Luận văn thạc sĩ Kỹ thuật hóa học: Nghiên cứu chiết xuất cao chiết giàu hoạt chất từ lá nhàu (Morinda Citrifolia L.)

Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy lá Nhàu có chứa flavonoid, saponin, alkaloids, iridoid glycosides, terpenoid và tannin có tác dụng chống viêm, chống vi khuẩn và chất chống oxy h

TỔNG QUAN

TỔNG QUAN VỀ CÂY NHÀU

Tên khoa học: Morinda citrifolia L

Tên khác: cây Ngao, Nhàu núi, Giầu, M bracteata Roxb, M litoralis Blanco,Dâu tằm Ấn Độ, Bengkudu, Mengkudu (Mã Lai)

Giới (regnum): Plantae Bộ (ordo): Gentianales Họ (familia): Rubiaceae Chi (genus): Morinda Loài (species): Morinda Citrifolia

- Cây gỗ nhỏ, mọc đứng

- Thân: Cây cao 4-8 m Thân có màu lục hoặc nâu nhạt.Cành non mập màu xanh, tiết diện vuông, có rãnh, nhẵn; cành già tiết diện tròn, màu nâu xám

-Lá: Lá mọc đối, hình bầu dục dài 12 -30 cm, rộng 6 -15 cm, mép uốn luợn, lá màu xanh bóng đậm ở mặt trên, mặt dưới nhạt hơn Bìa lá hơi dợn sóng Gân lá hình lông chim, nổi rõ ở mặt dưới, 6-7 cặp gân phụ Cuống lá dài 1-2 cm

-Hoa: Cụm hoa hình tròn hay hơi bầu dục, ở ngoài nách lá Trục cụm hoa hình trụ, màu xanh, nhẵn, dài 1-2 cm Đáy cụm hoa có 3 phiến hẹp, dài 5-8 mm Hoa đều, lưỡng tính Đài hoa là một gờ tròn, ống tràng hình phễu, màu xanh nhạt, cao 7-12 mm; bên trong có nhiều lông trắng; thùy dài khoảng 5-8 mm, màu trắng, hình bầu dục đầu nhọn, đỉnh có phụ bộ là một mấu nhỏ cong vào trong Khi hoa nở các thùy cong xuống phía dưới; tiền khai van Nhị bằng nhau, rời, gắn ở phần loe của ống tràng xen kẽ với các cánh hoa, chỉ nhị rất ngắn Bao phấn hình đầu tên, màu vàng nhạt, dài khoảng 4 mm; 2 ô mở dọc, hướng trong, đính gốc Hạt phấn rời, hình hình cầu, màu vàng nhạt

Lá noãn, ở vị trí trước sau, bầu dưới, 2 ô, mỗi ô 1 noãn, đính trung trụ Vòi nhụy dạng sợi màu xanh nhạt, dài 5 mm; 2 đầu nhụy dạng phiến mỏng, dài 3 mm, màu xanh Đĩa mật dày, hình khoen, màu vàng

2 -Cây ra hoa quanh năm, tập trung nhiều nhất vào khoảng tháng 11-2, cho quả vào khoảng tháng 3-5

-Quả: Quả hạch kép do bầu noãn và một phần lá đài của các hoa trên cụm hoa dính nhau tạo thành Quả còn non màu xanh nhạt, dài 5-7 cm, rộng 3-4 cm Quả già màu ngà vàng, nhẵn bóng, mùi khai, trên quả còn vết tích các đĩa mật Quả thịt, hình trứng gồm nhiều quả hạch dính vào nhau, khi chín màu vàng, chứa cơm mềm, ăn được

-Hạt: Hạt nhiều, hình bầu dục, một đầu nhọn, màu nâu đen

Cây Nhàu có nguồn gốc vùng nhiệt đới thuộc Châu Á và Châu Úc Loài cây này phân bố nhiều ở vùng Đông Nam Á,Trung Quốc và Ấn Độ Ở Việt Nam, cây mọc hoang và được trồng khắp nơi, cây thường dựa vào mép nước Ở Việt Nam cây Nhàu có nhiều ở Miền Nam, ngoài ra còn có ở các tỉnh Miền Trung như Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên-Huế và vài nơi thuộc đồng bằng Bắc Bộ

Hình 1.1 Hình thái tự nhiên của cây Nhàu [A], trái Nhàu[B]

Chụp bởi tác giả tại vườn bảo tồn gen và giống cây thuốc các tỉnh phía Nam Ngày 20/03/2018

3 Cây mọc hoang và được trồng nhiều ở các tỉnh phía Nam, lá được dùng làm rau phổ biến ở nông thôn

1.1.4 Thành phần hóa học của lá cây Nhàu

Các nghiên cứu hóa học của loài cho thấy gần 200 hợp chất đã được xác định và tách chiết từ những phần khác nhau của cây Nhàu Trong đó:

Lá có chứa glicosid tim, tannin, terpenoid, alkaloid, polysaccharid, quercetin 3,7- O-dimethylether ,quercetin 3-O-methylether,quercetin-3-O-rutinosid, saponin, alanin, phenyl alanin, tryptophan, threonin, cystein, lucin, acid (S)-2-amino-5- guanidinopentanoic, acid 2-aminopentanedioic, serin, tyrosin, valin, histidin, acid 2- amino-4-(methylthio)butanoic, proline,acid 2-aminobutanedioic [2]

Thân, rễ chứa anthraquinon, glicosid tim, flavonoid, coumarin, acid octadecadienoic, pentose, hexose

Quả chứa chủ yếu vitamin, flavonoid, alizarin, acid hexanoic, acid octanoic, acid hexanoic, acid (3R,4S,5R,6R)-6-(hydroxymethyl)oxan-2,3,4,5-tetrol, gluconic, ethyl caproat, ethyl caprylat, methyl octanoat, methyl decanoat

Các thành phần hoạt tính như flavonoid, saponin, alkaloids, iridoid glycosides, terpenoid và tannin có tác dụng chống viêm, chống vi khuẩn và chất chống oxy hóa để đẩy nhanh quá trình chữa lành vết thương [2]

Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy các bộ phận của cây Nhàu thể hiện nhiều tác dụng như kháng khuẩn, kháng viêm, kháng nấm, kháng oxy hóa, kháng ung thư, giảm đau, điều hòa miễn dịch, làm lành vết thương, các tác dụng trên xương,… Các công bố trước đây cho thấy flavonoid góp phần vào sự đa dạng các tác dụng của Nhàu [3] Tuy nhiên, các nghiên cứu tập trung vào quả hơn là rễ, thân, lá và hiện nay một số chế phẩm được nghiên cứu sản xuất từ quả, rễ, thân hơn là lá

Rutin, còn được gọi là rutosid, quercetin-3-O-rutinosid và sophorin, là glycosid kết hợp quercetin flavonol và rutinose disaccharide (α-L-rhamnopyranosyl- (1 → 6) - β-D-glucopyranose) Nó là một flavonoid cam quýt được tìm thấy trong nhiều loại thực vật bao gồm cả trái cây họ cam quýt

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của Rutin

Hầu hết các polyphenol đều có khả năng kháng khuẩn Các nghiên cứu về cơ chế tác dụng kháng sinh của flavonoid còn rất ít và có thể theo một số giả thiết sau:

- Flavonoid ức chế transpeptidare làm cho mucopeptid – yếu tố đảm bảo cho thành tế bào vi khuẩn vững chắc không tổng hợp được

- Gắn lên màng nguyên sinh chất của vi khuẩn, làm thay đổi tính thẩm thấu chọn lọc của màng nguyên sinh chất Vì vậy làm cho một số chất cần thiết cho đời sống vi khuẩn như nucleoid, pyrimidin, purin lọt qua màng nguyên sinh chất ra ngoài

- Tác động lên quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn theo hai kiểu: phong tỏa mạch peptit của vi khuẩn bằng cách phong tỏa transferare chuyển acid amin từ RNA vào mạch làm mạch không kéo dài thêm được hoặc tạo ra protein bất thường không có tác dụng đối với đời sống của vi khuẩn, làm chúng không sử dụng được

- Ức chế tổng hợp acid nucleic

- Flavonoid có thể tác dụng vào DNA khuôn, ức chế tổng hợp RNA của vi khuẩn

1.1.5 Công dụng và bộ phận dùng

Giống cây này có rất nhiều ứng dụng trong đời sống con người và có thể được coi là thực phẩm chức năng với nhiều hoạt chất sinh học, tính sinh dược học cao cụ thể như [1] :

- Hiệu quả trong việc chữa trị vết loét, ngừa phát ban

- Chữa tiêu chảy - Chữa mất ngủ, suy nhược thần kinh, huyết áp cao, loại bỏ độc tố: Tăng khả năng hấp thụ, tiêu hóa, sử dụng vitamin, thảo dược và khoáng chất

- Có khả năng chống oxy hóa cao giúp ngăn chặn sự hủy hoại những gốc tự do

- Giảm đau: Chữa những cơn đau trong cơ thể như đau lưng, cổ, đau cơ, thần kinh và những cơn đau như căng thẳng, đau nửa đầu

