Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Khảo sát khả năng ức chế trực khuẩn mủ xanh và tụ cầu vàng của Bacillus Subtilis

Hai chủng vi khuẩn này tuy không có bảo tửnhưng có khả năng tôn tai và thích ứng rất cao với điều kiện khắc nghiệt của môi trường.Do đó, việc sử dụng kháng sinh phố kháng khuẩn rộng thiế

TRUONG DAI HOC BACH KHOA

KHAO SAT KHẢ NANG UC CHE |

TRUC KHUAN MU XANH VA TU CAU VANG

CUA BACILLUS SUBTILIS

CHUYEN NGANH: CONG NGHỆ SINH HỌC

MA NGANH: 604280

LUAN VAN THAC SI

TP HO CHI MINH, THANG 09 NAM 2012

CHƯƠNG 1 — MO ĐẦU s°-s°©+es©SveseEErSeEsrxseorsseesrseetreserie 11.1 DAT VAN 11.2 MỤC TIỂU CUA DE TT À Ì - << %6 9% 9 9# E9 99299 2 0563992 21.3 Ý NGHĨA CUA DE TAL 2< s©EesE+xeEEYH99222A999730E27A9xerseorrxeeorred 21.3.1 Ý nghĩa khoa học 5° s5 €9 E94 Em g2 sex cssree 21.3.2 Y nghia thre té 7 an - ÔỎ 2

CHUONG 2 — TONG QUAN TÀI LIỆU 2- < 5-2 se se<ese 3

2.1 CÁC DOT TƯỢNG VI SINH VỆẬTT 2 ° <5 % 6% 9S 999992 eese 3

2.1.1 PSCUAOMONAS ACTUGINOSA co 5S S0 993 8 9 06 0994.099094 18804 06.08094008904969868990608004.008686 3PÁ VẤN 7/1/2022 00/0 01700866 ee 421.3 P(CHHÏHS SHĐẨÍÏIS co G55 S5 5 9 Họ ịg TH TH lọ 0.0 00.0 0000000000 5

2.2 TINH CHAT GAY BỆNH, XÉT NGHIỆM CAN LAM SANG VÀ DIEU TRINHIEM KHUAN DO TRUC KHUAN MU XANH VA TU CÂU VANG 62.2.1 Nhiém khuẩn MU xanh do PSCUAOMONAS GFHĐIH(OS( ceesG G5 sS 5665536 5556956656996 6

2.2.1.1 Tính chát SGV ĐỆHH S ete cee S1 k1 1110111 H111 k kg KH vn HH 62.2.1.2 Xét nghiệm cận IAM SÀHg che 72.2.1.3 Điêu trị nhiém [4/1//47/8//1/®12//1/NEEER NI TH aẶAẼšẼ 7

2.2.2 Nhiém khuan MU vàng do SLAPNVLOCOCCUS AUTCUS crrscccsssrrcssrssccsrrssccsssscsssseccssecccees 8

2.2.2.1 Tính chát SGV ĐỆHÌH - cece cee ce 1 v1 1k1 eee 111 11111111 11111 k v1 KH kg kg nh ổ2.2.2.2 Xét nghiệm cận LAM SÀHg, cành HH ổ

2.2.2.3 Dieu trị nhiễm khuẩn MU VÀNG - - - t TT EE TT E1 HE 11 tre ổ2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP DIEU TRI NHIÊM KHUAN -5- 5-5 <<<s 92.3.1 Điều trị bang kháng sinh «sec ng 0001011 se 9

2.3.1.1 Phán loại thuôc kháng SIHHHH ác ch k k1 v11 111111111111 K19 111 1k1 kg 10

2.3.1.2 Co ché đê khang kháng sinh của Vì kÏMẨN cằ-cccằcseeeteereeterietirerieerrie 11

2.3.2 Điều trị bang vaccine và huyét (hanhh <5 5s 9S 9.9906 9.9864 98896666666666666 12DBD 1D VACCING 1n a.HA4ẠO CEA GEE EE EEE EESG EEE EEaaEEEeEEEEES 122.3.2.2 AULO-VACCING — 132.3.2.3 Huyêt thanh (kháng huyệt thanh) , erie ieee senses 142.3.3 Phương pháp dùng vi sinh vat ức ChE -«ceseeeerererrrrrerrree 142.3.3.1 Tác động kháng KhUÂẲH ăcsằsìnnhnhhhhhHhthhhhhhhHhhhhhrrie 142.3.3.2 TAC AGG MIEN ICN n6 ốee I5

2.3.3.3 Tác động đến vi khuẩn đường rUGkeccecceccccecceccescsvsscsvssessesessvesesvssesssessvesssvesesessneseeees 15

2.3.3.4 Tac động kha năng '0)257/1181/17 iRRRRRRRRRREEEẽẽK 15

2.5 NGHIÊN CUU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VE HUONG CUA DE TÀI 22CHƯƠNG 3 — NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2-2-2 sssessesse 243.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 22s seE+v+eE9EYeErrSeeovrteotrkeeptrkesedie 243.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU s°- s°e<©+vxsserersteotrxeeetrrssere 243.3 DIA DIEM VÀ TRANG THIET BỊ PHỤC VU DE TÀI NGHIÊN CỨU 243.3.1 Địa điểm thực hiện để tài nghiên cứu . cccceeceeevveeeeveersarerree 24

3.3.2 Trang thiét bị phục vụ công tác nghiÊn CỨU - - 0 55 Ă S52 << S5 6196956569566 24

3.4 THIẾT KE THỰC NGHIEM NỘI DUNG I 2 5-5 55s se se ss=ssssss 253.4.1 Chuan bị giống gốc thuần ChỦng - series tre 26

3.4.2 Hoạt hóa, tang sinh khao sát đặc điểm sinh lý và lưu giữ các chung giông 263.4.3 Thứ nghiệm kha năng ỨC C Ề 0G G5 < S9 99 96986 9990.9948 99958089560664.666 263.4.4 Xác định các điêu kiện tôi ưu cho quá trình ức chêÊ s s<s<<s 273.4.4.1 Ty lệ đôi kháng ¬ ÔÒ 273.4.4.2 Lựa chọn thời diém thích hợp đê ket thúc quá trình ức Chê 263.4.4.3 Xác định PH tO1 HFHM nen reece HH HH HH Ha ha 263.4.4.4 Xdc Airh nhiet AG tOT 1n NtnnnáaaA 28

3.5 THIET KE THUC NGHIEM NỘI DUNG 2 - 5 5-5 55s s9 se ssesessss 293.5.1 Thu thập va tang sinh mẫu -‹«°sssseersveesstertrrestetrrrrsseernrrsee 29

3.5.2.1 Thu thập mau ¬—— a eeees acess eeeeeeseeseecseeeeseeeeseeesaeeesueecseseecseecsseeceseeesseeeeaeeseeeensaes 29SA nL.4./10 na n6 neẽaaajlj4Ụ 293.5.2 Thử kháng sinh đồ băng phương pháp đĩa kháng sinh 303.5.3 Thứ nghiệm khả năng ức chế trực khuẩn mủ xanh và tụ cầu vàng 30

3.5.3.1 Chuẩn bị đĩa giấy lọc tâm ƒ2///2///20/22/// 000000000004 Ngự 30

3.5.3.2 The nghiệm tec chê trên bệnh DhẲHH ác - 1E 1v E1 1199 1119 1 1111111111111 ky ch 30

CHƯƠNG 4 — KET QUÁ NGHIÊN CỨU - se ss<ssseessse 314.1 DAC DIEM SINH LY CUA CAC CHUNG GIÓNG NGHIÊN CỨU 31

4.1.1 Bacillus subtilis BK 1 (Ký hiệu BS Í) 0c G 99 0 9058065894556 314.1.2 Bacillus subtilis BK 2 (Ký hiệu BS2) ccsccssssssessscccssssssssccccssssscssceccsssscssecccensssseseenee 33

4.1.3 Bacillus subtilis BK 3 (Ký hiệu BS) Go G00 n0 08 806066866656 344.1.4 Bacillus subtilis VTCC 254 (Ký hiệu B4) co S9 S19956686556566 666 354.1.5 Bacillus subtilis AS 162 (Ký hiệu BSS) c 0 HH HH H40908686608866 656 364.1.6 Staphylococcus aureus HV 1 (KY hiệu SÁ Í) 0G Go G5006 906186665866 656 374.1.7 Pseudomonas aeruginosa BD 1 (Ký hiệu PA Í) G05 55956 569565865656 38

4.2 TUYẾN CHỌN CHUNG BACCILUS SUBTILIS TOI UU CHO QUA TRÌNH

e0 39

4.2.1 Ức chế tụ cầu VÀNG - con HH HA T00000000040001004000000010000000000000n0 394.2.2 Uc chế trực khuẩn mủ xanh -s<<5cessssrreseterxesetsrrrtsrrsersrrnnrrrsrie 404.2.3 Đôi tượng được tuyên ChỌI << G9 0.990.080.090 0006 6.048669408 69408604056 414.3 CÁC DIEU KIỆN TOI UU CHO QUÁ TRINH UC CHE TU CÂU VÀNG 42

4.3.1 Xác định ty lệ doi kháng BS4:SA1 — 42

4.3.2 Xác định thời điêm ket thúc quá trình ức chê -«e-«eeeeee 434.3.3 Xác định pH tôi ưu cho quá trình ức chê tụ cau MU 444.3.4 Xác định nhiệt độ tôi ưu cho quá trình ức chê ty cầu vàng - 45

4.3.5 Nhận xét chung về các điều kiện tôi ưu ức chê tụ cầu vàng - « s<«- 464.4 CÁC DIEU KIEN TOI UU CHO QUA TRÌNH UC CHE TRỰC KHUAN MUbì: 47

4.4.1 Xác định ty lệ doi kháng BS4:PAI — ` 47

4.4.2 Xác định thời điềm kêt thúc quá trình ức chê trực khuan mủ xanh 48

4.4.3 Xác định pH tôi ưu cho quá trình ức chê trực khuân mu xanh 49

4.4.4 Xác định nhiệt độ tôi ưu cho quá trình ức chê (rực khuân mu xanh 50

4.4.5 Nhận xét chung về các điều kiện thích hợp ức chê trực khuan mủ xanh 51

4.5 KET QUA KHANG SINH ĐỎ VÀ THU NGHIỆM ỨC CHE 52

4.5.1 Kết quá kháng sinh đỗ và thứ nghiệm ức chế tụ cầu vàng 52

4.5.2 Két qua kháng sinh đô va thứ nghiệm ức chê trực khuân mu xanh 53

4.5.3 Nhận xét về kêt qua khang sinh đồ va thir nghiệm ức chê < 55

CHƯƠNG 5 — KET LUẬN 2-2 s° 2s se se se eesesessesssee 56

5.1 NHỮNG KET QUA DAT ĐỢC 2-5 5° ° S5 62 92s 4 9 s2 ecveSz 565.2 NHUNG MAT HAN CHE VA DE NGHỊ, 2 <2 2s S9 s9 sssses 57

TÀI LIEU THAM KHAO .csssccsssccssscsssscsssscsssccsssscsssccsscscssccsssccenseccsscesssces vii

