TỔNG QUAN
Tình hình làm trắng da trên thế giới và Việt Nam
Trên thế giới, nhu cầu dưỡng trắng da ngày càng tăng lên nhanh và tập trung chủ yếu tại các nước châu Á, Trung Đông, châu Phi Theo thống kê, khu vực châu Á chiếm thị phần lớn nhất với 41% toàn thị trường mỹ phẩm thế giới vào năm 2019 Trong đó, Trung Quốc chiếm khoảng 40%, Nhật Bản 21% và Hàn Quốc 18% là các thị trường hàng đầu về làm đẹp và mỹ phẩm [1, 2] Ngoài ra, theo báo cáo của Hiệp hội Tinh dầu - Hương liệu - Mỹ phẩm Việt Nam (VOCA), chỉ tính riêng thị trường mỹ phẩm trong nước đã đạt 854.3 triệu USD vào năm 2019 [3] Trong đó, sản phẩm dưỡng trắng da chiếm hơn 70% các sản phẩm chăm sóc da khác Những số liệu trên đã chứng minh ngành công nghiệp mỹ phẩm làm trắng là một ngành vô cùng tiềm năng
Hiện nay, ngoài việc sử dụng mỹ phẩm, nhiều phương pháp làm trắng da khác đã được tìm thấy có tác dụng điều trị cũng như hỗ trợ trong việc thay đổi sắc tố da, đem lại hiệu quả tốt hơn trong thời gian ngắn Hầu hết các phương pháp này chủ yếu sử dụng hai cơ chế chính là giảm hàm lượng sắc tố melanin có trên da hoặc ức chế enzyme tyrosinase [4] Tuỳ thuộc vào tình trạng da và nhiều loại da khác nhau mà sử dụng phương pháp trắng da phù hợp Sau đây là một số phương pháp làm trắng da phổ biến: a) Phương pháp laser
Là phương pháp tái tạo bề mặt da bằng cách loại bỏ các lớp da và kích thích sự tăng trưởng của lớp hạ bì sản sinh collagen tái tạo da mới [5] Kỹ thuật này hướng các tia sáng ngắn, tập trung xung ánh sáng ở chỗ da không đều màu, loại bỏ chính xác từng lớp [6] Phương pháp laser được dùng điều trị các vấn đề về da như nhăn da, sạm da, sẹo, mụn cóc…
Tuy nhiên, việc lạm dụng phương pháp điều trị đốt laser có thể gặp phải một số tác dụng phụ như đỏ da, sưng phù và đau rát da rất phổ biến sau khi thực hiện phương pháp laser do bước sóng của tia laser có thể phá hủy lớp biểu bì trên cùng của da [7]
Phương pháp này dựa trên việc dùng các sản phẩm chứa acid hữu cơ có trong các loại trái cây như alpha hydroxy acid (AHA) hay beta hydroxy acid (BHA) nhằm kích thích bong tróc biểu bì, thúc đẩy lớp da non phát triển cũng như tái tạo làn da (bằng cách thúc đẩy tăng sinh collagen, elastin…) [8] Đây là phương pháp làm trắng da một cách nhanh chóng, có hiệu quả tức thời nhưng làm mất đi lớp bảo vệ bên ngoài, trong khi đó lớp da non bên trong vẫn còn quá mỏng, không đủ khả năng chống chọi với các tác nhân gây hại từ môi trường như ánh nắng, bụi bẩn Kết quả là da nhanh chóng sạm, thậm chí có thể gây viêm da, bong tróc, dị ứng Không chỉ vậy, những thành phần độc hại có trong các sản phẩm lột tẩy như hydroquinone, iode và corticoid còn tiềm ẩn nguy cơ nhiễm trùng dẫn đến hoại tử, thậm chí ung thư da [9, 10].
Đặc điểm cấu tạo và sinh lý của da
Da là đối tượng chịu tác động chính của các sản phẩm dưỡng trắng da Do đó, tại phần này sẽ tiếp tục tổng quan về cấu tạo, chức năng cũng như là phân loại da để có những định hướng thiết kế các sản phẩm phù hợp
1.2.1 Cấu tạo và chức năng của da a) Lớp thượng bì
Lớp thượng bì (tầng biểu bì) là cấu trúc da ở lớp trên cùng có độ dày trung bình khoảng 0.1-1 mm tùy từng vùng cơ thể [11] Thông thường, lớp thượng bì dày nhất ở lòng bàn chân và mỏng nhất ở quanh mắt Các bộ phận khác như nang lông, tuyến bã nhờn, tuyến mồ hôi… cũng tồn tại ở lớp thượng bì [12] Nhiệm vụ chính của lớp thượng bì là bảo vệ cơ thể khỏi sự xâm nhập của vật lạ, bao gồm khói bụi, hóa chất độc hại, nấm, vi khuẩn… Ngoài ra, lớp thượng bì còn có khả năng tổng hợp vitamin
D từ ánh nắng mặt trời, ngăn chặn tia cực tím và quyết định sắc tố da [13] Từ ngoài vào trong, lớp thượng bì được phân thành lớp sừng, lớp hạt, lớp gai và lớp đáy Ngoài ra, lòng bàn tay và bàn chân còn xuất hiện thêm lớp bóng giữa lớp sừng và lớp hạt
Hình 1.1 Cấu tạo lớp thượng bì
Lớp sừng là lớp ngoài cùng của da, bị sừng hóa trở thành mô chết, không còn cấu trúc tế bào [14] Các mô này xếp chồng lên nhau tạo thành bức tường chống thấm, bảo vệ da cũng như ngăn cản sự mất nước Còn lớp hạt bao gồm 2-3 lớp tế bào, các hạt này đi ra ngoài sẽ tạo thành chất sừng và các lipid thượng bì Lớp gai (lớp Malpigi) là lớp dày nhất gồm các tế bào nằm chồng lên và liên kết với nhau một cách chặt chẽ Lớp đáy là lớp trong cùng của thượng bì, nơi sản sinh melanin từ những tế bào tua melanocytes (tế bào biểu bì tạo hắc tố) [14] Trong khi đó, lớp bóng chỉ hình thành ở vùng da dày như lòng bàn tay, lòng bàn chân, thường trong suốt, ít thấm nước, ít cản tia, có vân nhưng không có lông và tuyến bã [15]
Hình 1.2 Quá trình sừng hoá theo độ tuổi
Làn da con người sản xuất khoảng 5 tỷ tế bào mỗi ngày, khi tế bào da được tái tạo, các tế bào cũ có một cơ chế tẩy da chết tự nhiên, gọi là bong da hay quá trình sừng hóa (turnover) [16] Đó là quá trình loại bỏ của các tế bào da cũ, khô cứng ra khỏi bề mặt da do mất đi độ ẩm và được thay thế bởi các tế bào mới Quá trình này bắt đầu ở lớp đáy Các tế bào lớp đáy sản sinh ra tế bào mới, di chuyển dần lên tạo thành các tế bào lớp trên, cuối cùng thành lớp sừng và tróc ra khỏi da Quá trình này thường mất khoảng 28 ngày (trong đó tế bào di chuyển từ lớp đáy lên lớp sừng mất khoảng 14 ngày và mất thêm 14 ngày nữa để tróc ra khỏi da) [17] Tùy từng độ tuổi mà quá trình này diễn ra nhanh hay chậm (Hình 1.2) [16] Càng lớn tuổi, turnover diễn ra càng chậm nên theo thời gian làn da của người lớn tuổi sẽ trở nên dày, nhăn nheo Quá trình turnover của em bé diễn ra nhanh và liên tục, nên da em bé lúc nào cũng hồng hào, khỏe mạnh
Khi tiếp xúc với nắng, các tuyến mồ hôi tiết ra urocanic acid, tế bào hạt sinh ra hắc tố melanin, tế bào sừng dày hơn để cản tia tử ngoại [18] Phản ứng tự vệ này gây ra bất lợi về mặt thẩm mỹ trên da bởi tế bào sừng càng dày thì càng bịt chặt tuyến bã nhờn gây viêm như mụn và các sắc tố melanin khiến da trở nên sần sùi, đen sạm đi và gây viêm b) Lớp trung bì
Là lớp nằm dưới thượng bì gồm 2 phần là lớp nhú và lớp lưới Lớp nhú là lớp trên bề mặt có gai hình nón, ăn sâu vào trong lòng thượng bì, rất mỏng chỉ khoảng 0.1 mm Lớp lưới là lớp chống đỡ, dày khoảng 0.4 mm, được cấu tạo từ nhiều bó liên kết chằng chịt với nhau chứa các phần phụ của da như tuyến mồ hôi, tuyến bã, nang lông… [19] Lớp biểu bì làm da trông sáng và mềm mại, còn nếp nhăn xuất hiện là do sự thay đổi ở lớp trung bì Đây là lớp chứa collagen, elastin và hyaluronic acid (HA) là 3 thành phần quan trọng của lớp bì trong việc tái tạo da [11] c) Lớp hạ bì
Lớp này nằm dưới cùng trong cấu trúc da, có chứa nhiều mỡ nên còn được gọi là mô mỡ dưới da Lớp này đóng vai trò quan trọng như một tấm nệm giúp giữ nhiệt và bảo vệ cơ bắp và các cơ quan bên trong [12]
Mỗi loại da đều có một đặc điểm riêng Việc phân loại da phụ thuộc vào các hệ thống và phương thức được thiết lập như: Fitzpatrick (1975), Kawada dành riêng cho da người Nhật (1986), hệ thống phân loại Glogau (1994), phân loại da cho toàn thế giới của Goldman (2002), hệ thống phân loại của Willis và Earles (2005) và phân loại da của Leslie Baumann (2006) [20] Trong số đó, cách phân loại da của Fitzpatrick và Leslie Baumann được sử dụng nhiều trong lĩnh vực da liễu, thẩm mỹ Tuy nhiên, theo phương pháp thông thường và phổ biến nhất (theo cách phân loại da của Fitzpatrick và Leslie Baumann), loại da được quyết định bởi gen di truyền và dựa trên tỷ lệ hàm lượng nước, hàm lượng dầu (lipid), mức độ nhạy cảm [21] Vì vậy, da cơ bản được phân làm 5 loại: da thường, da khô, da dầu, da hỗn hợp và da nhạy cảm
Da thường là loại da có sự cân bằng tốt giữa hàm lượng dầu và nước Da thường có bề mặt da mịn màng, lỗ chân lông nhỏ, sắc diện da đồng đều [22] Loại da khô sản sinh ít dầu hơn da thường, kèm theo sự đặc trưng thiếu nước trong các lớp da nên có vẻ ngoài căng chặt, khô ráp, sần sùi và dễ dàng bong tróc [23] Da dầu với đặc trưng là sự hoạt động quá mức của tuyến dầu khiến làn da dầu có vẻ bóng nhờn toàn bộ bề mặt, lỗ chân lông to, tối sẫm do oxy hoá bã nhờn [24] Còn da hỗn hợp là làn da có sự kết hợp giữa da dầu và da khô, trong đó, dầu có xu hướng tiết ra ở khu vực chữ T và hai má có xu hướng từ thường đến khô hơn [25]
Khác với loại da, tình trạng da được quyết định bởi các tác nhân bên ngoài và bên trong Các tác nhân bên ngoài có thể là môi trường sống (bao gồm thời tiết hay sự ô nhiễm), thuốc uống hay tác nhân bên trong như tuổi tác, hormones, sự căng thẳng lâu dài có thể quyết định tình trạng da [26] Trong cùng một thời điểm có thể có nhiều tình trạng da diễn ra Tuỳ thuộc vào loại da và tình trạng da mà có phương pháp chăm sóc phù hợp.
