Nghiên cứu chọn loại vi khuẩn lactic thích hợp cho mục đích khử protein và khoáng trên đầu và vỏ tôm

Lời cảm ơn Để hồn thành khóa luận này, em nhận nhiều bảo, giúp đỡ, động viên khích lệ nhiều thầy cơ, anh chị bạn bè Trước hết em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ sinh học quý thầy cô giảng dạy truyền đạt kiến thức quý báu tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian học tập trường Em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến Th.S Lê Phương Chung tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho em suốt thời gian thực khóa luận Qua em xin chân thành cảm ơn đến tồn thể thầy quản lý phịng thí nghiệm Hóa vi sinh thực phẩm, Cơng nghệ sinh học, cơng nghệ chế biến tạo điều kiện thuận lợi cho em hồn thành khóa luận Cảm ơn tất người bạn quan tâm, động viên giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Cuối xin bày tỏ lòng biết ơn công ơn sinh thành nuôi dưỡng cha me, giúp đỡ tận tình anh chị em thân yêu Những người theo dõi ủng hộ vật chất lẫn tinh thần để em hoàn thành đề tài Nha Trang, ngày 25 tháng năm 2014 Sinh viên thực Hoàng Thị Bảo Yến Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình Lời mở đầu Tính cấp thiết đề tài Là ngành kinh tế trọng tâm kinh tế quốc dân, ngành Thủy sản đóng góp phần không nhỏ vào phát triển kinh tế Cùng với nhịp độ phát triển kinh tế nước, ngành Thủy sản năm gần đạt thành tựu đáng kể nuôi trồng, chế biến thủy sản xuất nhập với phát triển ngành, vấn đề phế liệu chế biến thủy sản điểm hạn chế lượng phế liệu thải từ công nghiệp chế biến thủy sản hàng năm lớn phế liệu tôm nguồn cung cấp chitin chitosan phong phú Vì ngồi việc dùng phế liệu tơm để chế biến thức ăn chăn ni cịn sử dụng chúng để sản xuất chitin chitosan mang lại giá trị kinh tế cao Tuy nhiên, Ở Việt Nam nay, công nghệ sản xuất chitin chitosan chủ yếu theo phương pháp hóa học dùng HCl NaOH để khử tạp chất khỏi đầu vỏ tôm để deacetyl Công nghệ sản xuất gây ô nhiễm mơi trường, ăn mịn thiết bị, chi phí sản xuất cao, chưa tận thu thành phần có giá trị bên cạnh chitin-chitosan protein, chất màu từ phế liệu thủy sản Xuất phát từ thực tế trên, đồng ý Giám đốc Viện công nghệ sinh học môi trường, trường Đại học Nha Trang, đề tài “Nghiên cứu chọn loại vi khuẩn lactic thích hợp cho mục đích khử protein khống đầu vỏ tơm” thực Nhằm cải tiến quy trình sản xuất chitin chitosan cách sử dụng phương pháp sinh học (phối hợp dụng vi khuẩn lactics enzyme protease) để khử protein khoáng chất khỏi đầu vỏ tôm thay cho việc sử dụng hóa chất gây nhiễm mơi trường Nội dung đề tài Lựa chọn chủng vi khuẩn lactic phù hợp cho q trình lên men khử protein khống chất từ đầu vỏ tôm Đánh giá khả khử protein khống chất từ đầu vỏ tơm so với phương pháp hóa học Đề xuất quy trình sản xuất chitin chitosan phương pháp sinh học để khử khoáng, protein đánh giá chất lượng chitin, chitosan sản xuất theo phương pháp sinh học Tính thực tiễn đề tài Kết luận văn cải tiến quy trình sản xuất chitin chitosan theo hướng sử dụng vi khuẩn lactic để khử protein khoáng chất từ đầu vỏ tôm nhằm hạn chế ô nhiễm môi trường công