TĂNG CƯỜNG QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP TINH BỘT Ở CÂY MÔ HÌNH THUỐC LÁ THÔNG QUA VIỆC CHUYỂN GEN MÃ HÓA ADP GLUCOSE PYROPHOSPHORYLASE CỦA VI KHUẨN

TĂNG CƯỜNG QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP TINH BỘT Ở CÂY MÔ HÌNH THUỐC LÁ THÔNG QUA VIỆC CHUYỂN GEN MÃ HÓA ADP GLUCOSE PYROPHOSPHORYLASE CỦA VI KHUẨN

Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 14(1): 139-148, 2016 TĂNG CƯỜNG QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP TINH BỘT Ở CÂY MƠ HÌNH THUỐC LÁ THƠNG QUA VIỆC CHUYỂN GEN MÃ HÓA ADP GLUCOSE PYROPHOSPHORYLASE CỦA VI KHUẨN Lê Thu Ngọc1, Nguyễn Mậu Hưng1, Đinh Văn Hùng3, Nguyễn Thị Minh Hồng1,2, Phạm Bích Ngọc1, Chu Hồng Hà1 Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Trường Đại học Hồng Đức Trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên Ngày nhận bài: 23.9.2015 Ngày nhận đăng: 25.3.2016 TÓM TẮT Tinh bột polysaccaride dự trữ thực vật, đóng vai trị quan trọng bậc chế độ dinh dưỡng người nhiều loài động vật, đồng thời nguyên liệu thô công nghiệp chế biến thực phẩm cơng nghiệp vật liệu Do đó, hướng nghiên cứu quan tâm làm tăng hàm lượng tinh bột trồng sở tăng cường hoạt động số gen mã hóa enzyme đóng vai trị quan trọng q trình sinh tổng hợp tích lũy tinh bột ADP-Glc pyrophosphorylase (AGPase) chứng minh enzyme điều hòa quan trọng, điều chỉnh tốc độ phản ứng tồn chu trình sinh tổng hợp glycogen vi khuẩn tinh bột thực vật Trong nghiên cứu này, gen nhân tạo tối ưu mã AGPopt với kích thước 1,5 kb có nguồn gốc từ gen glgC mã hóa cho enzyme AGPase vi khuẩn E coli mang đột biến thay glycine aspartic acid vị trí 393 nhằm giảm lực với chất ức chế nối ghép với vector chuyển gen thực vật chuyển vào mơ hình thuốc lá, hoạt động điều khiển promoter 35S Sự tích hợp gen AGPopt vào genome thực vật khẳng định kỹ thuật PCR Southern blot, đồng thời phương pháp lai Western blot phát biểu AGPase dòng thuốc chuyển gen Đặc biệt, phép đo hàm lượng tinh bột tích lũy dịng chuyển gen cho thấy có dịng chứa lượng tinh bột cao dịng đối chứng khơng chuyển gen, dịng có mức tăng cao 56%, dịng cịn lại có mức tăng từ 18%-44% Những chứng bước đầu cho thấy việc biểu gen AGPopt chiến lược hiệu giúp tăng cường trình sinh tổng hợp tinh bột thực vật Từ khóa: ADP-Glc pyrophosphorylase, gen glgC, sinh tổng hợp tinh bột, thuốc biến đổi gen MỞ ĐẦU Tinh bột dạng dự trữ carbon quan trọng sinh vật nhân chuẩn quang hợp số loài phát sinh khơng có khả quang hợp ký sinh trùng ngành Apicomplexa nhóm tảo đơn bào hai roi (Ball & Morell, 2003) Về cấu tạo, tinh bột glucose polymer gồm đơn phân α-glucan nối với liên kết α-1,4 phân nhánh vị trí liên kết α-1,6 (Ball et al., 1996) Ở thực vật bậc cao, tinh bột tổng hợp lạp thể (plastid) tế bào quang hợp không quang hợp Là carbohydrate dự trữ chủ yếu, tinh bột đóng vai trị quan trọng suốt chu kỳ sống thực vật Trong lá, phần nhỏ carbon đồng hóa thơng qua quang hợp giữ lại lục lạp (chloroplast) dạng tinh bột khơng chuyển hóa thành sucrose để vận chuyển đến phận khác Dạng tinh bột tạm thời phân hủy vào ban đêm để cung cấp chất cho q trình hơ hấp tiếp tục tổng hợp sucrose cho việc phát triển khác Sự cung cấp carbon từ tinh bột cho cần thiết cho sống sinh trưởng bình thường (Smith, Stitt, 2007) Trong quan khơng diễn q trình quang hợp thân, rễ, củ hạt, sucrose chuyển hóa thành lượng lớn tinh bột dự trữ loại lạp thể chuyên biệt gọi bột lạp (amyloplast) Tinh bột lưu trữ tái huy động để hỗ trợ pha sinh trưởng tạo sau nảy mầm cần nguồn carbon cho số trình đặc biệt tiết mật hoa (Fincher, 1989; Razem et al., 1999) Với vai trò dinh dưỡng nguồn cung cấp calo, hầu hết tinh bột trồng dùng trực tiếp làm thực phẩm cho người thức ăn chăn nuôi Tuy nhiên, nhu cầu sử dụng tinh bột công