PowerPoint Presentation HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TÍNH GÂY BỆNH VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG TRỪ NẤM HỌ BOTRYOSPHAERIACEAE GÂY THỐI CUỐNG QUẢ BƠ SAU[.]
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TÍNH GÂY BỆNH VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG TRỪ NẤM HỌ BOTRYOSPHAERIACEAE GÂY THỐI CUỐNG QUẢ BƠ SAU THU HOẠCH I MỞ ĐẦU II ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NỘI DUNG ĐỀ TÀI III KẾT QUẢ - THẢO LUẬN IV KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ I MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài Trái bơ loại trái bổ dưỡng, tốt cho sức khỏe người Những tổn thất liên quan đến bệnh thối cuống bơ báo cáo tất vùng trồng bơ giới Nấm họ Botryosphaeriaceae mầm bệnh thối cuống bơ Nghiên cứu tính gây bệnh biện pháp phòng trừ nấm họ Botryosphaeriaceae gây thối cuống bơ sau thu hoạch I MỞ ĐẦU 1.2 Mục tiêu yêu cầu nghiên cứu đề tài Xác Mục tiêu định chế xâm nhiễm gây bệnh nấm họ Botryosphaeriaceae bơ sau thu hoạch Xác định khả phòng trừ bệnh thối cuống bơ sau thu hoạch Yêu cầu hoạt chất Fluodioxonil điều kiện invivo Phân lập nấm bệnh gây thối cuống bơ Định danh phân tử nấm phân lập Đánh giá tính gây bệnh nấm gây thối Xác định chế xâm nhiễm bào cuống lây nhiễm nhân tạo bơ tử nấm gây bệnh gây thối bơ STH Đánh giá khả phòng chống bệnh thối Đánh giá khả phòng chống bệnh cuống bơ STH hoạt chất Fluodioxonil thối cuống bơ điều kiện invivo trước thu hoạch II ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Mẫu bơ bệnh Đắk Nông, Sơn La, Gia Lai Nguồn nấm (L theobromae, L mahajangana, N parvum) gây bệnh thối cuống bơ phân lập lưu giữ Trung tâm nghiên cứu Bệnh nhiệt đới Quả bơ Hass, bơ Booth 7, bơ sáp Chế phẩm sử dụng: Thuốc SCHOLAR®230SC (fludioxonil 230g/L) Mơi trường ni cấy nấm: môi trường PDA, môi trường WA 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu Đề tài thực Trung tâm nghiên cứu bệnh nhiệt đới – Khoa Nông học – Học viện nông nghiệp Việt Nam – Trâu Qùy – Gia Lâm – Hà Nội Thời gian nghiên cứu: từ 10/2020 – 3/2021 II ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3 Nội dung nghiên cứu 01 Phân lập nấm gây bệnh thối cuống 02 Định danh nấm bệnh gây thối cuống bơ 03 Đánh giá tính gây bệnh nấm gây bệnh thối bơ bơ Sáp Hass 04 Nghiên cứu chế xâm nhiễm gây bệnh nấm họ Botryosphaeriaceae 05 06 bơ sau thu hoạch Nghiên cứu khả phòng chống bệnh thối cuống sau thu hoạch xử lý Fludioxonil trước thu hoạch Nghiên cứu khả phòng chống bệnh thối cuống sau thu hoạch xử lý Fludioxonil sau thu hoạch 2.4 Phương pháp đánh giá tính gây bệnh nấm gây bệnh thối bơ bơ giống Sáp Hass