột thường phân đoạn V.2 Phân đoạn Hệ dung môi Khối lượng
Sơ đồ 3.3: Quy trình phân lập các chat từ phân đoạn V cao Methanol
> > > > > > s on s on 5 e0 5 of 5S- sp 5S- sp 3S ow 8s 6 2 or a
-= os -= os -= os lene, en es en A len A len A Glen,
- Từ phân đoạn IV (80 g) tiến hành sắc ký cột pha thường rửa giải với hệ dung môi tăng dần độ phân cực EtOAc-MeOH: 0-100% thu được 7 phân đoạn đánh SỐ tương ứng từ IV.I-IV 7.
Quá trình sắc ký cột phân đoạn IV thu được 7 phần đoạn được tóm tắt như sau:
Bảng 3.3: Kết quả cột thường phân đoạn IV Phân đoạn Hệ dung môi Khối lượng
Tai phân đoạn IV.1 (15 g) tiến hành sắc ký cột pha thường rửa giải với hệ dung môi tăng dan CHCI:-MeOH-nước (90:10:0,1 - 80:20:0,2) thu được 4 phân đoạn đánh số tương ứng IV.1.1-IV.1 4.
Bảng 3.4: Kết quả cột thường phân đoạn IV.1 Phân đoạn Hệ dung môi Khối lượng
IV.14 CHC]1:-MeOH-nước (80:20:0,2) leg
Phan đoạn IV.1.3 (5 g) có vết hồng đậm tiếp tục đem đi sắc ký cột pha thường nhiều lần rửa giải với hệ dung môi CHCIa-MeOH-nước (90:10:0,1), sau đó tiếp tục cho qua sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi nước-MeOH (6:1) thu được 13 mg
Tai phân đoạn IV.2 (15 g) tiến hành sắc ký cột pha thường rửa giải với hệ dung môi tăng dần CHCIa-MeOH-nước (85:15:0,1 - 75:25:0,3) thu được 4 phân đoạn đánh số tương ứng IV 2.1-IV 2.4.
Bang 3.5: Kết quả cột thường phân đoạn IV 2 Phân đoạn Hệ dung môi Khối lượng
IV.24 CHCIz-MeOH-nước (75:25:0,3) leg
Phân đoạn IV.2.1 (3 g) có vết hồng đậm tiếp tục dem đi sắc ký cột pha thường nhiều lần rửa giải với hệ dung môi CHCIa-MeOH-nước (90:10:0,1), sau đó tiếp tục cho qua sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi nước-MeOH (5:1) thu được 8 mg SSL04. Phân đoạn IV.2.2 (4 g) có vết hồng đậm tiếp tục đem đi sắc ký cột thường nhiều lần rửa giải với hệ dung môi CHCI;-MeOH-nước (85:15:01), sau đó tiếp tục cho qua sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi nước-MeOH (4:1) thu được 9 mg SSL06.
Phan đoạn IV.2.3 (4 g) có vết hồng đậm tiếp tục đem đi sắc ký cột thường nhiều lần rửa giải với hệ dung môi CHCI:-MeOH-nước (75:25:0,1), sau đó tiếp tục cho qua sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi nước-MeOH (3:1) thu được 15 mg SSL03 và 8 mg
Tại phân đoạn IV.3 (20 g) tiến hành sắc ký cột pha thường rửa giải với hệ dung môi tăng dần CHCIa-MeOH-nước (80:20:0,2 - 70:30:0,5) thu được 4 phân đoạn đánh số tương ứng IV.3.1-IV.3.4.
Bảng 3.6: Kết quả cột thường phân đoạn IV.3 Phân đoạn Hệ dung môi Khối lượng
Phân đoạn IV.3.2 (7 g) có vết hồng đậm tiếp tục đem đi sắc ký cột pha thường nhiều lần rửa giải với hệ dung môi CHCIa-MeOH-nước (75:25:0,2), sau đó tiếp tục cho qua sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi nước-MeOH (1:1) thu được 12 mg
Sơ đồ 3.4: Quy trình phân lập các chất từ phân đoạn IV
` y, a J \ J \ J \, SJ ` wis nan 22 1V23 || IV.3.2 an
3.4 Quá trình thứ hoạt tinh ức chế enzyme a-glucosidase
Pha các dung dịch mẫu thử ở các nông độ 0, 10, 25, 50, 100, 250 ug/ml (625 UL).