PHU LUC Ï G5555 5< S 9 5 9999 0 66 9.96 999988906 06 0089988999990066668999996.66 XPHU LUC 2 <2 << <€©S®£€©#€EEE€EEE£€EESeEE2EEEdeEEAeEEcEEeCEseervseered xviiiPHU LUC Š o5 G G G5 5 SG 9 S0 0 990906 996.0668800 96080988999990066666666 xxIH

DANH MỤC BANG

Bảng 2.1 Các hợp chat kháng khuẩn được tổng hợp băng Ribosome [24] 19Bang 2.2 Các hợp chất kháng khuẩn không được tông hợp băng Ribosome [15] 20Bang 2.3 Các hợp chat kháng khuân khác [20] - 2 xc22EEE+EE2EEEEEEtEEsEsrrerkerek 21Bang 4.1 Đường kính vòng vô khuẩn (mm) của 5 chủng B subtilis đối với tụ cầu vàng 39Bang 4.2 Đường kính vòng vô khuẩn (mm) của 5 chủng B subtilis đối với trực khuẩn mủ

0 40

Bang 4.3 Ty lệ đối kháng BS4:SAL_ 5c cTt E275 xe re ướ 42Bang 4.4 Thời gian ức chế tụ cầu vàng -. - 5: sc x 22111211111 E21 TEEErErrrrrreerree 44Bảng 4.5 pH ức chế tụ câu Vang i-5c 5c 2 SE EEEEE2102121111 1111 12x TEE tre 45Bảng 4.6 Nhiệt độ ức chế tụ cầu VỀH Q.Q Q20 0Q nHn SH HS TH HT TT TH TK TH KH Hky 46Bang 4.7 Tỷ lệ đối kháng BS4:PAL occ ccccccccccccsesscsscsesevsessesecevesvessscecsusevsevevsecsuseveneeeee 48Bang 4.8 Thời gian ức chế trực khuẩn mủ xanh: 2-2225 EE£EE2EEEEEEtEESErrerkerek 49Bang 4.9 pH ức chế trực khuẩn mủ xanh - s: 2x 2EEEEEEEEEEEESEE2EEEEEEtEESErrrrkerrek 49Bảng 4.10 Nhiệt độ ức chế trực khuẩn mủ xanh - SE E155 1551551511555 1255E 551tr 50Bang 4.11 Kết qua kháng sinh đô và thử nghiệm ức chế tụ cầu vàng 52Bang 4.12 Kết qua kháng sinh đô và thử nghiệm ức chế trực khuẩn mủ xanh 54

DANH MUC HINH

Hình 2.1 Hình ảnh vi thé Pseudomonas aeruginosa [29] :ccccxcccccEsrkerersrrersree 3Hình 2.2 Hình ảnh vi thé Staphylococcus aureus [30] ciccccccsccccsccsssscssessssesstssestsseseseveseeeseee 4Hình 2.3 Hình ảnh vi thé Bacillus subtilis [28] 5à: 5c 5 2122 E1 E2 1t tren 5

gây bệnh [13] - - - 122 212211211211 151 15112111511 15311 111111111 11111 H1 H1 H1 H1 kg TH HH Hưng 15

Hình 2.5 Màng sinh học của B subtilis NCBI 3610 (trái), B subtilis 168 (phải) 17

Hình 2.6 Sự hình thành nội bào tử của tế bào Bacillus subtilis [21] .scccccscc 18Hình 3.1 Sơ đồ thực nghiệm nội dung Ï - - 2c 5-22 222213 232 E3 ssrkkserksee 25Hình 3.2 Sơ đô thiết kế thực nghiệm nội dung 2 + + 2x22 ESEE2EEEEEEtEEEEErErrkerxee 29Hình 4.1 B subtilis BK 1: (1) vi thể , (2) đại thé, (3) canh khuẩn s5 31Hình 4.2 Đô thị đường cong sinh trưởng của chủng Bacillus subtilis BK T 32

Hình 4.3 B subtilis BK 2: (1) vi thể , (2) đại thé, (3) canh khuẩn s5 33Hình 4.4 Đô thị đường cong sinh trưởng của chủng Bacillus subtilis BK 2 33

Hình 4.5 B subtilis BK 3: (1) vi thể , (2) đại thé, (3) canh khuẩn s5 34Hình 4.6 D6 thị đường cong sinh trưởng của chủng Bacillus subtilis BK 3 34

Hình 4.7 B subtilis VTCC 254: (1) vi thé , (2) đại thé, (3) canh khuẩn 35

Hình 4.8 Đô thị đường cong sinh trưởng của chủng Bacillus subtilis VTCC 254 35

Hình 4.9 B subtilis AS 162: (1) vi thể , (2) đại thé, (3) canh khuẩn 36

Hình 4.10 Đô thị đường cong sinh trưởng của chủng Bacillus subtilis AS 162 36

Hình 4.11 Staphylococcus aureus HV 1: (1) vi thể , (2) đại thé, (3) canh khuẩn 37

Hình 4.12 Đô thị đường cong sinh trưởng của chủng S aureus HV 1 37

Hình 4.13 Pseudomonas aeruginosa BD 1: (1) vi thé , (2) đại thể, (3) canh khuẩn 38

Hình 4.14 Đô thị đường cong sinh trưởng của chủng P aeruginosa BD L 38

Hình 4.15 Đường kính vòng vô khuẩn của 5 chủng B subtilis đối với tụ cau vàng 40

Hình 4.16 Đường kính vòng vô khuẩn của 5 chúng B subtilis đối với vi khuẩn mủ xanh¬— 41

Hình 4.17 D6 thị biểu diễn ty lệ đối kháng BS4:SALL 25:5: 5E EcxtrvsEsererrerrek 42Hình 4.18 D6 thị biểu diễn thời gian ức chế tụ cầu vàng . 5:cccccsrsrxerxec 43Hình 4.19 D6 thị biểu diễn pH ức chế tụ cầu vàng - 5:5: St ccreEtzEtrsErrerrerrek 44Hình 4.20 Đô thị biểu diễn nhiệt độ ức chế tụ cầu vàng - 5c cccscxrvsEsercrxerrek 45Hình 4.21 Một số hình ảnh ức chế tụ cầu VANS Ặ Q2 Q22 QQ 2H HH HH nhe 46Hình 4.22 Đô thị biểu diễn ty lệ đối kháng BS4:PALL 52525: reEczEtExsEsrrerrerrek 47

Hình 4.23 Đô thi biểu diễn thời gian ức chế trực khuẩn mủ xanh -s- s5 48Hình 4.24 Đô thị biểu diễn pH ức chế trực khuẩn mủ xanh s- s+zs+zzzxzzsrx 49Hình 4.25 Đồ thị biểu diễn nhiệt độ ức chế trực khuẩn mủ xanh 49Hình 4.26 Một số hình ảnh ức chế trực khuẩn mủ xanh : 22:52:22 51Hình 4.27 Đô thị biểu diễn kết quả khang sinh đồ và thử nghiệm ức chế tụ cầu vàng 53Hình 4.28 D6 thị biểu diễn kết quả kháng sinh đô và thử nghiệm ức chế trực khuẩn mủ

0 54

Hình 4.29 Dia khang sinh đồ và thử nghiệm ức chế: (1) tu cầu vàng, (2) trực khuẩn mủ

0 55

DANH MUC CHU VIET TAT

CFU/ml : đơn vị tế bao vi sinh vật trong 1 ml

BSI ky hiệu chung Bacillus subtilis BK 1BS2 ky hiệu chung Bacillus subtilis BK 2BS3 ky hiệu chung Bacillus subtilis BK 3BS4 ky hiệu chung Bacillus subtilis VTCC 254BSS ky hiệu chung Bacillus subtilis AS 162SAI ky hiệu chung Staphylococcus aureus HV 1PAI ky hiệu chung Pseudomonas aeruginosa BD 1MRSA Methicillin — resistant Staphylococcus aureusMSSA Methicillin — sensitive Staphylococcus aureusCLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

1.1 ĐẶT VAN DEViệt Nam là một nước nhiệt đới gió mùa, rất thuận lợi cho các đối tượng vi sinh vật gâybệnh tổn tại, phát triển Mặt khác, việc kiểm soát nhiễm khuẩn ở Việt Nam khá lỏng lẻo,chưa đồng bộ cộng với tập quán sử dụng kháng sinh thiếu hiểu biết của người dân đã tạora những chủng vi khuẩn đột biến, đa kháng thuốc Trong đó, hai điển hình vi sinh vật đakháng thuốc nguy hiểm nhất hiện nay 1a trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa)va tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) Hai chủng vi khuẩn này tuy không có bảo tửnhưng có khả năng tôn tai và thích ứng rất cao với điều kiện khắc nghiệt của môi trường.Do đó, việc sử dụng kháng sinh phố kháng khuẩn rộng thiếu kiểm soát làm cho chúngbiến chủng và có khả năng dé kháng với hau hết các kháng sinh họ B-lactamins vaCephalosporins thế hệ I va II Thêm vào đó, công tác chống nhiễm khuẩn trong các bệnhviện không thực sự tốt giúp cho các đối tượng nay tôn tai được trong điều kiện cực đoanvà ngày càng độc hơn với cái tên “vi trùng bệnh viện”; là nỗi ám ảnh của các bệnh nhâncó thời gian điều trị nội trú dài trên một tháng.