nghệ sản xuất chitin phương pháp hóa học Mặc dù có nhiều cố gắng bên cạnh việc đạt số kết định khóa luận khơng thể tránh khỏi sai sót Kính mong đóng góp ý kiến thầy bạn để đề tài hồn thiện Nha Trang, tháng năm 2014 Sinh viên thực Hoàng Thị Bảo Yến Chương TỔNG QUAN 1.1 tổng quan nguồn phế liệu tôm 1.1.1 nguồn phế liệu tôm phát triển nhanh ngành chế biến thủy sản góp phần lớn vào việc nâng cao giá trị xuất nước ta, hàng triệu thủy sản xuất hàng năm Tuy nhiên trình chế biến sản phẩm thủy sản tạo lượng lớn phế liệu Phế liệu tơm chủ yếu đầu, vỏ tơm, ngồi cịn có phần thịt vụn bóc nõn khơng quy trình kỹ thuật, nhiên phần khơng đáng kể Tùy thuộc vào lồi, sản phẩm chế biến khác mà lượng phế liệu tôm thu khác Trong thành phần phế liệu tôm, phần đầu thường chiếm khoảng 35÷45% trọng lượng tơm ngun liệu, phần vỏ chiếm 10÷15%, cịn lại phế liệu khác Tuy tỷ lệ phụ thuộc vào giống lồi, giai đoạn sinh trưởng cơng đoạn chế biến Các thành phần chiếm tỷ lệ đáng kể đầu, vỏ tôm chitin, protein, canxi cacbonat, sắc tố, lipid… Theo thống kê tổ chức lương thực Nơng nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO) sản lượng tôm giới khoảng triệu tấn/năm Hầu hết sản lượng tôm giới từ nước phát triển như: Thái Lan, Trung Quốc, Việt Nam, Ecuado, Malaysia, Ấn Độ, Indonexia Theo tạo lượng phế liệu tơm lớn, ước tính khoảng 1.6÷2 triệu tấn/năm Năm 2008, Việt Nam đứng đầu giới nuôi tôm sú, tôm sú đối tượng nuôi quan trọng lĩnh vực nuôi trồng chế biến xuất nước ta (chủ yếu tập trung khu vực Đồng Sông Cửu Long chiếm 90% sản lượng) Trong thời gian gần đây, nghề nuôi tôm thẻ chân trắng thương phẩm phát triển mạnh, sản lượng chế biến ngày lớn nên nguồn phế liệu tơm thẻ trở thành nguồn ngun liệu để sản xuất chitin chitosan, tỉnh miền Trung 1.1.2 cấu tạo thành phần hóa học phế liệu tơm 1.1.2.1 cấu tạo vỏ tơm lớp ngồi vỏ tơm có cấu trúc chitin protein bao phủ,lớp vỏ thường bị hóa cứng khắp bề mặt thể lắng đọng muối canxi hợp chất hữu khác nằm dạng phức hợp tương tác protein chất khơng hịa tan Lớp biểu bì, lớp màu, lớp canxi hóa cứng lắng đọng canxi Lớp màu, lớp canxi hóa, lớp khơng bị canxi hóa chứa chitin lớp biểu bì khơng Ta gọi lớp có chứa chitin lớp endocuticle Vỏ chia làm lớp chính: Lớp biểu bì (epicuticle) Lớp màu Lớp canxi Lớp khơng bị canxi hóa Lớp biểu bì (epicuticle): nghiên cứu cho thấy lớp màng nhanh chóng bị biến đỏ fuxin, có điểm pH = 5.1 khơng chứa chitin Nó khác với lớp vỏ cịn lại, bắt màu với anilin xanh Lớp epicuticle có lipid cản trở tác động acid nhiệt độ thường cơng đoạn khử khống acid lớp vỏ bên Màu lớp thường vàng nhạt có chứa polyphenol – oxidase bị hóa cứng quinone – tanin Lớp màu: tính chất lớp có mặt thể hình hạt vật chất mang màu giống dạng melanin Chúng gồm túi khí khơng bào Một vài vùng xuất hệ thống rãnh thẳng đứng có phân nhánh, đường cho canxi thấm vào Lớp canxi hóa: lớp chiếm phần lớn vỏ, thường có màu xanh trải khắp, chitin trạng thái tạo phức với canxi Lớp khơng bị canxi hóa: vùng lớp vỏ tạo thành phần tương đối nhỏ so với tổng chiều dày bao gồm phức chitin – protein bền vững canxi quinone 1.1.2.2 Thành phần