1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http //www lrc tnu edu vn/ i VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT *** LUẬN VĂN CAO HỌC Mã số chuyên ngành 60420103 Đề tài Nghiên cứu xạ khu[.]
Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -*** - LUẬN VĂN CAO HỌC Mã số chuyên ngành: 60420103 Đề tài: Nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh kháng tụ cầu vàng Staphylococcus aureus phân lập t tr Học viên: Lê Xuân Dân Lớp: CHST _ K15 Hướng dẫn: PGS.TS Ngơ Đình Bính Hà Nội, 2013 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! i Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Mục lục Mục lục i Danh mục từ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình ix Mở đầu Phần1 Tổng quan tài liệu 1.1 Xạ khuẩn 1.1.1 Xạ khuẩn phân bố tự nhiên 1.1.2 Cấu tạo xạ khuẩn 1.1.3 Đặc điểm hình thái, trình sinh trưởng phát triển xạ khuẩn 1.1.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 1.1.5 Sự hình thành bào tử 1.2 Phân loại xạ khuẩn 1.2.1 Lịch sử phân loại xạ khuẩn 1.2.2 Theo đặc điểm hình thái tính chất ni cấy 10 1.2.3 Theo đặc điểm hóa học 11 1.2.4 Theo đặc điểm sinh lý, sinh hóa 12 1.2.5 Theo phân loại số 12 1.2.6 Theo phát sinh chủng loại 13 1.2.7 Phân loại theo Chương trình xạ khuẩn quốc tế (ISP) 14 1.3 Một số sản phẩm trao đổi chất quan trọng xạ khuẩn 14 1.3.1 Kháng sinh chế hình thành chất kháng sinh vi sinh vật 14 1.3.2 Phân lập xạ khuẩn sinh chất kháng sinh từ tự nhiên 15 1.3.3 Các nhóm chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn 16 1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp kháng sinh xạ khuẩn 18 1.4 Tổng quan vi khuẩn Staphylococcus aureus 19 1.4.1 Đặc điểm phân loại 19 1.4.2 Đặc điểm sinh vật học 20 1.4.2.1 Hình thái tính chất ni cấy 20 1.4.2.2 Đặc tính yếu tố độc lực 21 1.4.2.3 Khả đề kháng 23 1.4.2.4 Sự kháng kháng sinh 23 1.4.2.5 Khả gây bệnh 23 Phần : Vật liệu phương pháp 24 2.1 Vật liệu 24 2.1.1 Nguyên liệu 24 2.1.2 Môi trường ( g/l ) 24 ii Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2.2 Phương pháp nghiên cứu 27 2.2.1 Phân lập tuyển chọn xạ khuẩn 27 2.2.1.1 Phân lập xạ khuẩn 27 2.2.1.2 Phân lập vi khuẩn Staphilococcus aureus : 27 2.2.1.2 Các phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh 28 2.2.1.3 Tuyển chọn xạ khuẩn 28 2.2.1.4 Bảo quản chủng giống 29 2.2.2 Phân loại xạ khuẩn 29 2.2.2.1 Đặc điểm hình thái 29 2.2.2.2 Đặc điểm nuôi cấy 29 2.2.2.3 Phương pháp xác định trình tự đoạn gene 16S rRNA 31 2.2.3 Nghiên cứu động thái trình lên men 33 2.2.4 Tách chiết chất kháng sinh 33 2.2.4.1 Tách chiết chất kháng sinh từ sinh khối 33 2.2.4.2 Tách chiết chất kháng sinh từ dịch lọc 33 2.2.5 Xác định số tính chất hố lý phân loại kháng sinh 33 2.2.5.1 Xác định độ bền nhiệt dịch kháng sinh thô 33 2.2.5.2 Xác định pH khuyếch tán kháng sinh thô 33 2.2.5.3 Phương pháp xác định giá trị Rf 34 Phần Kết thảo luận 36 3.1 Phân lập tuyển chọn 36 3.1.1 Phân lập xạ khuẩn từ đất rừng ngập mặn 36 3.1.2 Phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus 37 3.1.2 Sàng lọc hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn phân lập 40 3.2 Phân loại xạ khuẩn phương pháp truyền thống 45 3.2.1 Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn TB10.2 45 3.2.2 Đặc điểm sinh lý sinh hoá 46 3.2.2.1 Khả chịu mí 46 