nghiệp ngày tăng 139 Lê Thu Ngọc et al lên tính chất lý hóa chúng dùng làm chất tạo độ sánh nhớt cho thực phẩm dạng lỏng, tác nhân làm bền cho thực phẩm dạng keo, yếu tố kết dính làm đặc, tạo độ cứng đàn hồi cho nhiều thực phẩm Đặc biệt tinh bột nguồn vật liệu chủ yếu cho hệ nguyên liệu sinh học đặc tính dễ lên men (Zeeman et al., 2010) Quá trình tổng hợp tinh bột bao gồm ba bước quan trọng xảy lục lạp bột lạp: i) Cung cấp Glc-6-P vào lạp thể, ii) Tổng hợp ADP-Glc từ Glc-1-P, iii) Tổng hợp tinh bột từ ADP-Glc (Alisdair et al., 2002) Như vậy, bước phản ứng thiếu, tạo chất cho đường sinh tổng hợp tinh bột tổng hợp ADP-Glc từ Glc-1-P ATP xúc tác ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase) ADP-Glc phân tử đường mồi đóng vai trị chất cho (glucosyl donor) phản ứng tổng hợp chuỗi α-glucan xúc tác enzyme tổng hợp tinh bột (starch synthase) (Munyikwa et al., 1997) Nhiều nghiên cứu thực nghiệm chứng minh AGPase enzyme điều hòa đường sinh tổng hợp glycogen vi khuẩn tinh bột thực vật Ở E coli Salmonella, phương pháp gây đột biến hóa học, người ta thu số dạng đột biến khả tích lũy glycogen, AGPase chúng có đặc tính điều hịa bị biến đổi Kết phân tích cho thấy có mối liên hệ trực tiếp lực AGPase với chất hoạt hóa Fruc-1,6-bisP khả tích lũy glycogen thể đột biến (Ballicora et al., 2003) Khi nghiên cứu sinh vật quang hợp sản sinh oxy, cụ thể tảo lục đơn bào Chlamydomoras reinhardtii, Ball đồng tác giả (1991) phân lập thể đột biến thiếu hụt tinh bột thấy AGPase chúng không hoạt hóa 3-phosphoglyceric acid (3-PGA) Các liệu thực nghiệm so sánh khác chứng minh điều hòa dị lập thể AGPase đóng vai trị quan trọng mặt sinh lý mô quang hợp không quang hợp thực vật bậc cao (Giroux et al., 1996; Smidansky et al., 2002) Như vậy, đường sinh tổng hợp glycogen vi khuẩn tinh bột thực vật điều hòa cách hiệu bước – tổng hợp chất ADP-Glc xúc tác AGPase Ở thực vật, AGPase protein có cấu trúc dị tứ phân (heterotetramer) phức tạp, tạo thành từ chuỗi polypeptide riêng biệt cặp tiểu đơn vị lớn (large subunit) cặp tiểu đơn vị nhỏ (small subunit), hai tiểu đơn vị mã hóa hai gen khác Tiểu đơn vị lớn có kích thước 54-60 140 kDa, kích thước tiểu đơn vị nhỏ 51-54 kDa tùy loài thực vật (Martin and Smith, 1995) Các nghiên cứu hai tiểu đơn vị có vai trị khác nhau, tiểu đơn vị nhỏ cho có chức xúc tác điều hòa, tiểu đơn vị lớn chủ yếu chịu trách nhiệm điều hịa đặc tính dị lập thể tiểu đơn vị nhỏ (Frueauf et al., 2003; Baris et al., 2009), nhiên hai cần thiết để AGPase hoạt động hiệu (Frueauf et al., 2001; Tiessen et al., 2002) Yêu cầu khiến cho việc tác động mặt di truyền đến AGPase thực vật thách thức địi hỏi phải cải biến biểu hoạt động nhiều gen Thêm vào đó, AGPase thực vật hoạt hóa 3-PGA, bị ức chế photphate vô (Pi) điều hịa trạng thái oxy hóa khử tế bào (Ballicora et al., 2000; Tiessen et al., 2002; Geigenberger, 2003) Trong đó, AGPase vi khuẩn protein có cấu trúc đồng tứ phân (homotetrameric) điều hòa chất tác động khác với thực vật Enzyme hoạt hóa Fruc-1,6-bisP bị ức chế adenosine monophosphate (AMP) (Morán et al., 2007) AGPase vi khuẩn E coli mã hóa đơn gen glgC điều quan trọng có hoạt tính mạnh gấp vài trăm lần so với AGPase thực vật Ngoài ra, nghiên cứu xác định số vị trí cho điểm điều hòa dị lập thể quan trọng Người ta thấy AGPase E coli mang đột biến điểm thay glycine aspartic acid vị trí 336 (G336D) hoạt động hiệu mà khơng cần chất hoạt hóa Fruc-1,6-bisP, có lực cao với chất (ATP Glc-1-P) giảm lực với chất ức chế AMP (Ihemere et al., 2006) Kết chuyển biểu đặc hiệu gen củ khoai tây (dưới điều khiển promoter patatin) cho thấy hoạt tính AGPase tăng 36%, đồng thời tăng 35% hàm lượng tinh bột củ (Stark et al., 1992) Trong nghiên cứu này, thiết kế vector chuyển gen vào thực vật