Các yếu tố chính của màu da
Melanin là một nhóm lớn các sắc tố tự nhiên có nhiều trong tóc, tròng đen của mắt và đặc biệt là quyết định sắc tố da Sắc tố da melanin được tạo ra bởi những tế bào melanocytes (tế bào biểu bì tạo hắc tố), nằm phân bố rải rác ở lớp đáy của thượng
7 bì Ở người, sắc tố da melanin tồn tại dưới ba dạng: eumelanin, pheomelanin và neuromelanin [27]
Hình 1.3 Cấu trúc của melanin
Eumelanin tạo sắc tố nâu hoặc đen cho làn da, tóc và mắt Sắc tố này có nguồn gốc từ acid 5,6-dehydroxyindole-2-carbonxylic (DHICA) và 5,6-dehydroxyindole (DHI) Eumelanin là một sắc tố trơ có khả năng hấp thụ hiệu quả các photon UV khi chúng đi vào lớp biểu bì [28] Do đó, da càng sẫm màu thì càng có nhiều eumelanin trong da và hạn chế tia cực tím (UV) xâm nhập vào lớp biểu bì Sự lắng đọng của eumelanin trong lớp biểu bì giải thích lí do tại sao phần lớn những người da sẫm màu được bảo vệ tương đối khỏi các bệnh UV cấp và mãn tính Pheomelanin có nguồn gốc từ tyrosine, có sự kết hợp của cysteine trong quá trình sinh tổng hợp Nguyên tử lưu huỳnh trong cấu trúc phân tử là nguyên nhân tạo ra màu đỏ/cam của pheomelanin Pheomelanin ít có khả năng ngăn chặn năng lượng tia cực tím và trên thực tế có thể phối hợp với các photon UV để thúc đẩy sự hình thành gốc tự do và gây ung thư trong da [29]
Melanin được hình thành thông qua hàng loạt các phản ứng oxy hoá từ amino acid tyrosine và enzyme tyrosinase (Hình 1.4)
Hình 1.4 Cơ chế hình thành melenin Để tổng hợp melanin, đầu tiên các sắc tố eumelanin và pheomelanin có bản chất là các amino acid tyrosine sẽ được oxy hóa bởi enzyme tyrosinase tạo thành 3,4- dehydroxyphenylalanine (L-Dopa) Sau đó, L-Dopa bị oxy hóa thành dopaquinone Quá trình này sẽ xảy ra nhanh hơn khi có mặt enzyme tyrosinase [30] Bởi vì dopaquinone là một chất hoạt động mạnh nên có thể tự oxy hóa thành dopachrome Tiếp theo đó dopachrome sẽ chuyển hóa thành 5,6-dehydroxyindole (DHI) và thông qua các phản ứng oxy hóa sẽ hình thành 5,6-indole quinone và melanin
Tyrosinase (phenol oxydase) là một enzyme có chứa đồng (Cu) trong glycoprotein, được gọi là phân tử T4, có trung tâm hoạt động hay vùng hoạt động (active site) gồm các nguyên tử đồng tạo liên kết phối trí với các phân tử histamin, đóng vai trò quan trọng trong việc xúc tác của enzyme Tyrosinase được tổng hợp bởi melanocytes ở biểu mô, niêm mạc, võng mạc và đường mật Ngoài ra còn được hình thành từ các chuỗi acid amin như Val283, Phel264, His244, Val248, Asn260… [31]
Hình 1.5 Cấu trúc của enzyme tyrosinase
Hình 1.6 Đồng liên kết với histamine trong vùng hoạt động
Enzyme tyrosinase rất cần thiết cho sự hình thành melanogenesis và chịu trách nhiệm trong bước đầu tiên sản xuất sắc tố melanin giúp bảo vệ da khỏi tia cực tím nhờ vào quá trình oxy hoá và khử trong lớp biểu bì [32] Để sản xuất melanin, enzyme tyrosinase tham gia vào hai phản ứng riêng biệt của quá trình chuyển hóa melanin; một là hydroxyl hóa monophenol thành O-diphenol, hai là oxy hóa O-diphenol thành O-quinon; sau đó, O-quinon tham gia một loạt các phản ứng để tạo thành melanin [33]
Hình 1.7 Quá trình oxy hoá phenol với xúc tác enzyme tyrosinase
1.3.3 Các chất ức chế của enzyme tyrosinase
Chất ức chế kiểu cạnh tranh: Các hợp chất ức chế cạnh tranh sẽ liên kết với enzyme tyrosinase và ngăn cản enzyme này liên kết với cơ chất Ở đây, các chất ức chế và cơ chất loại trừ lẫn nhau, thường là bởi chúng cạnh tranh cho cùng một vị trí Các chất ức chế cạnh tranh dùng làm trắng da thường sẽ là một hợp chất hữu cơ có liên kết tâm đồng Cu của enzyme tyrosinase hoặc một dẫn xuất từ chính cơ chất đó [34]
Chất ức chế không cạnh tranh: Chất ức chế chỉ bám vào phức hợp enzyme - cơ chất (E – S), sản phẩm P không được tạo thành (Hình 1.8) [34]
Chất ức chế hỗn hợp: Chất ức chế này vừa liên kết với một enzyme tyrosinase vừa liên kết với phức hợp enzyme - cơ chất Phần lớn các loại hỗn hợp này có thế liên kết cân bằng cho mỗi loại enzyme khác nhau và hoạt động độc lập [34]
Chất ức chế cân bằng: Là một trường hợp đặc biệt của chất ức chế hỗn hợp khi liên kết của chúng với enzyme tyrosinase và enzyme chất nền có thể liên kết cân bằng giống như nhau (K2 = K4) (Hình 1.8) [34]
Hỗn hợp hay cân bằng (K 2 = K 4 )
Hình 1.8 Cơ chế làm trắng da
Trong đó: E, S, I, và P lần lượt là enzyme, cơ chất, chất ức chế, và sản phẩm tương ứng; ES là phức hợp enzyme - cơ chất, EI và ESI lần lượt là phức hợp enzyme - chất ức chế và enzyme - cơ chất - chất ức chế.
1.3.4 Ảnh hưởng của quá trình kháng oxy hóa đến quá trình ức chế enzyme tyrosinase
Các dạng oxy hoạt động (reactive oxygen species - ROS) bao gồm các gốc tự do và một số phân tử đặc biệt mà trong cấu trúc có chứa nguyên tử oxy có khả năng tham gia phản ứng oxy hóa khử mạnh [35] ROS là sản phẩm chuyển hóa tự nhiên của quá trình trao đổi chất trong cơ thể và đóng vai trò quan trọng trong hoạt động tế bào, cân bằng nội môi Tuy nhiên, qua thời gian bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài (tia UV, tiếp xúc với nhiệt độ cao…) hay yếu tố bên trong (căng thẳng, nội tiết tố…), lượng ROS có thể hình thành vượt quá khả năng kiểm soát của hệ thống chống oxy hóa của cơ thể dẫn đến tình trạng stress oxy hóa [36]
Nhiều nghiên cứu khoa học đã chứng minh sự gia tăng stress oxy hóa có ảnh hưởng đến quá trình hình thành sắc tố melanin trong da Trong đó, gốc hydroxyl (OH) được tạo ra thông qua phản ứng monophenolase chuyển tyrosine thành L-Dopa với xúc tác enzyme tyrosinase [37] Đây là gốc có hoạt động mạnh nhất trong các ROS và gây nhiều thương tổn cho tế bào [38] Sự có mặt của gốc hydroxyl này tham gia
12 vào hàng loạt các quá trình oxy hóa L-Dopa thành Dopaquinone, sau cùng là hình thành hắc tố melanin [30]
Kháng oxy hóa đóng vai trò quan trọng và là bước đầu tiên ngăn chặn quá trình hình thành hắc sắc tố melanin Nhiều nghiên cứu đã chứng minh gốc tự do NO có khả năng kích hoạt enzyme tyrosinase, xúc tác quá trình tổng hợp các dihydroxyphenylalanin (L-Dopa) từ các acid amin tyrosine [39] Ngoài ra, gốc tự do superoxide (H2O2) kích hoạt enzyme phenylalanine hydroxylase (PAH) để sản xuất ra các L-tyrosine [40]
Do đó, bằng cách sử dụng các hợp chất có khả năng kháng oxy hóa trong các loài thực vật như polyphenol, flavonoid… sẽ có tác dụng ức chế và ngăn chặn gốc tự do hydroxyl thông quan phản ứng enzyme tyrosinase với chất nền tyrosine và L-Dopa.
Các hợp chất có khả năng ức chế enzyme tyrosinase
Yếu tố chính quyết định sắc tố da là hàm lượng melanin có trên da và enzyme tyrosinase là một phân tử quan trọng tham gia vào quá trình hình thành các sắc tố melanin [41] Vì thế, ức chế enzyme tyrosinase có thể giúp điều trị, hạn chế các rối loạn liên quan đến vấn đề tăng sắc tố Hiện nay, việc nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất có tác dụng ức chế enzyme này có ý nghĩa lớn trong y học và mỹ phẩm
1.4.1 Các hợp chất ức chế tyrosinase có nguồn gốc tự nhiên
Polyphenol đại diện cho một nhóm đa dạng các hợp chất phenolic, chúng được phân bố rộng rãi trong tự nhiên Polyphenol cũng là một trong các hợp chất ức chế enzyme tyrosinase Tùy vào vị trí của nhóm thế trên các polyphenol đóng vai trò quyết định đến khả năng ức chế enzyme tyrosinase
Ngoài chiết xuất Citrus, các chất chiết xuất từ các loài thuộc chi Morus được biết đến như một cây giàu polyphenol và được sử dụng rộng rãi như một tác nhân điều trị tự nhiên không độc hại, cũng có tiềm năng cao do có nhiều chất ức chế tyrosinase mạnh đã được phân lập từ các bộ phận khác nhau của cây Mulberroside F (moracin M-6,3′-di-O-β-glucopyranoside) được phân lập từ lá cây dâu tằm có tác dụng ức chế enzyme tyrosinase cao gấp 4-5 lần kojic acid và thể hiện khả năng ức chế ảnh hưởng của việc hình thành melanin trong tế bào melanoma [34]
Flavonoid là một trong những hợp chất tự nhiên điển hình có khả năng ức chế enzyme tyrosinase [42] Những hợp chất thuộc họ flavonoid có số lượng rất lớn và là một trong những dẫn xuất của polyphenol Có hơn 4000 flavonoid được chia thành 7 nhóm chính là flavone, flavonol, flavanone, flavanol, isoflavonoid, chalcone và catechine có trong các bộ phận của cây như rễ, thân, quả, lá… đã được phát hiện [43] Các hợp chất flavonoid có khả năng ức chế mạnh do trong cấu trúc chứa nhóm resorcinol (là một nhóm có hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase mạnh) Những hợp chất này giúp chống lại bức xạ tia cực tím (UV), mầm bệnh Ngoài ra, chúng còn tạo màu xanh, đỏ đặc trưng của quả và rượu vang [44]
Năm 2011, nhóm nghiên cứu của You-Lin Xue và cộng sự đã phân lập thành công một số hợp chất thuộc nhóm polyphenol như quercetin, kaempferol từ lá của cây Persimmon, Diospyros kaki Nghiên cứu cũng đã thực hiện các thí nghiệm về hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của các hợp chất trên và cho thấy giá trị IC50 của quercetin là 9.7 àM và IC50 của kaempferol là 50.1 àM [45]
Ngoài ra, nhiều aldehyde và các dẫn xuất khác cũng được phân lập và xác định là có tác dụng ức chế enzyme tyrosinase như cinnamaldehyde (1), 2-hydroxy-4- methoxybenzaldehyde (2), anisaldehyde (3), cuminaldehyde (4), cumic acid (5) và benxaldehyde (6) [46-50] Cơ chế ức chế của chúng đến từ khả năng tạo thành base với nhóm amino trong phân tử của enzyme bằng phản ứng sinh học với nhóm nucleophilic (cho điện tử) như sulfhydryl, amino hay nhóm hydroxyl [47, 48]
(5) (6) Hình 1.12 Một số hợp chất thuộc nhóm aldehyde
1.4.2 Các hợp chất ức chế enzyme tyrosinase có nguồn gốc từ tổng hợp a) Hydroquinone
Hydroquinone (Hình 1.13) có nhiều trong trà, lúa mì, quả mọng, bia, cà phê và đã được sử dụng rộng rãi trong điều trị tăng sắc tố [51, 52] Hydroquinone ức chế cạnh tranh tổng hợp melanin bằng cách liên kết cộng hóa trị với histone, tương tác với đồng tại vị trí hoạt động [53] Các thử nghiệm in vitro và in vivo đã chứng minh hiệu quả đáng kể của hydroquinone trong việc ức chế sự tăng trưởng nhóm tế bào melanin trong cơ thể người Hydroquinone có khả năng làm giảm hoạt động của enzyme tyrosinase xuống 90% Vì thế, hydroquinone được sử dụng để điều trị nám da trong một thời gian dài
Tuy nhiên, hydroquinone có thể gây ra tổn hại vĩnh viễn cho melanosome và melanocytes bởi các gốc tự do semiquinone được tạo ra trong phản ứng enzyme [54]
Do các tác dụng phụ, chẳng hạn như sự mất sắc tố vĩnh viễn và không đồng bộ ngoại sinh do sử dụng lâu dài, hydroquinone đã bị cấm trong hầu hết các loại mỹ phẩm Bên cạnh đó, các dẫn xuất của hợp chất này như arbutin, deoxyarbutin và mequinol vẫn được sử dụng trong ngành công nghiệp mỹ phẩm như các chất làm trắng da [55, 56] b) Ascorbic acid
Vitamin C (Ascorbic acid – AA) (Hình 1.14) là một trong những chất chống lão hóa lâu đời và vẫn được sử dụng phổ biến nhất hiện nay Vitamin C có trong rau quả, trái cây thường dễ bị tác động bởi nhiệt, ánh sáng nên ít được sử dụng trực tiếp để làm trắng da Do đó, một dẫn xuất bền của vitamin C là Magnesium L-ascorbic acid-2-phosphate (MAP) được sử dụng như một chất làm trắng da Trong một nghiên cứu ở bệnh nhân bị mụn trứng cá và sạm da, một loại kem chứa 10% MAP có hiệu quả trắng da đáng kể đáng kể đối với 19 trên tổng số 34 người tham gia [57, 58]
Ngoài ra, MAP còn tác dụng bảo vệ chống lại tác động của bức xạ UVB (được xem như nguyên nhân chính gây ung thư da)
Vitamin C đóng vai trò quan trọng trong quá trình tái tạo và sản sinh collagen Với vai trò là một chất chống oxy hóa, vitamin C giúp da chống lại các gốc tự do là nguyên nhân khiến da bị lão hóa và trở nên sậm màu [57] Ngoài ra, vitamin C còn giúp làm tăng lượng glutathione và lượng vitamin E trong cơ thể Hai hợp chất này cũng được biết đến là những chất chống oxy hóa Glutathione còn giúp da sản sinh pheomelanin thay vì eumelanin, nhờ đó da sẽ trở nên sáng hơn Hầu hết các loại thực vật, động vật đều có khả năng tự tổng hợp vitamin C, nhưng một số động vật có xương sống và con người lại không có khả năng này
Vitamin C còn được xem là một chất tẩy tế bào chết, giúp da loại bỏ các tế bào hư tổn chứa melanin Trong trường hợp da đang bị viêm nhiễm và sưng đỏ, cũng có thể điều trị với vitamin C Không những thế, vitamin C còn bảo vệ da không bị cháy nắng và giữ cho da trắng hồng Một nghiên cứu trên nhóm 20 người cho thấy khả năng chống nắng tăng lên đến 20% sau 8 ngày sử dụng vitamin C (2 mg) Đồng thời da cũng giảm nguy cơ bị viêm nhiễm và hư tổn [58] c) Kojic acid
Kojic acid (Hình 1.15) là một chất thiên nhiên có nguồn gốc từ nấm như
Aspergillus và Penicillium, có dạng bột, màu trắng, tan trong dầu, không bền khi tiếp xúc với không khí và phản ứng với các chất khác khi có ánh nắng mặt trời [59] Kojic acid có tác dụng ức chế enzyme tyrosinase với giá trị IC 50 = 0.054 mM, là chất ức chế tyrosinase tốt nhất nên thường được sử dụng như chất đối chiếu trong các quy trình thử hoạt tính [60] Kojic acid làm sáng da, tăng đáng kể quá trình thực bào của
17 bạch cầu đa nhân trung tính và tăng sinh tân bào giúp cho việc loại bỏ các hắc tố gây nám da tốt hơn
Kojic acid là một trong những chất an toàn có thể sử dụng trực tiếp lên da mặt Hợp chất này thường được dùng nhiều trong sản phẩm dưỡng da như kem dưỡng trắng, kem tẩy tế bào chết, xà phòng rửa mặt, huyết thanh do độ hiệu quả và tính dịu nhẹ của nó Ngoài ra, đây cũng là một thành phần quan trọng trong kem đánh răng giúp làm trắng răng Kojic acid đã được các bác sĩ da liễu chứng minh là an toàn và không để lại các tác dụng phụ như hydroquinone [61] Nó giúp loại bỏ các đốm đen mà không gây khô da, không gây mẫn đỏ da đối với làn da nhạy cảm Kojic acid thường được sử dụng ở nồng độ từ 1% đến 4% [56] Trong suốt quá trình nghiên cứu, việc bổ sung 2% kojic acid vào hỗn hợp 2% hydroquinone, 2% glycolic acid làm tăng đáng kể việc điều trị nám và tàn nhang [62] Bên cạnh đó, kojic acid cũng được sử dụng làm chất bảo quản thực phẩm giúp kéo dài thời hạn sử dụng cho sản phẩm
Vì vậy, nó thực sự an toàn cho người tiêu dùng.