Thêm 0,2 U/mL enzyme a-glucosidase (25 uL) trong 0,01M đệm phosphate (pH =
Thêm 3 mM dung dich chất nên p-nitrophenyl-z-D-glucopyranoside (25 HL), lắc đều ủ ở 37°C trong 30 phút.
Dừng phan ứng bang cỏch thờm NaằCO; 0,1M (375 uL).
Sau đó, đem đo mật độ quang ở bước sóng À = 405 nm.
KET QUÁ THẢO LUẬN 5 5-5-5 s< se se se essscseseseseses 29
Nhận danh cấu trúc các chất đã phân lập - - - << -S SH hg 29
4.1.1 Biện luận cau trúc SSL01
Phố khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS (phụ lục 1.1) cho mũi ion phân tử giả với m/z: [M-H] = 455,3512 ứng với C3oH47O3 (so với lý thuyết 455,3525), cho phép xác định công thức phân tử của SSL01 là CaoH¿sOa.
Phố °C NMR (125 MHz, pyridine-d;, 8 ppm) (phụ lục 1.2) kết hợp với phổ DEPT90, DEPT135 (phụ lục 1.3) cho thấy SSL01 có 30 carbon: 1 carbon carbonyl
>C=O ở dc 1804 (C28); carbon tứ cấp >C= ở 6c 144,3 và carbon methine -CH-= ở 6c 122,1 dac trung cho 2 carbon olefin C13, C12; 1 carbon methine ké oxy -CH-O- ở ðc 77.9 (C3); 6 carbon tứ cấp >C< ở ồc46,3 (C17), 41,6 (C14), 39,2 (C8), 38,7 (C4), 36.8
(C22), 27,7 (C15), 26.9 (C2), 23,1 (C16, C11), 18,1 (C6); va 7 carbon methyl bậc bốn
Sự hiện diện của: 7 carbon methyl bac bốn cùng với 2 carbon olefin đặc trưng cho khung olean kết hợp với nhóm carbonyl và carbon oxymethine, từ đó nhận định sơ bộ SSL01 là acid oleanolic.
Phố 1H NMR (500 MHz, pyridine-d;, 8 ppm) (phụ lục 1.4) cho các tín hiệu:
1 proton olefin ở 64 5,57 (1H, brs, HI2); 1 proton oxymethine ở ồn 3,53 (1H, dd, J = 6,0 va 10,0, H3); 1 proton methine ở dy 3,33 (1H, dd, J = 4,0 va 14,0, H18); va các proton methylene vùng 3y 1,48 - 2,21; cùng các proton nhóm methyl bậc bốn 5,4 0,93 -
Phố HMBC (phụ lục 1.6) cho thay có các tương tác: Proton olefin ở 84 5,57 (1H, brs, H12) cho tương tác với carbon methine ở dc 47,6 (C9) va carbon bac bốn ở
Proton methine ở 04 3,33 (1H, dd, J = 4,0 và 14,0, H18) tương tác với carbon tứ cấp ở 8c 122,1 (C12), 46,0 (C19).
Bên cạnh đó proton ở dy 5,57 (1H, brs, H12) cũng có tương tác với carbon methine ở dc 41,4 (C18), chứng minh nối đôi ở vị trí C12 va C13 thuộc một phan khung suon olean.
Proton methyl ở dy 1,05 (3H, s, H29) lại có tương tác với carbon ở ở dc 46,0(C19), ở dc 30,4 (C20), ở dc 33,6 (C21), ở ốc 23,3 (C30) và ngược lai proton ở ồn 1,09(3H, s, H30) cũng có tương tác với carbon methyl ở ðc 32,8 (C29).