Việc điều trị nhiễm trùng mủ xanh và tụ cầu vàng rất khó khăn và tốn kém Hầu hếtbệnh nhân có kết quả xét nghiệm dương tính với Pseudomonas aeruginosa đều được điềutrị tích cực băng kết hợp giữa một kháng sinh ho Penicillin và một kháng sinh hoAminoglycoside Đối voi tụ cầu vàng kháng Methicillin (Methicillin resistantStaphylococcus aureus, gọi tat là MRSA) thì trị liệu băng Vancomycin liều cao ngay từđâu là lựa chọn can thiết Tuy nhiên, việc điều tri không phải lúc nào cũng thành công.Một số trường hợp bệnh nhân tử vong do ba nguyên nhân sau: thứ nhất, việc điều trịkhông tích cực ngay từ đầu làm cho vi khuẩn biến dị đa kháng thuốc; thứ hai, đường xâmnhập của vi khuẩn (nhiễm trùng máu hay viêm màng não); thứ ba, sức dé kháng của bệnhnhân yếu dẫn đến nhiễm trùng cơ hội

Ở nguyên nhân thứ nhất, vi khuẩn có thé biến dị thành nhiều hon một type tổn tại songsong và truyền khả năng kháng thuốc qua lại lẫn nhau dẫn đến việc điều trị đi vào bé tắc

và tính mạng bệnh nhân bi đe dọa.

khác ứng dụng vi sinh vat ức chế cạnh tranh lẫn nhau để loại bỏ đối tượng vi sinh vật gâybệnh Trong điều kiện nhất định, vi sinh vật muốn tôn tại và phát triển phải có cơ chế ứcchế (sản xuất các chất kháng khuẩn, chat nhảy, các sản phẩm trao đồi chất bậc hai) và cơchế lân at (cạnh tranh vị trí bám, khả năng tăng trưởng, khả năng chuyển hóa và hấp thụchất dinh dưỡng) đối với các đối tượng vi sinh vật khác Các nghiên cứu cơ bản về lýthuyết ức chế cạnh tranh giữa các vi sinh vật đã tạo tiền dé cho dé tài này.

Trong luận van, chúng tôi chỉ dừng lại ở giai đoạn “Khảo sát kha năng ức chế trựckhuẩn mủ xanh và tụ cầu vàng của Bacillus subtilis”, làm tiền đề khả nang ứng dụngphương pháp điều trị nay vào lâm sàng

1.2 MỤC TIỂU CUA DE TÀI

của Bacillus subtilis.

- Xác định được các điều kiện tối ưu cho quá trình ức chế.- Dự đoán được tính khả thi của quá trình ức chế và tiền thử nghiệm cận lâm sàng.1.3.2 Y nghĩa thực tế

Đề tài có quy mô nhỏ về nhân lực và điều kiện thực nghiệm; tuy nhiên phạm vi ứngdụng của dé tài là rat lớn (không dé cập đến ứng dụng probiotic của Bacillus subtilis):

- Mở ra hướng điều trị bệnh nhiễm không dùng kháng sinh đã bị bỏ ngỏ từ thập niên1950 đến nay

- Khả năng ứng dụng vảo các sản phẩm y tế: băng gạc (medical gauze) có tâm các sảnphẩm trao đối chat của Bacillus subtilis trong điều trị vết thương ngoài da, điều trị mun

2.1 CAC DOI TUQNG VI SINH VAT

Ngành: Proteobacteria LỆ Vev ip Sex , (v29 “Vị kXPRED cog 's r 4w ¬ Š xi M vt ` ^

Lớp: G Proteobacter1 h H227 Se V2 v4} Op: amma Proteobacteria 2sù¿ Pa mee The LB ew 2“c CÁ Xư! ‘

Chi: | Pseudomonas Cot nw Ae FT ae |

ng cứ TƯỜNG: Yale y ¿ Rye wy (

Loài Pseudomonas aeruginosa ‘4% Tela So i :Z “~~ ì = si VE # ‘ , £ 10 '

; Tv rir TA rào Hy đế

a * ALOT Xã v ivy xế 6 3Hinh 2.1 Hinh anh vi thé Pseudomonas aeruginosa [29]Pseudomonas aeruginosa gây bệnh cho người là những trực khuẩn Gram âm, thườngsống ở những nơi âm ướt như dat, nước, cây cối, kế cả trong bệnh viện Trên cơ théngười, vi khuẩn này thường sống ở vùng da 4m, một số cộng sinh ở đường tiêu hóa (đượcphân lập trong khoảng 1/10 phân người bình thường) Ngoài ra, còn được tìm thấy trongcác dung dịch nhỏ mắt, mỹ phẩm, dung dịch Phenol loãng, Benzalkinium chloride, xảbông nước Hexachlorophene, kem, nước căm hoa, bổn tắm, máy hút âm, máy thông khí,các vật dụng băng vải ở bệnh viện, trong các túi máu, huyết tương nhiễm khuẩn ở ngân

hang mau, [29]

2.1.1.1 Đặc điểm hình tháiPseudomonas aeruginosa là những trực khuẩn Gram âm, thang hay hơi cong: có khảnăng di động nhờ một hay hai tiên mao ở một đâu Kích thước 0,6x2,0 um; tuy nhiên,hình dang và kích thước của vi khuẩn có thé thay đôi trong lứa cấy gia [27]

Pseudomonas aeruginosa mọc dễ trên các môi trường thông thường, hiếu khí tuyệt đồi.Lứa cấy tỏa ra mùi thơm nhẹ giống như mùi nho khô, tăng trưởng tốt ở 35-42°C.

Trên môi trường đặc, khóm vi khuẩn mọc det hay hơi lôi, biên không đều, có khuynh

hướng mọc tràn, đặc biệt trên thạch dinh dưỡng hay Trypticase soy agar Trên thạch máu,

đa số cho tiêu huyết Bêta Trên thạch MC hay EMB, khóm vi khuẩn không màu do khônglên men Lactose Trong môi trường lỏng, vi khuẩn mọc làm đục va tạo một lớp vángmỏng trên bề mặt môi trường

Pseudomonas aeruginosa có thé tiết ra bỗn loại sắc tố là: Pyocyanin (màu xanh lá cây

không phát huỳnh quang), Pyoverdin (màu xanh lá cây phát huỳnh quang dưới tia cực tim,

còn gọi là Flourescent), Pyorubin (màu đỏ sam) và Pyomelanine (màu nâu đen) Trong đó,Pyocyanin là màu sac đặc trưng của vi khuẩn, có khả năng khuếch tán vao môi trường làm

cho môi trường có màu xanh lục.

2.1.1.3 Tỉnh chất sinh hóa

- Không có khả năng lên men các loại đường: Glucose (-), Lactose (-), Sucrose (-),Maltose (-), Mannitol (-) Chỉ có khả năng oxy hóa đường Glucose.

- Nitrate (+), Citrate (+), Urease (+), Indol (-) Di động (+).

- Oxidase (+), Catalase (+): đây là 2 tính chất sinh hóa quan trọng xác định vi khuẩn mủ

xanh [11]2.1.2 Staphylococcus aureus

Gidi: BacteriaNganh: FirmicutesLop: BacilliBộ: Bacillales

Ho: StaphylococceaeChi: Staphylococcus

Loài: Staphylococcus aureus

Hinh 2.2 Hinh anh vi thé Staphylococcus aureus [30]

1878 Đến năm 1884, Louis Pasteur và F Rosenbach nghiên cứu ti mi va phân loại Š.

aureus thuộc hàng Eubacferiales, họ Micrococcaceae, dong Staphylococcus S aureus CÓ

thé tồn tại trong không khí, bụi từ 50-100 ngày Do đó, chúng là vi trùng bệnh viện rấtthường gặp trong bông, gạc ban, khăn trải giường, ngay cả trên các mặt băng và thiết bị ytế nêu không được vệ sinh và khử trùng kỹ càng Chúng lây lan và thường khu trú trongnang lông của người và động vật, chúng chịu được nhiệt độ rất cực đoan từ 0-70°C, pH 3-8 Gặp điều kiện thuận loi, chúng gây 6 mủ gây viêm nang lông, áp-xe da, [30]

2.1.2.1 Đặc điểm hình tháiStaphylococcus aureus là vi khuân Gram dương có dạng hình cầu, đường kính 1,0-1,5

um, sắp xếp không có thứ tự nhất định, thường tụ lại thành từng đám giống chùm nho S

aureus không di động, không có bào tử, một số chủng có vỏ capsule.2.1.2.2 Đặc điểm nuôi cấy

Staphylococcus aureus mọc dé dàng trên hầu hết các loại môi trường, trong điều kiệnhiểu khí, vi hiểu khí và ky khí tùy nghi Nhiệt độ thích hợp nhất là 37°C và pH = 7,2-7,4

Trên môi trường đặc, S.aqureus mọc thành khóm màu vàng Trên thạch máu, S aureus

mọc khóm trơn, lôi, đường kính 1-4 mm và gây tan máu.2.1.2.3 Tỉnh chất sinh hóa

- Lên men đường: Glucose (+), Sucrose (+), Lactose (+), Maltose (+), Mannitol (+).- Catalase (+), Coagulase (+), Ornithine decarboxylase (-), Urease (-) [11].

2.1.3 Bacillus subtilisGidi: BacteriaNgành: FirmicutesLop: BacilliBộ: Bacillales

Ho: BacillaceaeChi: Bacillus

Loai: Bacillus subtilis

subtilis, đến năm 1872, Ferdinand Cohn chính thức đặt tên vi khuẩn nay là Bacillussubtilis Năm 1949-1950, Kenry Albot đã phân lập được chúng thuần Trong những nămthập niên 1950, được ứng dụng trong dược phẩm nhờ khả năng kích thích miễn dịch và

tiêu hóa [28].

2.1.3.1 Đặc điểm hình tháiBacillus subtilis thuộc họ Bacillaceae là trực khuẩn gram dương, hình dạng có 2 dautròn; có khả năng sản sinh bảo tử trong điều kiện môi trường cực đoan

2.1.3.2 Đặc điểm nuôi cấyBacillus subtilis là vi khuân hiéu khí tùy tiện (trước đây Bacillus subtilis được xếp vàoloại vi khuẩn hiếu khí bat buộc) và có nhiều đặc tính ưu việt, đặc biệt là khả năng chịunhiệt tốt, có thé tổn tại ở dạng bào tử ở nhiệt độ 52°C Bacillus subtilis có thé tồn tại trongkhoảng pH rộng từ pH = 2.5 đến pH = 6.5 [3]

2.1.3.3 Tinh chất sinh hóa

- Lên men đường: Glucose (+), Sucrose (+), Maltose (+), Mannitol (+), Lactose (-).- Citrate (+), VP (+), Indol (+), Di động (+).

2.2 TINH CHAT GAY BENH, XET NGHIEM CAN LAM SANG VA DIEU TRINHIÊM KHUAN DO TRUC KHUAN MU XANH VA TU CÂU VÀNG

2.2.1 Nhiễm khuẩn mủ xanh do Pseudomonas aeruginosa2.2.1.1 Tính chất gây bệnh

Pseudomonas aeruginosa gây nhiễm trùng sinh mủ có màu xanh ở nhiều nơi trong cơ

thể như: lỗ tai, mắt, vết thương, vết bỏng, đường tiểu, đường hô hấp, dich não tủy va mau,

Từ 6 nhiễm khuẩn đầu tiên, vi khuẩn có thé lan tran vào các mô sâu Pseudomonasaeruginosa gây bệnh bang cách tiết nhiều loại men như: Hemolysin, Lipase,Deoxyribosenuclase, và độc tố như: độc tố ruột, nội độc to Chung chi gay bénh khigap cac diéu kién sau:

- Sức dé khang của co thé suy giảm- Niém mac va da bị tổn thuong

- Su dung Corticoid lau ngay

địch não tủy, mở khí quản, chích thuốc, nhé rang, - Hóa trị, xa trị lam giảm miễn dich của cơ thé tao điều kiện cho nhiễm trùng cơ hội.- Lam dụng kháng sinh tiêu diệt các vi khuẩn cộng sinh trong đường ruột.