Đối tượng nghiên cứu khả năng làm trắng da
1.5.1 Ổi ( Psidium guajava L – Myrtaceae) Ổi có tên khoa học là Psidium guajava L, thuộc họ Myrtaceae, là một loại cây ăn quả và cây thuốc có ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới Thân ổi phân cành nhiều, cao 4-6 m, cao nhất 10 m, đường kính thân tối đa 30 cm Trên cành có lá đơn, mọc đối Hoa to, lưỡng tính, mọc từng chùm 2 đến 3 chiếc, ít khi ở đầu cành mà thường ở nách lá [63, 64]
Hình 1.16 Lá ổi (Psidium guajava L.) Ổi chứa các thành phần hóa học quan trọng như tannin, triterpene, flavonoid (quercetin), pentacyclic triterpenoid (guajanoic acid), saponin, carotenoid, profin, leucocyanidin, ellagic acid, acid amin [65] Vì thế, nó có các tác dụng dược lý trong y học như chống oxy hóa, chống viêm, kháng khuẩn , thuốc trị đái tháo đường, hạ mỡ máu, tác dụng bảo vệ tim mạch
Năm 2011, nhóm nghiên cứu của Dong-Huyn You và cộng sự đã khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của dịch chiết ethanol từ cây ổi (cành, quả, lá và hạt) Các chiết xuất của cành và lá cho thấy chất khả năng kháng oxy hóa của chúng cao hơn chiết xuất từ quả ổi và hạt ổi Đồng thời hoạt tính ức chế tyrosinase của chiết xuất ethanol từ lá ổi đạt 69,56% cao hơn hẳn so với các bộ phận còn lại của cây ở cùng một nồng độ [66]
Với những nghiên cứu về những ưu điểm của lá ổi như trên, đây thực sự là một đối tượng đáng được nghiên cứu nhiều hơn về các khía cạnh khác nhau để hiểu rõ được công dụng của nó
Trầu có tên khoa học là Piper betel L., thuộc họ Piperaceae, là một loại cây mọc leo, thân nhẵn có lá mọc so le, cuống có bẹ, dài 1.5-3.5 cm, phiến lá hình trái xoan, dài 10-13 cm, rộng 4.5-9 cm, phía cuống hình tim Cây được trồng tại nhiều nước ở châu Á, vùng nhiệt đới như Malaysia, Indonesia, Philippin và Việt Nam [67]
Hình 1.17 Lá trầu (Piper betel L.)
Trong lá trầu có 0.8-1.8%, có khi đến 2.4% tinh dầu thơm mùi creozot (củi đốt), vị nóng và hai hợp chất phenol là betel - phenol (đồng phân với chất eugenol chavibetol C10H12O2 và chavicol), kèm theo một số hợp chất phenolic khác [64] Năm 2009, theo nghiên cứu của Li-Ching Morgan Row và Jiau-Ching Ho, tinh dầu, chiết xuất methanolic và dịch chiết nước từ lá trầu đã được thử nghiệm hoạt động kháng khuẩn, đặc tính chống oxy hoá và ức chế tyrosinase Trong đó, chiết xuất methanolic của lá trầu không cho thấy hoạt động diệt khuẩn trong 2 giờ và 24 giờ với giá trị LD50 tương ứng là 153 và 125 g/mL, trong khi dịch chiết nước cho thấy hoạt động nhẹ hơn Tinh dầu có trong lá cũng thể hiện khả năng ức chế mạnh mẽ hoạt động enzyme tyrosinase, cho giá trị IC50 là 126 g/mL [68]
Lá trầu không chỉ gần gũi với đời sống hàng ngày mà còn đã được nghiên cứu qua nhiều bài báo khoa học Nhờ có nguồn kiến thức phong phú, sự hiểu biết về đối tượng nghiên cứu trầu được mở rộng, đây là cơ sở cho các ý tưởng nghiên cứu, ứng dụng về cây được thực hiện dễ dàng hơn
1.5.3 Tía tô ( Perilla frutescent L Britt)
Tía tô có tên khoa học là Perilla frutescent L Britt, thuộc họ Lamiaceae, là một loại thân thảo mọc hằng năm, thân thẳng đứng có lông Lá mọc đối, đầu nhọn, mép có răng cưa to; phiến lá dài 4-12 cm, rộng 2.5-10 cm, màu tím hoặc xanh tím [67]
Hình 1.18 Tía tô (Perilla frutescent L.)
Trong toàn cây tía tô có chứa 0.50% tinh dầu có thành phần chủ yếu gồm perilla- andehyde C10H14O (55%), limonen (20-30%), CL-pinen và dihydrocumin
C10H14O Chất perilla andehyt cho mùi thơm đặc biệt của tía tô, ngọt gấp 2000 lần đường, khó tan trong nước, đun nóng sẽ phân giải, có độc, cho nên không dùng làm chất điều vị được, nhưng có người dùng làm ngọt thuốc lá Chất màu trong lá tía tô là do este cùa chất xyanin clorit C27H31O16Cl Ngoài các chất trên, trong tía tô còn chứa adenin C5H5N5 và acginin C6H14N4O2 [69]
Theo nghiên cứu của Lee và Jin Hwan vào năm 2021, tía tô ngoài khả năng chống oxy hóa thì còn có hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase (với giá trị IC50 đạt 20.8
M) [70] Bên cạnh đó, theo kinh nghiệm dân gian, lá tía tô được dùng để ngâm tắm để có thể làm trắng da Vì thế, lá tía tô là đối tượng nghiên cứu tiềm năng cho khả năng làm trắng da
Ngải cứu có tên khoa học là Artemisia vulgaris L., thuộc họ Asteraceae, là một loại cỏ sống lâu năm, cao 50-60 cm, thân có rãnh dọc Lá mọc so le, rộng, không có cuống Màu lá ở hai mặt rất khác nhau, mặt trên nhẵn màu lục sẫm, mặt dưới màu trắng tro do có rất nhiều lông nhỏ, trắng, hoa mọc thành chùy kép gồm rất nhiều cụm hoa hình đầu [71]
Hình 1.19 Ngải cứu (Artermisia vulgaris L.)
Thành phần hoá học của ngải cứu gồm các hợp chất flavonoid, phenolic, tinh dầu và tannin,… Tuy nhiên, tannin chiếm tỷ lệ rất ít Dịch chiết của cây cũng có tác dụng ức chế enzyme tyrosinase 42.06% tại 3.58 g [72]
Về công dụng, ngải cứu là một vị thuốc có tính hơi ôn, vị cay, có tác dụng điều kinh, an thai, sơ cứu vết thương, trị mụn, mẫn ngứa, cảm cúm, ho, đau đầu…
Hình 1.20 Trà xanh (Camellia sinensis L.)
Trà xanh là cây gỗ sống lâu năm Thân non màu xanh nhẵn bóng, thân già màu xám tiết diện tròn Lá dài 9-11 cm, rộng 4-5 cm mọc ra từ đốt trà, thường mọc cách, màu xanh lục đậm dần từ trên xuống có mùi thơm đặc trưng Trên lá có nhiều gân, rìa lá có dạng răng cưa, có lông ở mặt dưới Hoa trà là hoa lưỡng tính, màu trắng, mọc thành từng cụm ở nách lá Quả chè thuộc loại quả nang Trong mỗi quả sẽ có khoảng 3 nang chia thành 3 ngăn riêng biệt, mỗi nang sẽ chứa 1 hạt Trung bình mỗi quả chè như vậy sẽ cho ra khoảng 2-4 hạt chè Quả chè chín sẽ ngả sang màu nâu Quả khô có thể tự nẻ ra làm bắn hạt ra ngoài tự nhiên Trà xanh có nguồn gốc ở Bắc Ấn Độ và Nam Trung Quốc nhưng ngày này được trồng phổ biến trên thế giới Trà
NỘI DUNG THỰC NGHIỆM
Mục tiêu, đối tượng và nội dung nghiên cứu
2.1.1 Mục tiêu và đối tượng nghiên cứu
Qua phần tổng quan cho thấy, việc kết hợp dưỡng trắng da và khả năng bắt gốc tự do hoặc kháng oxy hóa giúp nâng cao hiệu quả các sản phẩm mỹ phẩm làm trắng da Do đó, mục tiêu của đề tài này là khảo sát khả năng ức chế enzyme tyrosinase và khả năng bắt gốc tự do của các đối tượng thực vật như lá ổi, trầu, tía tô, ngải cứu, mận và trà xanh Đồng thời, cũng tiến hành nghiên cứu khả năng kết hợp của các đối tượng thực vật cho hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase tốt trên hai trường hợp tổ hợp lá và tổ hợp cao Với kết quả thu được, chiết và cô quay tổ hợp được lựa chọn theo các tỷ lệ 1:3, 1:2, 2:1, 3:1 để xác định được mẫu cho hoạt tính tối ưu nhất Ngoài ra, sau quá trình sàng lọc 6 loài thực vật sẽ chọn một loài để tiến hành loại bỏ tannin giúp tăng khả năng trắng da Đối tượng nghiên cứu bao gồm: ổi (Psidium guajava L.), trầu (Piper betel L.), tía tô (Perilla frutescent L.), ngải cứu( Artemisia vulgaris L.), mận (Syzygium samarangense), trà xanh (Camellia sinensis L.)