Proton methyl ở dy 1,05 (3H, s, H26) có tương tac với carbon methine ở 5c 47,6
(C9) carbon tu cap ở dc 39,2 (C8) carbon methylene ở d¢ 32,7 (C7) va proton methine
1,70 (3H, t, J = 9,H9) cũng có tương tác với carbon methyl ở dc 16,9 (C26).
Proton methyl ở dy 1,34 (3H, s, H27) có tương tac với carbon methine ở ðc 41,6 (C14) carbon methylene ở dc 27,7 (C15).
Proron methyl ở dy 0,93 (3H, s, H25) có tương tác với carbon methine ở ðc 55,3
(C5) dc 47,6 (CY) carbon tứ cap ở dc 36,8 (C10) carbon methylene ở ửc 384 (Cl) và proton methine ở ồn 1,70 (3H, 4, J = 9, H9) cũng có tương tac với carbon methyl ở ðc15,0 (C25).
Proton oxymethine ở ồn 3,53 (1H, dd, J = 6,0 và 10,0, H3) tương tác với 2 carbon methyl ở dc 28,2 (C23), 16,0 (C24) và ngược lại proton của 2 nhóm methyl này ở ồn 1,29 (3H, s, H23), 1,09 (3H, s, H24) tương tác với caron oxymethine ở 6c 77,9
(C3) và carbon methine ở õc 55.3 (C5), chứng minh nhóm hydroxy gan ở vị trí C3.
Proton methylene ở dy 2,21 (1H, m, H16a) tương tác với carbon carbonyl ở ðc
180.4 (C28) chứng minh nhóm carbonyl gan vào vi trí C28 của khung olean
Tóm lai từ các dữ liệu phổ HR-ESI-MS, H-NMR, C-NMR, kết hợp với phổ
DEPT, HSQC, HMBC, và so sánh với tài liệu”: chúng tôi khang định SSL01 là acid oleanolic.
Bang 4.1: Dữ liệu phố 'ÌC-NMR, 'H-NMR, HMBC của SSLO1 so sánh với tài liệu'””:
(pyridine-d;) vị| ~C- "H-NMR 6 ppm C-NMR trớ NMR (Số H, dang mũi, J = Hz) HMBC ử ppm ử ppm HC
4.1.2 Biện luận cau trúc SSL02
Phố HR-ESI-MS (phụ lục 2.1) cho mũi ion phân tử giả với m/z: [M-HỊ 631,3851 ứng với C36H55Oo (so với lý thuyết 631,3846), cho phép xác định công thức phân tử của SSLO2 là CseHz¿Os.
Phố °C NMR (125 MHz, pyridine-d;, 8 ppm) (phụ lục 2.2) kết hợp với phổ DEPT90, DEPT135 (phụ lục 2.3) cho thấy SSL02 có 36 carbon, trong đó 30 carbon tương tự SSLO1: 1 carbon carbonyl >C=O ở dc 180,3 (C28); carbon tứ cap >C= ở dc
144.3 va carbon methine -CH= ở ðc 122,2 đặc trưng cho 2 carbon olefin C13, C12; 1 carbon methine ké oxy -CH-O- ở dc 89,0 (C3); 6 carbon tứ cap >CCH-; 10 carbon methylene —CH>-; 7 carbon methyl bac bốn —CH3.
Sự hiện diện cua: 7 carbon methyl bậc bốn cùng với 2 carbon olefin, cùng với carbon carbonyl đặc trưng cho khung oleanolic Ngoài ra SSLO2 còn có: | carbon acetal -O—CH—O- ở ðc 106,2 (C1’); 4 carbon methine ké oxy -CH-O- ở 6¢ 77,5 (C3’, C5’), 74,8 (C2’), 73,1 (C4’) đặc trưng cho 1 đơn vi đường gắn vào khung oleanolic.