hóa học phế liệu tôm Nguồn nguyên liệu khác dẫn đến quy trình chiết rút chitin có khác nhau, tùy thuộc vào hàm lượng khống protein có phế liệu loại phế liệu thủy sản, vỏ cua có hàm lượng khống cao nhất, lên đến 50% nên q trình loại khống khó khăn hơn, hàm lượng protein đầu tôm cao Ngồi số lồi tơm vỏ đầu có hàm lượng lipid tương đối cao (trên 10%) cần phải lưu ý công đoạn xử lý lipid Thông thường lượng lipid loại công đoạn khử protein Thành phần khống phế liệu tơm, cua, ghẹ, nang mực chủ yếu Ca, ngồi cịn có Mg, P, K, Mn Fe Trong thời gian gần đây, việc nuôi tôm thẻ chân trắng (Penaaus vannamei) thương phẩm phát triển mạnh, nguồn phế liệu tôm thẻ trở thành nguồn nguyên liệu để sản xuất chitin Thành phần hóa học phế liệu tôm Penaaus vannamei (Trang Sĩ Trung cộng sự, 2007) stt Chỉ tiêu phân tích Khống (%) Protein (%) Chitin (%) Lipid (%) Penaaus vannamei 24.6 0.8 47.4 1.8 18.3 0.9 4.7 0.3 Thành phần chiếm tỷ lệ đáng kể đầu tôm protein, chitin, khống, sắc tố tỷ lệ thành phần khơng ổn định, chúng thay đổi theo giống, loài, đặc điểm sinh thái, sinh lý… thành phần chitin protein vỏ tôm tươi tương ứng 4.50% 8.05%, vỏ tôm khô 11-27.5 % 23.3-53.0% Hàm lượng chitin, protein, khống carotenoid phế liệu vỏ tơm thay đổi phụ thuộc vào trình chế biến phụ thuộc vào loài, trạng thái dinh dưỡng, chu kỳ sinh sản Protein: protein phế liệu tôm thường loại protein khơng hịa tan khó tách khỏi vỏ, tồn dạng Dạng tự do: dạng tồn quan nội tạng gắn phần vỏ Dạng phức tạp: dạng protein khơng hịa tan thường liên kết với chitin, canxi carbonate, với lipid tạo lipoprotein, với sắc tố tạo nên protein – carotenoid…như phần thống định tính bền vững vỏ tơm Chitin tồn dạng liên kết với protein, khoáng nhiều hợp chất hữu khác, khó khăn cho việc tách tinh chế chúng Canxi: vỏ tơm, đầu tơm, vỏ ghẹ có chứa lượng lớn muối vô cơ, chủ yếu muối CaCO3, hàm lượng Ca3(PO4)2 khơng nhiều q trình khử khống dễ hình thành hợp chất CaHPO4 khơng tan HCl gây khó khăn q trình khử khống Sắc tố: vỏ tơm có nhiều loại sắc tố chủ yếu astaxanthin Trong đầu vỏ tôm astaxanthin kết hợp với protein cách chặt chẽ Cũng nhờ có liên kết mà thành phần astaxanthin vỏ tôm bảo vệ Enzyme: phế liệu tôm có chứa số enzyme Trong đầu tơm có chứa enzyme tiêu hóa chymotrypsin, ứng dụng điều trị bệnh ung thư Một vài loại enzyme khác có mặt phế liệu tơm gồm alkaline phosphate, chitinase, -N-acetyl glucosamidase ứng dụng nhiều thực tế hoạt độ enzyme protease đầu tôm khoảng 6.5 đơn vị hoạt độ/g tươi (theo tạo chí Khoa học Công nghệ Thủy sản, số 5/1993) 1.2 tổng quan chitin chitosan 1.2.1 Sự tồn chitin chitosan tự nhiên Chitin dẫn xuất chitosan polysaccharide mạch thẳng, chúng phổ biến tự nhiên sau cellulose Chitin tồn động vật thực vật động vật thủy sản chitin tồn nhiều, đặc biệt vỏ tơm, cua ghẹ… Vì vậy, chúng ngun liệu dồi để sản xuất Chitin-Chitosan Trong động vật: chitin thành phần cấu trúc quan trọng vỏ bao số động vật không xương sống côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác, giun tròn, Chitin coi chất tạo xương hữu động vật khơng xương sống Trong thực vật: Chitin có vách tế bào