mang gen AGPopt có nguồn gốc từ gen glgC E coli mã hóa cho enzyme AGPase tạo đột biến G336D cải biến mã để phù hợp với hệ thống tổng hợp protein thực vật; tạo dòng thuốc chuyển gen biểu AGPase vi khuẩn định hướng tới lục lạp điều khiển promoter định 35S đánh giá tác động enzyme tới trình sinh tổng hợp tích lũy tinh bột dòng chuyển gen Kết nghiên cứu góp phần tạo tiền đề cho chiến lược nâng cao sản lượng tinh bột trồng cơng nghệ gen Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 14(1): 139-148, 2016 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Phương pháp chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium Vật liệu Giống thuốc Nicotiana tabacum K326 nuôi cấy điều kiện in vitro; vector tách dòng pUC/AGPopt mang gen AGPopt tổng hợp nhân tạo hãng IDT (Integrated DNA Technologies, Mỹ), vector chuyển gen vào thực vật pBI121; chủng vi khuẩn Escherichia coli DH5α, Agrobacterium tumefaciens C58/pGV2260 Phịng Cơng nghệ Tế bào thực vật, Viện Cơng nghệ sinh học cung cấp Phương pháp Thu thập thông tin, tối ưu hóa mã di truyền tổng hợp nhân tạo gen AGPopt Tìm kiếm khai thác thơng tin trình tự nucleotide gen glgC mã hóa cho enzyme AGPase vi khuẩn E coli ngân hàng GenBank (mã số V00281.1), cải biến trình tự để tạo đột biến G336D Tối ưu hóa mã di truyền chương trình Codon Usage Database (http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html) Codon Optimization 2.0 Invitrogen Đoạn nucleotide mã hóa cho chuỗi peptide tín hiệu dẫn protein vào lục lạp có nguồn gốc từ gen rbcS mã hóa tiểu phần nhỏ enzyme ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase Arabidopsis gắn vào đầu 5’, đồng thời trình tự mã hóa cho c-myc gắn vào đầu 3’ đoạn DNA Hai vị trí nhận biết enzyme giới hạn XbaI SacI thêm vào đầu 5’ 3’ gen, theo thứ tự tương ứng Gen AGPopt đặt tổng hợp nhân tạo hãng Integrated DNA Technologies (Mỹ) nhân dòng vector pUCIDT-AMP Thiết kế vector chuyển gen vào thực vật mang gen AGPopt Vector tách dòng pUCIDT-AMP mang gen nhân tạo AGPopt vector chuyển gen pBI121 đồng thời cắt tạo đầu sole cặp enzyme giới hạn XbaI SacI Đoạn gen AGPopt nhân tạo vector pBI121 thu sau tinh sử dụng làm nguyên liệu cho phản ứng nối ghép xúc tác T4-DNA ligase Sản phẩm lai biến nạp vào E coli DH5α theo phương pháp sốc nhiệt Vector chuyển gen tái tổ hợp pBI121/AGPopt sau kiểm tra cách cắt enzyme hạn chế biến nạp vào chủng A tumefaciens C58/pGV2260 phương pháp xung điện phục vụ cho mục đích chuyển gen vào thực vật Quy trình chuyển gen AGPopt vào giống thuốc N tabacum K326 thông qua Agrobacterium tiến hành theo phương pháp Topping (1998) có tiến Mảnh thuốc có diện tích 1cm2 ngâm dịch huyền phù vi khuẩn A.tumefaciens mang vector chuyển gen pBI121/AGPopt có OD600 = 0,7 khoảng 10-20 phút đặt lên môi trường tạo đa chồi MS+1 mg/l BAP Sau ngày đồng nuôi cấy, chuyển mảnh sang mơi trường chọn lọc MS+1 mg/l BAP có bổ sung kháng sinh cefotaxim 500 mg/l kanamycine 50 mg/l Sau tuần, chồi phát triển tốt cấy chuyển sang môi trường tạo rễ MS + 0,1 mg/l NAA Sau - tuần rễ phát triển hoàn chỉnh với 3-4 thật sẵn sàng cho bầu trấu : cát (1:1) Cây phát triển với 4-5 thật chuyển trồng bầu chứa giá thể điều kiện nhà kính Phân tích chuyển gen kỹ thuật sinh học phân tử Kỹ thuật PCR Sử dụng DNA tổng số tách chiết từ dòng thuốc chuyển gen pha lỗng tới nồng độ 100 ng/µl làm khn cho phản ứng PCR kiểm tra có mặt gen chuyển AGPopt cặp mồi đặc hiệu AGPopt_F (5’-ATGGCAAGCATGATTTCTAGTAGT-3’) AGPopt_R (5’-CAGTTCATCTTTATTAAGGTC-3’) Phản ứng PCR tiến hành với tổng thể tích 20 µl gồm: µl DNA, 10 µl DreamTaq PCR Master Mix 2X, µl mồi xuôi, µl mồi ngược µl nước khử ion vơ trùng Q trình nhân gen gồm bước sau: 94oC/3 phút; 30 chu kỳ lặp lại bước 94oC/1 phút, 57oC/30 giây, 72oC/1 phút; 72oC/10 phút, bảo