Phố 'H NMR (500 MHz, pyridine-d;, 5 ppm) (phụ luc 2.4) cho các tín hiệu:
1 proton olefin ở ồn 5,37 (1H, brs, H12); 1 proton oxymethine ở dy 3,31 (1H, dd, J = 4.0 va 11,5, H3); 1 proton methine ở ồn 3,15 (1H, dd, J = 4,0 va 13,5, H18); các proton methylene vung dy 1,21 - 2,29; và các proton nhóm methyl bac bốn 8; 0,69 - 1,21.
Ngoài ra còn các tín hiệu đặc trưng cho đơn vi đường: | proton anomer ở ở ồn
4.62 (1H, đ, 7= 7,5, H1’); các proton nhóm methine kề oxy cho tín hiệu mỗi / vùng ồn
Bên cạnh đó, phố COSY (phụ lục 2.7) va HSQC (phụ lục 2.5) giúp xác nhận tương tác giữa các proton trong don vi đường là D-glucuronic (GlcA) Mặt khác, với hang số ghép cặp J của proton anomer ở 644,82 (1H, đ, J = 7,5 Hz, H1’) chứng tỏ don vị đường là đường 6-D-GIcA.
Phố HMBC cho thấy các tương tác tương tự SSL0I, và ngoài ra còn có thêm tương tác giữa proton anomer ở dy 4,82 (1H, d, J = 7,5 Hz, H1’) với carbon methine mang oxy ở 8c 89,0 (C3); chứng tỏ don vị đường D-glucuronic gắn vào khung aglycon ở vi trí C3. là In °
Tóm lai từ các dữ liệu phổ HR-ESI-MS, 'H, C-NMR, kết hợp với phổ
DEPT, COSY, HSQC, HMBC, và so sánh với tài liệu””Ì: chúng tôi khang định
Bảng 4.2: Dữ liệu phổ ”C, 'H-NMR, HMBC của SSL02 và so sánh với t
Vt | NMR tri 5 ppm HMBC 5 ppm
Vl | NMR tri 5 ppm HMBC 5 ppm
*tin hiệu yếu không xác định
4.1.3 Biện luận cau trúc SSL03
Phố HR-ESI-MS (phụ lục 3.1) cho mũi ion phân tử giả với m/z: [M+Na]* 8174385 ứng với C¿z¿H¿O¡x4Na (so với lý thuyết 817,4345), cho phép xác định công thức phân tử của SSLO3 là Ca2H¿¿Oa.
Phố °C NMR (125 MHz, pyridine-d;, 8 ppm) (phụ lục 3.2) kết hợp với phổ DEPT90, DEPT135 (phụ lục 3.3) cho thay SSL03 có 42 carbon, trong đó 30 carbon tương tự SSL01 và SSL02: 1 carbon carbonyl >C=O ở õc 176.4 (C28); carbon tứ cấp
>C= ở bc 144,1 va carbon methine —CH= ở ửc 122,9 đặc trưng cho 2 carbon olefin
C13, C12; 1 carbon methine kề oxy -CH-O- ở 6¢ 89,1 (C3); 6 carbon tứ cấp >CCH-; 10 carbon methylene -CH;-; 7 carbon methyl bậc bốn —CHa.
Sự hiện diện của: 7 carbon methyl bậc bốn cùng với 2 carbon olefin, nhóm carbon carbonyl, oxymethine đặc trưng cho khung oleanolic Ngoài ra còn có các carbon đặc trưng sau: 2 carbon acetal -O-CH-O- ở 6¢ 107,3 (C1ˆ) va ðc 95,7 (C1’’);
1 carbon carbonyl >C=O ở õc 172.8 (C6’); 1 carbon methylene kề oxy -CH¿-O ở 8c 62,2 (C6’’); và 8 carbon methine kề oxy -CH-O-.
Tu đó, cho nhận định sơ bộ SSLO3 là saponin triterpen khung acid oleanolic với
2 đơn vị đường 6 carbon lần lượt là đường D-glucose (Glc) va D-glucuronic (GlcA).