3.2.2.2 Khả đồng hóa nguån đường 46 3.2.3 Mô tả đặc điểm phân loại 47 3.3 Phân loại phương pháp sinh học phân tử 49 3.4 Nghiên cứu động thái lên men chủng TB10.2 52 3.5 Nghiên cứu số tính chất dịch kháng sinh thô 54 3.5.1 Tách chiết chất kháng sinh 54 3.5.2 Độ bền nhiệt dịch kháng sinh thô 54 3.5.3 Ảnh hưởng pH đến độ khuyếch tán dịch kháng sinh thơ 55 3.5.4 Đặc điểm sắc kí dịch kháng sinh thô chủng xạ khuẩn chủng S padanus TB10.2 số hệ dung môi 56 Kết luận 58 Tài liệu tham khảo 59 iii Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Lời cảm ơn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Ngơ Đình Bính người thầy hướng cho tơi ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận án Tơi xin trân trọng cảm ơn phịng tập thể phịng Di truyền Vi sinh vật, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa học luận án Tôi xin cảm ơn tất thầy cô giáo Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam chia sẻ, động viên, giúp vượt qua khó khăn để hồn thành tốt cơng việc nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin tỏ lịng biết ơn đến gia đình bè bạn, người ln bên tơi, động viên, góp ý tạo điều kiện tốt cho suốt thời gian học tập nghiên cứu Tác giả iv Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Lời cam đoan Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu số kết cộng tác với đồng khác Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực Hà Nội, ngày tháng Tác giả v năm 2013 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Danh mục từ viết tắt KTKS KTCC RF (Rectus-Flexibilis) RA (Retinaculum aperturm) DNA RNA CSBT BMBT PCR Khuẩn ty khí sinh Khuẩn ty chất Cuống bào tử thẳng hay lượn sóng Cuống bào tử xoắn đơn hình móc câu Deoxyribonucleic acide Ribonucleic acide Cuống sinh bào tử Bề mặt bào tử Polymerase chain reaction vi Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Danh mục bảng Bảng 3.1 Phân loại xạ khuẩn TB theo màu sắc KTKS 36 Bảng 3.2 Phân loại xạ khuẩn NĐ theo màu sắc KTKS 36 Bảng 3.3.Kết phân lập vi khuẩn S aureus phòng mổ phòng thủ thuật 37 Bảng 3.4 Phân loại xạ khuẩn phân lập Thái Bình theo nhóm màu hoạt tính kháng sinh 40 Bảng 3.5 Hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn phân lập Tỉnh Thái Bình kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus 41 Bảng 3.6 Hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn phân lập Thái Bình mơi trường dịch thể kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus 41 Bảng 3.7 Phân loại xạ khuẩn phân lập rừng ngập mặn Tỉnh Nam Định theo nhóm màu hoạt tính kháng sinh 42 Bảng 3.8 Hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn tuyển chọn kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus 43 Bảng 3.9 Hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn tuyển chọn môi trường dịch thể kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus 44 Bảng 3.10 Đặc điểm hình thái chủng TB10.2 45 Bảng 3.11 số đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn TB110.2 45 Bảng 3.12 Khả đồng hóa nguồn đường 46 Bảng 3.13 So sánh đặc điểm hình thái chủng TB10.2 với chủng S padanus 48 Bảng 3.14 so sánh trình tự 16S rRNA chủng TB10.2 ngân hàng gen quốc tế 51 Bảng 3.15 Hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn S padanus TB10.2 môi trường nghiên cứu 53 Bảng 3.16 Sự biến đổi