quản mẫu 4oC Kỹ thuật lai Southern blot 60 µg DNA tổng số tách chiết từ dòng thuốc chuyển gen dương tính với phản ứng PCR tinh xử lý XbaI Các phân đoạn DNA phân tách gel agarose 1% chuyển sang màng Nilon tích điện dương Màng sau lai với mẫu dò tổng hợp nhờ Kit Biotin DecaLabel DNA Labeling Kit (Thermo Scientific) với đoạn dò sản phẩm PCR nhân gen AGPopt Nhiệt độ lai 42°C (với dung dịch lai chứa 50% formamide NaCl 1M) rửa màng 65°C (0,1X SSC) Quy trình màng thực theo kit Biotin Chromogenic Detection Kit (Thermo Scientific) 141 Lê Thu Ngọc et al Kỹ thuật lai Western blot 0,1 g dòng thuốc chuyển gen nghiền mịn nitơ lỏng hòa 500 µl dung dịch đệm chiết (50 mM Tris-HCl pH 7,4; mM EDTA; mM MgCl2; mM DTT; 2,5 mM PMSF; 0,1% Triton-X-100) Hỗn hợp sau ly tâm 13000 vòng/phút 15 phút 4oC, thu dịch có chứa protein Nồng độ mẫu protein tổng số định lượng phương pháp Bradford 30 µg protein tổng số tách chiết từ dịng thuốc phân tách điện di SDS-PAGE gel 12%, sau chuyển lên màng Nitrocellulose máy chuyển màng Fast blotter hãng Thermo Scientific Pierce 25 V, 1,3 A 20 phút Sau phủ màng sữa tách béo 5% pha PBST 0.05% giờ, màng ủ với kháng thể anti-cmyc qua đêm trước ủ với kháng thể antimouse IgG cộng hợp HRP Sự có mặt protein tái tổ hợp phát nhờ phản ứng màu chất DAB (3,3'-diaminobenzidinetetrahydrochloride-dihydrate) Phương pháp phân tích hàm lượng tinh bột Các bước xác định hàm lượng tinh bột dòng thuốc chuyển gen thực theo hướng dẫn Kit phân tích tinh bột (Starch (HK) Assay Kit, Sigma) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Cải biến, tối ưu mã di truyền tổng hợp nhân tạo gen AGPopt Thực vật xem hệ thống biểu protein tái tổ hợp với nhiều điểm khác biệt so với hệ thống biểu vi khuẩn Sự biểu gen đích hệ thống thực vật phụ thuộc vào nhiều yếu tố có mã di truyền, promoter terminator Mỗi loài thực vật có mã di truyền ưu tiên khác Do đó, việc cải biến mã di truyền mà khơng làm thay đổi trình tự amino acid giúp cho việc tăng cường biểu protein tái tổ hợp Sơ đồ trình thiết kế gen nhân tạo AGPopt thể hình Sau tạo đột biến G336D, việc tối ưu mã di truyền thực dựa sở mã thay đổi cho phù hợp với hệ thống biểu thực vật khơng làm thay đổi trình tự amino acid Trình tự nucleotide trình tự axid amin suy diễn đoạn gen trước sau đổi mã kiểm tra so sánh phần mềm BioEdit Kết cho thấy, gen glgC gen AGPopt cải biến mã có trình tự nucleotide tương đồng 74% Tuy nhiên ngồi vị trí tạo đột biến G336D, vị trí sai khác cịn lại khơng làm ảnh hưởng đến q trình dịch mã (khơng cơng bố) Ngồi ra, gen AGPopt cịn gắn thêm đoạn trình tự 171 nucleotide mã hóa cho 57 amino acid chuỗi peptide tín hiệu dẫn protein vào lục lạp có nguồn gốc từ gen rbcS mã hóa tiểu phần nhỏ ribulose 1,5bisphosphate carboxylase Arabidopsis vào đầu 5’, đầu 3’ bổ sung 48 nucleotide mã hóa cho 11 amino acid c-myc (giúp phát protein tái tổ hợp thông qua phương pháp lai Western) Đồng thời, để thuận tiện cho việc cắt nối ghép gen trình thiết kế vector chuyển gen vào thực vật, hai vị trí nhận biết enzyme giới hạn XbaI SacI thêm vào đầu 5’ 3’ gen AGPopt, theo thứ tự tương ứng Gen AGPopt sau thiết kế có kích thước 1500 bp tổng hợp nhân tạo hãng Integrated DNA Technologies (Mỹ) nhân dòng vector pUCIDTAMP SacI site Gen AGPopt nhân tạo (1500 bp) Hình Sơ đồ thiết kế gen AGPopt nhân tạo 142 Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 14(1): 139-148, 2016 Thiết kế vector chuyển gen vào thực vật pBI121/AGPopt Như trình bày trên, q trình thiết kế vị trí nhận biết cặp enzyme giới hạn XbaI SacI thêm vào đầu gen AGPopt, điều tạo thuận lợi cho việc cắt nối gen thí nghiệm Theo đó, vector pUC/AGPopt pBI121 xử lý đồng thời cặp XbaI SacI Đoạn gen AGPopt vector pBI121 loại bỏ gen gus sau tinh (Hình 2A) sử dụng làm nguyên