Từ mục tiêu đề ra, quá trình nghiên cứu bao gồm 6 nội dung
Nội dung 1: Đánh giá sơ bộ sáu đối tượng nghiên cứu
- Xử lý và đánh giá các loại nguyên liệu (độ ẩm, độ tro)
- Chiết và so sánh hiệu suất thu cao tổng của các loại nguyên liệu
Nội dung 2: Nghiên cứu các thành phần hóa học của các đối tượng nghiên cứu
- Khảo sát sơ bộ hóa thực vật
- Định lượng polyphenol, flavonoid và tannin của các cao chiết để dự đoán hoạt tính sinh học của chúng
Nội dung 3: Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của các đối tượng nghiên cứu
Nội dung 4: Đánh giá khả năng bắt gốc tự do DPPH của các đối tượng nghiên cứu
Nội dung 5: Đánh giá khả năng kết hợp các loài thực vật dựa trên hai trường hợp kết hợp cao và kết hợp lá theo tỷ lệ 1:1
- Sau khi lựa chọn được tổ hợp tốt, tiến hành chiết đối tượng nghiên cứu theo các tỉ lệ 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3
- Định lượng lại polyphenol, flavonoid và tannin của cao chiết kết hợp rồi so sánh với các thí nghiệm cây riêng lẻ
- Khảo sát và so sánh khả năng ức chế enzyme tyrosinase, kháng oxy hoá của cao chiết kết hợp sau khi kết hợp hai loại dược liệu
Nội dung 6: Loại tannin ra khỏi thực vật
- Sau quá trình sàng lọc và kết hợp các thực vật sẽ lựa chọn được tổ hợp cho khả năng ức chế enzyme tyrosinase tốt nhất Tổ hợp này tiến hành loại tannin bằng phương pháp collagen
- Mẫu sau khi loại tannin sẽ được đánh giá lại hàm lượng flavonoid và hoạt tính enzyme tyrosinase.
Hoá chất và thiết bị sử dụng
- Gallic acid (Sigma Chemical Co.)
- DPPH (1,1-Diphenyl - 2 - picrylhydrazyl) (Sigma Chemical Co.)
- Ascorbic acid (Sigma Chemical Co.)
- Thuốc thử Folin–Ciocalteau (Sigma Chemical Co.)
- Enzyme tyrosinase (Sigma Chemical Co.)
- Ethanol (Chemsol), Na2CO3 (Trung Quốc), AlCl3.6H2O (Trung Quốc) và một số hóa chất cần thiết khác…
Thiết bị sử dụng trong quá trình nghiên cứu: máy đo độ ẩm SATORIUS MB45, bể điều nhiệt 70 o C, hệ thống tách chiết, máy khuấy từ RH basic KTC, máy cô quay
RE 301 A-W, máy đo độ hấp thu UV – Vis, bể đánh siêu âm, máy Elisa Reader, lò
26 nung 500 o C, máy ủ 37 o C và một số dụng cụ khác như becher các loại (50 mL, 100 mL, 250 mL, 500 mL), lọ bi, chai đựng dung dịch, đũa thuỷ tinh, bếp điện,….
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp xác định độ tro toàn phần Độ tro toàn phần là lượng chất vô cơ còn lại sau khi nung cháy hoàn toàn mẫu nguyên liệu Cân một lượng chính xác 2.00 g nguyên liệu cho vào chén sứ, được nung trong tủ ở 500 o C đến khi phân giải thành tro màu trắng (khoảng từ 2-4 giờ) Chén sứ được cho vào bình hút ẩm đến khi nguội và đem cân khối lượng (đến khi khối lượng không đổi) Độ tro được tính theo công thức sau: Độ tro (%) = 𝑚 𝑠 −𝑚 𝑐
Trong đó: ms: khối lượng sau khi nung (g) mc: khối lượng chén sứ (g)
2.3.2 Phương pháp đo độ ẩm Độ ẩm của nguyên liệu được đo bằng máy đo độ ẩm hiệu SATORIUS MB45 Nguyên liệu được trải thành một lớp mỏng trên đĩa nhôm, đặt vào máy đo độ ẩm và được sấy ở 105 o C đến khối lượng không đổi Kết thúc quá trình đo khi màn hình máy hiện chữ END và đọc độ ẩm hiển thị trên màn hình Độ ẩm được tính theo công thức:
W(%) = khối lượng đầu − khối lượng sau khối lượng đầu × 100%
Phép đo được thực hiện lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình Từ độ ẩm W, khối lượng nguyên liệu khô (mnlk) được tính theo công thức: m nlk =m cân × (100 − W)
2.3.3 Phương pháp chiết cao tổng
Trước khi tiến hành chiết, nguyên liệu được kiểm tra độ ẩm Khi kết quả đã đạt tiêu chuẩn Dược Điển Việt Nam V [71], tiến hành chiết lấy cao tổng Bột nguyên liệu khô và dung môi chiết ethanol tuyệt đối (tỉ lệ 1 g bột: 10 mL ethanol tuyết đối) được cho vào becher, đậy kín cốc thủy tinh bằng giấy bạc và màng bọc thực phẩm, đặt trên
27 bếp cách thủy Điều kiện chiết được sử dụng là 45-50 o C, trong 45 phút Sau khi kết thúc, lọc bã, cô quay thu hồi dung môi, bã được thu lại để tiến hành chiết tiếp Cao chiết được xác định độ ẩm và quy đổi sang khối lượng cao khô để xác định hiệu suất chiết
Hình 2.1 Sơ đồ quy trình chiết cao của các đối tượng nghiên cứu
Hiệu suất chiết cao tổng được tính theo công thức:
H(%) = m cao khô mnguyên liệu khô × 100
Trong đó: H (%): hiệu suất chiết (%) m cao khô : khối lượng cao khô thu được sau quá trình chiết (g) mnguyên liệu khô: khối lượng nguyên liệu khô đem chiết (g)
2.3.4 Phương pháp sơ bộ thực vật
Phương pháp định tính các hợp chất có trong cây và dấu hiệu nhận biết nếu kết quả dương tính như sau:
Kiểm tra polyphenol: 2 mL dịch chiết được khuấy với 2 mL nước cất và vài giọt dung dịch FeCl3 được thêm vào Tùy vào số lượng, vị trí nhóm OH trong phân tử mà cho màu lục, xanh, nâu đỏ
Phản ứng cyanidin: thêm vào dịch chiết đối tượng nghiên cứu bột Mg rồi nhỏ từ từ HCl đậm đặc Để yên sau 1 đến 2 phút và quan sát hiện tượng Hiện tượng dương tính khi có màu đỏ cam, đỏ thẫm hoặc đỏ tươi
Tác dụng của chì acetate kiềm: cho 1 mL dịch chiết, thêm 1 mL dung dịch chì acetate 10% Phản ứng dương tính tạo tủa vàng nhạt đến sậm
Kiểm tra tanin (Kết tủa với gelatin): thêm vào dịch chiết dung dịch gelatin 1% có chứa 10% NaCl Hiện tượng dương tính khi phản ứng tạo tủa
Kiểm tra carotenoid: cho vào dịch chiết đối tượng nghiên cứu 1-2 giọt H2SO4 đậm đặc Dung dịch có ánh xanh dương nếu có mặt carotenoid
Kiểm tra glycoside tim (Phản ứng Keller-Kiliani): Hòa tan 5 mg chất thử vào 2 mL dung dịch 1 rồi cho thêm 2 mL dung dịch 2 Trong đó, dung dịch 1 gồm 100 mL acetic acid đậm đặc trộn với 1 mL dung dịch FeCl3 5% Dung dịch 2 gồm 100 mL sulfuric acid đậm đặc trộn với 1 mL FeCl3 5% Lớp phân cách có màu đỏ hoặc nâu đỏ và dần dần lớp trên sẽ có màu xanh khuếch tán lên
Kiểm tra saponin (Phản ứng Liebermann-Burchard): Lấy 5 mL dịch chiết đun cách thủy trong ống nghiệm cho nóng rồi cho vào 1 mL anhydride acetic, cho thêm
1 giọt H2SO4 đậm đặc Nếu là dẫn xuất steroid thì có màu lơ - xanh lá, còn dẫn xuất triterpenoid thì có màu hồng đến tía
2.3.5 Định lượng hàm lượng polyphenol theo phương pháp Folin – Ciocalteau
Hàm lượng polyphenol của các đối tượng khảo sát được xác định theo phương pháp Folin – Ciocalteau của Singleton (1999) [82] a) Nguyên tắc
Sự trao đổi điện tử trong môi trường kiềm của hợp chất phenolic bị oxy hóa bởi thuốc thử Folin – Ciocalteau sẽ tạo thành hợp chất có màu xanh (molydenium) Đo độ hấp thu ở bước sóng 760 nm kết hợp với đồ thị đường chuẩn theo gallic acid, tính được hàm lượng tổng các hợp chất phenolic có trong mẫu phân tích b) Phương pháp tiến hành
- Chuẩn bị các dung dịch sau:
Dung dịch Na2CO3 20%: hòa tan 20 g Na2CO3 bằng nước cất, định mức lên thể tích 100 mL rồi đun sôi Sau khi dung dịch nguội, thêm một vài tinh thể Na2CO3, sau
24 giờ lọc lấy dung dịch trong
Dung dịch gallic acid 1 mg/mL: hòa tan 10 mg gallic acid trong 1 mL DMSO, sau đó định mức lên 10 mL bằng nước cất Từ dung dịch trên pha ra các dung dịch có nồng độ sau bằng nước cất: 0; 100; 200; 400; 500; 600; 700; 800; 900 và 1000 (g/mL)
Cho 200 μL thuốc thử Folin – Ciocalteau vào 40 μL dung dịch gallic acid ở các nồng độ khác nhau, đồng nhất bằng bể lắc siêu âm trong 5 phút ở nhiệt độ phòng Thêm 600 μL dung dịch Na2CO3 20% và 3160 μL nước cất vào hỗn hợp trên, tiếp tục đồng nhất bằng bể lắc siêu âm trong 30 phút cũng ở nhiệt độ phòng Tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng λ = 760 nm Lặp lại 3 lần cho mỗi nồng độ, lấy giá trị trung bình
Hòa tan 10 mg cao chiết trong 1 mL DMSO 100%, sau đó pha ra các nồng độ phù hợp để thu được độ hấp thu nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn gallic acid Tiến hành đo mẫu tương tự như bước lập đường chuẩn gallic acid Lặp lại 3 lần cho mỗi nồng độ, lấy giá trị trung bình
Hình 2.2 Quy trình định lượng polyphenol
Tính toán kết quả: từ độ hấp thu của dung dịch gallic acid tại các nồng độ, dựng đồ thị ở Hình 2.3
Siêu âm Đo mật độ quang
Nhiệt độ phòng t = 30 phút λ = 760 nm
Hình 2.3 Độ hấp thu của gallic acid
- Hàm lượng polyphenol có trong mẫu được tính theo công thức sau:
TPE = GAE.V m Trong đó: TPE (mg GAE/g cao): hàm lượng polyphenol tính trên một gam cao chiết
GAE (mg/L): hàm lượng ước lượng của phenol suy ra từ đường chuẩn gallic acid
GAE chính là giá trị x trong công thức đường chuẩn gallic acid, được tính bằng cách thay giá trị độ hấp thu của mẫu vào giá trị y
2.3.6 Định lượng hàm lượng flavonoid theo phương pháp aluminum chloride - AlCl 3 a) Nguyên tắc
Phản ứng tạo phức giữa nhóm flavonoid với muối aluminum chloride trong môi trường methanol, cho phức chất màu vàng Đo độ hấp thu ở bước sóng 425 nm kết hợp với đồ thị đường chuẩn theo quercetin, tính được hàm lượng flavonoid có trong mẫu phân tích [83] y = 0.0012x - 0.0362 R² = 0.9979
- Chuẩn bị các dung dịch sau:
Dung dịch AlCl3 10%: hòa tan 10 g AlCl3 bằng nước cất, định mức lên thể tích
Dung dịch NaNO2 5%: hòa tan 5 g NaNO2 bằng nước cất, định mức lên thể tích
Dung dịch NaOH 1M: hòa tan 4 g NaOH bằng nước cất, định mức lên thể tích
Dung dịch Quercetin 1000 àg/mL: hũa tan 10 mg quercetin trong 1 mL methanol Từ dung dịch trên pha ra các dung dịch có nồng độ sau bằng methanol: 0; 100; 200; 300; 400; 500; 600; 700; 800 (àg/mL)
Hỗn hợp ban đầu gồm 2 mL nước cất; 0.5 mL quercetin và 0.15 mL NaNO2 5% lần lượt được cho theo thứ tự Sau 5 phút, cho vào hỗn hợp trên 0.15 mL AlCl3 10% Sau đó 1 phút, cho thêm 1 mL NaOH 1M và 1.2 mL nước cất Cuối cùng tiến hành đo mật độ quang tại bước sóng λ = 425 nm Lặp lại 3 lần cho mỗi nồng độ, lấy giá trị trung bình. Định lượng flavonoid của mẫu: tiến hành như lập đường chuẩn nhưng thay chất chuẩn bằng cao chiết Hàm lượng flavonoid được tính toán từ đường chuẩn với đơn vị là mg quercetin/g cao khô.