pH, hoạt tính kháng sinh, sinh khối chủng S padanus TB10.2 môi trường Gauze-1 53 vii Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Bảng 3.17 Hoạt tính dịch kháng sinh thô chủng S Padanus TB10.2 sau xử lý nhiệt với vi sinh vật kiểm định S aureus (mm) 55 Bảng 3.18 Ảnh hưởng pH tới khuyếch tán chất kháng sinh Error! Bookmark not defined Bảng 3.19 Giá trị Rf dịch kháng sinh thô số hệ dung môi 57 viii Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Danh mục hình Hình 1.1 Hình thể Staphylococcus aureus 20 Hình 1.2 Các yếu tố độc lực Staphylococcus aureus 22 Hình 2.1 Đĩa thạch Gradient pH 34 Hình 2.2 Băng sắc kí giấy 35 Hình 3.1 phân lập vi khuẩn S.aureus bệnh viện ĐK tỉnh Bắc Ninh 37 Hình 3.2a kháng sinh đồ chủng vi khuẩn S.aureus bệnh viện đa khoa tỉnh Bắc Ninh 38 Hình 3.2b Kháng sinh đồ chủng vi khuẩn S.aureus phòng Di truyềnVi sinh vật – Viện Công nghệ Sinh học cung cấp 39 Hình 3.3 hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn phân lập Tỉnh Thái Bình diệt vi khuẩn S aureus 41 Hình 3.4 Hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn tuyển chọn đất ngập mặn tỉnh Thái Bình 42 Hình 3.5 hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn phân lập Nam Định diệt vi khuẩn S aureus 43 Hình 3.6 Hoạt tính kháng sinh dịch ni cấy chủng xạ khuẩn tuyển chọn đất rừng ngập mặn tỉnh Nam Định 44 Hình 3.7 Hình dạng bề mặt bào tử chủng TB10.2 45 Hình 3.8 Khả đồng hoá nguồn đường chủng TB10.2 47 Hình 3.9 Màu KTKS (A) màu KTCC (B) chủng TB10.2 môi trường Gause sau ngày nuôi 48 Hình 3.10 Điện di DNA chủng TB10.2 sau tách từ kit QIAamp DNA Mini Kit 50 Hình 3.11 Điện di sản phẩm PCR gen 16S rRNA chủng TB10.2 50 Hình 3.12 Cây phát sinh chủng loại chủng TB10.2 52 Hình 3.13 Động thái trình lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng xạ khuẩn Streptomyces padanus TB10.2 môi trường Gauze-1 54 ix Mở đầu Tụ cầu vàng vi khuẩn thường xuất bệnh viện, chúng gây mối đe dọa lớn cho bệnh nhân bệnh viện khơng có cơng tác kiểm sốt nhiễm khuẩn thực tốt Chúng gây nhiễm trùng vết mổ làm ảnh hưởng đến tính mạng bệnh nhân Bên cạnh đó, khả kháng kháng sinh tụ cầu vàng lớn cần nghiên cứu sinh học diệt khuẩn có nguồn gốc từ vi sinh vật đối kháng nhà khoa học hướng đến xạ khuẩn sinh kháng sinh trung tâm vấn đề nghiên cứu Xạ khuẩn thuộc nhóm sinh vật nhân sơ (prokaryote) với số lượng loài lớn phân bố nhiều vùng sinh thái khác Chúng ngày biết đến rộng rãi với nhiều ứng dụng thực tế thông qua việc tạo sản phẩm thứ cấp có giá trị cao chất kháng sinh, chất chống ung thư, chất kích thích sinh trưởng nhiều hợp chất y dược khác Ngồi ra, xạ khuẩn cịn có khả sinh enzyme ngoại bào nên sử dụng rộng rãi làm chế phẩm sinh học nông nghiệp công nghệ xử lý rác thải Thái Bình Nam Định hai tỉnh có diện tích đất rừng ngập mặn lớn Bắc Việc nghiên cứu đa dạng sinh học vi sinh vật đất rừng ngập mặn chưa công bố nhiều, đặc biệt sản phẩm trao đổi chất chúng Vì vậy, để góp phần tìm hiểu đa dạng sinh học xạ khuẩn đất rừng ngập mặn hoạt tính chất kháng sinh chúng vi khuẩn tụ cầu vàng, thực đề tài: “Nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh kháng tụ cầu vàng Staphylococcus aureus phân lập t tr */ Mục tiêu đề tài: - Khảo sát phân bố, đặc điểm hình thái xạ khuẩn mẫu đất thu thập số khu vực đất rừng ngập mặn thuộc tỉnh Thái Bình