liệu cho phản ứng nối ghép xúc tác T4-DNA ligase tạo thành vector tái tổ hợp pBI121/AGPopt nhân dòng vi khuẩn E coli DH5α Vector tái tổ hợp khẳng định phản ứng PCR nhân gen AGPopt (không công bố) sử dụng mồi đặc hiệu AGPopt_F/R cắt kiểm tra cặp giới hạn XbaI SacI Kết điện di gel agarose 0,8% (Hình 2B) cho thấy: sản phẩm phản ứng cắt vector tái tổ hợp cặp enzyme XbaI SacI hai băng DNA, băng có kích thước 1,5 kb tương ứng với gen AGPopt băng cịn lại có kích thước lớn 10 kb phù hợp với phần lại vector pBI121 Như vậy, thiết kế thành cơng vector chuyển gen pBI121/AGPopt Vector sau biến nạp vào vi khuẩn A tumefaciens C58/pGV 2260 phương pháp xung điện để phục vụ cho mục đích chuyển gen vào thực vật 1 M M bp bp 20000 10000 5000 3000 1500 1000 500 A Hình Kết thiết kế vector chuyển gen pBI121/AGPopt (A) Tinh đoạn gen AGPopt (2) vector pBI121 xử lý loại bỏ gen gus (1) cặp enzyme XbaI SacI (B) Kết cắt kiểm tra vector tái tổ hợp pBI121/AGPopt cặp enzyme XbaI SacI (1); M: Thang DNA chuẩn 1kb Plus, Thermo Scientific Kết tạo dòng thuốc chuyển gen AGPopt Trong chuyển gen thực vật, thuốc xem loại mơ hình phục vụ cho nghiên cứu đánh giá chức gen hệ thống tái sinh tiếp nhận gen ngoại lai hiệu quả, thời gian phân hóa từ mơ đến tạo hoàn chỉnh ngắn, mặt khác thuốc ngắn ngày, dễ trồng chăm sóc nên dễ dàng thu hạt để nghiên cứu hệ Bởi vậy, nghiên cứu chúng tơi chọn thuốc làm mơ hình để đánh giá ảnh hưởng việc biểu gen AGPopt đến q trình sinh tổng hợp tích lũy tinh bột Kết chuyển gen AGPopt vào mảnh thuốc thông qua Agrobacterium cho thấy, sau khoảng tuần từ mảnh biến nạp đa số mọc lên cụm chồi mép lá, tỉ lệ mẫu tạo đa chồi cao, đạt 81% Trong đó, mẫu đối chứng âm không chuyển gen đặt mơi trường có chứa kháng sinh chọn lọc kanamycin 50 mg/l bị chết dần hầu hết không thấy tượng phát sinh chồi (Hình 3) Từ cụm chồi, chọn 60 chồi khỏe, mập mạp chuyển sang môi trường rễ chọn lọc kháng sinh Sau tuần, thu 53 rễ phát triển hoàn chỉnh với 3-4 thật để bầu trấu cát trồng nhà lưới (Hình 3) 143 Lê Thu Ngọc et al B A D C E H G F I K Hình Một số hình ảnh chuyển gen AGPopt vào thuốc thông qua Agrobacterium A: Khuẩn Agrobacterium, B: Dịch huyền phù vi khuẩn, C: Mẫu môi trường đồng nuôi cấy, D: Mẫu biến nạp sau tuần môi trường tạo đa chồi, E: Mẫu biến nạp sau tuần môi trường tạo đa chồi, F: Chồi môi trường rễ, G: Chồi rễ môi trường rễ sau tuần, H: Cây hoàn chỉnh, I: Cây bầu trấu cát, K: Cây trồng nhà lưới sau tuần Kiểm tra có mặt gen AGPopt dịng thuốc chuyển gen kỹ thuật PCR Southern blot PCR kỹ thuật phổ biến đơn giản để bước đầu sàng lọc dòng chuyển gen Kết phản ứng cho phép khẳng định tồn hay không gen chuyển genome kiểm tra Chúng sử dụng 200 ng DNA tổng số tách chiết từ 30 dòng thuốc chuyển gen tuần tuổi chọn ngẫu nhiên làm khuôn cho phản ứng PCR nhân gen AGPopt với cặp mồi đặc hiệu AGPopt_F/R Đồng thời, vector chuyển gen pBI121/AGPopt DNA tổng số tách chiết từ thuốc không chuyển gen sử dụng làm đối chứng dương đối chứng âm cho phản ứng Hình ảnh điện di cho thấy có 27 dịng thuốc cho kết PCR dương tính với kích thước băng DNA sản phẩm 1,5 kb tương ứng với gen AGPopt (Hình 4) Điều chứng tỏ gen AGPopt có khả chuyển thành cơng vào dịng thuốc bp Hình Điện di sản phẩm phản ứng PCR kiểm tra có mặt gen AGPopt dòng thuốc chuyển gen 1-13: Các dòng thuốc chuyển gen AGPopt, ĐC-: WT, ĐC+: phản ứng PCR sử dụng khuôn DNA plasmid pBI121/AGPopt, M: thang DNA chuẩn kb (Thermo Scientific) 144 Tạp chí Công nghệ Sinh học 14(1): 139-148, 2016 Đối với dịng thuốc xác định có mang gen AGPopt, tiếp tục tiến hành lai Southern blot để khẳng định tích hợp số lượng copy gen chuyển genome chủ Trên màng lai, băng tương ứng với copy gen AGPopt chúng tơi xử lý DNA tổng số dòng thuốc chuyển gen XbaI enzyme có điểm cắt