Ngày nay, Pseudomonas aeruginosa được xem là tác nhân gây nhiễm trùng ở nhữngbệnh nhân năm viện lâu ngày (bệnh nhiễm khuẩn ở bệnh viện mặc phải) Nhiễm khuẩn doPseudomonas aeruginosa ngày càng trầm trong và khó chữa do sự kháng thuốc rất mạnhcủa vi khuan này đối với nhiều lọai kháng sinh [34]

2.2.1.2 Xét nghiệm cán lâm sàng

Chân đoán nhiễm trùng do Pseudomonas aeruginosa, cần tiễn hành 4 bước xét nghiệm:- Lay mẫu bệnh phẩm: tùy theo bệnh hay vi trí vết thương, bệnh phẩm có thé là: mủ, vếtbỏng, đàm, máu, dịch não tùy, nước tiểu,

- Nhuộm Gram: trực khuẩn Gram âm- Nuôi cấy: phân lập trên các môi trường: BA, MC, EMB Khảo sát đặc tính lứa cấy sauủ 24 giờ, ở 37°C: khóm điển hình màu xanh lục, bờ không đều và mọc lan ra, có mùi nho

loại kháng sinh thuộc ho Penicillin (Piperacillin/Tazobactam, Ticarcillin, Carbenicillin)với một loại kháng sinh thộc ho Aminoglycoside (Gentamycin, Tobramycine, Amikacin).

Ngoài ra, có thé dùng các Cephalosporins thế hệ mới như: Ceftazidime, Ceftriaxone,

Imipenem/Cilastatin hoặc một loại khang sinh thuộc họ Quinolone là Ciprofloxacin [23].

2.2.2.1 Tính chất gây bệnhTu cầu khuẩn xâm nhập vào cơ thé người qua da và niêm mạc băng giọt nước bọt và bụitrong không khí Khoảng 40-50% người có tụ cầu vàng cộng sinh ở mũi Khả năng gâybệnh của S aureus là sản xuất các chat ngoại bảo và tính chất lắn at của vi khuẩn.

Dang sang thương ban dau thường là nhọt hay những áp-xe khu trú Sự xâm nhập của S.aureus vào nang lông làm da bị hoại tử Coagulase được tiết ra làm đông sợi huyết tương,tạo một vách bao quanh sang thương và giới hạn quá trình tiễn triển của sang thương.Vách được củng cố bởi tế bào viêm và cuối cùng là mô sợi Sau đó phan giữa sẽ hóa longdo bị hoại tử, còn gọi là sự nung mủ Nếu vách bị phá vỡ trước khi sang thương hóa mủ sẽtạo điều kiện cho vi khuẩn lan đi nhanh hơn, bệnh sẽ tiến triển nặng, đặc biệt là mụn nhọtở mặt Từ 6 nhiễm, vi khuẩn có thé thâm nhập theo đường bạch huyết vào máu gây nhiễmtrùng huyết Hay vi khuẩn theo đường bạch huyết đi đến và khu trú tại các cơ quan gâyviêm phổi, viêm cơ tim, viêm thận, viêm màng não, viêm khớp xương, [31]

- Làm các test sinh hóa dé định danh vi khuẩn: Catalase (+), Coagulase (+), Glucose (+),

Mannitol (+), Urease (+), Ornithine decarboxylase (-) [7].

2.2.2.3 Diéu trị nhiễm khuẩn mủ vàngĐiêu trị chủ yếu là sử dụng kháng sinh Tuy nhiên, S aureus có khả năng dé khángkháng sinh rat mạnh, đặc biệt đối với nhóm Penicillin Vì vậy việc điều trị cần tham khảokết qua kháng sinh đồ mới có kết quả Đối với áp-xe và những sang thương kín có mủ,điều can thiết nhất là phải dẫn lưu mt, bởi vì thuốc kháng sinh không thé tác dụng vàophan giữa mủ được Phòng bệnh chủ yếu là giữ vệ sinh chung, đảm bảo vô trùng [8]

Trong cuộc sống, con người va vi sinh vật luôn luôn tiếp xúc với nhau va trong mộthoàn cảnh nhất định, vi sinh vật thâm nhập vào cơ thé ký chủ thông qua niêm mạc biểumô (niêm mạc hô hấp, tiêu hóa, tiết niệu, sinh dục) hoặc vết thương, tốn thương ở da,niêm mạc, Chúng tăng sinh tạo 6 nhiễm ở biểu mô hay qua đường bạch huyết vào máu,gây nhiễm khuẩn huyết Từ đó, vi khuẩn có thé lan tràn khap cơ thé hay định vị tại một cơquan thích hop dé phát triển Trong cơ thé ký chủ, vi sinh vật tiết ra các độc tổ (nội độc tốhay ngoại độc tô) là các sản phẩm trao đối chat bậc hai của chúng dé tăng trưởng va phattriển.

Cơ thể có cơ chế kháng cự không đặc hiệu (hàng rảo sinh lý ngã vào, các loại thực bào,phản ứng viêm và hiện tượng sốt) và cơ chế kháng cự đặc hiệu (phản ứng miễn dịch).Việc điều trị nhiễm khuẩn chính là loại bỏ tác nhân gây bệnh (kháng nguyên) Không décập đến các phương pháp vật lý như: thông hut 6 nhiễm, ôxy cao áp, chúng tôi chỉ banluận về việc điêu trị bệnh nhiễm bang các phương pháp hóa học, sinh học hay các phươngpháp phối hợp nội khoa Thứ nhất, sử dụng các loại kháng sinh gây độc cũng như ức chếvi khuẩn gây bệnh Thứ hai, sử dụng vaccine hay kháng huyết thanh tạo miễn dịch cho cơthé chống lại tác nhân gây bệnh Thứ ba, sử dụng các vi khuẩn có lợi tạo cơ chế lấn at,cạnh tranh dinh dưỡng để tiêu diệt vi sinh vật gây hại [5]

2.3.1 Điều trị băng kháng sinhKháng sinh là các hợp chất hóa học có tác dụng tiêu diệt vi khuẩn hay ngăn chan vikhuẩn nhân lên với liêu lượng rất nhỏ Các hợp chat nay là dẫn xuất của các phân tử xâydựng tế bao vi khuân Chúng có tác dụng ức chế cạnh tranh làm cho vi khuẩn không tonghợp được những nguyên liệu an thiết để xây dựng tế bào, từ đó bị chết đi

Kháng sinh có 3 nguồn gốc khác nhau:- Kháng sinh tự nhiên: là những chất do vi sinh vật tiết ra- Kháng sinh tông hợp: là những hóa chat do con người tông hợp nên- Khang sinh bán tong hop: là những chat do vi sinh vật tiết ra, được xử lý làm thay đôi

cau trúc hóa học sao cho phù hợp với yêu câu sử dụng

Kháng sinh có tác dụng đặc hiệu, có tác động lên 1 loại hay 1 nhóm vi khuẩn nhất định.Do đó, thuốc kháng sinh không có cùng hoạt tính đối với nhiều loại vi khuẩn khác nhau.Trong đó, kháng sinh có hoạt phô hẹp chỉ có hoạt tính đối với 1 số ít vi khuẩn Ngược lại.kháng sinh có hoạt phô rộng có hoạt tính với nhiều loại vi khuẩn.

2.3.1.1 Phân loại thuốc kháng sinhTùy vào cơ chế tác động lên tế bào vi khuẩn gây bệnh ma kháng sinh được chia thành 7họ và 1 số nhóm đặc hiệu:

- Họ Nitromidazole (Metronidazole, Tinidazole, Secnidazole) có tác dụng ức chế cạnhtranh chất chuyển hóa PABA cần thiết của vi khuẩn Metronidazole có tác dụng rất tốt đốivới vi khuẩn kị khí; nhưng cũng như Clindamycin cần phải kết hợp thêm với một

Cephalosporins II hay một Fluoroquinolon.

- Ho j-lactamins gồm 2 nhóm: Penicillins và Cephalosporins, có tac dụng ức chế sựtong hợp vách tế bào vi khuẩn Các Penicillin cổ điển đến nay đã bị vi khuẩn kháng lạikhá nhiều Hiện nay Penicillin kết hợp với các dược chất khác như: Clavulanic acid

(Augmentin), Sulbatam (Unasyn), Tazobactam (Tazocin), có khả năng vô hiệu hoa

được men ƒj-lactamase của vi khuẩn Nhóm Cephalosporins là nhóm lớn nhất và đượcphát triển nhiều nhất qua 4 thé hệ Nhược điểm lớn của nhóm Cephalosporins là ở mọi thếhệ đều không có tác dụng đôi với Enterococci

+ Cephalosporins I (Cephalotine, Cephalexine, Cephazoline, Cephaloridine): tac dụng

diệt khuẩn tốt đối với câu khuẩn, kém hơn đổi với trực khuẩn, đặc biệt là trực khuẩn

- Họ Cyclines (Tetracycline, Doxycyline, Metacycline) có tac dụng gắn vao tiêu đơn vi30s của Ribosomes ngăn chặn sự tổng hop Protein, kèm hãm sự phát triển của vi khuẩn.Hiện nay, Cyclines đã bị kháng lại rất nhiều nên từ năm 1990 đến nay ít được sử dụng

trong ngoại khoa.- Họ Aminoglycosides (Streptomycin, Gentamycin, Amikacin, Kanamycin) có tác dụng

găn vào tiểu đơn vị 30s của Ribosome vi khuẩn, diệt khuẩn khá tốt đối với nhiều trựckhuẩn Gram âm, ít có tác dụng đối với câu khuẩn Gram dương, nhưng khi phôi hợp vớinhóm Penicillin hay Vancomycin thi lại có tac dụng đáng kế đối với Enterococci Trênlâm sàng khi sử dụng Aminoglycosides can thận trọng vi nông độ tác dụng va nông độđộc của thuốc rất gần nhau đặc biệt là đối với chức năng thận và thính giác

- Họ Phenicols (Chloramphenicol, Thiamphenicol) có tác dụng gắn vao tiểu đơn vị 50scủa Ribosome vi khuẩn, kềm hãm sự phát triển của vi khuẩn, độc tinh kha cao nên hiệnnay rất ít được sử dụng trên lâm sàng