- Giảm sưng vết thương triệu chứng như vết thâm tím, căng da và bỏng

- Hỗ trợ hệ miễn dịch: Kích thích việc sản xuất những tế bào T - tế bào đóng vai trò chống viêm: có tác dụng trong việc chữa các bệnh liên quan đến cơ và khớp như bệnh viêm khớp, hội chứng nhức xương cổ tay

Các bộ phận của cây nhàu có thể sử dụng để trị liệu các bệnh như sau:

CƠ CHẾ LÀNH VẾT THƯƠNG

Da được xem là một trong những cơ quan quan trọng nhất của cơ thể, có nhiệm vụ bao bọc, che chở cơ thể khỏi những tác động bất lợi từ môi trường bên ngoài, ngoài ra da còn giúp điều hòa nhiệt độ cơ thể, cảm giác thông tin từ bên ngoài Các chấn thương cấp tính, vết thương mãn tính hoặc can thiệp phẫu thuật ảnh hưởng đến chức năng của da, làm tổn thương da, mất da và khuyết tật thẩm mỹ

11 Quá trình liền vết thương trải qua 4 giai đoạn cơ bản: giai đoạn cầm máu, giai đoạn viêm, giai đoạn tăng sinh và giai đoạn tái tạo Tùy vào mức độ nghiêm trọng của vết thương và cơ địa người vị thương mà 4 giai đoạn này nhanh hoặc chậm hoặc có thể để lại sẹo trên da

1 Giai đoạn cầm máu Do tác động của ngoại vật, vết thương chảy máu và tác động lên collagen tại vết thương, nó có tác dụng kích thích sự hoạt hóa của tiểu cầu và các yếu tố đông máu khác, từ đó các yếu tố này tác động lên các mao mạch nhỏ hình thành lên các cục máu đông có tác dụng ngăn chặn sự chảy máu của vết thương Khi vết thương quá sâu hoặc chạm vào các mạch máu lớn các yếu tố đông máu này không kịp hình thành các cục máu đông ngăn quá trình chảy máu vì máu chảy nhanh và nhiều vì vậy cần áp dụng các cách ngăn sự cháy máu từ bên ngoài như băng gạc, ga rô

2 Giai đoạn viêm Giai đoạn này diễn ra do có sự can thiệp của bạch cầu đa nhân trung tính có nhiệm vụ dọn dẹp những vật thể lạ xâm nhập vào vết thương bằng hiện tượng thực bào, quá trình diễn ra trong vòng 24- 48h Sau đó những đại thực bào do bạch cầu đơn nhân sẽ thay thế cho bạch cầu đa nhân trung tính ở trên vừa có tác dụng loại bỏ những vật ngoại lai còn lại vừa có tác dụng thúc đẩy các yếu tố tăng trưởng (một trong những yếu tố quan trọng trong quá trình liền vết thương)

Khi cơ thể có dấu hiệu suy giảm hệ thống miễn dịch làm số lượng đại thực bào bị suy giảm, từ đó suy yếu quá trình loại bỏ vật thể lạ cũng như làm chậm quá trình lành vết thương

3 Giai đoạn tăng sinh Sau giai đoạn cầm máu và loại bỏ tạp chất thì giai đoạn tăng sinh bắt đầu diễn ra (thường ở ngày thứ 2 sau khi bị thương)

Tăng sinh nguyên bào sợi: quá trình này diễn ra khi những nguyên bào sợi ở những vùng xung quanh di chuyển tới vết thương, những nguyên bào sợi này tăng sinh, kết hợp với collagen, proteoglycan, glycosamin sẽ hình thành lên chất nền mô liên kết của tế bào hạt Thời kỳ này đại thực bào giảm số lượng nhanh chóng và thay thế vào đó là nguyên bào sợi, thường diễn ra trong vòng 7- 14 ngày sau khi bị thương

12 Hình thành mô liên kết: trong quá trình tăng sinh, nguyên bào sợi kết hợp với collagen hình thành lên chất nền mô liên kết, thúc đẩy quá trình hình thành cấu trúc mô khi bị tổn thương và tạo ra độ bền vững cho vết thương Bên cạnh đó collagen còn thúc đẩy quá trình hình thành chất nền mô liên kết trung bì giúp cho cytokin và các yếu tố tăng trưởng hoạt động

Hình thành mao mạch: vết thương muốn lành nhanh cần có dinh dưỡng từ máu thông qua hệ thống mao mạch Từ hoạt động của các đại thực bào và nguyên bào sợi giúp kích thích hình thành các tế bào nội mô và các mầm mao mạch, tạo ra hệ thống mao mạch mới nuôi dưỡng vết thương

Tăng sinh biểu mô: quá trình tăng sinh biểu mô được xem là quá trình then chốt của quá trình lành vết thương Với vết thương nhỏ, quá trình tăng sinh biểu mô diễn ra nhanh hơn và vết thương sẽ lành nhanh hơn Vết thương lớn, quá trình tăng sinh biểu mô khó khăn đôi khi phải nhờ vào phẫu thuật cấy ghép để vết thương lành nhanh hơn

Liền vết thương: đặc trưng của giai đoạn này là các nguyên bào sợi làm nhiệm vụ kéo các mô về trung tâm, giúp vết thương liền miệng, hạn chế sẹo

4 Giai đoạn tái tạo Giai đoạn này bắt đầu ngay khi quá trình liền vết thương diễn ra Đây là giai đoạn giúp khôi phục lại tính toàn vẹn và chức năng của mô Nó không những giúp vết thương liền nhanh hơn, bền vững hơn mà còn quyết định tới hình dạng vết thương sau quá trình lành hoàn thiện Nếu giai đoạn này diễn ra nhanh và mạnh có thể làm vết thương hình thành sẹo lồi và ngược lại

Trên đây là các giai đoạn của quá trình liền vết thương, như vậy cơ thể có cơ chế tự liền vết thương và không cần can thiệp từ bên ngoài Tuy nhiên có những tổn thương nhiễm trùng có thể gây nguy hiểm cho người bệnh nếu không được chữa trị kịp thời, hoặc một số tổn thương mãn tính ở người mắc bệnh tiểu đường, người bị loét do nằm lâu một chỗ, ở người già đều khó có thể tự lành nếu không được can thiệp

Muốn cho vết thương nhanh lành vẫn cần chú ý chăm sóc vết thương đáng cách và nên dùng băng vết thương dạng xịt Nacurgo để bảo vệ cũng như kích thích quá trình liền vết thương diễn ra nhanh hơn Vì thế băng vết thương dạng xịt Nacurgo với màng

13 sinh học Polyesteramide được coi là cứu tinh cho các vết thương nói chung và các vết thương khó lành nói riêng

Hình 1.3 Các giai đoạn làm lành vết thương

Viêm là một giai đoạn bình thường của quá trình điều trị vết thương, rất cần thiết trong việc loại bỏ các vi sinh vật gây nhiễm Vi khuẩn và nội độc tố có thể dẫn đến sự gia tăng các cytokin tiền viêm như TNF-α và IL-1, tuy nhiên, nếu giai đoạn này kéo dài, vết thương có thể chuyển thành mãn tính và khó lành Trong mô da người, hàm lượng protein chiếm khoảng 25-30%, trong đó hàm lượng collagen chiếm khoảng 72% protein Hàm lượng hydroxyproline trong collagen là 13,5%, nên sản xuất collagen là rất cần thiết trong quá trình làm lành vết thương Trong quá trình chữa lành vết thương, các yếu tố dinh dưỡng và hàng rào chống oxy hóa cũng giữ vai trò quan trọng do hoạt động của tế bào tăng liên tục [21] Các nghiên cứu cho thấy NO và ROS là những yếu tố quan trọng trong việc làm lành vết thương [22] Ở mức độ thấp, ROS có lợi cho việc bảo vệ khỏi sự xâm nhập của vi khuẩn; truyền dẫn tín hiệu nội bào; hydrogen peroxid ở mức thấp rất cần thiết cho sự hình thành mạch máu Tuy nhiên, NO và ROS quá mức làm giảm tác dụng có lợi của nó do có tính phản ứng cao và có thể dẫn đến tổn thương mô, cản trở quá trình làm lành vết thương [23] Mặc dù, sự lành

TỔNG QUAN VỀ QUY TRÌNH TỐI ƯU HÓA BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÁP ỨNG BỀ MẶT

Phương pháp này được phát triển từ những năm 50 của thế kỉ trước bởi nhà khoa học Box và các đồng sự [33, 34] Phương pháp đáp ứng bề mặt bao gồm một nhóm các kĩ thuật toán học và thống kê dựa trên sự phù hợp của mô hình thực nghiệm để các dữ liệu thực nghiệm thu được liên quan đến thiết kế thí nghiệm Theo hướng mục tiêu này, các hàm đa thức bậc hai hay bậc nhất được sử dụng để mô tả hệ nghiên cứu đó và khảo sát các điều kiện thực nghiệm để tìm ra sự tối ưu Ứng dụng kĩ thuật tối ưu RSM