Hình 2.4 Quy trình định lượng flavonoid của mẫu
Tính toán kết quả: từ độ hấp thu của dung dịch quercetin tại các nồng độ, dựng được đồ thị ở Hình 2.5
Hình 2.5 Độ hấp thụ của quercetin y = 0.0015x - 0.0194 R² = 0.9992
2 mL nước cất 0.5 mL quercetin (trong CH3OH)
1 mL NaOH 1M 1.2 mL nước cất Đo độ hấp thu
Hàm lượng flavonoid có trong mẫu được tính theo công thức sau:
QUE mẫu = QUE chuẩn V m Với: QUEmẫu (mg QUE/g cao): hàm lượng flavonoid tính trên một gam cao chiết
V (L): thể tích mẫu m (g): khối lượng mẫu
QUEchuẩn (mg/L): hàm lượng ước lượng của quercetin suy ra từ đường chuẩn quercetin
QUEchuẩn chính là giá trị x trong công thức đường chuẩn quercetin, được tính bằng cách thay giá trị độ hấp thu của mẫu vào giá trị y
2.3.7 Định lượng tannin theo phương pháp Folin - Ciocalteau a) Nguyên tắc
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Chuẩn bị nguyên liệu
Sau khi nguyên liệu bao gồm lá ổi, lá trầu, lá tía tô, ngải cứu, lá mận và trà xanh được thu hái tại vườn đối tượng nghiên cứu Hóc Môn và Long An vào tháng 01/2022, cây được phơi trong bóng râm và sấy thông gió trong khoảng nhiệt độ từ 40 ± 2 o C cho đến khi độ ẩm đạt dưới 12% (Hình 3.1) [92] Nguyên liệu được mang đi xay nhỏ thành bột qua rây có kích thước từ 0.25-1 mm và được đo độ tro toàn phần để xác định hàm lượng chất vô cơ có trong đối tượng nghiên cứu gồm các loại muối khoáng, kim loại [92] Từ đó, độ tro toàn phần được dùng để đánh giá độ sạch của nguyên liệu Độ tro dưới 10% đạt tiêu chuẩn theo Dược điển Việt Nam V [92] a 1 ) Lá ổi a 2 ) Lá ổi sau khi sấy b 1 ) Lá tía tô b 2 ) Lá tía tô sau khi sấy
46 c 1 ) Ngải cứu c 2 ) Ngải cứu sau khi sấy d 1 ) Lá trầu d 2 ) Lá trầu sau khi sấy e 1 ) Mận e 2 ) Mận sau khi sấy
47 f 1 ) Trà xanh f 2 ) Trà xanh sau khi sấy
Hình 3.1 Nguyên liệu trước và sau khi sấy Độ tro toàn phần và độ ẩm của nguyên liệu được thể hiện ở Bảng 3.1, Phụ lục
Bảng 3.1 Độ tro và độ ẩm của các đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu
(Tên khoa học) Độ ẩm (%) Độ tro (%)
Lá tía tô ( Perilla frutescent L.) 9.08 ± 0.07 7.15 ± 0.03
Như vậy, cả 6 đối tượng nghiên cứu đều đạt tiêu chuẩn của Dược Điển Việt Nam V [92] để bảo quản và tiếp tục thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu tiếp theo
Hiệu suất thu cao tổng
Việc khảo sát hiệu suất thu cao tổng nhằm đánh giá sự khác biệt về hiệu suất chiết giữa các lần chiết với nhau của đối tượng nghiên cứu nhằm xác định số lần chiết hợp lý để tiếp tục thực hiện các bước sau của luận văn
Quy trình chiết cao của các đối tượng nghiên cứu được thực hiện theo quy trình
Mục 2.3.3 Quy trình được thực hiện lặp ba lần và ghi nhận khối lượng cao khô thu được Hiệu suất chiết được thể hiện ở Hình 3.2 và Phụ lục 3
Hình 3.2 Hiệu suất thu cao tổng của sáu đối tượng nghiên cứu
Theo kết quả Hình 3.2, hiệu suất thu cao tổng qua ba lần chiết của các đối tượng nghiên cứu theo thứ tự lá ổi, lá trầu, lá tía tô, ngải cứu, lá mận và trà xanh lần lượt là 22.98; 12.70; 16.43; 12.43; 18.73 và 22.4% Trong đó, hiệu suất chiết của lá ổi là cao nhất, cao gấp 1.9 lần so với trầu và gấp khoảng 1.4 lần so với lá tía tô Lá trà xanh cho hiệu suất chiết tương đương với lá ổi Hiệu suất của mận nhìn chung cao chỉ sau lá ổi và trà xanh Hiệu suất thu cao tổng của ngải cứu là thấp nhất do trong quá trình nghiền đối tượng nghiên cứu có chứa cả lá và cành
25 Ổi Trầu Tía tô Ngải cứu Mận Trà xanh
H iệu suấ t H (% ) Đối tượng nghiên cứu
Qua đồ thị Hình 3.2 cho thấy, hiệu suất chiết lần thứ nhất luôn cao hơn hẳn lần thứ hai, lần thứ ba Ở lần chiết đầu tiên, các hợp chất trong đối tượng nghiên cứu dễ dàng khuếch tán vào dung môi do chênh lệch nồng độ lớn, còn ở các lần tiếp theo, hàm lượng hợp chất giảm do đã được lôi cuốn ra dung môi ở lần thứ nhất nên khả năng khuếch tán kém đi, từ đó hiệu suất chiết cũng thấp hơn Vì vậy ở lần chiết thứ hai, các đối tượng nghiên cứu giảm so với lần thứ nhất từ 2-3 lần và khi chiết đến lần thứ ba hiệu suất rất thấp (giảm 90-95% so với lần chiết thứ nhất)
Dựa trên kết quả Hình 3.2, hiệu suất chiết lần thứ ba của 6 đối tượng nghiên cứu rất thấp so với hai lần chiết đầu Vì vậy, tăng số lần chiết không những không tăng lượng cao thu được mà còn có thể gây biến tính các hoạt chất có trong dịch chiết do thời gian chiết kéo dài cùng với việc gia nhiệt độ quá lâu [93] Do đó, trong các bước thí nghiệm tiếp theo sẽ tiến hành chiết hai lần để đảm bảo đạt được hiệu suất chiết tối ưu.
Kết quả sơ bộ hoá thực vật
Việc xác định thành phần hóa học có trong các đối tượng nghiên cứu giúp dự đoán các hoạt tính sinh học của chúng Các nhóm chất như polyphenol, flavonoid, tannin, saponin, glycoside tim và carotenoid được định tính dựa trên các thí nghiệm sơ bộ thực vật ở Mục 2.3.4 Kết quả sơ bộ hóa thực vật được thể hiện ở Bảng 3.2
Bảng 3.2 Kết quả sơ bộ thực vật của các cao chiết
Theo Bảng 3.2, kết quả sơ bộ thực vật của sáu đối tượng nghiên cứu nhìn chung đều có chứa các hợp chất như polyphenol, flavonoid, tannin, glycoside tim và carotenoid Trong đó, trầu, tía tô, ngải cứu và mận đều không có các hợp chất tự nhiên saponin như ổi hay trà xanh Tuy nhiên, việc có mặt của hợp chất polyphenol trong cả sáu đối tượng nghiên cứu có thể dự đoán sự đa dạng hoạt tính sinh học của các đối tượng nghiên cứu [94]
Theo kết quả nghiên cứu khoa học của Te Sheng Chang vào năm 2009, polyphenol có khả năng ức chế enzyme tyrosinase và kháng oxy hóa theo cơ chế
Kết quả thí nghiệm Ổi Trầu Tía tô Ngải cứu Mận Trà xanh
++ : hoạt chất có mặt với lượng nhiều
DPPH (tương tự vitamin C) bởi khả năng bắt cặp với các gốc tự do như OH - , ROO - (là các yếu tố gây biến dị, hủy hoại tế bào, ung thư, tăng nhanh sự lão hóa…) [34] Ngoài ra, hợp chất quan trọng flavonoid đã được chứng minh có khả năng ức chế enzyme tyrosinase Ở kết quả định tính flavonoid có xuất hiện thuốc thử Mg/HCl, cả sáu đối tượng nghiên cứu đều có sự chuyển màu dung dịch sang cam Nguyên nhân là do phản ứng giữa Mg và HCl cho H2 hình thành, H2 tham gia vào quá trình khử các hợp chất flavonoid tạo ra sản phẩm có màu Màu biến đổi chứng tỏ các đối tượng nghiên cứu có chứa các dẫn chất flavone, flavanonol, flavanone, aurone và chalcone (Phụ lục 4-9 ) Đối với thí nghiệm với chì acetate 10%, thuốc thử chì acetate 10% phản ứng hầu hết với các flavonoid sinh ra kết tủa Đặc biệt, lá ổi, lá trầu, lá mận và trà xanh qua việc sơ bộ hóa thực vật cho hàm lượng polyphenol và flavonoid cao hơn tía tô và ngải cứu Như vậy, có thể kết luận sơ bộ khả năng kháng oxy hóa cao của sáu đối tượng nghiên cứu này, một trong những yếu tố quan trọng để định hướng ứng dụng của các đối tượng nghiên cứu này vào mỹ phẩm
Bên cạnh thành phần hóa học của cả sáu đối tượng nghiên cứu là các polyphenol, flavonoid và tannin thì còn có các hoạt chất khác như saponin, glycoside tim và caretonoid Saponin là một hoạt chất có khả năng kháng viêm [95] trong khi đó glycoside tim có khả năng điều hòa nhịp tim, huyết áp [96] Tuy nhiên, glycoside tim có yêu cầu nhất định khi sử dụng vì các tác dụng phụ như gây ảo giác, nhịp tim chậm, buồn nôn, đau bụng… Vì thế, sự không có mặt của glycoside tim ở cả hai đối tượng nghiên cứu ổi và trầu giúp hạn chế được các tác dụng phụ không mong muốn như loạn nhịp tim, viêm cơ tim và bệnh tim thiếu máu cục bộ.