- Họ Macrolides (Erythromycin, Azithromycin, Clarithromycin, Spiramycin) cũng có

tac dung gan vào tiểu đơn vi 50s của Ribosome, kém hãm sự phát triển của vi khuẩn vàdiệt khuẩn ở liều cao Hiện nay, trên lâm sàng các Macrolides đã bị kháng khá nhiều nêncác kháng sinh mới như Clarythromycin va Azithromycin có phổ kháng khuẩn rộng hon,cho tác dụng tốt ở dạng viên uống, được sử dụng ngày cảng nhiêu hơn

- Họ Glycopeptides (Vancomycin, Ristocetin) có tac dụng gắn vào mang bảo tương vikhuẩn, gây rối loạn thâm thấu làm phá vỡ tế bào Trong nhóm này có Vancomycin có tácdụng rat tốt đối với cầu khuẩn Gram dương, đặc biệt là Staphyloccus aureus kháng

Methicillin va Enterococci.- Cac nhóm đặc hiệu: các Mitrofurans, nhóm Quinolones (Ofloxaxin, Norfloxacin,

Ciprofloxacin va Pefloxacin), Novobiocin, Fusidic acid, thuốc chống lao (Rifampicin kếthợp với Ethambutol va Isoniazid), thuốc chống nắm, thuốc khang virus [1 1]

2.3.1.2 Cơ chế dé kháng kháng sinh của vi khuẩnKhả năng dé kháng kháng sinh của vi khuẩn gồm 2 loại: kháng thuốc tự nhiên và kháng

thuốc thu được Kháng thuốc tự nhiên là sự kháng thuốc của những vi khuẩn không năm

trong pho tác dụng của một kháng sinh nao đó Ví dụ: vi khuẩn lao (Mycobacterium

tuberculosis) không bi tac động bởi Penicillin Su kháng thuốc tự nhiên là biểu hiện củagenotype nên nó bên vững va di truyền được Kháng thuốc thu được là sự kháng thuốc củanhững vi khuẩn nằm trong phô tac dụng của kháng sinh nhưng đã trở nên kháng lại khángsinh đó Ví dụ: Vi khuẩn tụ cầu vàng (S aureus) kháng lai Methicillin.

Vi khuẩn thu được kha năng dé kháng kháng sinh là do 4 cơ chế sau:- Vị khuẩn sản xuất enzyme phá hủy hoạt tính thuốc Ví dụ: vi khuẩn sản xuất B-

lactamase thủy phân các kháng sinh thuộc họ B-lactamins

- Vi khuẩn giam tính thấm của thành tế bào làm cho thuốc bị giữ lại trên bé mặt tế bào,nhờ đó tránh được sự tác động của thuốc

- Vi khuẩn tăng tổng hợp các chat chuyển hóa hay thay đôi đường biến dưỡng để cạnhtranh và lam mat tác dụng của thuốc

- Vi khuẩn thay đối cấu trúc vị trí điểm gan của thuốc trên thành tế bào hay thay đối câutrúc protein của ribosome làm cho thuốc không thé tác động lên tế bào của chúng

Khả năng dé kháng kháng sinh thu được 1a do những thay đổi thích nghỉ dé ton tại của vikhuẩn Đây là những biến đổi phenotype nên không bên vững và không duy truyền được.Tuy nhiên, vi khuẩn có khả năng truyền yêu tô kháng R (Resistant posibility) nhờ plasmidmang những gen kháng kháng sinh từ vi khuẩn nọ sang vi khuẩn kia cùng loài hay loàikhác thân cận thông qua con đường tiếp hợp hay tải nạp Khả năng di truyền yếu tố R tạora 1 quan thé vi sinh vat gây bệnh đa kháng thuốc rất nguy hiểm, nên cần có những biệnpháp phòng chống kháng kháng sinh chéo trong điều trị lâm sàng như: tuân thủ điều trịtheo kháng sinh đô, phối hợp kháng sinh điều trị đúng nông độ và duy trì đủ thời gian,dùng kháng sinh liều cao ngay từ dau, kiếm soát nghiêm ngặt khâu phòng chống nhiễmkhuẩn bệnh viện [1 1]

2.3.2 Điều trị băng vaccine và huyết thanh

2.3.2.1 Vaccine

Vaccine la mot loai khang nguyén duoc ché tao tir vi sinh vat hay từ độc tô của chúng đãđược điều chế không còn khả năng gây bệnh cho người và làm cho cơ thé được chủng taora kháng thể để có miễn dịch Vaccine tạo ra miễn dịch hoạt động nhân tạo tương đối lâubên Vaccine có 4 hình thức:

- Vaccine sống: được điều chế từ vi sinh vật còn sông nhưng đã bị cải biến cho yếu đihoặc giảm tối đa độc lực của chúng Vi dụ: vaccine dịch hạch BCG, vaccine bại liệt Sabin

- Vaccine chết: được điều chế từ vi sinh vật đã bị giết chết băng phương pháp hóa lýthích hợp mà vẫn còn nguyên vẹn câu trúc kháng nguyên Ví dụ: vaccine tả, thương hàn

- Vaccine vô độc tố: ngoại độc tô (exotoxin) của vi sinh vật được điều chế thành vô độctố (anatoxin) băng hóa chất hay xử lý nhiệt, không còn độc hại nhưng vẫn giữ nguyên vẹncau trúc kháng nguyên Vi du: vaccine vô độc tố bach hau, uốn ván

- VaccIne phối hợp: là loại vaccine gôm nhiều loại vi sinh vật khác nhau để tạo miễndịch cho cùng lúc nhiều loại bệnh khác nhau Ví dụ: vaccine DTC giúp phòng ngừa bệnhbach hau, uốn ván, ho ga [17]

2.3.2.2 Auto-vaccine

Auto-vaccine là phương pháp điều trị nhiễm khuẩn thông qua miễn dịch không đặc hiệucó được từ một vi sinh vật tương cận (không gây hại, được phân lập từ chính cơ thể bệnhnhân) với chủng vi sinh vật gây bệnh Auto-vaccine thường áp dụng trong điều trị cácbệnh viêm nhiễm cơ hội mắc phải mãn tính mà các phương pháp điều trị thông thườngnhư dùng kháng sinh và kháng huyết thanh không có kết quả Những năm đâu thế kỷ 20,khi thuốc kháng sinh còn chưa được ứng dụng rộng rãi thì phương pháp auto-vaccine đãđược nghiên cứu và sử dụng rộng rãi như là 1 liệu pháp giúp tăng cường miễn dịch, giúpcơ thé tang sức dé kháng chống lại tác nhân gây bệnh

Năm 1998, nhóm nghiên cứu của Zaluga tiền hành phân lập Propionibacterium acnes từda bệnh nhân điều chế thành auto-vaccine sử dụng cho chính bệnh nhân đó Kết qua47.6% bệnh nhân có thay đôi miễn dịch tích cực thông qua nông độ kháng thé kháng 7

acnes cao trong máu Từ năm 1995-1997, Symbio Vaccin GmbH (Herborn, Đức) phân lậpcác chung £ coli thô từ chính đường tiêu hóa của 78 bệnh nhân Các chủng E coli này

được xử lý nhiệt ở 70°C trong vòng 2 giờ và được tiêm cho từng bệnh nhân với nồng độ

từ 3x10°-3x10° CFU/ml Sau 4-6 tuần, các bệnh nhân được kiểm tra miễn dịch thông qua

nông độ kháng nguyên protein, nồng độ kháng thé và cytokines Kết quả nghiên cứu chothấy auto-vaccine giúp tạo ra 3 loại cytokines quan trong tao ra miễn dịch không đặc hiệucho cơ thê chống lại các tác nhân vi khuẩn Gram âm [19]

2.3.2.3 Huyết thanh (kháng huyết thanh)Huyết thanh hay đúng hơn là kháng huyết thanh là lọai kháng thể trong huyết thanh củađộng vật được làm miễn dịch hay trong huyết thanh của người bình phục sau một bệnhnhiễm nao đó, dùng dé điều trị một bệnh nhiễm tương ứng.

Huyết thanh trị liệu đưa vào cơ thé một loại kháng thể đặc hiệu sẵn CÓ, chống lai tác

nhân gây bệnh Huyết thanh tạo cho cơ thể miễn dịch thụ động nhân tạo tức khắc, để điềutrị cấp thời một bệnh nhiễm khuẩn Miễn dịch này không bên vì kháng thể sẽ bị đào thải

trong vòng 10-15 ngày.

Người ta dùng huyết thanh trị liệu để điều trị cấp cứu những trường hợp bị nhiễm khuẩnhay ngộ độc cấp Trong huyết thanh trị liệu phải dùng liều cao ngay từ đầu Nếu có phảnứng mẫn cảm (kích ngất hóa mẫn, hiện tượng Arthus hay các phản ứng chậm như nóng,sốt, phù né, sưng khóp, nôi hạch, ) xảy ra thì tùy vào điều kiện bệnh nhân cũng như tiênlượng về mức độ trầm trọng của bệnh nhiễm mà quyết định có sử dụng kháng huyết thanh

Trong điều kiện nhất định, vi sinh vat muốn tổn tại va phát triển phải có cơ chế ức chế(sản xuất các chất kháng khuẩn, chất nhảy, các sản phẩm trao đồi chat bậc hai) và cơ chếlân át (cạnh tranh vị trí bám, khả năng tăng trưởng, khả năng chuyên hóa và hấp thụ chấtdinh dưỡng) đối với các đối tượng vi sinh vật khác [26]

2.3.3.1 Tác động kháng khuẩnGiảm sự di chuyển và làm giảm số lượng vi khuẩn gây bệnh để ngăn chặn các mambệnh băng nhiều cơ chế khác nhau:

- Tiết ra các chất kháng khuẩn gồm các acid hữu cơ, HạO;, bacteriocin, có khả năng ứcchế vi khuan Gram (+), Gram (-)

- Cạnh tranh với các vi khuẩn gây bệnh vi trí bám dính vào đường ruột

- Cạnh tranh dinh dưỡng cần thiết cho sự sống sót của mam bệnh [16].2.3.3.2 Tac động miễn dịch

- Probiotic như là phương tiện phân phát các phân tử kháng viêm cho đường ruột.

- Day mạnh sự báo hiệu cho tế bao chủ dé làm giảm đáp ứng viêm.- Tạo đáp ứng miễn dịch để làm giảm dị ứng

- Kháng nguyên của Probiotic kích thích tế bảo niêm mạc ruột sản sinh kháng thể.2.3.3.3 Tác động đến vi khuẩn đường ruột

- Probiotic giúp tạo sự cân băng tạm thời của hệ sinh thái đường ruột Điều này phụthuộc vao công dụng và liều lượng của giống vi khuẩn

- Vi khuẩn Probiotic điều hòa hoạt động trao đổi chất của sinh vật đường ruột.2.3.3.4 Tác động khả năng hấp thụ thức ăn

Tăng lượng thức ăn ăn vao và kha năng tiêu hóa: chúng tham gia vao sự trao đổi chất

đinh dưỡng như các carbohydrate, protein, lipid và khoáng.