Nam Định Hữu Agar +++ Glyxerin+++ Nitrat Ghi chó: + : sinh tr-ëng yÕu, Vàng Trắng Vàng yếu xanh ++ : sinh tr-ëng trung b×nh +++ :sinh tr-ëng tèt, ++++: sinh tr-ëng rÊt tèt KTKS: khuẩn ty khÝ sinh KTCC: khuẩn ty c¬ chÊt Kết cho thấy mơi trường khác chủng TB10.2 có màu sắc khác nhau, chủ yếu từ trắng đến vàng chanh, sinh trưởng tốt hầu hết môi trường phân loại Trên môi trường ISP-6, màu môi trường không thay đổi, chủng TB10.2 không sinh sắc tố melanin 3.2.2 Đặc điểm sinh lý sinh hoá 3.2.2.1 Khả chịu muối Kết thí nghiệm cho thấy chủng TB10.2 phát triển mức độ yếu môi trường 5% muối NaCl Trên môi trường 7% muối NaCl chủng TB10.2 phát triển mạnh, mơi trường với 10 % NaCl chủng TB10.2 phát triển yếu Điều hồn tồn hợp lý chủng xạ khuẩn phân lập từ vùng đất ngập mặn tỉnh Thái Bình 3.2.2.2 Khả đồng hóa ngn đường Để thử khả đồng hố số nguồn cacbon khác nhau, xạ khuẩn nuôi môi trường ISP-9 với nguồn đường khác nhau, xạ khuẩn sinh trưởng phát triển tốt mơi trường có bổ sung nguồn cacbon phù hợp với chúng Bảng 3.12 Khả đồng hóa nguồn đường Stt Nguồn đường Glucoza Arabinoza Saccaroza Xyloza Inositol Manitol Fructoza Lactoza Phát triển ++++ ++ + + ++++ ++ ++++ ++ 46 Xenluloza + 10 Đối chứng Chú thích: Khơng phát triển (-), phát triển yếu (+), phát triển trung bình (++), phát triển (+++), phát triển tốt (++++) Chú thích Glucoza Arabinoza Saccaroza Xyloza Inositol 10 Manitol Fructoza Lactoza Xenluloza Đối chứng Hình 3.8 Khả đồng hố nguồn đường chủng TB10.2 Kết bảng cho thấy, chủng TB10.2 sử dụng tốt nguồn cacbon từ đường glucoza, inositol fructoza Trên nguồn cacbon khác, chủng phát triển mức trung bình Với nguồn cacbon xenluloza, chủng TB10.2 có khả đồng hố yếu, chứng chúng phát triển mơi trường có nguồn cacbon xenluloza Điều có nghĩa chủng TB10.2 có khả sinh tổng hợp enzym xenlulaza mức độ yếu (hình 3.8 bảng 3.12) 3.2.3 Mô tả đặc điểm phân loại * Mô tả phân loại TB10.2 CS 1983: 1: màu hệ sợi khí sinh (KT hồng nhạt Roreus (Hình 3.9) 47 TB10.2 A B Hình 3.9 Màu KTKS (A) màu KTCC (B) chủng TB10.2 môi trường Gause sau ngày nuôi 3.7A 3.7B) Trên môi trường khống Gause-1, khơng tạo Streptomyces padanus Từ thơng tin đặc điểm hình thái, tính chất sinh lý sinh hóa ni cấy kết TB10.2 thuộc chi Streptomyces Streptomyces padanus So sánh đặc điểm hình thái sinh lý hóa chủng xạ khuẩn TB10.2 với đặc điểm hình thái sinh lý sinh hóa chủng xạ khuẩn Streptomyces pandanus cho thấy chủng xạ khuẩn TB10.2 có đặc điểm giống với chủng xạ khuẩn Streptomyces pandanus có số điểm khác biệt màu sắc khuẩn ty Kết so sánh đặc điểm phân loại chủng xạ khuẩn TB 10.2 chủng Streptomyces pandanus trình bày bảng 3.13 Bảng 3.13 So sánh đặc điểm hình thái chủng TB10.2 với chủng S padanus Môi trường Gauze-1 Đặc điểm Chủng KTCC 48 TB 10.2 S Padanus Vàng Vàng Glyxerin- Nitrat ISP-6 KTKS Hồng Hồng CSBT Xoắn tạo sợi Xoắn tạo sợi Bề mặt bào tử Trơn Trơn Sắc tố tan - - KTCC Vàng xanh Vàng xanh KTKS Trắng Trắng Sắc tố tan Vàng yếu Vàng yếu Sinh melanin - - Chú thích: KTCC: Khuẩn ty chất KTKS: Khuẩn ty khí sinh CSBT: Cuống sinh bào tử Như chủng TB10.2 chủng thuộc loài Streptomeces padanus đặt tên S padanus TB10.2 3.3 Phân loại phương pháp sinh học phân tử Từ đặc điểm hình thái ni cấy nêu dựa khóa phân loại ISP, Gauze cộng chúng tơi phân loại chủng TB10.2 thuộc lồi