Định lượng các hoạt chất tiêu biểu có hoạt tính trắng da và kháng oxy hóa
Nhóm chất polyphenol trong thực vật đã được chứng minh có sự đa dạng hoạt tính sinh học [94] Polyphenol phân bố rộng rãi trong tự nhiên và được xem là một trong các chất ức chế enzyme tyrosinase [97] Đồng thời, vị trí của nhóm thế trong hợp chất polyphenol như OH - đóng vai trò quyết định đến khả năng ức chế enzyme tyrosinase [34]
Ngoài ra, flavonoid là một trong những hợp chất điển hình thuộc nhóm polyphenol và cũng có nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh khả năng sử dụng những hợp chất này vào các mỹ phẩm trắng da và có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong y học và dược học [42] Trên cơ bản flavonoid ức chế enzyme dựa trên cơ chế tạo
“chelate” với nguyên tử đồng trong vùng hoạt động của enzyme tyrosinase (Hình
3.3) Trong đó một số flavonoid như quercetin, kaempferol, morin, rhamnetin (Hình 1.13 và Hình 1.14) thểhiện tác dụng ức chế hoạt tính của enzyme tyrosinase, trong khi những chất khác như catechin vàrhamnetin, có khả năng phản ứng với tyrosinase [98-102]
Ngoài ra theo nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh các flavonoid không thuộc nhóm polyphenol như tangeretin, deguelin, sinensetin, nobilentin, cũng có hoạt tính nổi bật như kháng oxy hóa, ức chế hoạt tính của enzyme tyrosinase [103- 105]
Hình 3.3 Flavonoid liên kết với tâm Cu của enzyme tyrosinase
Hàm lượng polyphenol (TPE) và flavonoid (TFE) của sáu đối tượng khảo sát được thể hiện ở Hình 3.4, Phụ lục 10 và Phụ lục 11
Hình 3.4 Hàm lượng polyphenol và flavonoid của đối tượng nghiên cứu
Dựa trên biểu đồ cột Hình 3.4, có sự khác biệt về hàm lượng polyphenol giữa sáu đối tượng nghiên cứu với nhau Trong đó, giá trị TPE của lá trầu cao nhất (441.49 mg GAE/g cao), cao gấp 6 giá trị TPE thấp nhất là lá tía tô (52.22 mg GAE/g cao) Theo nghiên cứu của Ameena Ali và cộng sự năm 2018, khi chiết lá trầu với ethanol
70 o cho hàm lượng phenolic là 311.21 mg GAE/g cao và thấp hơn kết quả TPE khi chiết với ethanol 96 o [106] Nguyên nhân do thực hiện ở điều kiện chiết khác nhau nên có sự chênh lệch vế các giá trị TPE Giá trị TPE của lá ổi thấp hơn lá trầu khoảng 2.5 lần và tương đương với hàm lượng polyphenol có trong lá trà xanh (169.79 mg GAE/g cao) và lá mận (142.76 mg GAE/g cao) Ba đối tượng này có giá trị TPE cao hơn hẳn so với đối tượng tiếp theo là cây tía tô gấp 3 lần Với kết quả trên, có thể dự đoán rằng lá trầu cho hoạt tính tốt nhất, tiếp theo đó là lá ổi, lá mận, trà xanh và sau cùng là lá tía tô và ngải cứu Với hàm lượng polyphenol trên, rất có thể các đối tượng nghiên cứu sẽ cho hoạt tính kháng oxy hóa cao theo cơ chế bắt gốc tự do DPPH
700 Ổi Trầu Tía tô Ngải cứu Mận Trà xanh
H àm lượ ng ( m g/ g) ca o khô) Đối tượng nghiên cứu
Hàm lượng flavonoid (TFE) của sáu đối tượng nghiên cứu có sự thay đổi so với giá trị TPE Trong đó, TFE của ngải cứu và tía tô có giá trị tương đương nhau, lần lượt là 85.72 mg QUE/g cao và 73.16 mg QUE/g cao Lá trầu cho giá trị TFE cao nhất (595.86 mg QUE/g cao), cao gấp 8 lần so hai đối tượng ngải cứu và tía tô Ba đối tượng nghiên cứu còn lại như ổi, mận và trà xanh cho hàm lượng flavonoid khá cao với giá trị TFE trong khoảng từ 210.77 đến 345.78 mg QUE/g cao Tuy nhiên, kết quả định lượng lại cho thấy hai chỉ số TPE và TFE ở các đối tượng nghiên cứu như lá ổi, lá trầu, tía tô, mận và trà xanh lại không tỉ lệ thuận với nhau: chỉ số TFE của trà xanh khá cao, cao hơn khoảng 200 mg/g so với giá trị TPE Trong khi đó, chỉ số TFE của lá tía tô (85.72 mg QUE/g cao) cao hơn không đáng kể so với TPE (52.22 mg GAE/g cao) Vì vậy, có thể dự đoán ở năm đối tượng nghiên cứu này có hợp chất flavonoid không thuộc nhóm polyphenol do một số flavonoid không có nhóm -OH ở vòng thơm nên không cho kết quả phản ứng khi định lượng polyphenol [107] Với kết quả TFE trên có thể dự đoán được các đối tượng nghiên cứu như lá ổi, lá trầu, tía tô, mận và trà xanh sẽ cho hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase khá tốt vì nhóm chất có khả năng liên kết được tâm Cu của enzyme thường là các hợp chất flavonoid
Từ kết quả này, có thể thấy tiềm năng của các đối tượng khảo sát trong việc ức chế hoạt động của enzyme tyrosinase cũng như khả năng kháng oxy hóa, đặc biệt là lá trầu và trà xanh với các giá trị TPE và TFE rất cao so với hai đối tượng nghiên cứu còn lại
Tannin là một chất có khả năng kháng oxy hóa mạnh [94] Do đó, việc có mặt của hợp chất này trong các đối tượng nghiên cứu ở Bảng 3.2 giúp một phần nào có thể dự đoán được khả năng bắt gốc tự do của các đối tượng nghiên cứu trên Đồng thời, với đặc tính kháng viêm, kháng khuẩn, tannin được ứng dụng trong việc điều trị viêm da dị ứng (một tình trạng viêm da gây ra bởi một số loại thực phẩm và môi trường) [108]
Hình 3.5 Hàm lượng tannin của bốn đối tượng khảo sát
Dựa vào kết quả Hình 3.5, cả sáu đối tượng nghiên cứu đều có hợp chất tannin Tuy nhiên, khác với kết quả định lượng polyphenol và flavonoid, ở lá trầu cho giá trị TPE và TFE lớn nhất thì ở hàm lượng tannin, lá trà xanh cho giá trị TTE cao nhất (161.40 mg TAE/g cao) Theo sau là lá ổi với lá mận đều cho hàm lượng tannin lớn hơn 100 mg TAE/g cao Các đối tượng còn lại đều có hàm lượng tannin khá thấp và nhỏ hơn 100 mg TAE/g cao Trong đó, các giá trị TPE, TFE và TTE khi so sánh giữa các đối tượng khảo sát thì lá tía tô luôn cho hàm lượng thấp nhất (14.29 mg TAE/g cao) Do đó, từ kết quả định lượng có thể dự đoán lá tía tô sẽ có hoạt tính sinh học thấp hơn so với các đối tượng nghiên cứu còn lại Đồng thời, trà xanh, ổi, mận và trầu là các đối tượng có tiềm năng cho khả năng kháng oxy hóa rất mạnh theo cơ chế bắt gốc tự do DPPH Tuy nhiên, cũng cần kiểm tra lại các thí nghiệm in vitro để đánh giá lại khả năng ức chế enzyme tyrosinase và kháng oxy hóa của các đối tượng nghiên cứu
180 Ổi Trầu Tía tô Ngải cứu Mận Trà xanh
Hàm lượng (mg/g cao) Đối tượng nghiên cứu
Khảo sát hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase
Để kiểm tra hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase, đầu tiên cần khảo sát nồng độ của các mẫu cao tan trong DMSO 5% Kết quả thực nghiệm được thể hiện ở Bảng
Bảng 3.3 Khả năng ức chế enzyme tyrosinase ở nồng độ 1000 àg/mL Đối tượng nghiên cứu
Theo kết quả trên, phần trăm ức chế enzyme tyrosinase của ngải cứu ở 1000 àg/mL rất thấp (34.34%) Do đú, cú thể kết luận ngải cứu khụng cú hoạt tớnh trắng da Tuy nhiên, bốn đối tượng còn lại là ổi, tía tô, mận và trà xanh khi khảo sát ở nồng độ 1000 àg/mL đều cú phần trăm ức chế lớn hơn 50% Vỡ vậy, cỏc đối tượng nghiờn cứu này có khả năng ức chế hoạt tính enzyme tyrosinase Mặc dù ở lá trầu qua khảo sát hàm lượng polyphenol và flavonoid Hình 3.4 cao nhất trong cả bốn đối tượng nghiên cứu nhưng khả năng ức chế enzyme tyrosinase thấp (28.02%) Điều này có thể giải thích do trong cao chiết EtOH của lá trầu có nhiều hợp chất isoflavone và flavanone Năm 2014, Federico Ferreres đã nghiên cứu thành phần hóa học trong cao chiết EtOH của lá trầu Piper betle L bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC kết hợp đầu dò DAD và khối phổ MS, kết quả có 12 hợp chất phenolic được
57 phát hiện bao gồm phenylpropanoid, 5 cinnamoyl và 6 dẫn chất flavonoid Trong đó, hydroxychavicol là hợp chất có hàm lượng cao trong cao chiết EtOH [109], đây là hợp chất polyphenol có khả năng kháng oxy hóa rất mạnh nhưng lại là một trong những chất thúc đẩy phản ứng enzyme tyrosinase hình thành o-quinone [110] (Hình
1.17) Ngoài ra, theo một nghiên cứu khác của Rathee và cộng sự năm 2006 trên cao
EtOH của lá trầu cũng ghi nhận hai hợp chất quan trọng trong lá trầu là chevibetol (CHV) và allylpyrocatechol (APC) có khả năng bắt gốc tự do mạnh tuy nhiên chưa ghi nhận về khả năng ức chế enzyme tyrosinase [111]
Như vậy, ở nồng độ 1000 àg/mL bốn đối tượng nghiờn cứu ổi, mận, trà xanh và tía tô đều có phần trăm ức chế lớn hơn 50% Để có thể đánh giá chính xác hơn về khả năng ức chế enzyme tyrosinase của bốn đối tượng nghiên cứu này cần phải tìm ra giá trị IC50 và được biểu diễn ở sơ đồ Hình 3.8 và Phụ lục 13
Kết quả thực nghiệm được thể hiện qua Hình 3.8
Hình 3.8 Khả năng ức chế enzyme tyrosinase của các đối tượng
Kết quả thực nghiệm Hình 3.8 cho thấy khả năng ức chế enzyme tyrosinase của lá ổi là tốt nhất trong các đối tượng nghiên cứu, khả năng này thấp hơn chứng dương (kojic acid) khoảng 17 lần Trái ngược với phần dự đoán trước, lá tía tô sẽ cho hoạt tính trắng da thấp nhất trong cả bốn đối tượng nghiên cứu nhưng qua khảo sát, khả năng này lại cao hơn lá trầu và ngải cứu So với chứng dương, khả năng ức chế enzyme tyrosinase của lá tía tô thấp hơn 48 lần Theo một nghiên cứu của Linghua Meng, có khoảng 50-80% flavonoid là hợp chất flavone có trong lá tía tô [112] và hợp chất này cũng đã được chứng minh có khả năng ức chế enzyme tyosinase Đó là sự khác biệt trong thành phần hóa học giữa lá tía tô với lá trầu cũng như ngải cứu đã dẫn tới sự chênh lệch về hoạt tính Vì vậy, lá tía tô vẫn có khả năng làm trắng da mặc dù hàm lượng TPE và TFE thấp nhất trong cả bốn đối tượng nghiên cứu Mặc dù lá trà xanh có hàm lượng polyphenol tương đương với lá ổi và có hàm lượng flavonoid lớn hơn khoảng 100 mg/g cao nhưng khi đo hoạt tính thì kết quả cho giá trị IC50 thấp hơn 2 lần so với lá ổi (518.23 g/mL) Điều này có thể lý giải do hàm lượng chính trong lá trà xanh là catechin và đây là một hợp chất có khả năng ức chế enzyme
1200 Ổi Tía tô Mận Trà xanh Acid Kojic
IC50(g/mL) Đối tượng nghiên cứu
59 tyrosinase mạnh [113] Theo nghiên cứu của C-J Hu và cộng sự năm 2016, hàm lượng catechin thu được sau quá trình chiết lá trà xanh tốt nhất ở điều kiện cồn ethanol 50 o [113] Tuy nhiên, trong đề tài này, các đối tượng nghiên cứu đều được chiết bằng cồn tuyệt đối nên cao tổng lá trà xanh không chứa hàm lượng catechin tối ưu nhất Vì vậy, hoạt tính của trà xanh thấp hơn so với lá ổi Ngoài ra, lá mận cho hoạt tính ức chế enzyme cao chỉ sau lá ổi với giá trị IC50 là 223.53 g/mL và không có sự chênh lệch đáng kể Kết quả này là hợp lý vì hàm lượng polyphenol và flavonoid của lá mận thấp hơn khoảng 1.2 lần so với lá ổi.
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa
Trong ngành công nghiệp mỹ phẩm hiện nay, bên cạnh khả năng làm trắng da thì làm chậm tiến trình lão hóa da cũng là điều hết sức quan trọng Kháng oxy hóa là yếu tố quan trọng nhất trong cơ chế ức chế enzyme tyrosinase hình thành hắc sắc tố melanin [37, 38] Một trong những nguyên nhân chính gây nên lão hóa da là các gốc tự do và những tác động mạnh mẽ từ ánh nắng mặt trời (tia cực tím) Do đó, trong khuôn khổ đề tài này ngoài việc tập trung nghiên cứu những đối tượng nghiên cứu có khả năng ức chế enzyme tyrosinase thì cũng xem xét khả năng bắt gốc tự do theo cơ chế DPPH của các đối tượng nghiên cứu
Với hàm lượng polyphenol và flavonoid cao ở cả bốn đối tượng nghiên cứu cùng với màu sắc rõ rệt ở các phản ứng sơ bộ chứng tỏ các dẫn xuất thuộc các nhóm này có nhiều nhóm hydroxyl gắn trên vòng benzen rất giống với các chất kháng oxy hóa theo phương pháp DPPH của Sharma (2009) [88]
Kết quả hoạt tính kháng oxy hóa theo phương pháp DPPH của các đối tượng nghiên cứu được trình bày trong Hình 3.9 và Phụ lục 15
Hình 3.9 Kết quả khảo sát kháng oxy hóa
Với kết quả hàm lượng polyphenol Hình 3.4 ở Mục 3.4.1, dựa trên kết quả Hình
3.9, trầu cho khả năng kháng oxy hóa tốt nhất với giá trị IC50 = 4.46 g/mL và cao hơn chứng dương vitamin C gấp 1.3 lần Bên cạnh đó, ngải cứu cũng cho khả năng bắt gốc tự do (IC50 = 5.59g/mL) tương đương với chứng dương Các đối tượng còn lại như ổi, mận và trà xanh cho hoạt tính mạnh và không có sự chênh lệch đáng kể về giá trị IC50 (từ 16-25 g/mL) Khả năng kháng oxy hóa của tía tô là thấp nhất và thấp hơn khoảng 6.4 lần so với vitamin C Điều này phù hợp với kết quả hàm lượng polyphenol ở Hình 3.4 và tannin ở Hình 3.5 trong lá tía tô là thấp nhất Qua đó cũng góp phần chứng minh vai trò của hàm lượng polyphenol và tannin với khả năng kháng oxy hóa
Từ các kết quả nghiên cứu ở hai biểu đồ Hình 3.8 và Hình 3.9, lá ổi cho hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase cao nhất, sau đó là lá mận có giá trị IC50 tương đương với lá ổi Trà xanh cho hoạt tính trắng da thấp khoảng hơn 2 lần so với lá ổi nhưng nhìn chung vẫn được xem là có khả năng làm trắng da một cách tương đối Về khả năng bắt gốc tự do, tất cả sáu đối tượng đều cho khả năng kháng DPPH cao và không có sự chệnh lệch đáng kể về giá trị IC50 Do đó, bước tiếp theo sẽ tiến hành kết hợp
45 Ổi Trầu Tía tô Ngải cứu Mận Trà xanh Vit C
IC50(g/mL) Đối tượng nghiên cứu
61 ba đối tượng lá ổi, lá mận và trà xanh theo hai trường hợp kết hợp lá và kết hợp cao theo tỷ lệ 1:1 Sau đó, tiến hành thực hiện lại các thí nghiệm định lượng polyphenol, flavonoid, tannin và khảo sát hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase để lựa ra tổ hợp tốt nhất Mẫu cao chiết kết hợp này sẽ được thực hiện ở các tỷ lệ 1:2; 1:3; 2:1; 3:1 để lựa ra kết quả tối ưu nhất về khả năng làm trắng da.