Công Nồng độ Thể tích bào tử thức (bào tử/ml) (µl) 106 Lây nhiễm thân 106 Lây nhiễm thân quả, dùng kim tiêm vô trùng tạo tổn thương 0 Nhỏ µl dung dịch nước cất 0 Nhỏ µl dung dịch nước cất, dùng kim tiêm vô trùng tạo tổn thương Phương pháp Số lần lặp (quả) 2.5 Phương pháp xác định chế xâm nhiễm nấm họ Botryosphaeriaceae vào bơ (giống Booth) Cơng Nồng độ Thể tích bào tử thức (bào tử/ml) (µl) 106 106 20 106 0 Phương pháp Số lần lặp (quả) Điểm đầu cuống cách núm 1cm Xung quanh núm điểm đối xứng thân - 2.6 Phương pháp đánh giá khả phòng chống bệnh thối cuống sau thu hoạch xử lý Fludioxonil trước thu hoạch điều kiện invivo Công thức 1: Xử lý thuốc Công thức 2: Đối chứng khơng xử lý thuốc Thí nghiệm lặp lại lần (3 cây) 2.7 Phương pháp đánh giá khả phòng chống bệnh thối cuống sau thu hoạch xử lý Fludioxonil sau thu hoạch điều kiện invivo Công Nồng độ Nồng độ hoạt chất Thể tích thức (bào tử/ml) (ppm) bào tử (µl) 106 300 25 Nhúng thuốc – 12h – Lây nhiễm nấm bệnh 106 300 25 Lây nhiễm nấm bệnh – 12h - Nhúng thuốc 106 25 Lây nhiễm nấm bệnh vào cuống, núm 300 Nhúng thuốc Phương pháp Số lần lặp (quả) III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập bệnh thối cuống bơ sau thu hoạch Bảng 3.1 Phân lập bệnh thối cuống bơ STH Đắk Nông, Sơn La Gia Lai Địa điểm Thời gian lấy mẫu lấy mẫu Sơn La 13/09/2020 Đắk Nông 21/09/2020 Giống Bệnh Booth Thối cuống Sáp Thối cuống Sáp Thối cuống Booth Thối cuống Gia Lai 05/10/2020 Booth Thối cuống Sơn La 12/11/2020 Booth Thối cuống Triệu chứng Xung quanh cuống xuất vết thâm màu nâu đen, xuất sợi nấm màu trắng cuống gây biến màu Xung quanh cuống xuất vết thâm màu nâu, xuất sợi nấm màu trắng gây thối nhũn, biến màu Xung quanh cuống xuất vết thâm màu nâu, xuất sợi nấm màu trắng đến trắng xám cuống vị trí gần cuống, gây thối nhũn, biến màu Xung quanh cuống xuất vết thâm màu nâu, xuất sợi nấm màu trắng đến trắng xám cuống gây biến màu Xung quanh cuống xuất vết thâm màu nâu đen, xuất sợi nấm màu đen xám cuống gây biến màu Xung quanh cuống xuất vết thâm màu nâu đen, xuất sợi nấm màu trắng cuống gây biến màu Hình 3.1 Mẫu bơ bệnh thu thập Sơn La, Gia Lai Đắk Nông B1 B2 B4 B7 B8 B9 Mẫu B1 B2 B4 B7 B8 B9 3.2 Định tên loại nấm phân lập bơ bị bệnh thối cuống sau thu hoạch phương pháp giải trình tự gen M B1 B2 B4 B7 B8 B9 M7 Hình 3.2 Sản phẩm PCR nhân vùng gen ITS mẫu nấm phân lập từ bệnh thối cuống bơ sau tinh chiết từ agarose gel (M thang DNA kb (GeneRuler kb, Thermo Scientific)) Bảng 3.2 Kết tìm kiếm Ngân hàng gen mẫu nấm phân lập từ bệnh thối cuống bơ dựa trình tự gen ITS STT Mẫu Địa điểm Giống Loại mơ Lồi xác định Mã GenBank Mức đồng trình tự (%) B1 Sơn La booth