15 cần trải qua các bước sau: (1) Lựa chọn các biến độc lập ảnh hưởng quan trọng tới hệ nghiên cứu trong phạm vi giới hạn của nghiên cứu đó theo mục tiêu và kinh nghiệm của người nghiên cứu; (2) Thiết kế thí nghiệm và tiến hành thực hiện các thí nghiệm đó theo một ma trận đã vạch ra trước đó; (3) Xử lý về mặt thống kê toán học các dữ liệu thực nghiệm thu được thông qua sự tương thích của hàm đa thức; (4) Đánh giá tính tương thích của mô hình; (5) Xác minh tính khả thi và tính thiết yếu để tiến hành chuyển hướng sang ranh giới tối ưu; (6) Tiến hành thí nghiệm dựa trên kết quả tối ưu cho từng biến

Ma trận thiết kế phức hợp trung tâm được mô tả lần đầu tiên bởi hai nhà khoa học Box và Wilson bao gồm các phần sau: (1) Thiết kế thừa số phân đoạn trên các mức mã hóa: mức trung bình (0), mức thấp (-1) và mức cao (+1); 2) Thiết kế thêm các điểm nằm ngoài vùng phân đoạn, cách vị trí trung tâm (0) một khoảng ; (3) Biểu diễn các điểm trung tâm để đánh giá độ lặp lại của phương pháp

Ngoài ra, để đánh giá độ tương thích của mô hình, phân tích hồi quy ANOVA được sử dụng và dựa trên các hệ số R 2 và P để đưa ra mức ý nghĩa về mặt thống kê của mô hình đạt được.Thông thường, khi tối ưu hóa các thông số cho quá nghiên cứu thực nghiệm, các nhà khoa học thường dùng phương pháp luân phiên từng biến để thay đổi các thông số khảo sát Tuy nhiên, phương pháp này có một số giới hạn, đó chính là không thể hiện rõ ràng sự tương tác/ảnh hưởng giữa các thông số với nhau và tổng số thí nghiệm thực hiện tăng nhiều khi số lượng thông số khảo sát tăng Để khắc phục nhược điểm đó, phương pháp đáp ứng bề mặt (Response Surface Methodology- RSM) đã được ứng dụng trong quá trình tối ưu hóa các thông số thực nghiệm Trong các nghiên cứu liên quan các quá trình hoá học, phương pháp RSM đã được ứng dụng rộng rãi trong hóa học như để chiết xuất hoạt chất tự nhiên [35 - 40] , tổng hợp hóa học [41] và tối ưu hóa các quá trình hóa học khác như khả năng hấp phụ Cu 2+ , Ni 2+ và Pb 2+ từ than hoạt tính làm từ vỏ chuối [42] , loại bỏ Cu 2+ trong nước [43] , tối ưu hoá việc chế tạo cacbon hoạt tính ZnCl2 từ bã mía để loại bỏ Cu 2+ [44] ,loại bỏ các ion Ni 2+ trong nước sử dụng các nguyên tử cacbon được chế tạo từ rơm rạ [45] , tối ưu hóa điều kiện quá trình phản ứng xà phòng hóa từ dầu dừa tỉnh Bến Tre [46] Điều này đã cho thấy

16 phương pháp bề mặt đáp ứng là rất quan trọng trong lĩnh vực nghiên cứu để thay thế các phương pháp khác giúp nâng cao hiệu quả cho quá trình tối ưu hóa các thông số

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện chiết xuất cao chiết lá nhàu và hoạt chất lá nhàu

- Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu và cao chiết bán thành phẩm lá nhàu

- Đánh giá hoạt tính sinh học cao chiết lá nhàu

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu: độ tinh khiết, định tính bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng, định lượng flavonoid toàn phần

Khảo sát điều kiện chiết xuất: dung môi, nhiệt độ, thời gian, thể tích

Chọn điều kiện chiết tối ưu dựa trên: hàm lượng flavonoid, kháng khuẩn, kháng viêm Điều chế cao chiết toàn phần

Tiêu chuẩn hóa cao chiết toàn phần: độ tinh khiết, định tính bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng, định lượng flavonoid toàn phần Đánh giá hoạt tính sinh học cao chiết toàn phần: hàm lượng flavonoid, kháng khuẩn, kháng viêm, kháng oxi hóa Sơ bô ̣ thành phần hóa thực vật lá Nhàu

Sơ đồ 2.1 Nội dung nghiên cứu

Lá Nhàu được thu hái từ vườn bảo tồn gen và giống cây thuốc các tỉnh phía Nam–

Trung tâm Sâm và Dược liệu TP Hồ Chí Minh Lá Nhàu được phơi sấy khô ở điều kiện thích hợp (nhiệt độ 40 o C và trong 3 ngày) Bột dược liệu khô (được xay thành bột qua ray có kích thước 2 mm) Cao chiết được lưu trữ lạnh trong cốc thủy tinh

Hình 2.1 Hình thái tự nhiên lá Nhàu [A], bột lá Nhàu [B]

2.2.2 Hóa chất và dụng cụ

Bả ng 2.1 Danh sách hóa chất, thuốc thử sử dụng trong nghiên cứu

Kiểm nghiệm Hoạt tính sinh học

- HCl đậm đặc, H2SO4 đậm đặc - Ethanol 96%, Methanol - Diethyl ether, Ethyl acetat - NaOH 10%, FeCl3 5%, AlCl3 2%

- CH3COOH,Pb(CH3COO)210%

- Chuẩn rutin (HPLC ≥ 98%, Trung Quốc)

- Hệ dung môi khai triển sắc ký - Thuốc thử hiện màu: FeCl3/EtOH - Diclofenac sodium, acid ascorbic

- DMSO (Trung quốc) - Sinh khối vi khuẩn:

Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Staphylococus aureus

- Amoxicillin (Công ty Cổ phần Dược phẩm

DOMESCO) - Bột agar 1,5%, pepton 1%, yeast extract 0,5%,NaCl 1%

Bả ng 2.2 Danh sách thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu

Kiểm nghiệm Hoạt tính sinh học

- Máy cô quay Buchi Switzeland, bếp đun cách thủy Memmert và hệ thống máy sinh hàn

- Bình hút ẩm, chén sứ - Bình chiết đun hồi lưu - Hệ thống ống sinh hàn - Đèn UV hai bước sóng - Tủ sấy SANYO MOV – 112 - Lò nung LENTON FURNACES,

Made in England - Cân kỹ thuật Mettler Toledo

AB204 - Bản silica gel F254 tráng sẵn trên nền nhôm (Merck,Art 1,05554) - Bể siêu âm Sonorex RK-1028H

(Bandelin) - Máy đo quang UV – Vis Beckman coulter DU 730 Life Science UV/Vis, cuvette thạch anh Spectrophotometer, cuvette thạch anh

- Máy chụp ảnh CANON 16.0 mega pixels

- Bể điều nhiệt Memmert WNB14, Đức

- Tủ cấy vi sinh - Đĩa petri, micropipet - Lò vi sóng

- Nồi hấp tiệt trùng dạng đứng - Máy spin down

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chiết di ̣ch chiết ether: chiết 10 - 15 g bô ̣t dược liê ̣u bằng diethyl ether trong Soxhlet hay lắc trong mô ̣t bình nón trong 10 - 20 phút Chiết cho đến khi di ̣ch chiết ether sau khi bốc hơi không còn để la ̣i lớp cắn mờ trên mă ̣t kính đồng hồ Gô ̣p di ̣ch chiết, lo ̣c và cô đến cắn đến khi còn khoảng 50 mL di ̣ch chiết ether

Chiết di ̣ch chiết cồn: bã dược liê ̣u được chiết tiếp với cồn 96% trong bình nón vớ i sinh hàn hồi lưu 20 – 30 phút trên bếp cách thủy, thực hiê ̣n 2 – 3 lần Gô ̣p các di ̣ch chiết, lo ̣c và cô la ̣i đến khi còn khoảng 50 mL di ̣ch chiết cồn Phần lớn các di ̣ch chiết cồn được dùng để đi ̣nh tính trực tiếp các nhóm hợp chất

Chiết di ̣ch chiết cồn thủy phân: mô ̣t phần di ̣ch chiết cồn được thủy phân để đi ̣nh tính các aglycon sau thủy phân Lấy 15 mL di ̣ch chiết cồn cho vào bình nón 100 mL, thêm 10 mL acid hydrocloric 10% Và đun hồi lưu trên bếp cách thủy 30 phút, cô còn 50%, thêm 20 mL nướ c Để nguô ̣i, cho hỗn hợp vào bình lắng ga ̣n và chiết bằng diethyl ether (15mL x 3 lần) Di ̣ch ether được dùng để đi ̣nh tính các aglycon

Chiết di ̣ch chiết nước: bã dược liê ̣u sau khi chiết bằng cồn được đem chiết nóng vớ i nước cất trong bình nón trên bếp cách thủy sôi Gô ̣p các di ̣ch chiết, đê nguô ̣i, lo ̣c và cô để thu được khoảng 50 mL di ̣ch chiết nước