nấm số loài tảo chlorophyceae Chitin tồn tự nhiên dạng tinh thể Nó có cấu trúc gồm nhiều phân tử nối với cầu nối hydro tạo thành hệ thống dạng sợi nhiều có tổ chức tự nhiên gặp dạng tồn tự chitin, liên kết dạng phức hợp Chitin-protein, Chitin với hợp chất hữu … tồn Chitin có đề kháng chất thủy phân, hóa học enzyme Do gây khó khăn cho việc tách chiết tinh chế Tùy thuộc vào đặc tính thể thay đổi hàm lượng chất lượng Chitin Trong tự nhiên, Chitosan gặp, có vách số lớp vi nấm (đặc biệt: zygomycetes, mucor, …) vài loại côn trùng thành bụng mối chúa Sự deacetyl kiềm, Chitin tạo thành Chitosan tan dung dịch acid acetic lỗng 1.2.2 Cấu trúc tính chất Chitin-Chitosan 1.2.2.1 Cấu trúc Chitin-Chitosan Chitin-Chitosan polysaccharide nên có cấu trúc dạng chuỗi Trong đó: Chitin: R: -NH-COCH3 Chitosan: R: -NH2 Chitin: Chitin polysaccharide mạch thẳng, có cấu trúc tuyến tính gồm đơn vị N-acetyl-glucosamine nối với nhờ cầu β-1,4 glucoside Công thức phân tử: (C8H13O5N)n Phân tử lượng: M = (203,19)n Trong n phụ thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu: Đối với tôm hùm: n = 700 800 Đối với cua: n = 500 600 Đối với tôm thẻ: n = 400 500 Công thức cấu tạo: Chitosan: chitosan polysacchride mạch thẳng, gồm phân tử D-1,4 glucosamine Khi xử lý kiềm đặc từ chitin ta thu Chitosan Công thức phân tử: (C6H11O4N)n Phân tử lượng: M = (161,07 Cơng thức cấu tạo: 1.2.2.2 Tính chất Chitin-Chitosan Chitin: Chitin có màu trắng, khơng tan nước, kiềm, acid lỗng dung mơi hữu khác ete, rượu chitin hòa tan dung dịch đậm đặc, nóng muối thyoxyanat liti (LiSCN) muối thyoxyanat canxi (Ca(SCN)2) tạo thành dung dịch keo Chitin ổn định với chất chống oxy hóa KMnO4, nước javen, NaOCl, … người ta lợi dụng tính chất để khử màu cho Chitin Chitin có khả hấp thụ tia hồng ngoại bước sóng 884 890 Chitin polysaccharide có nguồn gốc tự nhiên, có hoạt tính sinh học cao, có tính hịa hợp sinh học tự phân hủy da Chitin bị men lysozyme, loại men có thể người, phân giải thành monome N-acetyl-D-glucosamine Chitin kết tinh dạng vơ định hình, khó hịa tan dung dịch amoniac (NH3), khơng hịa tan thuốc thử Schueizer-Sacrpamonia Điều thay đổi nhóm hydroxyl (-OH) vị trí C2 nhóm acetamic (NHCOCH3) ngăn cản tạo thành phức hợp cần thiết Khi nung nóng Chitin dung dịch NaOH đặc chitin bị khử gốc acetyl tạo thành chitosan Khi đun nóng Chitin acid HCl đặc Chitin bị thủy phân tạo thành glucosamine 85.5%, acid acetic 14.5% Chitosan: Đặc tính Chitosan: Chitosan có nguồn gốc thiên nhiên, khơng độc, dùng an tồn cho người thức ăn, thực phẩm, dược phẩm, có tính hịa hợp sinh học cao với thể, có khả tự phân hủy sinh học, có nhiều tác dụng sinh học đa dạng: có khả Hiệu suất khử protein (DP (%)) khử protein (DA (%)) xác định dựa công thức Rao cộng (2000) DP (%) = [(P0*O)-(PR*R)]*100/(P0*O) DA (%) = [(A0*O)-(AR*R)]*100/(A0*O) Trong đó: P0, PR: hàm lượng protein (g/g) tương ứng mẫu trước sau xử lý A0, AR: hàm lượng khoáng (g/g) tương ứng mẫu trước sau xử lý O, R: khối lượng (g) tương ứng mẫu trước sau xử lý Phương pháp xử lý số liệu: Các số liệu xử lý phần mềm excel 2007,ANOVA với giá trị p