2.3.3.5 Tác động lên biếu mô- Day mạnh sự liên kết chặt của những tế bào biểu mô.- Giảm việc kích thích bài tiết và những hậu quả do bị viêm của sự lây nhiễm vi khuẩn.- Day mạnh sự tạo ra các phân tử phòng vệ như chat nhây

Probiotic chịu được VWpH thap, tiét ra cac

hợp chat chống lại: vi

sinh vật có hại và các

chất gây hại từ nắm

Probiotic tạo thànhmột màng như hàng

rào ngăn cản sự xâmnhập của các vi sinh

vật và nắm gây hại

Hình 2.4 Probiotic cạnh tranh vị trí bám trên nhu mô ruột với các đối tượng vi sinh vật

gây bệnh [13]

2.4 TINH CHAT UU VIỆT CUA BACILLUS SUBTILISBacillus subtilis là đối tượng vi sinh vật được tập trung nghiên cứu va ứng dụng nhiềunhất từ những năm 1950 đến nay bởi những đặc tính ưu việt của chúng đối với con người.Thứ nhất, là chủng vi khuẩn có bao tử, Bacillus subtilis có khả năng tôn tại rất cao trongcác điều kiện cực đoan như: pH < 5, t? > 40°C, môi trường nghèo dinh dưỡng [3] Thứ hai,khả năng sinh trưởng va phát triển nhanh giúp chúng dé dàng cạnh tranh vị trí bám vào co

chất; từ đó cạnh tranh dinh dưỡng với các đối tượng vi sinh vật khác Thứ ba, quan trọng

nhất là khả năng sản sinh các chất hợp chất kháng khuẩn tự nhiên, giúp tiêu diệt hay kimhãm sự phát triển của các loài khác cùng tôn tại và phát triển trong hệ sinh thái cục bộ.2.4.1 Khả năng ức chế cạnh tranh

Kha năng tôn tại của Bacillus subtilis thé hiện thông qua sự phân bố rat đa dạng trên sinhquyên; ta có có thé phân lập chúng từ môi trường nước hay trên cạn Bao tử của chúng baytrong không khí theo gió va phán tán khắp moi nơi, nhưng chúng không bao giờ nảy mam

trong không khí.

B subtilis có thé sinh trưởng ở rễ cây Rudrappa T và cộng sự (2007) đã quan sát hiệntượng này trên cây bắp cải giống A Rap (Arabidopsis thaliana), thêm vào đó B subtilis lạicòn được tim thay nhiều hơn hết ở rễ của nhiều loài cây so với các vi khuẩn sinh bào tửtrong dat nào khác [22] B subtilis thực sự có tác dụng làm giảm khả năng mắc bệnh củacây nhờ khả năng cảm ứng kích thích hệ thống miễn dịch của cây Với nghiên cứu trên

cây đậu và cà chua năm 2007 Ongena và cộng sự chứng minh B subtilis có khả năng sinh

nhiều Surfactin và Fengycin làm tăng cường khả năng phòng vệ của cây [77] Có băngchứng cho rằng B subtilis có khả năng thúc day sự phát triển của thực vật nhờ vào 3 lý

do Một là, B subtilis cạnh tranh với vi sinh vật gây hại cho cây Hai là, B subtilis hoạt

hóa hệ thông phòng ngự của thực vật Ba là, B subtilis tạo thêm các chất dinh dưỡng chocây từ trong đất như Phốtpho và Nitơ (F.M Cazorla và cộng sự, 2007) [14]

Tu đó, B subtilis cũng hiện diện luôn cả trong đường tiêu hóa của động vật ăn co Nhờ

sự hiện diện của B subtilis trong đường ruột, các động vật này được kích hoạt hệ thốngmiễn dịch B subtilis cũng đóng vai trò là Probiotic trong đường ruột nhằm di trì sự cân

bằng và trang thai khỏe mạnh của đường ruội

Trong môi trường nước, B subtilis hiện diện rộng rãi trong môi trường đại dương nhờ

vào sự hiện diện trong đường ruột của các động vật biển.Ngoài cau tạo cơ bản gồm: màng tế bào, thành tế bảo, tế bào chất, thé nhân; các thànhphan cấu tạo đặc biệt giúp cho Bacillus subtilis có ưu thé cạnh tranh hon so với các đôi

tượng vi sinh vật khác:

- lớp capsule: cau trúc ngoài cùng bao lấy tế bào vi khuẩn là các Polysaccharidevà/hoặc Polypeptide, có độ nhớt cao Chính lớp nhảy này giúp tế bào sống sót qua giaiđoạn thiếu nước, dự trữ chất dinh dưỡng, hấp thu các lon giúp cân băng điện giải từ môitrường, liên kết thành mang sinh học (biofilm) giúp ngăn chặn kẻ thù [5]

Hình 2.5 Màng sinh học của B subtilis NCBI 3610 (trái), B subtilis 168 (phat).

có khả năng ngăn chặn sự thấm thấu của nước va các chất hoa tan trong nước, chúng cótác dụng tăng cường kha năng bảo vệ bảo tử trước các điều kiện bat lợi.

Dưới lớp vỏ là lớp màng trong của bào tử và trong cùng là một khối tế bào chất đồng

nhất Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao đối chat, vi vậy có thê giữ ở trạng thái

tiêm sinh trong nhiêu năm.

Cho đến nay người ta đã phát hiện ra Bacillus subtilis có thé sản sinh ra rất nhiều hợpchất kháng khuẩn, với nhiều cau trúc khác nhau, nhưng không phải dòng nào cũng có khảnăng tông hợp tat cả số hợp chất đó Nhìn chung, các hợp chất kháng khuẩn của Bacillussubtilis đa phan là các Peptide; trong đó, một phan là được tong hợp bằng Ribosome (cácLantibiotic) và phan còn lại thi không được tong hợp bang Ribosome nhưng bang hệ xúctác Enzyme phức tạp (các Lipopeptide) Ngoài ra, chúng còn có khả năng tông hợp một sốhợp chất kháng khuẩn khác như: Polyketide, Aminosugar và Phospholipid [25]

Pentacyclic Lantibiotic có cau trúc giống

như Nisin Chúng tác động lên màngmenbrane cua vi khuân Gram dương.

Ericin S va Ericin A: Có câu tạo như hình

vẽ và cũng tác động lên vi khuan Gramđương như Sutilin.

Mersaxitin: ching tác động lên thành tếbào của vi khuẩn Chúng có thể tiêu diệt

được Staphylococcus aureus khángMethicillin.

Sublancin: cau tạo phan tu cua loai nayngoài cầu B—MethylLanthionine chúngcòn có 2 cầu Disulphide Chúng tác động

lên màng tê bào vi khuân Gram dương.

Subtilosin: Ching kháng lại nhiều vikhuẩn Gram dương kế ca Listeria Chúng

tác động lên màng menbrane.

Các loại nay bao gồm: Surfactin, Iturin, Bacillomycin, Mycosubtilin, Fengycin,Corynebactin Chúng được tổng hop băng phức hop Enzyme phức tap, có khả năng khángđược nâm và nhiều loại vi khuẩn.

Bang 2.2 Các hợp chat kháng khuẩn không được tổng hợp bang Ribosome [15]

1) srf P coms 27.0 kb

Surfactin A-A A-B A-C A-D

(ATCC 6633, -> Lm A CøszCHCHzCO=E~—L—L—V—D-L-LA1/3, 21332) hxIR ycxA B = = V

(jae | iv {0 C j

kDa 402 408 144

learn 2) itu 38.0 kb 5(RB 14) D A 8 c > |

vie vụn = A Gre CHCH2CO—N—Y—N—Q—P—N-—S

mmmsmannnmmboasamb)-aoe yng oe E-O-Y-T-E-A

CETICT ICEL ETT CJ OH Vv

(168) >> mmani HCN LÔ Ó- c0 7yu yue.! re)

CH,

2.4.2.3 Cac hợp chat kháng khuẩn khácNam trong số này gồm có các Polyketide, các Difficidin Đặc biệt, Amicoumacin có

khả năng khang Helicobacter pylori gầy bệnh loét dạ dày.

Bảng 2.3 Các hợp chất kháng khuẩn khác [20]

Bacilysin 3,3'-Neotrehalosa- Difficidin lv”

(168) diamine (168) (ATCC 39320, 39374) No

0H0

NH»

0 OH aul 0H.N 0 hầu

2.5 NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VE HUONG CUA DE TÀIViệc điều trị nhiễm khuẩn mủ xanh và tụ câu vàng chủ yếu là dùng khang sinh nên cácnghiên cứu tập trung vào việc lựa chọn loại kháng sinh, liều lượng và đường dùng khángsinh (đường uống, đường xông mũi xoang, tiêm truyền tinh mạch hay tiêm bắp) cũng nhưnghiên cứu phác đô diéu trị cho hai loại nhiễm trùng kế trên Năm 2009, Samer Qaradthuộc Đại hoc Arkansas (Mỹ) đã nghiên cứu tông hợp phác đồ điều trị cho nhiễm khuẩnPseudomonas aeruginosa khá hoàn chỉnh [23] Từ tháng 9/2003 đến tháng 1/2005, nhómtác giả Phạm Hùng Vân có nghiên cứu về khả năng đề kháng kháng sinh của 235 chủng vikhuẩn Staphylococcus aureus phân lập từ 7 bệnh viện ở Da Nẵng, Cần Thơ và Thành phốH6 Chí Minh Kết quả chỉ ra rằng S aureus khang methicillin (MRSA) có ty lệ đề khángcác kháng sinh cao hon tất rõ rệt so với vi khuẩn nhạy cảm methicillin (MSSA) Nghiêncứu cũng ghi nhận Vancomycin là kháng sinh đặc trị vi khuẩn S aureus, vẫn còn 100%

nhạy cam [8].

Việc phát triển va thử nghiệm lâm sang các loại kháng sinh thế hệ mới van diễn ra liêntục để khac phục tình trạng dé kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh Năm 2005, PhạmXuân Khiêm thử nghiệm sử dụng khang sinh liều cao Fosfomycin (IV) (Fosmicin — MeijiSeika Kaisha) liều cao 6g/ngày kết hợp với Amikacin (IM) 3g/ngày trong điều trị viêm đaxoang do trực khuẩn mủ xanh [10] Cũng trong năm 2005, nghiên cứu của Phạm HùngVân và cộng sự đã đưa Linezolide (một kháng sinh tổng hợp mới thuộc lớpOxazolidinones) vào thử nghiệm cận lâm sàng Kết quả là ngoài Vancomycin để điều trịcác trường hợp nhiễm trùng do S aureus kháng methicillin, Linezolide là một lựa chon

đáng tin cậy [8].