Chiết di ̣ch chiết nước thủy phân: mô ̣t phần di ̣ch chiết được thủy phân để đi ̣nh tính các aglycon sau khi thủy phân Lấy 15 mL di ̣ch chiết nước cho vào bình nón 100 mL, thêm 10 mL acid hydrocloric 10% và đun hồi lưu trên bếp cách thủy 30 phút Để nguội, cho hỗn hợp vào bình lắng ga ̣n và chiết bằng diethyl ether (15mL x 3 lần) Di ̣ch ether được dùng để đi ̣nh tính các aglycon

Tinh dầu Carotenoid Triterpenoid tự do Alkaloid Coumarin Anthraquinon

Flavonoid Alkaloid, coumarin, flavonoid Saponin

Acid hữu cơ Triterpenoid thủy phân, coumarin, anthraquinon, flavonoid

Alkaloid, flavonoid, tannin, saponin, các hợp chất khử, acid hữu cơ

Triterpenoid thủy phân, anthraquinon, flavonoid

Chất béo Vết mờ trên giấy lọc

H 2 SO 4 đậm đặc Phản ứng Libermann-Burchard Thuốc thử đặc trưng

KOH 10%/365nm Phản ứng Borntrager Phản ứng Cyanidin

FeCl 3 – gelatin muối Thuốc thử Fehling Na 2 CO 3

Dịch chiết nước Dịch chiết cồn thủy phân Dịch chiết ether

Dịch chiết nước thủy phân Dược liệu

Bã dược liệu Chiết với ether

Sơ đồ 2.2 Tóm tắt phân tích sơ bô ̣ thành phần hóa thực vâ ̣t

Bả ng 2.3 Tóm tắt phân tích sơ bô ̣ thành phần hóa thực vâ ̣t

Nhóm hợp chất Thuốc thử

Cách thực hiện Phản ứng dương tính

Chất béo Nhỏ dung dịch lên giấy

Carotenoid Carr-Price Xanh chuyển sang đỏ

H2SO4 Xanh dương hay xanh lục ngả xanh dương Tinh dầu Bốc hơi đến cắn Có mùi thơm đặc trưng Triterpenoid tự do Liebermann-Burchard Đỏ nâu tím, lớp trên có màu xanh lục Alkaloid TT chung của Alkaloid Kết tủa Coumarin Phát quang trong kiềm Phát quang mạnh hơn

Antraglycosid KOH 10% Dung dịch kiềm có màu hồng đến đỏ Flavonoid Mg/HCl đậm đặc Dung dịch có màu hồng đến đỏ

Tannin DD FeCl3 Xanh rêu hay xanh đen

(Polyphenol) DD gelatin-muối Tủa bông trắng (Tanin) Triterpenoid thủy phân Liebermann-Burchard Đỏ-nâu tím, lớp trên có màu xanh lục

Saponin TT Liebermann Có vòng tím nâu

Lắc mạnh dung dịch nước

Acid hữu cơ Na2CO3 Sủi bọt

Chất khử TT Fehling Có kết tủa đỏ gạch

Hợp chất polyuronic Pha loãng với cồn

Tủa bông trắng vàng nâu

2.3.2 Phương pháp chiết xuất đun hồi lưu

• Nguyên tắc Đun hồi lưu là phương pháp sử dụng dung môi để lấy các chất tan ra khỏi mô thực vật dưới tác dụng của nhiệt, dung môi và các chất dễ bay hơi sẽ được chuyển trở lại môi trường phản ứng thông qua hệ thống ngưng tụ

24 Sản phẩm thu được sau quá trình chiết xuất là một dung dịch của các chất hòa tan trong dung môi, dung dịch này được gọi là dịch chiết Ưu điểm:

- Tiết kiệm dung môi - Thiết bị đơn giản, dễ thực hiện - Hiệu suất chiết xuất cao

- Hạn chết được ô nhiễm môi trường Nhược điểm:

- Sau khi chiết xuất, phải tiến hành tách riêng phần các chất với nhau để thu được chất cần chiết xuất, đó là một quá trình phức tạp

- Tốn thời gian - Không khuấy trộn được - Dịch chiết luôn ở nhiệt độ sôi của dung môi nên các chất không bền với nhiệt dễ bị phân hủy

Cân 700 g khối lượng bột nguyên liệu khô lá Nhàu Dược liệu được ngâm cùng 17,5 lít dung môi ethanol 70% trong một bình cầu đáy tròn được nối với hệ thống ngưng tụ Đun nóng bình cầu chứa dược liệu và dung môi đến nhiệt độ sôi 60 o C, dung môi bốc hơi sẽ ngưng tụ và quay trở lại bình chiết Đun dược liệu trong 95 phút ở nhiệt độ 60 o C để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên rồi tiến hành rút dịch chiết Dịch chiết được cô quay chân không dưới áp suất giảm thu cao loãng và thu hồi dung môi, tiếp tục cô cao loãng đến dạng cao đặc bếp cách thủy ở 80 o C thu được cao cồn 70% lá Nhàu

Công thức tính hiệu suất chiết cao

25 H: Hiệu suất chiết cao (%) m: Khối lượng cao chiết thu được (g) M: Khối lượng nguyên liệu (g) a: Hàm ẩm cao chiết (%) A: Hàm ẩm nguyên liệu (%)

2.3.3 Các phương pháp tiêu chuẩn hóa dược liệu và cao toàn phần

Nguyên liệu và cao chiết được kiểm định độ tinh khiết trên các chỉ tiêu “mất khối lượng do làm khô”, “độ tro toàn phần”, “độ tro không tan trong acid” dựa theo Dược điển Việt Nam V Định tính flavonoid bằng phản ứng hóa học đặc trưng và sắc ký lớp mỏng; định lượng flavonoid toàn phần bằng phương pháp UV-Vis dựa vào bước sóng hấp thu cực đại

Các phương pháp tiêu chuẩn hóa dược liệu

✓ Xác định mất khối lượng do làm khô

Sấy một khối lượng chính xác mẫu dược liệu ở nhiệt độ 105 o C cho đến khối lượng không đổi Cân mẫu thử sau khi sấy Từ độ chênh lệch khối lượng của mẫu trước và sau khi sấy, xác định được lượng nước, một phần hoặc toàn bộ lượng nước kết tinh và lượng chất dễ bay hơi trong mẫu dược liệu Xác định mất khối lượng do làm khô được tiến hành theo Dược điển Việt Nam V (Phụ lục 9.6 trang 203), đối với mẫu nguyên liệu khô khối lượng mất do làm khô không quá 13%, đối với mẫu cao chiết khối lượng mất do làm khô không quá 20%

Sấy chén sứ ở nhiệt độ 105 o C cho đến khi cân khối lượng 3 lần liên tiếp không đổi Để nguội trong bình hút ẩm trong 15 phút

Cân chính xác khoảng 1 g mẫu dược liệu vào chén sứ, trải đều mẫu ở đáy chén sứ và sấy ở nhiệt độ 105 o C, áp suất thường, trong 4 giờ Để nguội trong bình hút ẩm 15 phút, cân và ghi nhận khối lượng

26 Tiếp tục sấy mẫu ở 105 o C, áp suất thường trong 1 giờ, để vào bình hút ẩm đến nguội và cân lại khối lượng sau khi sấy Lặp lại nhiều lần cho đến khi cân 3 lần liên tiếp khối lượng không đổi, độ chênh lệch không quá 5 mg

Thực hiện 3 lần trên 1 mẫu, lấy giá trị trung bình từng mẫu

Công thức tính độ ẩm

A = a − b a × 100 (%) Trong đó, A: Khối lượng mất do làm khô (%) a: Khối lượng mẫu trước khi sấy (g) b: Khối lượng mẫu sau khi sấy (g)

✓ Xác định độ tro toàn phần

Nung một khối lượng xác định mẫu dược liệu ở nhiệt độ 550 o C cho đến khi khối lượng không đổi Cân lượng tro đến khối lượng không đổi Tro chính là phần cắn vô cơ còn lại sau khi ta đốt cháy hoàn toàn mẫu dược liệu Xác định độ tro toàn phần theo Dược điển Việt Nam V (Phụ lục 9.8 trang 204), đối với phần lớn nguyên liệu, độ tro toàn phần thường trong khoảng 4 - 12%, một vài trường hợp có thể cao tới 15 - 18%, đối với mẫu cao chiết độ tro toàn phần không quá 35%

• Tiến hành Nung chén sứ cho đến khi khối lượng không đổi sau ba lần cân liên tiếp

Cân chính xác khoảng 1 g mẫu dược liệu khô cho vào chén sứ Trải đều mẫu ở đáy chén và sấy ở nhiệt độ 105 o C trong 30 phút

Dùng kẹp sắt dài đưa chén vào lò nung ở 550 o C (tránh đứng trực tiếp trước cửa lò nung) và nung cho đến khi vô cơ hóa hoàn toàn (tro không còn màu đen) Để nguội trong bình hút ẩm khoảng 30 phút Cân và ghi lại kết quả