Kết hợp các loài thực vật
Qua các kết quả nghiên cứu về hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase và kháng DPPH của các đối tượng nghiên cứu thì lá ổi, lá mận và trà xanh là ba đối tượng tiềm năng cho quá trình kết hợp Tiến hành kết hợp xen kẽ 3 loài thực vật trà xanh- ổi trà xanh- mận, ổi- mận theo hai trường hợp kết hợp lá và kết hợp cao
Về kết hợp lá, bột lá sau khi nghiền sẽ được đo độ ẩm và được trộn theo tỷ lệ 1:1 về khối lượng khô Tiến hành chiết bằng cồn tuyệt đối, ở nhiệt độ 45 ± 2 o C, trong thời gian 45 phút, sau đó đi cô quay để thu được cao tổng kết hợp lá của các đối tượng
Về kết hợp cao, cao tổng riêng lẽ của ba loại thực vật sẽ được đo độ ẩm và được cân theo tỷ lệ 1:1 về khối lượng cao khô Mẫu sau khi cân sẽ được pha trong cồn tuyệt đối và đem đi cô quay để thu được cao tổng kết hợp cao của các đối tượng
3.7.1 Định lượng polyphenol của các cao chiết kết hợp lá và cao chiết kết hợp cao
Hình 3.10 Hàm lượng polyphenol của các cao chiết kết hợp lá và kết hợp cao
Kết quả xác định hàm lượng polyphenol (Hình 3.10) cho thấy có sự khác biệt giữa các cao chiết kết hợp Nhìn chung, cả sáu cao chiết kết hợp lá và kết hợp cao đều cho giá trị TPE cao hơn giá trị TPE của các đối tượng ổi, mận, trà xanh Trong đó, các tổ hợp (4), (6), (8) sau khi kết hợp có sự tăng mạnh hàm lượng polyphenol khoảng 2.5 lần so với (1), (2), (3) và không có thay đổi đáng kể về giá trị TPE Tương tự như các mẫu cao chiết kết hợp lá, các kết hợp cao (5), (7), (9) cũng cho giá trị TPE rất cao so với từng đối tượng riêng lẽ và có giá trị gần ngang bằng nhau Trong đó, giá trị TPE của các cao chiết kết hợp lá chiếm ưu thế cao hơn so với các cao chiết kết hợp cao (giá trị TPE của mẫu (4) lớn hơn (5), mẫu (6) lớn hơn (7), mẫu (8) lớn hơn (9)) Mặc dù quá trình kết quả có sự thay đổi về hàm lượng polyphenol trong các mẫu cao chiết kết hợp nhưng tùy vào trường hợp kết hợp mà cho ra kết quả khác nhau Điều này có thể giải thích do sự khác biệt về quy trình và điều kiện kết hợp Ở các kết hợp lá, do các loài thực vật được chiết ngay từ ban đầu với nhiệt độ 45 ± 2 o C cùng với tác động cơ học của cánh khuấy nên có đủ thời gian để thực hiện các phản ứng
450 Ổi Mận Trà xanh Trà xanh
+Mận (Cao) Ổi+ Mận (Lá) Ổi+ Mận (Cao)
63 giữa các chất trong hai loài thực vật khi kết hợp Còn ở kết hợp cao, các phản ứng sinh ra các hợp chất mới vẫn xảy ra nhưng do thời gian tiếp xúc nhiệt không lâu như ở các kết hợp cao nên diễn ra ít và chậm hơn Do trong trà xanh và lá ổi chứa hàm lượng catechin nhiều [113-115] và lá mận chứa các aldehyde, acid…[116] nên phản ứng diễn ra có thể kể đến là phản ứng trùng hợp của catechin hay phản ứng giữa catechin và các andehyde tạo ra các polyphenol mới Vì vậy, sau khi kết hợp thì tất cả các tổ hợp đều tăng mạnh so với từng đối tượng nghiên cứu và nhờ vào sự khác biệt trong quy trình kết hợp đã cho kết quả các mẫu kết hợp lá tốt hơn so với các mẫu kết hợp cao Dựa vào Hình 3.10 có thể dự đoán hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của các mẫu kết hợp sẽ tăng so với ban đầu
3.7.2 Định lượng flavonoid của các cao chiết kết hợp lá và cao chiết kết hợp cao
Hình 3.11 Hàm lượng flavonoid của các cao chiết kết hợp lá và kết hợp cao Đồ thị Hình 3.11 thể hiện hàm lượng flavonoid của các cao chiết kết hợp Tương tự như polyphenol, giá trị TFE của các cao chiết kết hợp lá và kết hợp cao đều cao hơn so với từng đối tượng riêng rẽ ổi, mận Tuy nhiên, cả sáu tổ hợp này cho kết quả thấp hơn so với lá trà xanh Nguyên nhân là do hàm lượng flavonoid của trà xanh lớn
400 Ổi Mận Trà xanh Trà xanh+Ổi
Mận (Cao) Ổi+ Mận (Lá) Ổi+ Mận (Cao)
64 nhất và chênh lệch hơn 100 mg QUE/g cao so với hai đối tượng nghiên cứu còn lại (với giá trị TFE là 345.28 mg QUE/g cao) nên khi kết hợp trà xanh- ổi (4), (5) hay trà xanh- mận (6), (7) thì hàm lượng flavonoid sẽ tăng trong khoảng giá trị TFE giữa lá mận, lá ổi và trà xanh Riêng khi kết hợp hai thực vật ổi- mận (8), (9), mặc dù giá trị TFE ban đầu lần lượt là 245.02 mg QUE/g cao và 210.77 mg QUE/g cao nhưng kết quả tổ hợp theo tỷ lệ 1:1 ở hai trường hợp kết hợp lá và cao đều cho hàm lượng flavonoid tăng khoảng 1.3 lần Như đã trình bày ở phần polyphenol kết hợp ở Mục
3.7.1, trong quá trình kết hợp sẽ xảy ra các phản ứng tạo ra các flavonoid mới Dựa vào kết quả Hình 3.11, có thể dự đoán cả sáu tổ hợp sẽ cho giá trị phần trăm ức chế enzyme tyrosinase cũng như khả năng kháng oxy hóa cao hóa cao hơn so với từng đối tượng lá ổi, lá mận và trà xanh Trong đó, cao chiết kết hợp ổi- mận có thể sẽ cho hoạt tính vượt bậc hơn so với 4 tổ hợp còn lại
3.7.3 Định lượng tannin của các cao chiết kết hợp
Dựa trên kết quả Hình 3.12, hầu hết hàm lượng tannin trong các cao chiết kết hợp lá và kết hợp cao đều không có sự chênh lệch đáng kể với các đối tượng nghiên cứu riêng lẻ như lá ổi, lá mận và trà xanh Các tổ hợp lá và tổ hợp cao từ (5) đến (9) đều dao động trong khoảng từ 126.5 mg TAE/g cao đến 163.91 mg TAE/ g cao Riêng mẫu kết hợp lá trà xanh- ổi (4) có sự tăng hàm lượng tannin với giá trị TTE là 204.60 mg TAE/g cao so với 5 tổ hợp còn lại Bên cạnh đó, cả 6 kết hợp này đều cho giá trị TTE cao hơn giá trị TTE của lá mận (119.24 mg TAE/ g cao) Vì tannin là hợp chất kháng oxy hóa rất mạnh [79] nên hàm lượng tannin tăng trong các cao chiết kết hợp đồng nghĩa với khả năng bắt gốc tự do DPPH của các cao chiết 1:1 từ (5) đến (9) sẽ cao hơn so với lá mận Bên cạnh đó, ở mẫu cao chiết kết hợp lá trà xanh- ổi (4), với lượng tannin cao nhất trong kết quả biểu đồ Hình 3.12 cùng với giá trị TPE (Hình 3.10) có thể sẽ cho khả năng bắt gốc tự do tốt
Hình 3.12 Hàm lượng tannin của các cao chiết kết hợp lá và kết hợp cao
3.7.4 Khảo sát hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của các cao chiết kết hợp
Hình 3.13 Khả năng ức chế enzyme tyrosinase của các cao chiết kết hợp lá và kết hợp cao
250 Ổi Mận Trà xanh Trà xanh + Ổi (Lá) Trà xanh + Ổi (Cao) Trà xanh +
600 Ổi Mận Trà xanh Trà xanh+ Ổi (Lá) Trà xanh+ Ổi (Cao) Trà xanh+Mận (Lá)
Trà xanh+Mận (Cao) Ổi+Mận (Lá) Ổi+Mận (Cao) Acid Kojic
Kết quả Hình 3.13 cho thấy khả năng ức chế enzyme tyrosinase của các cao chiết kết hợp lá và kết hợp cao so với lá ổi, lá mận và trà xanh Nhìn chung, cả bốn tổ hợp (4), (5), (6), (7) có trà xanh trong quá trình kết hợp trên đều cho giá trị IC50 cao hơn lá trà xanh riêng lẽ (IC50 = 518.23g/mL) Trong đó, các cao kết hợp lá đều cho hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase cao hơn khảng 1.2 lần so với các kết hợp cao trong tổ hợp trà xanh- ổi, trà xanh- mận và ổi- mận Ba kết hợp (4), (5) và (7) đều cho giá trị IC50 nằm trong khoảng giá trị IC50 của lá trà xanh và hai đối tượng nghiên cứu còn lại Riêng tổ hợp trà xanh- mận (6) trong quá trình kết hợp lá lại cho hoạt tính tốt hơn so với trà xanh và lá mận (IC50 = 184.87 g/mL) Tương tự tổ hợp (6), tổ hợp (8) ở trường hợp kết hợp lá của ổi- mận cũng cho hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase tốt nhất trong tất cả các kết hợp và cho giá trị IC50 = 172.07 g/mL thấp hơn hai đối tượng nghiên cứu lá ổi và lá mận Giá trị này thấp hơn chứng dương acid Kojic khoảng
8 lần Vì trong lá ổi qua khảo sát chứa hàm lượng catechin cao với 4456.49 g/g [114, 115] và trong lá mận chứa nhiều các aldehyde, acid như betulinic aldehyde, p - hydroxybenzaldehyde, ursolic aldehyde…[116] nên khi kết hợp thông qua các điều kiện xúc tác như nhiệt độ, tốc độ khuấy phản ứng trùng hợp diễn ra sinh ra các chất mới có hoạt tính trắng da Một trong các phản ứng được trình bày ở Hình 3.14 Hợp chất mới được hình thành qua quá trình polymer hóa được hình thành theo nghiên cứu của Joo Eun Chung và cộng sự năm 2004 cho hoạt tính kháng oxy hóa cao và được sử dụng nhiều trong công nghệ thực phẩm [117]
Hình 3.14 Phản ứng trùng hợp giữa catechin và andehyde
Ngoài ra, phản ứng trùng hợp tự tăng mạch catechin sẽ hình thành các proanthocyanidin [118] Hợp chất này rất phổ biến trong các loài thực vật và có nhiều
67 hoạt tính sinh học được sử dụng trong điều trị các bệnh lý như kháng khuẩn, kháng oxy hóa, kháng viêm…[119]
Hình 3.15 Phản ứng polymer hóa catechin
Như vậy, sau quá trình kết hợp xen kẽ tỷ lệ 1:1 giữa ba đối tượng lá ổi, lá mận và trà xanh trên hai phương thức kết hợp lá và kết hợp cao thì kết quả cho thấy cả sau tổ hợp đều cho hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase khá tốt Trong đó, mẫu ổi- mận ở trường hợp kết hợp lá cho giá trị IC50 mạnh hơn so với năm tổ hợp còn lại cũng như từng đối tượng lá ổi, lá mận Vì thế, đây là tổ hợp tiềm năng được lựa chọn để tiếp tục thực hiện chiết theo các tỷ lệ còn lại như 1:2; 1:3; 2:1; 3:1 và xác định lại hoạt tính để thu được kết hợp ổi- mận có tỷ lệ tối ưu nhất trong các đối tượng nghiên cứu
3.7.5 Khảo sát hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của các cao chiết kết hợp ổi- mận theo các tỷ lệ
Hai loài thực vật ổi và mận được kết hợp theo các tỷ lệ 1:2; 1:3; 2:1; 3:1 về khối lượng khô, sau đó được chiết bằng dung môi cồn tuyệt đối ở thời gian và tốc độ khuấy thích hợp Cô quay dịch chiết để thu được cao tổng và xác dịnh hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase Kết quả được thể hiện qua biều đồ cột Hình 3.16 và Phụ lục 21
Hình 3.16 Khả năng ức chế enzyme tyrosinase của các cao kết hợp tỷ lệ