Quả Lasiodiplodia theobromae MF801620 99.8 B2 Sơn La sáp Quả (loại bán) Diaporthe hongkongensis MW202979 99.5 B4 Sơn La sáp Quả (loại bán) Diaporthe hongkongensis KY433558 99.1 B7 Đắk Nông booth Quả Lasiodiplodia theobromae MK530072 100 B8 Gia Lai booth Quả Lasiodiplodia theobromae MT644474 99.8 B9 Sơn La booth Quả (bảo quản MCP) Diaporther sp KY039149 98.5 M7 Đắk Lắk Không xác định Quả Lasiodiplodia theobromae MT644474 100 3.3 Đánh giá đặc điểm hình thái nấm gây bệnh thối cuống bơ Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái loài nấm gây bệnh thối cuống bơ Loài Lasiodiplodia theobromae Lasiodiplodia mahajangana Neofusicoccum parvum Mẫu Tốc độ phát triển tản nấm nhanh đều, phủ hoàn toàn bề mặt đĩa petri đến ngày Màu M7 khuẩn lạc thay đổi dần từ màu trắng đến xám đen sau bốn đến bảy ngày Sợi nấm ban đầu thưa, sau lên, mọc dày phía ngồi Tốc độ phát triển tản nấm nhanh đều, phủ hoàn toàn bề mặt đĩa petri đến ngày Màu M4 khuẩn lạc thay đổi dần từ màu trắng đến xám nhạt sau bốn đến bảy ngày Sợi nấm ban đầu thưa, sau lên, mọc thưa tâm S2 B2 Diaporthe hongkongensis Đặc điểm tản nấm B4 Tốc độ phát triển tản nấm nhanh, sợi nấm ban đầu thưa, sau lên, ban đầu có màu trắng mịn sau đáy chuyển sang màu đen Khuẩn lạc bao phủ đĩa với nhiều vòng dễ thấy, sợi nấm bơng ít, tâm mọc thưa hơn, phía ngồi mọc dày hơn, màu trắng, màu nhạt phía rìa Khuẩn lạc bao phủ đĩa với nhiều vịng dễ thấy, sợi nấm bơng ít, tâm mọc thưa hơn, phía ngồi mọc dày hơn, màu trắng, màu nhạt phía rìa Đáy màu vàng nhạt tâm, xung quanh màu trắng 3.3 Đánh giá đặc điểm hình thái nấm gây bệnh thối cuống bơ Bảng 3.4 Khả sinh sản đặc điểm bào tử phân sinh loài nấm gây bệnh thối cuống bơ Lồi Mẫu Kích thước bào tử (µm) Khả Đặc điểm bào tử phân sinh sinh bào tử Hình elip đến giống hình trứng, đầu rộng trịn, đầu thon, có thành dày, bào tử ban đầu suốt không L theobromae M7 22.8 ± 1.9 x 13.7 ± 1.3 Nhiều có vách ngăn, bào tử trưởng trưởng thành có màu từ nâu nhạt đến nâu sẫm xuất vách ngăn rõ ràng màu tối Hình elip đến hình trứng, thon hai đầu, có thành dày, L mahajangana M4 24.4 ± 2.1 x 16.2 ± 2.4 Nhiều bào tử ban đầu suốt khơng có vách ngăn, sau trưởng thành có màu tử nâu nhạt đến nâu sẫm xuất vách ngăn rõ ràng, màu tối N parvum S2 - Không D hongkongensis B2 6.5 ± 1.2 x Nhiều Hình bầu dục, suốt (Ghi chú: kích thước trung bình 30 bào tử ghi dạng TB ± SD) 3.3 Đánh giá đặc điểm hình thái nấm gây bệnh thối cuống bơ A A B C D A B C Hình 3.3 Đặc điểm hình thái nấm Hình 3.5 Đặc điểm hình thái nấm Lasiodiplodia theobromae (mẫu M7) Neofusicoccum parvum (mẫu S2) B C D A B D Hình 3.4 Đặc điểm hình thái nấm Hình 3.6 Đặc điểm hình