Streptomyces padanus, để khẳng định lại kết phân loại phương pháp sinh học phân tử dựa độ tương đồng đoạn gen 16S rRNA chủng với chủng xạ khuẩn ngân hàng gene quốc tế từ có thêm để phân loại Để xác định trình tự đoạn gene mã hóa 16S rRNA chủng xạ khuẩn TB.10.2 tiến hành bước nghiên cứu nêu 2.2.4 thu kết sau: 49 Hình 3.10 Điện di DNA chủng TB10.2 sau tách từ kit QIAamp DNA Mini Kit DNA tổng số chủng xạ khuẩn TB 10.2 tách chiết theo Kit hãng QIAamp DNA Mini Kit có cải tiến trình bày mục 2.2.4.1 DNA tổng số điện di kiểm tra gel agarose 1% phổ điện di thu thể hình 3.10 cho thấy DNA hàm lượng đủ lớn, để sử dụng để nhân gene phản ứng PCR DNA tổng số sử dụng làm khn để xác định trình tự gen 16S rRNA với căp mồi 27F 1492R khuếch đại đoạn gen ~1500bp Kết thu sau: bp 1500 Hình 3.11 Điện di sản phẩm PCR gen 16S rRNA chủng TB10.2 Giếng 1: TB10.2; Giếng 2: marker Từ hình 3.11 cho thấy sản phẩm phản ứng PCR thu băng có kích thước ~1500bp điều hồn tồn với tính tốn lý thuyết Vì vậy, phản ứng PCR thực lại với thể tích lớn để tinh với kit AccuPrep gel purification theo quy trình nhà sản xuất Gene mã hóa 16S rRNA chủng TB10.2 giải trình tự trực tiếp từ sản phẩm PCR với cặp mồi dùng nhân đoạn gene từ DNA tổng số máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Sau phân tích xử lý số liệu, trình tự đoạn gene 16S rRNA chủng dược so sánh với chuỗi 50 rRNA 16S công bố ngân hàng gene quốc tế chương trình BLAST Bảng 3.14 so sánh trình tự 16S rRNA chủng TB10.2 ngân hàng gen quốc tế Max score Total score Query E Max cover value ident Streptomyces padanus 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2791 2791 100% 0.0 99% AF455813.1 Streptomyces sp 2482 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2785 2785 99% 0.0 99% EU864311.1 Streptomyces sp P127 16S ribosomal RNA gene, complete sequence 2785 2785 99% 0.0 99% EU797798.1 Streptomyces sp MD1 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2780 2780 99% 0.0 99% HM641908.1 Streptomyces sp NRRL 30562 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2736 2736 98% 0.0 99% AY127079.1 Streptomyces sp TP-A0274 gene for 16S rRNA, partial sequence 2732 2732 97% 0.0 99% AB088069.1 Streptomyces costaricanus strain NBRC 100773 16S ribosomal RNA, partial sequence 2717 2717 97% 0.0 99% NR_041414.1 Streptomyces graminearus gene for 16S rRNA, partial sequence, strain: NBRC 15420 2710 2710 97% 0.0 99% AB184667.1 Streptomyces griseofuscus strain NBRC 12870 16S ribosomal RNA, partial sequence 2710 2710 97% 0.0 99% NR_041084.1 Streptomyces murinus strain NBRC 12799 16S ribosomal RNA, partial sequence 2710 2710 97% 0.0 99% NR_041072.1 Streptomyces griseofuscus 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2708 2708 97% 0.0 99% AY207605.1 Streptomyces sp WZ1-5019 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2700 2700 97% 0.0 99% HQ456134.1 Streptomyces sp MV2 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2697 2697 96% 0.0 99% GU220453.1 Bacterium TOPO-cloneB 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2695 2695 97% 0.0 99% HM243131.1 Streptomyces griseofuscus strain LS-H1 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 2691 2691 97% 0.0 99% GU138373.1 Streptomyces murinus gene for 16S rRNA, partial sequence, strain: NBRC 14802 2686 2686 