Phố 'H NMR (500 MHz, pyridine-d;, 5 ppm) (phụ luc 3.4) cho các tín hiệu proton tương tự SSLO1: | proton olefin ở ồn 5,40 (1H, brs, H12); 1 proton oxymethine ở ồn 3,37 (1H, dd, J = 4,5 và 12,0, H3); 1 proton methine ở dy 3,17 (1H, dd, J = 3,5 va
13,5, H18); các proton methylene vùng dy 1,30 - 2,33; các proton nhóm methyl bac bốn 80,71 - 1,30.
Ngoài ra, còn có thêm một vài tín hiệu đặc trưng ở vùng trường thấp: | proton anomer ở ồn 6,30 (1H, d, J = 8,5, H1’’); 1 proton anomer ở dy 5.01 (1H, đ, J = 8,0,
H1’); các proton nhóm methine kề oxy cho tín hiệu mũi t ving 54 4,01 - 4,70.
Hang số ghép của 2 proton anomer giúp xác nhận 2 don vị đường gắn vào aglycon của SSLO3 đều là Pf.
Pho COSY (phụ lục 3.7) va HSQC (phụ lục 3.5) khang định lại các tương tác giữa các proton trong đơn vị đường D-glucose và tương tác giữa các proton trong đường D-glucuronic.
Phố HMBC (phụ lục 3.6) cho các tín hiệu tương tự với SSL01 giúp xác nhận phân aglycon là acid oleanolic Ngoài ra, còn có các tương tác: Proton anomer ở ồn 5,01 (1H, d, J = 6, H1’) tương tác với carbon methine ké oxy ở dc 89,1 (C3), chứng tỏ đơn vi đường D-glucuronic gan vào khung aglycon ở vị trí C3.
3 Proton anomer ở ồn 6,30 (1H, d, J = 6,5, HIˆˆ) tương tác với carbon carbonyl ở
5c 176,4 (C28), chứng tỏ đơn vị đường D-glucose gan vào khung aglycon ở vị trí C28.
Tóm lai từ các đữ liệu phổ H, C-NMR, kết hợp với phổ DEPT, HSQC, HMBC,
COSY và so sỏnh với tài liệu tham khảo!”'!: chỳng tụi khang định SSL03 là 3-O-ỉ-D- ứlucuronopyranosyl oleanolic
(Chikusetsusaponin IVa). acid 28-O-/ỉ-D-glucopyranosyl ester
Bang 4.3: Dữ liệu phố °C-NMR, HMBC, của SSL03 và so sánh với tài liệu tham khảo:
Vi trí C-NMR HMBC C-NMR
Vitri| C-NMR HMBC BC_NMR
4.1.4 Biện luận cau trúc SSL04
Phố HR-ESI-MS (phụ lục 4.1) cho mũi ion phân tử giả với m/z: [M+Na]* 831.4502 ứng với CaaH¿sOxNa (so với lý thuyết 831.4507), cho phép xác định công
Phố °C NMR (125 MHz, pyridine-d;, 5 ppm) (phụ lục 4.2) kết hợp với DEPT90, DEPT135 (phụ lục 4.3) cho thấy SSL04 có 43 carbon, trong đó có 30 carbon tương tự acid oleanolic SSLO1: 1 carbon carbonyl >C=O ở dc 176,5 (C28); carbon tu cap >C= ở dc 144,1 va carbon methine -CH= ở 6¢ 122,8 đặc trưng cho 2 carbon olefin C13, C12; 1 carbon methine ké oxy -CH-Q- ở 6c 89,1 (C3); 6 carbon tứ cấp >CCH-; 10 carbon methylene -CH-; 7 carbon methyl bậc bốn —CHs.
Ngoài ra còn thêm 12 carbon của 2 đơn vị đường D-glucose và D-glucuronic tương tự SSLO3: 2 carbon acetal -O-CH-O- ở dc 107,2 (C1’) và ðc 95,7 (C1’’); 1 carbon carbonyl >C=O ở 8c 170,8 (C6’); 1 carbon methylene kể oxy -CH¿-O 6 8c 62,2 (C6’’); và 8 carbon methine kề oxy -CH-O-.