thái nấm Lasiodiplodia mahajangana (mẫu M4) Diaporthe hongkongensis (mẫu B4) (Ghi chú: A Tản nấm PDA sau ngày (mặt trên) B Tản nấm PDA sau ngày(mặt dưới) C Quả cành (Pycnidium) nấm mọc thông đĩa WA D Bào tử phân sinh trưởng thành) 3.4 Đánh giá tính gây bệnh nấm gây bệnh thối bơ bơ giống Sáp Hass Bảng 3.5 Đánh giá tính gây bệnh loài nấm gây bệnh thối bơ lây nhiễm nhân tạo Số nhiễm bệnh/số lây Loài (mẫu) nấm lây nhiễm Bơ Sáp Tổn thương D hongkongensis (B2) D hongkongensis (B4) L theobromae (M7) L mahajangana (M4) N parvum (S2) 2/2 2/2 1/1 1/1 2/2 Không tổn thương 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 Bơ Hass Không tổn Tổn thương thương 0/5 0/5 3/5 0/5 5/5 0/5 3/5 0/5 5/5 0/5 Kích thước vết bệnh trung bình (mm) Bơ Sáp Bơ Hass 6.0 13.8 15.0 26.0 33.5 2.2 5.0 2.7 20.8 Ghi chú: số liệu đánh giá sau lây nhiễm ngày Mỗi mẫu nấm lây quả/giống Kích thước vết bệnh xác định sau bổ Hình 3.7 Minh họa kết lây nhiễm mẫu nấm bơ giống bơ Hass Ảnh chụp sau lây nhiễm ngày (Mũi tên đỏ vị trí lây nhiễm mẫu nấm S2 Mũi tên vàng vị trí lây nhiễm mẫu nấm M7) 3.5 Xác định chế xâm nhiễm nấm họ Botryosphaeriaceae vào bơ Bảng 3.6 Thí nghiệm xác định chế xâm nhập nấm họ Botryosphaeriaceae vào bơ Booth Booth Công thức CT1 CT2 CT3 Loài Số Số nấm xuất (đĩa) L theobromae (M7) Đầu cuống đối diện vết cắt 5/5 L mahajangana (M4) Đầu cuống đối diện vết cắt 5/5 L theobromae (M7) Núm 0/5 L mahajangana (M4) Núm 0/5 L theobromae (M7) Bề mặt thân 0/10 L mahajangana (M4) Bề mặt thân 0/10 CT4 Ghi chú: Loại mảnh mô tái phân lập Đầu cuống đối diện vết cắt 0/5 Núm 0/5 Bề mặt thân 0/5 CT1: Lây vào đầu cuống = đầu vết cắt CT2: Lây vào xung quanh núm, không gây tổn thương CT3: Lây vị trí đối xứng thân quả, khơng gây tổn thương CT4: Đối chứng, không lây 3.5 Xác định chế xâm nhiễm nấm họ Botryosphaeriaceae vào bơ Booth A B A B A B C Hình 3.8 Đánh giá tồn nấm môi trường WA (Chú thích: A - lây nhiễm dịch bào tử nấm Lasiodiplodia theobromae, B - lây nhiễm dịch bào tử nấm Lasiodiplodia mahajangana, C – khơng lây nhiễm) 3.6 Đánh giá khả phịng chống bệnh thối cuống sau thu hoạch xử lý Fludioxonil trước thu hoạch Bảng 3.7 Kết thí nghiệm đánh giá khả phịng chống bệnh thối cuống bơ Booth sau thu hoạch xử lý Fludioxonil trước thu hoạch Xử lý thuốc (n = 35) Đối chứng không xử lý (n = 34) Ngày đánh giá sau thu hoạch Tỷ lệ bệnh (%) Chỉ số bệnh (%) bị bệnh Cấp bệnh trung bình bị Tỷ lệ bệnh (%) bệnh Chỉ số bệnh (%) bị bệnh Cấp bệnh trung bình bị bệnh 9/10 0.0 0.0 0.0 2.9 2.0 1.0 10/10 0.0 0.0 0.0 2.9 5.0 1.0 11/10 0.0 0.0 0.0 2.9 10.0 1.0 13/10 31.4 3.7 1.0 58.8 8.8 1.5 14/10 57.1 9.7 1.6 88.2 12.7 1.7 15/10 80.0 18.1 2.2 88.2 