Tuy nhiên, P aeruginosa và S aureus là hai chủng vi khuẩn đa kháng thuốc (có khanăng dé kháng chéo) cực kỳ nguy hiểm Việc diéu trị hai đối tượng trên bang kháng sinhkhông phải lúc nảo cũng cho kết quả tốt, đặc biệt là những trường hợp nhiễm trùng cấptính như viêm màng não hay nhiễm trùng máu Vì vậy, các hướng điều trị khác như:vaccine, kháng huyết thanh, các sản phẩm trao đối chất có tác dụng ức chế vi khuẩn gâybệnh (Bacteriocin) vẫn liên tục được nghiên cứu và ứng dụng

Năm 2003, Hoàng Ngọc Hiển và cộng sự nghiên cứu xây dựng quy trình chế tao vaccinetrực khuẩn mủ xanh quy mô phòng thí nghiệm và bước dau đánh giá chất lượng vaccinetrên động vật [2] Tuy nhiên dé tài được đăng trên Tap chí Y học này chưa thé đưa vàoứng dụng thực tế do vaccine được chế tạo không mang tính đại diện, chỉ có tác dụng trên1 số type nhất định in vitro Cũng trong năm 2003, tác giả Kiều Chi Thanh, điều chế thànhcông huyết thanh đa giá kháng trực khuẩn mủ xanh từ ngựa và bước đầu thử nghiệm trênchuột [4] Kết quả được đăng trên Tạp chí Y học Việt Nam số 9/2003.

Một hướng khác là sử dung Bacillus subtilis như là một lợi khuẩn để cạnh tranh va ứcchế các đối tượng vi sinh vật gây bệnh Tiên phong về hướng nghiên cứu này ở Việt Namlà Bác sĩ Phạm Ngọc Thạch; người đã sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis và bảo quantrong các ống am-pun từ năm 1947 Trong thời kỳ chưa có kháng sinh, chế phẩm nàyđược ứng dụng rất nhiêu trong y học đặc biệt trong điều trị viêm ruột [9] Nam 2005, ĐỗThị Hồng Tươi và cộng sự đã tiến hành khảo sát tình hình đề khang kháng sinh của vikhuẩn gây viêm mũi xoang tại Tp HCM và bước đầu thử nghiệm tác dụng của thuốc nhỏ

Bacillus subtilis trên bệnh nhan tình nguyện [1].

Ở lĩnh vực protein - enzyme, năm 2006 Charles E Shelburne và cộng sự thuộc trườngĐại hoc Michigan đã nghiên cứu phố kháng khuẩn của Subtilosin A (một loại kháng sinhquan trọng do Bacillus subtilis sản xuât) Nghiên cứu nay thử nghiệm và cho kết quả ứcchế tốt (MIC<100mg/I) đôi với nhiều chủng vi khuân Gram dương và Gram âm, bao gồmcả vi khuẩn hiếu khí và ky khí như: Z faecalis OGX-1, L monocytogenes ATCC 19115,

P gingivalis ATCC 33277, K rhizophila ATCC 9341, Enterobacter aerogenes ATCC13408, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Shigella sonnei ATCC 25931, Escherichiacoli ATCC 8739, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, S gordonii Challis ATCC49818 va Staphylococcus aureus ATCC 6538 [12].

Theo đuôi phương pháp vi sinh vật ức chế vi sinh vat trong diéu trị nhiễm khuẩn; chúngtôi khảo sát khả năng ức chế trực khuẩn mủ xanh va tụ cầu vàng của Bacillus subtilis.Trong điều kiện nhất định, chúng tôi tuyển chọn chủng Bacillus subtilis có khả năng ứcchế hai đối tượng gây bệnh trên xác định các điều kiện tối ưu in vitro Từ đó, thử nghiệmcận lâm sàng quá trình ức chế dé định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo

CHƯƠNG 3 - NỘI DUNG NGHIÊN CỨU3.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Đề tai mang tinh chất thực nghiệm vi sinh truyền thống, chia thành hai nội dung chính:- Nội dung 1: Tuyển chọn giống Bacillus subtilis có khả năng ức chế trực khuẩn mủxanh và tụ câu vàng Xác định được chúng giống tốt nhất và tính chất cũng như các điềukiện tối ưu của quá trình ức chế

- Nội dung 2: Dựa trên các điều kiện tối ưu, tiến hành thử nghiệm cận lâm sàng để xácđịnh độ tin cậy của đề tài nghiên cứu

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU- Phương pháp thực nghiệm vi sinh truyền thống (thé hiện ở phan phụ lục)

- Phương pháp khảo sát và thu thập dữ liệu

- Phương pháp thống kê xử lý dữ liệu3.3 DIA DIEM VÀ TRANG THIET BỊ PHỤC VU DE TÀI NGHIÊN CUU3.3.1 Địa điểm thực hiện đề tài nghiên cứu

Theo yêu cau của nội dung nghiên cứu, dé tai được thực hiện tại hai nơi:

- Nội dung 1: thí nghiệm cơ ban được thực hiện tại Phòng 102B1, Khoa Kỹ thuật Hóa

học, Trường Đại học Bách Khoa Tp HCM, địa chỉ số 268 Lý Thường Kiệt, Phường 10,

Quận 10, Tp.HCM.- Nội dung 2: thí nghiệm cận lâm sang được thực hiện tại Phong vi sinh, Khoa Xét

nghiệm, Bệnh viện Bình Dân, địa chỉ số 371 Điện Biên Phủ, Phường 4, Quận 3, Tp

HCM.

3.3.2 Trang thiết bị phục vụ công tác nghiên cứuTrang thiết bị cân thiết được phòng thí nghiệm hỗ trợ, bao gồm:- Tủ cây vô trùng, tủ hấp vô trùng, tủ ủ, tủ sấy, tủ lạnh, - Máy so màu, máy lac, máy đo pH, cân điện tử

- Kính hién vi, các loai hóa chất, thuốc nhuộm, - Vật dụng thủy tinh: ông nghiệm, ống dong, chai thủy tinh, đĩa petri và các vật dụngcần thiết khác

3.4 THIẾT KE THỰC NGHIỆM NOI DUNG 1

r

Dự đoán kết quả(1), (2) hay (3)

Á

Tối ưu hóa kết quả trên:tỷ lệ đối kháng, pH, t”

r

Dự đoán điêu kiện ức chê

tôi ưu nhât

Hình 3.1 Sơ đô thực nghiệm nội dung 1

3.4.1 Chuẩn bị giống gốc thuần chủng- Thu thập 5 giống Bacillus subtilis thuần chủng có nguôn gốc từ: Trường Đại học BachKhoa Tp HCM, Trung tâm lưu giữ giống vi sinh vật chuẩn với các tiêu chí: tính lấn at,cạnh tranh cao; bao gom: Bacillus subtilis BK 1, Bacillus subtilis BK 2, Bacillus subtilisBK 3, Bacillus subtilis VTCC 254, Bacillus subtilis AS 162 Các chủng giống này đượcký hiệu lần lượt là: BS1, BS2, BS3, BS4, BSS.

- Phân lập 1 chủng giống Pseudomonas aeruginosa BD 1(ky hiệu PA1) có nguồn gốctừ bệnh phẩm tại Bệnh viện Bình Dân Tp HCM và 1 chủng giống Methicillin resistantStaphylococcus aureus HV 1 (ký hiệu SA1) có nguồn gốc từ bệnh phẩm tại Bệnh viện

Hung Vuong Tp HCM.

3.4.2 Hoạt hóa, tăng sinh khảo sát đặc điểm sinh ly và lưu giữ các chủng giống- Các giông thuần thu thập được được hoạt hóa băng chế độ chiếu UV 2 giây- Tiên hành khảo sát hình thái vi thé, hình thái đại thé của các chủng giống- Các đối tượng vi sinh vật được tăng sinh trên môi trường Nutrient broth (NB), ủ 12-18ĐIỜ, 37°C Xác định mật độ dựa trên đường chuẩn mối quan hệ giữa mật độ vi khuẩn và

độ đục môi trường.

- Giống thuần chủng được cấy sang ống thạch nghiêng Nutrient agar (NA), ủ 24 giờ ở37C Tiếp theo, giống được bảo quản ở 5-7°C, cây chuyển giữ giống mỗi 30 ngày [6].3.4.3 Thử nghiệm khả năng ức chế

Huyện phù tế bao Bacillus subtilis sau 20-24 giờ tăng sinh đạt mật độ khoảng 2.0x10'' CFU/ml được chia thành 3 phan:

1.5 Một phan: huyén phủ tế bao Bacillus subtilis: nghiệm thức (1)- Hai phan: ly tâm dịch huyền phù ở 4000 vòng/phút, 10 phúi:

3.4.3.1 Ly tâm tách riêng các pha

Sau ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút, pha rắn và pha lỏng được tách riêng:- Pha ran: sinh khối tế bao Bacillus subtilis: nghiệm thức (2)

- Pha lỏng: dịch ngoại bào: nghiệm thức (3)

3.4.3.2 Thử nghiệm khả năng ức chế- Sử dụng các đĩa NA đã cây mủ xanh va mủ vàng, đục 5 16 tạo các giêng xét nghiệm

- Thực hiện 3 nghiệm thức, với 5 chủng giỗng Bacillus subtilis trên 2 đối tượng vi sinhvật gây bệnh Mỗi nghiệm thức thực hiện 3 lần.