27 Đặt chén nung vào lò nung và tiếp tục nung ở nhiệt độ trên trong 1 giờ, để nguội trong bình hút ẩm và cân, ghi nhận kết quả

Tiếp tục tiến hành lặp lại như trên cho đến khi khối lượng cân 3 lần liên tiếp không thay đổi, độ chênh lệch không quá 0,5 mg

Thực hiện 3 lần trên 1 mẫu, lấy giá trị trung bình từng mẫu

Công thức tính độ tro toàn phần

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

KẾT QUẢ PHÂN TÍCH SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA THỰC VẬT LÁ NHÀU

Bả ng 3.1 Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật lá Nhàu

Kết quả định tính trên các dịch chiết

Kết quả định tính chung * Dịch chiết ether

Dịch chiết cồn Dịch chiết nước

Ghi chú *: (-): không có; (±): nghi ngờ; (+): có ít; (++): có; (+++): có nhiều;

(++++): có rất nhiều Ghi chú: có thể có phản ứng nhưng không thực hiện

Không có mặt của nhóm hợp chất trong dịch chiết

Từ kết quả bảng 3.1 cho thấy trong lá Nhàu có nhiều các hợp chất: carotenoid, triterpenoid tự do, coumarin, antraglycosid, flavonoid, triterpenoid thủy phân, saponin, acid hữu cơ, chất khử Có các hợp chất: alkaloid, tannin Không có các hợp chất: chất béo, tinh dầu, anthocyanosid, proanthocyanidin, hợp chất polyuronic

TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG

3.2.1 Tối ưu dung môi chiết cao lá Nhàu

3.2.1.1 Định lượng flavonoid bằng phương pháp UV-Vis

Bả ng 3.2 Kết quả định lượng flavonoid bằng phương pháp UV-Vis

Mẫu Lần OD Hàm lượng flavonoid đã trừ độ ẩm

Hàm lượng flavonoid trung bình đã trừ độ ẩm (mg/g)

Ghi chú: kết quả ± với độ lệch chuẩn của từng giá trị a p < 0,05 so với cao cồn 70%

Kết quả bảng 3.2 cho thấy hàm lượng flavonoid của cao cồn 70% cao hơn cao cồn 45% và 96% một cách khác biệt có ý nghĩa thống kê

3.2.1.2 Định tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch

Bả ng 3.3 Kết quả định tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch

Cao cồn 96% Cao cồn 70% Cao cồn 45%

19,167 ± 0,167 Ghi chú: (+) Amoxicilin (50 μg/mL) đối với E.coli, Amoxicilin (100 μg/mL) đối với S.aureus , P Aeruginosa;

*p< 0,05 so vơ ́ i cao cồn ở nồng độ 100 mg/mL; #p< 0,05 so với cao cồn 70%

Kết quả bảng 3.3 cho thấy khả năng kháng khuẩn của các cao cồn ở nồng độ 100 mg/mL cao hơn ở nồng độ 50 mg/mL một cách khác biệt có ý nghĩa thống kê Đường kính vòng kháng khuẩn của cao cồn 70%cao hơn cao cồn 45% và 96% một cách khác biệt có ý nghĩa thống kê

3.2.1.3 Đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro

Bả ng 3.4 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro cao chiết

Nồng độ cao chiết (àg/m

Bả ng 3.5 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro diclofenac sodium

Nồng độ diclofenac sodium (ug/mL) 40 100 200 300 400

47 Ghi chú: kết quả ± với độ lệch chuẩn của từng giá trị

Kết quả bảng 3.4, 3.5 cho thấy giá trị IC 50 của cao cồn 70% là thấp hơn cao cồn 45%, 96% và diclofenac sodium

Dung môi chiết ảnh hưởng nhiều đến thành phần và chủng loại các hợp chất có trong cao chiết Ethanol có tác dụng biến tính nhanh chóng, phá hủy màng tế bào lá, tạo điều kiện thuận lợi cho việc xâm nhập, tiếp xúc với các hoạt chất kháng oxy hóa khác nên cho hiệu quả chiết cao hơn Chúng tôi chọn 3 loại dung môi là cồn 45%, 70% và 96% do nồng độ ethanol khác nhau thì mức độ hòa tan các hợp chất sẽ khác nhau

[49] Mức độ phân cực của dung môi tùy thuộc vào hằng số điện môi, giá trị liên kết hydro trong đó, nước có hằng số điện môi, giá trị liên kết hydro cao hơn ethanol Do đó, khi trộn lẫn ethanol và nước sẽ cho các hỗn hợp ethanol - nước có mức độ phân cực khác nhau Kết quả bảng 3.2 cho thấy hàm lượng flavonoid của cao cồn 70% cao hơn cao cồn 45% và 96% một cách khác biệt có ý nghĩa thống kê Điều này có thể giải thích bởi polyphenol trong lá Nhàu là có chứa nhiều nhóm hydroxyl linh động nhưng vì có cấu trúc phân tử lớn nên độ phân cực của chúng gần xấp xỉ độ phân cực của ethanol và ở nồng độ ethanol 70% có độ phân cực tương đương với độ phân cực của polyphenol nên chúng hòa tan tốt hơn [16] Từ kết quả bảng 3.4 và bảng 3.5 cho thấy khả năng kháng khuẩn và kháng viêm của cao cồn 70% là tốt nhất do hàm lượng flavonoid là cao nhất nên có tác dụng kháng khuẩn tốt nhất thể hiện qua đường kính vòng kháng khuẩn cao nhất và giá trị IC50 thấp nhất thì hoạt tính kháng viêm cao nhất.

Tối ưu điều kiện chiết xuất dược liệu dựa trên phần mềm Design–Expert 11.0

Bả ng 3.6 Bố trí các điều kiện thí nghiệm và kết quả thực nghiệm theo phần mềm

Ghi chú: kết quả ± với độ lệch chuẩn của từng giá trị

Hình 3.1 Đồ thị 3D ảnh hưởng 2 yếu tố đến hàm lượng flavonoid: (A) Thời gian và nhiệt độ; (B) Thể tích và nhiệt độ; (C) Thời gian và thể tích

Hình 3.2 Đồ thị 3D ảnh hưởng 2 yếu tố thời gian và nhiệt độ đến kháng khuẩn

Hình 3.3 Đồ thị 3D ảnh hưởng 2 yếu tố thời gian và nhiệt độ đến kháng viêm

Hình 3.4 Dự đoán sự thay đổi hàm lượng flavonoid theo sự thay đổi các yếu tố

Hình 3.5 Dự đoán sự thay đổi kháng khuẩn theo sự thay đổi của các yếu tố

Hình 3.6 Dự đoán sự thay đổi kháng viêm theo sự thay đổi của các yếu tố

Sau khi khảo sát các điều kiện chiết được thiết kế trên phần mềm Design- Expert 11.0 và tiến hành thực nghiệm ta được kết quả như bảng 3.6 Từ kết quả bảng 3.6 ta có phương trình hồi quy tương thích với thực nghiệm cho hàm lượng flavonoid (1), kháng khuẩn (2) và kháng viêm (3) có dạng:

Theo phương trình hồi quy (1) cho thấy hàm lượng flavonoid chịu ảnh hưởng bậc 1 của cả 3 yếu tố nhiệt độ (X1), thời gian chiết (X2), thể tích dung môi (X3); không chịu ảnh hưởng bậc 2 của yếu tố nào nhưng đồng thời chịu ảnh hưởng của tương tác giữa

54 2 yếu tố nhiệt độ phản ứng và thời gian chiết (X1X2) ;cụ thể: Trong 3 yếu tố khảo sát, 2 yếu tố nhiệt độ (X1) và thời gian chiết ảnh hưởng đến hàm mục tiêu theo hàm bậc 1 với hệ số âm ( 0,1688; 0,2327).Yếu tố thể tích dung môi (X3) ảnh hưởng đến hàm mục tiêu với hệ số dương của hàm bậc 1 là 0,1093 Hai yếu tố nhiệt độ phản ứng và thời gian tương tác với nhau (X1X2) và ảnh hưởng đến hàm mục tiêu theo hệ số dương (0,4502) Hai yếu tố nhiệt độ phản ứng và thể tích dung môi tương tác với nhau (X1X3) và ảnh hưởng đến hàm mục tiêu theo hệ số dương (0,6289); còn hai yếu tố thời gian chiết và thể tích dung môi (X2X3) tương tác với nhau có sự ảnh hưởng không đáng kể với hệ số dương là 0,0290 Đối với khả năng kháng khuẩn theo phương trình (2) cho thấy khả năng kháng khuẩn không chịu sự ảnh hưởng bậc 1, 2 của các yếu tố nhiệt độ (X1), thời gian chiết (X2), thể tích dung môi (X3) cũng như sự tương tác của chúng Đối với khả năng kháng viêm theo phương trình (3) cho thấy khả năng kháng viêm chỉ chịu ảnh hưởng bậc 1 của cả 3 yếu tố X1, X2, X3 nhưng không chịu ảnh hưởng bậc 2 của 3 yếu tố X1,X2,X3 đồng thời cũng không chịu ảnh hưởng của tương tác giữa chúng