Dựa vào kết quả Hình 3.16, hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của các cao chiết kết hợp tỷ lệ ổi- mận 1:2; 2:1; 3:1 đều có giá trị gần ngang bằng nhau và không có sự chênh lệch đáng kể so với lá mận (IC50 = 172.07 g/mL) Riêng tỷ lệ 1:3 và 1:1 cho giá trị IC50 thấp hơn hai đối tượng nghiên cứu lá ổi, lá mận lần lượt là 190.56 g/mL và 172.07 g/mL Như vậy, dù là kết hợp hai đối tượng nghiên cứu, tuy nhiên tỷ lệ kết hợp giữa chúng đóng vai trò rất quan trọng Như đã trình bày ở Mục 3.7.1, có nhiều phản ứng diễn ra giữa các chất có trong hỗn hợp ổi- mận hình thành các hợp chất mới Các hợp chất này có thể cho hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase hay kháng oxy hóa Từ đó, các tổ hợp tăng hoạt tính so với các cây ban đầu Tuy nhiên, tùy vào tỷ lệ kết hợp mà các phản ứng này xảy ra ít hay nhiều Vì thế, giá trị IC50 của các tỷ lệ kết hợp có sự khác biệt Tỷ lệ 1:1 cho kết quả tốt nhất
3.7.6 Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của cao chiết kết hợp ổi- mận 1:1
Bảng 3.4 Phần trăm ức chế DPPH của cao chiết kết hợp ổi-mận tỷ lệ 1:1 Ổi- Mận 1:1
Qua khảo sát bắt gốc tự do DPPH theo phương pháp Sharma năm 2009 [88], hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết kết hợp ổi- mận tỷ lệ 1:1 đạt 86.19% ở nồng độ 10 g/mL, tăng so với các đối tượng riêng như lá ổi và lá mận (giá trị IC50 của lá ổi và lá mận qua Mục 3.6 lần lượt là 24.99 g/mL và 22.25 g/mL) Kết quả này phù hợp với kết quả xác định hàm lượng polyphenol, flavonoid ở các Mục 3.7.1 và 3.7.2 Việc kết hợp giữa hai đối tượng nghiên cứu này giúp tăng ở cả hai hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase và kháng oxy hóa Mẫu kết hợp ổi- mận theo trường hợp lá ở tỷ lệ 1:1 có tiềm năng để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
Khảo sát khả năng loại tannin khỏi tổ hợp ổi- mận
Tannin là một hợp chất polyphenol có trong hầu hết tất cả các loài thực vật Bên cạnh những tác dụng có lợi như khả năng kháng oxy hóa mạnh, kháng khuẩn, chống ung thư hay giảm khả năng gây đột biến gen thì hàm lượng tannin nhiều có trong thực vật sẽ gây ra các bệnh lý nghiêm trọng [120] Ngày càng có nhiều nghiên cứu cho thấy tannin thủy phân có tác dụng phụ với con người và động vật [120, 121] Một số loại tannin như acid tannin với hàm lượng cao có thể gây độc tính tế bào, hoại tử gan, chán ăn, buồn nôn, tiêu chảy và đau đầu [121] Ngoài ra, với khối lượng phân tử lớn và đặc tính se da hay se niêm mạc, các thuốc điều trị cũng như mỹ phẩm chứa tannin sẽ khó thẩm thấu qua da hay làm rối loạn quá trình hấp thu thông qua đường uống
Tổ hợp ổi- mận ở kết hợp lá qua các nghiên cứu cùng với việc khảo sát giá trị TTE ở
Mục 3.7.3 cho kết quả hàm lượng tannin khá cao Mặc dù khả năng ức chế enzyme tyrosinase của kết hợp ổi- mận tốt nhưng với hàm lượng tannin cao có thể gây ra các tác dụng phụ không mong muốn Vì vậy, trong khuôn khổ đề tài này thực hiện quá
70 trình loại tannin khỏi tổ hợp ổi- mận bằng collagen để đạt được mẫu tối ưu về khả năng làm trắng da cũng như hạn chế các tác dụng phụ, và tăng khả năng ứng dụng vào các sản phẩm mỹ phẩm trong ngành công nghiệp làm đẹp
Theo nghiên cứu về phương pháp loại tannin của Xue-Oin và cộng sự, hàm lượng tannin được loại ra khỏi dịch chiết thực vật bị ảnh hưởng bởi thời gian hấp phụ và hàm lượng collagen [90] Vì vậy, cần thực hiện khảo sát ảnh hưởng của hai yếu tố này trong quá trình loại tannin Mục đích của việc khảo sát là nhằm lựa chọn được điều kiện tối ưu nhất tác động lên quá trình hấp phụ tannin mà vẫn giữ được khả năng ức chế enzyme tyrosinase
3.8.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình loại tannin
Thời gian là yếu tố có tác động đáng kể đến việc loại các hợp chất tannin có trong thực vật Thời gian ngắn thì collagen không thể hấp phụ tối đa được tannin, tuy nhiên, thời gian hấp phụ kéo dài sẽ làm cho mẫu dễ nhiễm các vi sinh vật do sử dụng dung môi cồn 90 o dẫn đến các hoạt chất sẽ bị biến tính theo thời gian Do đó, trong đề tài nghiên cứu này, chọn tiến hành khảo sát thời gian hấp phụ của collagen trong khoảng thời gian từ 6-48 giờ với hàm lượng collagen được cố định là 0.5 g Kết quả định lượng hàm lượng tannin, hàm lượng flavonoid và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của các mẫu sau loại tannin ở các thời gian khác nhau được thể hiện ở Hình
Hình 3.17 Ảnh hưởng của thời gian lên hàm lượng tannin, flavonoid và khả năng ức chế enzyme tyrosinase
Dựa vào kết quả biểu đồ Hình 3.17, cho thấy hàm lượng tannin sau khi loại ra khỏi thực vật giảm dần trong các khoảng thời gian từ 0-24 giờ Sau 24 giờ, hàm lượng tannin có trong thực vật giảm hơn 80% so với mẫu chưa loại tannin Tuy nhiên, khi tăng thời gian hấp phụ lên 36 giờ hay 48 giờ thì không có sự khác biệt nhiều về các giá trị TTE Các giá trị TTE ở ba mốc thời gian 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ lần lượt là 18.17; 19.73; 19.29 mg TAE/g cao Điều này có thể giải thích là do collagen sau một thời gian hấp phụ đã đạt đến trạng thái bão hòa, dù có tăng thời gian hấp phụ thì lượng tannin được loại ra khỏi thực vật vẫn không thay đổi
Như đề cập trước, phần lớn flavonoid là hợp chất có khả năng ức chế được enzyme tyrosinase nên việc khảo sát lại về hàm lượng là điều cần thiết Kết quả cho thấy giá trị TFE qua các mốc thời gian từ 0-24 giờ không có sự chênh lệch đáng kể về hàm lượng Riêng mẫu khi loại tannin ở 36 giờ cho thấy có giảm giá trị TTE khoảng 50 mg/g cao và mẫu 48 giờ giảm gấp 2 lần so với mẫu ở 24 giờ Nguyên nhân là do thời gian hấp phụ quá lâu, dung môi pha mẫu có nước là môi trường dễ nhiễm vi sinh vật làm cho các hợp chất có trong thực vật bị biến tính
Sau khi xác định các giá trị TTE và TFE, tiến hành thực nghiệm khảo sát khả năng ức chế enzyme tyrosinase Kết quả cho thấy có sự thay đổi giá trị IC50 của các mẫu ở các thời gian khác nhau Nhìn chung, hoạt tính sinh học của các mẫu sau khi loại tannin đều giảm so với ban đầu (IC50 = 172.07 g/mL) Ở các mẫu có thời gian hấp phụ từ 6-24 giờ vẫn cho hoạt tính khá cao và giảm khoảng 20-25% so với mẫu ổi- mận chưa loại tannin Riêng mẫu ổi- mận ở 36 giờ và 48 giờ qua khảo sát cho khả năng ức chế tyrosinase giảm khoảng 2 lần (trên 50%) so với mẫu ban đầu chưa loại tannin
Vì vậy, dựa vào kết quả xác định hàm lượng tannin đã loại cũng như hoạt tính làm trắng da có trong các mẫu thời gian từ 6-48 giờ thì mẫu cho kết quả tối ưu nhất tại 24 giờ trong quá trình loại tannin Qua đó, có thể thấy rằng việc thay đổi thời gian hấp phụ có tác động rất lớn đến hàm lượng tannin trong tổ hợp lá ổi- mận Do đó, chọn giá trị tại thời gian 24 giờ để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo
3.8.2 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng collagen đến quá trình loại tannin
Bên cạnh yếu tố thời gian, hàm lượng collagen cũng là tác nhân có ảnh hưởng quan trọng đến quá trình loại tannin có trong thực vật Với cùng một lượng thực vật, tùy thuộc vào hàm lượng tannin mà xác định được lượng collagen phù hợp Kết quả định lượng TTE, TFE và khả năng làm trắng da của các mẫu ở các hàm lượng collagen khác nhau được trình bày trong Hình 3.18.
Hình 3.18 Ảnh hưởng của hàm lượng collagen lên hàm lượng tannin, flavonoid và khả năng ức chế enzyme tyrosinase
Dựa vào Hình 3.18, cho thấy khi tăng hàm lượng collagen thì lượng tannin có trong tổ hợp ổi- mận giảm Trong đó, khi hấp phụ tannin bằng 0.25 g và 0.5 g collagen sẽ cho giá trị TTE lần lượt là 68.16 và 18.17 mg TAE/g cao Kết quả loại tannin giảm đến 70% khi chỉ tăng 0.25 g collagen trong thời gian hấp phụ 24 giờ Tuy nhiên, khi tăng hàm lượng collagen gấp đôi lên 1 g, hàm lượng TTE được loại so với mẫu 0.5 g có sự chệnh lệch không nhiều nhưng lại giảm hoạt tính so với các mẫu 0.25 g và 0.5 g collagen Việc tăng gấp đôi hàm lượng collagen nhưng kết quả loại tannin lại không có sự khác biệt đáng kể so với mẫu 0.5 g dẫn đến việc tốn kém kinh phí và nguyên liệu Đồng thời, hoạt tính sinh học bị giảm khoảng 50% so với mẫu chưa loại tannin nên lựa chọn mẫu 24h-0.5 g vừa loại tannin tốt nhất, vừa phù hợp với mục đích ban đầu của đề tài cho khả năng làm trắng da
Như vậy, qua quá trình khảo sát khả năng kết hợp của ba loài thực vật ổi, mận, trà xanh thì các mẫu cao kết hợp lá cho khả năng ức chế enzyme tyrosinase cũng như khả năng kháng oxy hóa tốt hơn các mẫu kết hợp cao Trong đó, mẫu ổi- mận 1:1 khi
74 kết hợp lá cho hàm lượng polyphenol, flavonoid cao hơn so với hai đối tượng nghiên cứu ban đầu nên hoạt tính sinh học tăng Phần trăm ức chế enzyme tyrosinase của mẫu ổi- mận cho giá trị IC50 = 172.07 g/mL Tại nồng độ 10 g/mL, mẫu này cũng cho giá trị I% kháng oxy hóa lớn hơn 80% Đây là mẫu tiềm năng có thể ứng dụng vào trong lĩnh vực mỹ phẩm hoặc định hướng thực hiện các nghiên cứu tiếp theo như phân lập, tối ưu hoạt tính Bên cạnh đó, việc loại bỏ hàm lượng tannin bằng collagen có trong dịch chiết lá ổi- mận còn giúp giảm các ảnh hưởng tiêu cực mà hợp chất này mang lại Từ kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của các điều kiện hấp phụ đến hàm lượng tannin đã xác định được điều kiện thích hợp để giá trị TTE hay giá trị IC50 ức chế enzyme tyrosinasecủa kết hợp ổi- mận đạt tối ưu là: thời gian hấp phụ 24 giờ với hàm lượng collagen 0.5 g Mẫu cao tối ưu này được đánh giá có hoạt tính làm trắng da khá tốt với hàm lượng tannin, flavonoid và nồng độ ức chế 50% của enzyme tyrosinase lần lượt là 18.17 mg TAE/g cao; 294.06 mg QUE/g cao và 252.01 g/mL