cassette Phân tích lai Southern blot dịng thuốc (Hình 5) cho thấy dòng xuất băng (dòng 1, 2, 3, 4, 7) băng (dòng 5, 6) tương ứng với gen AGPopt genome Kích thước băng khơng đồng cho thấy vị trí gắn gen chuyển genome khác Trong đối chứng khơng chuyển gen cho kết âm tính chứng tỏ phản ứng lai đặc hiệu, mẫu dị khơng liên kết với gen nội sinh Như vậy, gen AGPopt chuyển thành cơng vào dịng thuốc K326 Một số nghiên cứu cho thấy không số lượng copy gây ảnh hưởng đến biểu gen mà vị trí chèn gen chuyển genome đóng vai trị quan trọng (Yang et al., 2013) Vì vậy, cần có nghiên cứu để đánh giá khả biểu gen dịng Hình Kết lai Southern blot mẫu thuốc chuyển gen AGPopt (1-7); P: đối chứng dương plasmid pBI121/AGPopt; WT: đối chứng âm không chuyển gen; M: thang DNA chuẩn kb (Thermo Scientific) Hình Kết lai Western blot kiểm tra biểu gen AGPopt dòng thuốc chuyển gen (1-7); WT: đối chứng âm không chuyển gen; ĐC+: 25 ng protein ScFv_cmyc; M: marker protein (Thermo Scientific) Đánh giá biểu gen AGPopt dòng thuốc chuyển gen phương pháp Western blot Sự biểu protein tái tổ hợp đích đến quan trọng q trình chuyển gen vào thực vật Do trình tự gen AGPopt chúng tơi thiết kế sẵn trình tự mã hóa cho c-myc đầu 3’nên để khẳng định cách chắn gen chuyển hoạt động biểu dòng thuốc chuyển gen tiến hành kiểm tra kỹ thuật lai Western blot sử dụng kháng thể anti-c-myc Gen AGPopt nhân tạo có kích thước 1500 bp nên 145 Lê Thu Ngọc et al theo tính tốn lý thuyết, protein AGPase tái tổ hợp sau tổng hợp có khối lượng phân tử khoảng 53 kDa Kết lai Western blot (Hình 6) cho thấy đường chạy protein tổng số tách chiết từ dòng thuốc chuyển gen xuất băng vạch phù hợp với kích thước protein đích, dịng đối chứng âm không xuất băng protein Điều chứng tỏ protein tái tổ hợp AGPase biểu dòng thuốc chuyển gen Qua độ đậm nhạt băng protein màng lai thấy mức độ biểu gen chuyển dòng thuốc khác Cụ thể, dòng số gen AGPopt biểu mạnh dòng lại, đồng thời gen biểu yếu dịng số Điều giải thích cấu trúc gen chuyển chèn vào vùng khác hệ gen chủ, gây ảnh hưởng đến hoạt động mức độ biểu gen ngoại lai Kết lai Western blot cho phép khẳng định gen AGPopt hoạt động protein tái tổ hợp AGPase vi khuẩn tổng hợp chủ Phân tích hàm lượng tinh bột dòng thuốc chuyển gen Phép đo hàm lượng tinh bột phương pháp enzyme sử dụng Kit Starch (HK) Assay thực dựa nguyên lý: i) Tinh bột thủy phân thành glucose xúc tác amyloglucosidase; ii) Glucose tiếp tục phosphoryl hóa ATP phản ứng xúc tác hexokinase tạo thành Gluc-6P; iii) Gluc-6P sau bị oxy hóa thành 6-phosphogluconate có mặt NAD xúc tác glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH), trình đồng thời khử NAD thành NADH chất hấp thu ánh sáng có bước sóng 340 nm Do đó, mức tăng độ hấp thu 340 nm tỷ lệ thuận với nồng độ glucose gián tiếp hàm lượng tinh bột Trong thí nghiệm này, để đảm bảo độ xác kết quả, tiến hành chiết mẫu lần với cồn 80% lần với cồn 99% nhằm loại bỏ hoàn toàn lượng đường tự có mẫu trước tiến hành phản ứng enzyme Kết xác định hàm lượng tinh bột cho thấy số dòng thuốc chuyển gen khảo nghiệm có dịng chứa lượng tinh bột cao dịng đối chứng khơng chuyển gen Trong đó, hàm lượng tinh bột dòng A1 đạt mức cao nhất, nhiều 56% so với đối chứng, dòng lại (A4, A5, A6 A7) có mức tăng từ 18%-44% Tuy nhiên, dòng thuốc chuyển gen A2 A3, lượng tinh bột tích lũy ghi nhận thấp khơng chuyển gen Ngồi ra, mức độ tăng hàm lượng tinh bột dòng không tuyệt đối tương quan với mức độ biểu protein AGPase vi khuẩn Một số kết tương tự báo cáo Stark đồng tác giả (1992) tiến hành chuyển gen glgC16 promoter patatin đặc hiệu củ điều khiển vào khoai tây Hiện tượng hàm lượng tinh bột không tuyệt đối phụ thuộc vào mức độ biểu AGPase vi khuẩn giải thích theo hai khả năng: việc biểu mức độ vừa phải