- Do đường kính vòng vô khuẩn có 90 kết quả.3.4.3.3 Dự đoán kết quả

Từ 90 kết quả, ta kết luận được 2 vẫn đề sau:- Ching giống Bacillus subtilis ức ché P aeruginosa hoac/va S aureus tốt nhất- Thanh phan ức chế 2 đối tượng gây bệnh trên là: (1) huyền phù nuôi cấy Bacillussubtilis, (2) sinh khối Bacillus subtilis hay (3) dịch ngoại bào

3.4.4 Xác định các điều kiện tối ưu cho quá trình ức chếSử dụng các kết quả của thí nghiệm 3.4.3, ta tiến hành thử nghiệm tối ưu hóa các điềukiện ức chế mủ xanh và mủ vàng, bao gồm: tỷ lệ đối kháng, thời điểm kết thúc, pH, t”

Khả năng ức chế trực khuẩn mủ xanh và tụ cầu vàng cua Bacillus subtilis được đánh giathông qua tỷ lệ % tế bao Bacillus subtilis trên tong số tế bào sau quá trình ức chê

3.4.4.1 Tỷ lệ đối khángTheo đường cong sinh trưởng (phụ lục 1) thì sau 18-24 giờ nuôi cấy thì cả 3 đối tượng

nghiên cứu đều ở trạng thái cân băng: cụ thê BS4 đạt mật độ 1.6x10!! CFU/ml, PAI =

1.0x10!" CFU/ml, SAI = 1.67x10!! CFU/ml Qua 1 số thi nghiệm khảo sat bước dau,chúng tôi tiến hành khảo sat tỷ lệ đối kháng với các nghiệm thức dưới day:

- Tiên hành 4 nghiệm thức với tỷ lệ B subtilis:S aureus tương ứng là : 3:1, 2:1, 1:1, 1:2.Thứ nghiệm ức chế cạnh tranh bằng cách nuôi cấy cả 2 đối tượng vi sinh vật trong chaithủy tinh chứa môi trường NB, ủ 24 giờ ở 37C Sau đó, pha loãng dịch nuôi cây đến 10

'! tiến hành trải đĩa môi trường NA, ủ 24 giờ ở 37C.- Tiên hành đồng thời 4 nghiệm thức với tỷ lệ B subtilis:P aeruginosa tương ứng là:25:1, 30:1, 35:1, 40:1 Thử nghiệm ức chế cạnh tranh băng cách nuôi cây cả 2 đối tượngvi sinh vật trong ống nghiệm chứa môi trường NB, ủ 24 giờ ở 37°C Sau đó, pha loãngdịch nuôi cấy đến 10''', tiến hành trải đĩa môi trường NA, ủ 24 giờ ở 37C

Quan sát đại thể, đếm và so sánh số lượng khuẩn lạc của từng đối tượng vi sinh vật Ghinhận kết quả Độ lặp thí nghiệm 3 lần Nhu vậy từ 24 kết quả, xác định được ty lệ đôikháng tôi ưu để ức chế 2 đối tượng vi khuẩn

3.4.4.2 Lựa chon thời điểm thích hop dé kết thúc quả trình ức chếTừ kết quả thí nghiệm 3.4.4.1, ta tiến hành khảo sát thời gian thích hợp cho quá trình ứcchế, phục vụ cho các thí nghiệm sau Khảo sát thời gian của quá trình ức chế băng cáchnuôi cấy cả 2 đối tượng vi sinh vật trong chai thủy tính chứa môi trường NB, ủ ở 37C.Lay mẫu vao các thời điểm: sau 12 giờ, sau 16 giờ, sau 18 giờ, sau 24 giờ, sau 28 giờ Phaloãng mẫu như thí nghiệm 3.4.4.1, tiến hành trải đĩa môi trường NA, ủ 24 giờ ở 37°C.

Quan sát đại thể, đếm và so sánh số lượng khuẩn lạc của từng đối tượng vi sinh vật Ghinhận kết qua Độ lặp thí nghiệm3 lân

Như vậy từ 30 kết quả, xác định được thời gian thích hợp cho quá trình ức chế.3.4.4.3 Xác định pH toi wu

Từ kết quả 2 thí nghiệm trên, thử nghiệm ức chế cạnh tranh B subtilis:P aeruginosa vaB subtilis:S aureus theo 5 nghiệm thức với nồng độ pH tương ứng: pH = 5.5, pH = 6, pH= 6.5, pH = 7, pH = 7,5 bang cách nuôi cây cả 2 đối tượng vi sinh vat trong chai thủy tinhchứa môi trường NB, ủ 24 giờ ở 37°C Sau đó, pha loãng dịch nuôi cấy, tiến hành trải đĩamôi trường NA, ủ 24 giờ ở 37C

Quan sát đại thể, đếm và so sánh số lượng khuẩn lạc của từng đối tượng vi sinh vật Ghinhận kết qua Độ lặp thí nghiệm3 lân

Như vậy, với 30 kết quả, chúng tôi xác định được nông độ pH tôi ưu dé ức chế 2 đốitượng vi khuẩn

3.4.4.4 Xác định nhiệt độ toi wuTừ kết quả 3 thí nghiệm trên, thử nghiệm ức chế cạnh tranh B subtilis:P aeruginosa vaB subtilis:S aureus theo 4 nghiệm thức với nhiệt độ tương ứng: t= 32°C, t= 37°C, t=42°C, Ú = 45°C bang cach nuôi cấy cả 2 đối tượng vi sinh vật trong chai thủy tinh chứamôi trường NB, ủ 24 giờ Sau đó, pha loãng dịch nuôi cấy, tiễn hành trải đĩa môi trườngNA, ủ 24 giờ ở 37C

Quan sát đại thể, đếm và so sánh số lượng khuẩn lạc của từng đối tượng vi sinh vật Ghinhận kết qua Độ lặp thí nghiệm3 lân

Như vậy, với 24 kết quả, chúng tôi xác định được nhiệt độ tối ưu dé ức chế 2 đối tượng

vi khuân.

3.5 THIẾT KE THỰC NGHIỆM NOI DUNG 2

Pseudomonasaeruginosa aureus

Thu thap mau Thu thap mau

Tang sinh mau Tang sinh mau

khang sinhDia xét

nghiệm ức chê

Hình 3.2 Sơ đô thiết kế thực nghiệm nội dung 23.5.1 Thu thập và tăng sinh mẫu

3.5.2.1 Thu thập mẫuMẫu Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa được lưu trữ tại Khoa Xétnghiệm, Bệnh viện Bình Dân trong điều kiện bảo quản lạnh ở -4°C

Thu thập mẫu, rã đông tự nhiên.3.5.2.1 Tăng sinh mẫu

Mẫu mủ xanh va mủ vàng đã rã đông được cấy trên canh trường NB dé tăng sinh.Ủ 24h, ở 37C cho các xét nghiệm tiếp theo

3.5.2 Thứ kháng sinh đồ bằng phương pháp đĩa kháng sinhMẫu tăng sinh sau 18 giờ được cấy trang trên 2 đĩa MHAĐặt các đĩa kháng sinh lên các đĩa Petri chứa khuẩn lạc quan tâm, ủ 24h, 37CĐo đường kính vòng vô khuẩn, tra bang MICs để xác định độ nhạy của vi khuẩn mủxanh, vi khuẩn mủ vàng đối với từng loại kháng sinh.

Ghi nhận kết quả.3.5.3 Thử nghiệm khả năng ức chế trực khuẩn mủ xanh và tụ cầu vàng3.5.3.1 Chuẩn bị đĩa giấy lọc tam Bacillus subtilis

Chuẩn bị các đĩa giây lọc đường kính lcm, sấy khô và hap khử trùngSau 20-24 giờ nuôi cấy, BS4 đạt mật độ 1.6x10'' CFU/ml ta tiễn hành cố định lên đĩagiây lọc băng phương pháp hấp phụ bê mặt

Các đĩa xét nghiệm này được bảo quản trong hũ thủy tinh vô trùng có nắp đậy.3.5.3.2 Thử nghiệm ức chế trên bệnh phẩm

Sử dụng trên cùng dia Petri với thí nghiệm 3.5.2 (xét nghiệm kháng sinh đồ)Đặt 1 đĩa chế phẩm (tương tự như đặt đĩa kháng sinh)

Quan sát và nhận xét vòng vô khuẩn

Ghi nhận kết quả

CHUONG 4- KET QUÁ NGHIÊN CỨU4.1 ĐẶC DIEM SINH LY CUA CAC CHUNG GIÓNG NGHIÊN CỨU

Các giống thuần chủng thu thập được được tiến hành khảo sát:- Vi thể: nhuộm Gram, quan sát hình thái tế bảo dưới kính hiển vi quang học (vật kínhdâu x100)

- Đại thể: cay trên môi trường NA, ủ 37°C, 24 210, quan sát hình thái khuẩn lạc.- Đặc điểm nuôi cấy trên môi trường lỏng: cây trên môi trường NB, ủ 37°C, 24 giờ, quansát dạng tổn tại của sinh khối vi khuẩn trong môi trường lỏng

- Đường cong sinh trưởng: Các chủng giỗng được khảo sát mỗi quan hệ giữa mật độ tếbào và độ đục môi trường Sau đó, tiến hành khảo sát các pha trong chu kỳ sinh trưởngcủa từng chủng giống

Đây là những nghiên cứu cơ bản không thể thiếu, phục vụ trực tiếp cho các nghiên cứu

điêu kiện ức chê sau này Kêt quả khảo sát đặc diém sinh ly của các chủng giông được thê

Hình 4.1 B subtilis BK 1: (1) vi thé , (2) dai thé, (3) canh khuẩn

- Hình thái vi thé: Trực khuân Gram dương, hình dạng có hai đầu tròn, có bào tử.- Hình thái đại thé: Khuan lạc trơn, mọc lan, bờ không đều, màu trăng sữa, có mùi nồng- Đặc điểm nuôi cấy trên môi trường NB: Moc dễ trên môi trường lỏng, kết mang vachìm xuống đáy môi trường.

- Đường cong sinh trưởng:

11.300 11.100 -10.900 -10.700 -10.500 -10.300 -

-Log(CFU/ml) 10.100 9.900 -9.700 -

+ Pha lag: bắt dau từ thời điểm vi khuẩn được cây vào môi trường NB, kết thúc tại thờiđiểm sau 6 giờ nuôi cấy,

+ Pha log: sinh khối tế bảo tăng trưởng theo cấp số nhân; bắt dau từ cuối pha lag đếnthời điểm sau 12 giờ nuôi cấy,

+ Pha cân băng: kéo dài từ thời điểm 14 giờ đến 40 giờ nuôi cấy sinh khối tế bào đạtmật độ cao nhất và 6n định trong khoảng: 2x10''-2,07x10'! CFU/ml,

+ Pha suy vong: từ thời điểm 42 giờ nuôi cấy trở đi, mật độ tế bào giảm dan đánh dấu

giai đoạn suy vong của vi khuân.

Hình 4.3 B subtilis BK 2: (1) vi thé , (2) đại thé, (3) canh khuẩn- Hình thái vi thé: Trực khuân Gram dương, hình dạng có hai đầu tròn, có bào tử.

- Hình thái đại thé: Khuân lạc trơn, mọc lan, bờ không đều, màu trăng sữa, có mùi nồng

- Đặc điểm nuôi cấy trên môi trường NB: Moc dễ trên môi trường lỏng, kết mang vachìm xuống đáy môi trường

- Đường cong sinh trưởng: Pha lag kéo dài trong 6 giờ đầu tiên, pha log kéo dài trong 8giờ tiếp theo, pha cân bang bat dau từ giờ thứ 14 đến giờ thứ 40, khi đó mật độ tế bảo datcao nhất là 1.7x10'' CFU/ml Sau giờ thứ 40 bat đầu đi vào pha suy vong

11.30011.100 ¬10.900 +10.700 +10.500 +10.300 +

Log(CFU/ml) 10.100 +9.900 -9.700 -9.500 I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I

Thời gian (h)

Hình 4.4 Đồ thị đường cong sinh trưởng của chủng Bacillus subtilis BK 2