Theo yêu cầu nghiên cứu đặt ra thì ta chọn các điều kiện phù hợp với hàm lượng flavonoid cao nhất, kháng khuẩn cao nhất và kháng viêm thấp nhất

Bả ng 3.7 Kết quả giá trị tối ưu hóa theo các yếu tố đáp ứng

Yếu tố khảo sát Yếu tố đáp ứng

Kháng viêm (μg/mL ) Nhiệt độ phản ứng

Kết quả giá trị tối ưu hóa các điều kiện trong quá trình chiết cao lá Nhàu bằng phương pháp đáp ứng bề mặt được thể hiện trong Bảng 3.7 Theo đó, nhiệt độ chiết để có: hàm lượng flavonoid cao nhất là 60 o C, kháng khuẩn cao nhất là 89 o C và kháng viêm thấp nhất là 90 o C Thời gian chiết để ba yếu tố được đáp ứng lần lượt là 75 phút, 150 phút và 95 phút Thể tích dung môi cần để ba yếu tố được đáp ứng lần lượt là 300 mL, 568,179 mL và 500 mL Từ kết quả hình 3.1, 3.4 ta thấy hàm lượng flavonoid có xu hướng giảm giá trị khi yếu tố yếu tố nhiệt độ phản ứng X1 và thời gian chiết X 2 tăng Đối với yếu tố thể tích dung môi X3 tăng thì hàm lượng flavonoid thể hiện xu hướng

55 tăng trong vùng khảo sát Từ kết quả hình 3.3, 3.6 ta thấy khả năng kháng viêm có xu hướng tăng khi yếu tố thời gian chiết X2 giảm trong vùng khảo sát Đối với yếu tố thể tích X3 tăng thì khả năng kháng viêm thể hiện xu hướng tăng.Từ đó ta chọn các điều kiện như sau để tối ưu quá trình chiết cao:

HIÊ ̣U SUẤT CHIẾT CAO CỒN 70% TỪ LÁ NHÀU

Bả ng 3.8 Kết quả hiê ̣u suất chiết cao cồn 70% từ lá Nhàu

Khối lượng nguyên liệu (g) Độ ẩm nguyên liệu (%)

Khối lượng cao chiết (g) Độ ẩm cao chiết (%)

Như vậy, sau quá trình chiết xuất dược liệu với dung môi cồn 70% thu được hiệu suất chiết cao là 21,218% Để kiểm tra tính tương thích của kết quả phương trình hồi quy từ đối với thực nghiệm, tiến hành thực hiện lại phản ứng xà phòng hóa với điều kiện tối ưu đã lựa chọn và thí nghiệm được thực hiện 3 lần Kết quả thí nghiệm kiểm tra lại kết quả tối ưu hóa từ tính toán:

Bả ng 3.9 Kiểm tra độ lặp lại của mô hình tối ưu hoá

Sai số hàm lượng flavonoid giữa kết quả sử dụng phần mềm và thực nghiệm:

Sai số kháng khuẩn giữa kết quả sử dụng phần mềm và thực nghiệm:

Sai số kháng viêm giữa kết quả sử dụng phần mềm và thực nghiệm:

Tính toán kết quả sai số trung bình sau 3 lần thực hiện hàm lượng flavonoid là

2,267%, kháng khuẩn là 19,156% và kháng viêm là 9,9%

Từ những kết quả trên cho thấy sai số thấp, cho thấy mô hình tối ưu có độ lặp lại tốt

Bả ng 3.10 Phân tích phương sai (ANOVA) ảnh hưởng của các nhân tố chiết đến hàm mục tiêu hàm lượng flavonoid

Bậc tự do Trung bình bình phương

Kết quả cho thấy các biến đơn: X1, X2, X3 không có ảnh hưởng đáng kể đến hàm mục tiêu (p > 0,05), nhưng tương tác bậc hai (X1X3) của biến này có ảnh hưởng đáng kể nên biến X1,X3 được giữ lại để phân tích tối ưu Riêng biến đơn X2 không có ảnh hưởng đáng kể nên không được giữ lại phân tích tối ưu sau này

Hình 3.7 So sánh hàm lượng flavonoid từ thực nghiệm và từ mô hình được xây dựng

Kết quả phân tích cho thấy các yếu tố tương tác với hàm mục tiêu hàm lượng flavonoid với giá trị mức ý nghĩa R 2 =0,544 và độ tin cậy là 74%

Hệ số xác định R (coefficient of determination) cho biết 54,4% sự biến đổi của hàm lượng flavonoid là do ảnh hưởng của các biến độc lập như hàm nhiệt độ, thời gian phản ứng và thể tích dung môi, có 45,6% sự thay đổi là do các yếu tố không xác định được gây ra (sai số ngẫu nhiên) Giá trị p của kiểm định sự không tương thích của mô hình (lack of fit) là 0,393 lớn hơn 0,05 Như vậy sự khác biết giữa dự đoán của phần mềm và thực nghiệm không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 Do đó, mô hình hồi qui trên tương thích với thực nghiệm

Bả ng 3.11 Kết quả phân tích phương sai cho mô hình đa thức bậc hai kháng viêm

Bậc tự do Trung bình bình phương

Kết quả cho thấy các biến đơn: X1, X2, X3 không có ảnh hưởng đáng kể đến hàm mục tiêu (p > 0,05) nên không được giữ lại để phân tích tối ưu sau này

Hình 3.8 So sánh kháng viêm từ thực nghiệm và từ mô hình được xây dựng

Kết quả phân tích cho thấy các yếu tố tương tác với hàm mục tiêu kháng viêm với giá trị mức ý nghĩa R 2 =0,246 và độ tin cậy là 49,6%

Hệ số xác định R (coefficient of determination) cho biết 24,6% sự biến đổi của hàm lượng flavonoid là do ảnh hưởng của các biến độc lập như hàm nhiệt độ, thời gian chiết và thể tích dung môi, có 75,4% sự thay đổi là do các yếu tố không xác định được gây ra (sai số ngẫu nhiên) Giá trị p của kiểm định sự không tương thích của mô hình (lack of fit) là 0,422 lớn hơn 0,05 Như vậy sự khác biết giữa dự đoán của phần mềm và thực nghiệm không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 Do đó, mô hình hồi qui trên tương thích với thực nghiệm

TIÊU CHUẨN HÓA NGUYÊN LIÊ ̣U VÀ CAO CHIẾT CỒN 70% TỪ LÁ NHÀU

3.4.1 Xác đi ̣nh mất khối lươ ̣ng do làm khô Bả ng 3.12 Kết quả đô ̣ ẩm mẫu nguyên liê ̣u và cao chiết cồn 70% từ lá Nhàu

Mẫu Lần Độ ẩm (%) Độ ẩm trung bình (%)

Ghi chú: kết quả ± với độ lệch chuẩn của từng giá trị

Từ kết quả bảng 3.12 ta thấy độ ẩm của mẫu nguyên liệu và cao chiết cồn 70% từ lá Nhàu đạt tiêu chuẩn về nguyên liệu (≤ 13%) và cao đặc (≤ 20%) theo Dược điển Việt Nam V và đạt yêu cầu về độ đồng nhất để có thể tiến hành thực hiện các chỉ tiêu tiếp theo trong tiêu chuẩn nguyên liệu và cao chiết

3.4.2 Xác đi ̣nh đô ̣ tro toàn phần Bả ng 3.13 Kết quả đô ̣ tro toàn phần mẫu nguyên liê ̣u và cao chiết cồn 70% từ lá

Nhàu Mẫu Lần Độ tro toàn phần (%) Độ tro toàn phần trung bình (%)

Ghi chú: kết quả ± với độ lệch chuẩn của từng giá trị Từ kết quả bảng 3.13 ta thấy độ tro toàn phần của mẫu nguyên liệu và cao chiết cồn 70% từ lá Nhàu đạt tiêu chuẩn về nguyên liệu (4 – 12%) và cao đặc (≤ 35%)

3.4.3 Xác đi ̣nh đô ̣ tro không tan trong acid Bả ng 3.14 Kết quả đô ̣ tro không tan trong acid HCl của mẫu nguyên liê ̣u lá Nhàu

Mẫu Lần Độ tro không tan trong acid (%) Độ tro không tan trong acid trung bình (%)

Ghi chú: kết quả ± với độ lệch chuẩn của từng giá trị

Từ kết quả bảng 3.14 ta thấy độ tro không tan trong acid HCl của mẫu nguyên liệu từ lá Nhàu đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V (thường nhỏ hơn 2,4%)

3.4.4 Định tính flavonoid bằng phương pháp hóa ho ̣c

Hình 4.9 Kết quả định tính flavonoid lá Nhàu bằng phản ứng hóa học Flavonoid phản ứng với thuốc thử: (A) trong nguyên liệu lá Nhàu; (B) trong cao chiết cồn