57.9 5.9 85.7 6.3 1.1 88.2 18.6 2.0 15/10 (bên quả) T-test (bên quả, Phụ lục 3) - Chỉ số bệnh (%) bị bệnh xử lý đối chứng: t (35.906) = 3.403; p = 0.002 - Cấp bệnh bị bệnh xử lý đối chứng: t(67) = 2.648; p = 0.010 3.6 Đánh giá khả phòng chống bệnh thối cuống sau thu hoạch xử lý Fludioxonil trước thu hoạch Hình 3.9 Khả phịng chống bệnh thối bơ Booth phun Fludioxonil trước thu hoạch Hình chụp sau thu hoạch 13 ngày 3.7 Đánh giá khả phòng chống bệnh thối cuống sau thu hoạch xử lý Fludioxonil sau thu hoạch Bảng 3.8 Đánh giá khả phòng chống bệnh thối cuống bơ xử lý Fludioxonil sau thu hoạch Cơng thức CT1 Lồi CT4 Ghi chú: ngày sau thí nghiệm TLB (%) CSB (%) CBTB TLB (%) CSB (%) CBTB TLB (%) CSB (%) ngày sau thí nghiệm CBTB TLB (%) ngày sau thí nghiệm ngày sau thí nghiệm (trong quả) CSB (%) CBTB TLB (%) CSB (%) CBTB TLB (%) CSB (%) CBTB 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 20.0 5.0 1.0 20.0 5.0 1.0 L mahajangana (M4) 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 20.0 5.0 1.0 40.0 7.5 1.0 10 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 20.0 5.0 1.0 30.0 6.7 1.0 L theobromae (M7) 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 60.0 6.7 1.0 80.0 6.0 1.0 L mahajangana (M4) 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 40.0 5.0 1.0 80.0 7.0 1.0 80.0 7.5 1.0 10 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 20.0 5.0 1.0 70.0 6.9 1.0 80.0 6.8 1.0 L theobromae (M7) 0.0 0.0 0.0 100 30.0 3.0 100 56.0 5.8 100 78.0 8.0 100 85.7 8.8 100 92.2 9.4 L mahajangana (M4) 0.0 0.0 0.0 100 29.0 3.2 100 46.0 4.8 100 84.4 8.6 100 94.8 9.6 100 98.0 10.0 Tổng loài 0.0 0.0 0.0 100 29.5 3.1 100 51.0 5.3 100 81.2 8.3 100 90.3 9.2 100 95.1 9.7 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 Tổng lồi CT3 n ngày sau thí nghiệm L theobromae (M7) Tổng loài CT2 ngày sau thí nghiệm TLB: Tỷ lệ bệnh, tính theo số bị bệnh/số thí nghiệm CSB: Chỉ số bệnh (của số bị bệnh) CBTB: Cấp bệnh trung bình (của số bị bệnh) n: Số thí nghiệm 3.7 Đánh giá khả phòng chống bệnh thối cuống sau thu hoạch xử lý Fludioxonil sau thu hoạch Hình 3.10 Khả phịng chống bệnh thối bơ xử lý Fludioxonil sau thu hoạch Hình chụp ngày sau xử lý lây nhiễm Ghi chú: A Thí nghiệm với Lasiodiplodia theobromae (mẫu M7) B Thí nghiệm với Lasiodiplodia mahajangana (mẫu M4) CT1 (Công thức 1): Nhúng vào dung dịch Fludioxonil 300ppm trước, sau 12h lây nhiễm nấm bệnh CT2 (Công thức 2): Lây nhiễm nấm bệnh trước, sau 12h nhúng vào dung dịch Fludioxonil 300ppm CT3 (Công thức 3): Đối chứng 1: Lây nhiễm nấm bệnh vào cuống, núm CT4 (Công thức 4): Đối chứng 2: Nhúng vào dung dịch Fludioxonil (Scholar230SC) 300 ppm