AGPase vi khuẩn đủ để khắc phục tình trạng thiếu hụt chất ADP-Glc cho sinh tổng hợp tinh bột, khả khác lượng chất Glc-1-P dùng cho phản ứng ADP-Glc pyrophosphorylase thân bước giới hạn tốc độ Hình Hàm lượng tinh bột tích lũy dòng thuốc chuyển gen AGPopt so với dòng đối chứng khơng chuyển gen A1-A7: dịng thuốc chuyển gen AGPopt, WT: khơng chuyển gen 146 Tạp chí Công nghệ Sinh học 14(1): 139-148, 2016 KẾT LUẬN Dựa vào trình tự gen glgC GenBank với mã số V00281.1, cải biến tổng hợp nhân tạo gen AGPopt mã hóa cho enzyme AGPase vi khuẩn E coli mang đột biến G336D đồng thời biểu định hướng lục lạp với mã di truyền phù hợp với hệ thống thực vật Gen AGPopt với kích thước 1500 bp nối ghép thành công vào vector chuyển gen pBI121 điều khiển promoter 35S chuyển vào mơ hình thuốc Sự hoạt động cấu trúc 35S-AGPopt dòng thuốc chuyển gen chứng minh giúp tăng hàm lượng tinh bột tích lũy từ 18-56% so với đối chứng không chuyển gen Kết bước đầu cho thấy việc biểu gen AGPopt chiến lược hiệu giúp tăng cường trình sinh tổng hợp tinh bột thực vật Lời cảm ơn: Cơng trình thực nhờ kinh phí đề tài “Khai thác phân lập nguồn gen có sẵn tập đồn giống sắn Việt Nam nhằm phát triển giống sắn có khả chống chịu bệnh suất cao công nghệ gen” thuộc nhiệm vụ hợp tác quốc tế khoa học công nghệ, Bộ Khoa học Công nghệ; thời gian thực từ 6/2012 đến 6/2015 Các thí nghiệm nghiên cứu tiến hành phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam TÀI LIỆU THAM KHẢO Alisdair RF, Willmitzer L, Trethewey RN (2002) Sucrose to starch: a transition in molecular plant physiology Trends Plant Sci 7: 35-41 Ball S & Morell M (2003) From bacterial glycogen to starch: Understanding the biogenesis of the plant starch granule Annu Rev Plant Biol 54: 207-233 Ball S, Guan H-P, James M, Myers A, Keeling P, Mouille G, Buleon A, Colonna P, Preiss J (1996) From glycogen to amylopectin: A model for the biogenesis of the plant starch granule Cell 86: 349-352 Ball S, Marianne T, Dirick L, Fresnoy M, Delrue B, Decq A (1991) A Chlamydomonas reinhardtii low starch mutant is defective for 3-phospho-glycerate activation and orthophosphate inhibition of ADP-glucose pyrophosphorylase Planta 185: 17–26 Ballicora M, Frueauf JB, Fu Y, Shurmann P, Preiss J (2000) Activation of the potato tuber ADP-glucose pyrophosphorylase by thioredoxin J Biol Chem 275: 1315-1320 Ballicora MA, Iglesias AA, Preiss J (2003) ADPglucose pyrophosphorylase; a regulatory enzyme for bacterial glycogen synthesis Microbiol Mol Biol Rev 67: 213-225 Baris I, Tuncel A, Ozber N, Keskin O, Kavakli IH (2009) Investigation of the interaction between the large and small subunits of potato ADP-glucose pyrophosphorylase PLoS Comput Biol (10): 1-14 Fincher GB (1989) Molecular and cellular biology associatedwith endospermmobilization in germinating cereal grains Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 40: 305-46 Frueauf JB, Ballicora MA, Preiss J (2001) Aspartate residue 142 is important for catalysis by ADP-glucose pyrophosphorylase from Escherichia coli J Biol Chem 276 (46): 319-325 Frueauf JB, Ballicora MA, Preiss J (2003) ADP-glucose pyrophosphorylase from potato tuber: site-directed mutagenesis of homologous aspartic acid residues in the small and large subunits Plant Journal 33: 503–511 Geigenberger P (2003) Regulation of sucrose to starch conversion in growing potato tubers J Exp Bot 54: 457–465 Giroux MJ, Shaw J, Barry G, Cobb BJ, Greene T, Okita T, Hannah LC (1996) A single gene mutation that increases maize seed weight Proc Natl Acad Sci USA 93: 5824–5829 Ihemere U, Arias-Garzon D, Lawrence S, Sayre R (2006) Genetic modification of cassava for enhanced starch production Plant Biotechnol J (4): 453-65 Morán-Zorzano MT, Viale AM, Moz