Từ hình 3.9A, 3.9 B cho thấy mẫu nguyên liệu và cao chiết cồn 70% từ lá Nhàu có chứa flavonoid phản ứng với NaOH 10% làm đậm màu dung dịch hơn so với chứng dương Mẫu nguyên liệu và cao chiết cồn 70% từ lá Nhàu có chứa flavonoid nên khi phản ứng với thuốc thử FeCl3 5% làm đổi màu dung dịch thành xanh đen do tùy theo nhóm flavonoid và vị trí, số lượng nhóm – OH phenol trong phân tử mà dung dịch đổi màu lục, xanh hoặc nâu Mẫu nguyên liệu và cao chiết cồn 70% từ lá Nhàu có chứa flavonoid nên khi phản ứng với thuốc thử cyanidin (bột Mg kim loại + 0,5 mL HCl đậm đặc) tạo phức acid ổn định làm đổi màu dịch chiết thành màu đỏ, chứng tỏ trong mẫu thử chứa các flavonoid có vòng γ – pyron hay γ – dihydropyron tạo phản ứng khử với thuốc thử cyanidin cho các anthocyanidin có màu.Mẫu nguyên liệu và cao chiết cồn 70% từ lá Nhàu có chứa flavonoid nên khi phản ứng với thuốc thử Pb(CH3COO)2

10% làm dung dịch xuất hiện tủa màu trắng

Từ những kết qủa trên cho thấy mẫu nguyên liệu và cao chiết cồn 70% từ lá Nhàu đều cho kết quả dương tính với cả bốn phản ứng trên Như vậy, mẫu nguyên liệu và cao chiết cồn 70% từ lá Nhàu đều có chứa flavonoid

3.4.5 Đi ̣nh tính flavonoid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng theo chuẩn rutin

Ghi chú * : A: Quan sát dưới đèn tử ngoại bước sóng 254 nm; B: Nhuộm FeCl3 và quan sát dười ánh sáng thường; 1: Vết rutin; 2: Vết nguyên liệu; 3: Vết cao

Hình 3.10 Sắc ký đồ định tính flavonoid trong dịch chiết từ lá Nhàu Hệ khai triển: (TEA) Toluen – Ethyl acetat – Acid formic (8: 2: 1) ; (EMN) Ethyl acetat – Methanol – Nước (100: 17: 13)

Hình 3.11 Sắc ký đồ định tính flavonoid trong dịch chiết từ lá Nhàu Hệ khai triển: (BAN) n-butanol – Acid acetic – Nước (7: 1: 2); (TEMA) Toluen -

Etyl acetat – Methanol – Acid formic (7: 5: 5: 1)

63 Từ hình 14 và 15 quan sát sắc ký đồ dưới đèn UV 254 nm và nhuộm hiện màu với thuốc thử FeCl3 5% trong cồn, mẫu nguyên liệu và cao chiết cồn 70% từ lá Nhàu xuất hiện vết có màu và Rf tương tự nhau, cho thấy có sự hiện diện của nguyên liệu lá

Nhàu trong cao chiết Đồng thời, mẫu nguyên liệu và cao chiết cồn 70% từ lá Nhàu đều xuất hiện vết có màu và Rf = 0,533 (hình 3.10 TEA ), 0,44 (hình 3.10 EMN ), 0,613 (hình 3.11 BAN ) và 0,347 (hình 3.11 TEMA) giống với chất chuẩn rutin nên kết luận trong nguyên liệu và cao chiết cồn 70% từ lá Nhàu đều có rutin

3.4.6 Định lươ ̣ng flavonoid bằng phương pháp UV – Vis theo chuẩn rutin

Sau khi tiến hành xác định bước sóng hấp thu cực đại của dung dịch chuẩn rutin ở các nồng độ khác nhau trên máy quang phổ tử ngoại khả kiến, xác định được bước sóng hấp thu cực đại của mẫu chuẩn là 431 nm Tiếp tục xây dựng đường chuẩn và đo OD của mẫu cao chiết cần định lượng

Bả ng 3.15 Nồng độ và mật độ quang chất chuẩn Rutin Nồng độ dung dịch chuẩn (àg/mL) OD 431 nm

Từ những kết quả đo OD mẫu chuẩn ở các nồng độ 60, 70, 80, 90, 100 μg/mL, đường chuẩn rutin được xây dựng với phương trình hồi quy có dạng y = 0,0053x – 0,0774 với sai số giữa lý thuyết và thực nghiệm nhỏ (R 2 = 0,999), nên có thể áp dụng vào định lượng flavonoid tính theo chuẩn rutin

Công thức tính hàm lượng flavonoid (tính theo chuẩn rutin) có trong 100 g mẫu khô được xây dựng từ phương trình hồi quy y =0,0053x – 0,0774:

At: độ hấp thu của mẫu thử k: độ pha loãng của mẫu thử Dc: độ tinh khiết của mẫu chuẩn a: khối lượng mẫu dùng (g) h: khối lượng mất do làm khô trong 1 g mẫu

F (mg/g): hàm lượng flavonoid tính theo chuẩn rutin (%)

Bả ng 3.16 Kết quả định lượng flavonoid trong mẫu nguyên liệu và cao chiết cồn

70% từ lá Nhàu bằng phương pháp cân và UV-Vis

Hàm lượng flavonoid đã trừ độ ẩm (mg/g)

Hàm lượng flavonoid toàn phần trung bình đã trừ độ ẩm

Ghi chú: kết quả ± với độ lệch chuẩn của từng giá trị

Qua các kết quả bảng 3.12, 3.13, 3.14 ta thấy nguyên liệu và cao chiết cồn 70% từ lá Nhàu được tiến hành tiêu chuẩn hóa theo Dược điển Việt Nam V đạt yêu cầu về các chỉ tiêu: “mất khối lượng do làm khô”, “độ tro toàn phần” và “độ tro không tan trong acid” Như vậy, nguyên liệu và cao chiết đảm bảo độ an toàn trong bảo quản, không lẫn nhiều tạp chất, đất cát

Qua các thí nghiệm định tính bằng phản ứng hóa học và phương pháp sắc ký lớp mỏng hình 3.9, 3.10, 3.11 cho thấy trong thành phần của nguyên liệu và cao chiết cồn 70% từ lá Nhàu có hợp chất thứ cấp flavonoid Phân tích định tính bằng sắc ký lớp mỏng trên chuẩn rutin có thể nhận định thành phần flavonoid trong mẫu Trong đề tài này, phân tích định tính và định lượng được thực hiện theo chất chuẩn rutin vì đối với chuẩn rutin sẽ cho kết quả đặc hiệu do ngay trong thành phần flavonoid của lá Nhàu đã có rutin và khi tiến hành định tính, định lượng flavonoid không cần thực hiện các khảo sát về điều kiện thủy phân flavonoid Nghiên cứu trước đây về lá Nhàu, rutin được sử dụng như một biomarker nhận biết sự có mặt của flavonoid hay cụ thể là thành phần flavonol glycosid [20]

66 Từ những kết quả định lượng flavonoid trong mẫu nguyên liệu và mẫu cao chiết cồn 70% từ lá Nhàu bảng 3.16, cho thấy hàm lượng rutin trung bình có trong 1 g mẫu bột nguyên liệu khô lá Nhàu là 15,854 mg (phương pháp cân), 0,715 mg (phương pháp

UV-Vis), hàm lượng rutin trung bình có trong 1 g mẫu cao chiết cồn 70% lá Nhàu là 103,014 mg (phương pháp cân), 2,227 mg (phương pháp UV-Vis) So sánh kết quả định lượng flavonoid bằng phương pháp UV-Vis theo chất chuẩn rutin trên mẫu nguyên liệu và cao chiết cồn 70% từ lá Nhàu cho thấy hàm lượng rutin trong mẫu cao chiết cao hơn trong mẫu nguyên liệu Mặt khác, định lượng flavonoid theo phương pháp cân cho hàm lượng flavonoid toàn phần cao hơn nhiều so với định lượng bằng phương pháp UV-Vis, điều này cho thấy nhóm hợp chất flavonoid có hiện diện trong phân đoạn ethyl acetat nhưng phân đoạn ethyl acetat không chỉ có chứa nhóm hợp chất flavonoid nên thực tế hàm lượng flavonoid toàn phần cao hơn nhiều lần

Tóm lại, thực hiện kiểm nghiệm nguyên liệu và cao chiết cồn 70%từ lá Nhàu được tiến hành theo quy định của Dược điển Việt Nam V, được khảo sát lặp lại nhiều lần để khẳng định độ tin cậy, chính xác của kết quả nghiên cứu và khẳng định cao chiết cồn 70% từ lá Nhàu đủ tiêu chuẩn để thực hiện các khảo sát hoạt tính sinh học tiếp theo.

ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CAO TOÀN PHẦN

3.5.1 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao toàn phần Bả ng 3.17 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao toàn phần

Ghi chú: kết quả ± với độ lệch chuẩn của từng giá trị (-) không có khả năng kháng khuẩn

3.5.2 Nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu (MIC) của cao chiết toàn phần Bả ng 3.18 Kết quả nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu (MIC) của cao chiết toàn phần

Sau 24 giờ Cao chiết toàn phần(mg/mL)

Sau 48 giờ Cao chiết toàn phần(mg/mL)

Khả năng kháng khuẩn của cao chiết cồn 70% từ lá Nhàu được xác định dựa trên nồng đô ̣ ức chế sự phát triển của vi khuẩn thể hiện qua đường kháng khuẩn của cao chiết cồn 70% được tạo ra trên đĩa petri thể hiê ̣n ở Bảng 3.17 Đường kính vòng kháng khuẩn tỉ lệ thuận với nồng đô ̣ cao chiết, nghĩa là khả năng kháng khuẩn của cao chiết cồn 70% từ lá Nhàu tăng khi tăng nồng độ cao chiết Kết quả cho thấy cao chiết cao chiết cồn 70% lá Nhàu có hoa ̣t tính kháng khuẩn đối với các chủng vi khuẩn Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và chưa thể hiện hoa ̣t tính đối với

Staphylococus aureus ở các nồng độ khảo sát 150mg/mL và 200 mg/mL

So sánh về độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh thì cả ba chủng vi khuẩn khảo sát nhạy cảm với cao chiết cồn 70% từ lá Nhàu thấp hơn so với kháng sinh amoxicillin Ở nồng mộ 50 mg/mL, cao chiết cồn 70% có hoạt tính ức chế với ba chủng vi khuẩn Escherichia coli , Pseudomonas aeruginosa và Staphylococus aureus tạo vòng vô khuẩn rõ rệt, lần lượt là 17,5 ∓ 0,5 mm, 10 mm và 11 mm trong khi đó kháng sinh amoxicillin ức chế cả ba dòng vi khuẩn khảo sát ở nồng độ 50 μg/mL (Bảng 3.17)

Khả năng kháng khuẩn cao chiết cồn 70% từ lá Nhàu được xác định dựa trên giá tri ̣ củ a MIC (minimum inhibitory concentration) Kết quả so sánh khả năng kháng khuẩn của cao chiết cồn 70% từ lá Nhàu với kháng sinh amoxicillin được trình bày ở

Bảng 3.18 Nồng đô ̣ ức chế tối thiểu là nồng đô ̣ cao chiết (hoặc kháng sinh) thấp

68 nhất xuất hiện vòng vô khuẩn nên nồng đô ̣ ức chế tối thiểu càng thấp thì khả năng kháng khuẩn càng cao

Kết quả trình bày ở Bảng 3.18 cho thấy sau 24 giờ nồng nộ ức chế tối thiểu của cao chiết cồn 70% từ lá Nhàu ở chủng Pseudomonas aeruginosa là 6,25 mg/mL Nồng nộ ức chế tối thiểu của cao chiết cồn 70% từ lá Nhàu ở chủng vi khuẩn

Staphylococus aureus là 12,5 mg/mL Nồng nộ ức chế tối thiểu của cao chiết cồn

70% từ lá Nhàu ở chủng vi khuẩn Escherichia coli là 3,125 mg/mL Kháng sinh amoxicillin có khả năng kháng chủng vi khuẩnStaphylococus aureus (MIC = 60 μg/mL) cao hơn cao chiết cồn 70% từ lá Nhàu (MIC = 12,5 mg/mL) Khả năng ức chế của kháng sinh amoxicillin đối với chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa (MIC = 60 μg/mL) cao hơn cao chiết cồn 70% từ lá Nhàu (MIC = 6,25 mg/mL) và đối với chủng vi khuẩn Escherichia coli nồng nộ ức chế tối thiểu của kháng sinh amoxicillin nhỏ hơn 12,5 μg/mL trong khoảng nồng độ khảo sát

Sau 48 giờ nồng nộ ức chế tối thiểu của cao chiết cồn 70% từ lá Nhàu ở chủng vi khuẩn Escherichia coli là 6,25 mg/mL Nồng nộ ức chế tối thiểu của cao chiết cồn 70% từ lá Nhàu ở chủng vi khuẩn Staphylococus aureus là 25 mg/mL Nồng nộ ức chế tối thiểu của cao chiết cồn 70% từ lá Nhàu ở chủng vi khuẩnPseudomonas aeruginosa là 12,5 mg/mL Kháng sinh amoxicillin có khả năng ức chế tối thiểu chủng vi khuẩn Escherichia coli nhỏ hơn 12,5 μg/mL trong khoảng nồng độ khảo sát Khả năng ức chế của kháng sinh amoxicillin đối với Staphylococus aureus và

Pseudomonas aeruginosa là bằng nhau (MIC = 60 μg/mL) Nhìn chung nồng hộ ức chế tối thiểu của amoxicillin đối với ba chủng vi khuẩn cao hơn so với cao chiết cồn 70% từ lá Nhàu

Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ lá Nhàu là do sự kết hợp của các thành phần hóa thực vật như flavonoid, alkaloid, tannin, triterpenoid,… Flavonoid là nhóm các hợp chất thuô ̣c nhóm hợp chất phenolic đa vòng được báo cáo là có hoạt tính kháng khuẩn, kháng virus, kháng dị ứng, chống co thắt Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm được báo cáo là có hoạt tính kháng khuẩn Nghiên cứu chứng minh sự hiện diện của nhóm hợp chất flavonoid trong nguyên liệu và cao chiết từ lá Nhàu, là nhóm hoạt chất cho hoạt tính kháng khuẩn mạnh, cụ thể là rutin Đồng thời, cũng có nhiều công bố trên thế giới cho thấy các hợp chất nhóm flavonoid có hoạt tính kháng khuẩn Rutin tăng cường hoạt động kháng khuẩn cho một số flavonoid như quercitrin, quercitrin, morin, galangin, kaempherol, myricetin và fisetin Và hoạt tính này được cho là ức chế tổng hợp DNA của vi khuẩn [24] , quercitrin và rutin có hoạt tính kháng khuẩn tiềm năng trong phát triển thuốc kháng sinh [25]

69 Như vậy, kết quả đề tài cho thấy dược liệu lá Nhàu có tiềm năng trong phát triển các sản phẩm có tác dụng kháng khuẩn đáp ứng nhu cầu ngày càng cao và phổ biến của con người.Kết quả có thể chứng minh khả năng kháng khuẩn của cao chiết cồn 70% từ lá Nhàu, tuy không cao hơn so với kháng sinh thương mại Nhưng có thể ứng dụng phát triển sản phẩm có khả năng kháng khuẩn thân thiện với người tiêu dùng

3.5.3 Đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro cao toàn phần Bả ng 3.19 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro cao toàn phần

Ghi chú: kết quả ± với độ lệch chuẩn của từng giá trị

Từ kết quả bảng 3.19 ta thấy gía trị IC50 càng thấp thì khả năng kháng viêm càng mạnh Chỉ số IC50 của diclofenac sodium (IC50 = 168,814 μg/mL) cao hơn và cao gấp 2,4 lần cao chiết toàn phần (IC50 = 70,209 μg/mL) chứng tỏ cao chiết toàn phần có tác dụng kháng viêm tốt hơn diclofenac sodium

3.5.4 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa cao toàn phần Bả ng 3.20 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa cao toàn phần

Bả ng 3.21 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của acid ascorbic

Ghi chú: kết quả ± với độ lệch chuẩn của từng giá trị

Từ kết quả bảng 3.20 ta thấy giá trị IC50 càng thấp thì khả năng kháng oxy hóa càng mạnh Chỉ số IC50 của cao chiết toàn phần (IC50 = 139,992 μg/mL) cao hơn và cao gấp 32 lần acid ascorbic (IC50 = 4,37 μg/mL) Trong khi IC50 của cao ethanol trong nghiên cứu của nhóm tác giả trường Đại hoc Cần Thơ [9] (IC50 = 917,2 μg/mL) cao hơn và cao gấp 6,5 lần cao chiết toàn phần trong nghiên cứu (IC50 = 139,992 μg/mL) chứng tỏ cao chiết toàn phần có tác dụng kháng oxy hóa tốt hơn nghiên cứu trước đây nhưng kém hơn acid ascorbic

Do cao toàn phần có sự hiện diện của các hợp chất phenolic ,các hợp chất phenolic là các chất chuyển hóa thứ cấp thực vật được biết đến với đặc tính chống oxy hóa và chống viêm tốt nên sự kết hợp góp phần làm tăng hoạt tính cho cao chiết toàn phần

Tuy nhiên do cao toàn phần chứa hầu hết các hợp chất từ kém phân cực đến các chất phân cực mạnh như glycoside, acid hữu cơ, muối vô cơ nên hoạt tính kháng oxi hóa chưa thể hiện rõ Xác định khả năng chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH là phương pháp đơn giản, nhanh chóng và ít tốn kém Trong những năm gần đây phương pháp này cũng được sử dụng để định lượng chất chống oxy hóa trong các hệ thống sinh học phức tạp Kết quả cũng chứng minh rằng dịch chiết ethanol lá Nhàu cải thiện khả năng làm sạch gốc tự do DPPH in vitro.Từ kết quả trên cho thấy đây là loại cao chứa nhiều hợp chất có hoạt tính cần được tiến hành phân lập nghiên cứu sâu