FJ, AlonsoCasajús N, Eydallín GG, Zugasti B, Baroja-Fernández E, Pozueta-Romero J (2007) Escherichia coli AspP activity is enhanced by macromolecular crowding and by both glucose-1,6-bisphosphate and nucleotide-sugars FEBS Lett 581 (5): 1035-1040 Munyikwa TRI, Langeveld S, Salehuzzaman SNIM, Jacobsen E, Visser RGF (1997) Cassava starch biosynthesis: new avenues for modifying starch quantity and quality Euphytica 96: 65-75 Razem FA, Davis AR (1999) Anatomical and ultrastructural changes of the floral nectary of Pisum sativum L during flower development Protoplasma 206: 57-72 Smidansky ED, Clancy M, Meyer FD, Lanning SP, Blake NK, Talbert LE, Giroux MJ (2002) Enhanced ADP-glucose pyrophosphorylase activity in wheat endosperm increases seed yield Proc Natl Acad Sci USA 99: 1724–1729 Smith AM, StittM (2007) Coordination of carbon supply and plant growth Plant Cell Environ 30: 1126-1149 Stark DM, Timmerman KP, Barry GF, Preiss J, Kishore G (1992) Regulation of the amount of starch in plant tissues by ADP-glucose pyrophosphorylase Science 258: 287–292 147 Lê Thu Ngọc et al Tiessen A, Hendriks JH, Stitt M, Branscheid A, Gibon Y, Farre EM, Geigenberger P (2002) Starch synthesis in potato tubers is regulated by post-transcriptional redox modification of ADP-glucose pyrophosphorylase: a novel regulatory mechanism linking starch synthesis to the sucrose supply Plant Cell 14: 2191–2213 Topping JF (1998) Tobacco transformation Methods in Molecular Biology 81: 365–372 Yang X, Li F, Zhang X, Liu K, Wang Q, Zhang C, Liu C, Zhu W, Shan G, Chin CK, Fang W (2013) Integration and characterization of T-DNA insertion in upland cotton Czech J Genet Plant Breed 49: 51-57 Zeeman SC, Kossmann J, Smith AM (2010) Starch: its metabolism, evolution, and biotechnological modification in plants Annu Rev Plant Biol 61: 209-234 ENHANCEMENT OF STARCH PRODUCTION IN TOBACCO THROUGH TRANSFER OF THE GENE ENCODING BACTERIAL ADP GLUCOSE PYROPHOSPHORYLASE Le Thu Ngoc1, Nguyen Mau Hung1, Dinh Van Hung3, Nguyen Thi Minh Hong1,2, Pham Bich Ngoc1, *, Chu Hoang Ha1 Institute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Technology (IBT, VAST) Hong Duc University (HDU) Thai Nguyen University of Science (TNUS) SUMMARY Starch is the primary storage polysaccharide in plants It not only plays a role as the most important nutritional component in the diet of humans and many animal species, but is also a raw material in the food processing industry or material industry Therefore, a current research direction is the improvement of crops by increasing starch yields based on enhancing the activity of key enzymes involved in starch biosynthesis by genetic engineering ADP-Glc pyrophosphorylase (AGPase) is an important regulatory enzyme for synthesis of glycogen in bacteria and starch in plants In this paper, the 1.5 kb synthetic mutant of AGPopt gene derived from E coli AGPase was inserted into the plant expression vector pBI121 under the control of 35S promoter The efficiency of this construct was tested in transgenic Nicotiana tabacum The integration of AGPopt into the plant genome was confirmed by PCR and Southern hybridization, and the expression of bacterial AGPase in transgenic lines was detected by Western hybridization Interestingly, starch assays in tobacco transgenic lines resulted in lines displaying an increase in the levels of starch accumulated in the leaves, approximately 18%–56% higher than those of WT plants These results indicate that the expression of AGPopt is one of effective strategies for enhanced starch production in plant Keywords: ADP-Glc pyrophosphorylase, glgC gene, starch biosynthesis, tobacco transgenic plant * Author for corresspondence: E-mail: pbngoc@ibt.ac.vn 148