96% 0.0 99% AB184622.1 Description Accession Kết so sánh trình tự gene 16rRNA cho thấy trình tự 16S rRNA chủng TB10.2 có độ tương đồng 99% với số loài thuộc chi Streptomyces Streptomyces padanus AF455813.1, Streptomyces graminearus AB184667.1, Streptomyces murinus NR_041072.1…Vì vây, 51 tiến hành dựng phân loại để xác định chủng TB10.2 thuộc lồi Hình 3.12 Cây phát sinh chủng loại chủng TB10.2 Từ phát sinh chủng loại nhận thấy chủng TB10.2 có quan hệ gần gũi với chủng S padanus điều hoàn tồn hợp lý với khóa phân loại cổ điển ISP Gauze cộng dựa vào đặc điểm ni cấy đặc điểm hình thái Từ đưa kết luận cuối chủng TB10.2 thuộc lồi Streptomyces padanus có tên Streptomyces padanus TB10.2 Hiện nay, giới số chủng xạ khuẩn thuộc lồi Streptomyces padanus có khả sinh chất kháng sinh công bố Theo Waksman, xạ khuẩn thuộc lồi Streptomyces padanus có khả sinh chất kháng sinh etabetacin hoạt phổ rộng ức chế vi sinh vật thông qua ức chế tổng hợp vật chất di truyền chúng Ngoài ra, kháng sinh cho thấy có hoạt tính diệt tế bào ung thư 3.4 Nghiên cứu động thái lên men chủng TB10.2 3.4.1 Lựa chọn môi trường lên men chủng xạ khuẩn TB10.2 Chủng S padanus TB10.2 nuôi lắc môi trường Gauze-1, ISP-4, A-4H với thơng số: - Thể tích: 100ml/bình tam giác 500 ml - Nhiệt độ: 28 - 30 oC - Tốc độ máy lắc: 200 vòng/phút 52 Kết thử hoạt tính kháng sinh dịch lên men ba mơi trường thấy hoạt tính kháng sinh mạnh môi trường Gauze - Kết thể bảng 3.15 Bảng 3.15 Hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn S padanus TB10.2 môi trường nghiên cứu Mơt trường Hoạt tính kháng sinh (D-d), mm Gauze-1 22 ISP-4 17 A-4H 16 Vì vậy, chọn mơi trường Gauze-1 để tiến hành nghiên cứu 3.4.2 biến động pH, tốc độ sinh trưởng sinh chất kháng sinh chủng xạ khuẩn TB10.2 Các thông số nghiên cứu biến đổi pH, tăng sinh khối trình lên men, hoạt tính kháng sinh dịch lên men Sau 24, 48, 144 nuôi cấy dịch lấy mẫu để xác định thơng số pH, hoạt tính kháng sinh, sinh khối Kết trình bày bảng 3.16 hình 3.13 Bảng 3.16 Sự biến đổi pH, hoạt tính kháng sinh, sinh khối chủng S padanus TB10.2 mơi trường Gauze-1 Thơng số pH Hoạt tính kháng sinh Sinh khối 7,0 24 Thời gian lên men ( giờ) 48 72 96 6,8 7,2 18 20 24 30 25 0,4 6,8 7,3 8,7 5 53 120 7,5 144 7,5 35 30 pH 25 20 hoạt tinh kháng sinh ( mm) sinh khèi 15 10 0 24 48 72 96 120 144 Hình 3.13 Động thái trình lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng xạ khuẩn Streptomyces padanus TB10.2 môi trường Gauze-1 Kết trình bày bảng 3.15 hình 3.13 cho thấy pH dịch lên men giảm dần sau 48 lên men sau lại tăng trở lại kết thúc trình lên men Khối lượng sinh khối chủng xạ khuẩn TB10.2 tích luỹ cao thời điểm 96h nuôi cấy (8,7 mg/ml) giảm dần sau Hoạt tính kháng sinh dịch lên men đạt cực đại sau ngày nuôi cấy giải thích chất kháng sinh chất trao đổi thứ cấp hình thành sau 1-2 ngày ni cấy 3.5 Nghiên cứu số tính chất dịch kháng sinh thô 3.5.1 Tách chiết chất kháng sinh Dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn S Padanus TB10.2 sau 120 nuôi cấy lọc qua giấy lọc tách làm phần: Phần dịch lọc điều chỉnh pH=7 chiết n-butanol cho bay butanol nhiệt độ 40oC Chất kháng sinh thô chủng xạ khuẩn TB10.2 tuyển chọn có màu vàng nghệ 3.5.2 Độ bền nhiệt dịch kháng sinh thô Để xác định độ bền nhiệt dịch kháng sinh thô chủng TB10.2 sinh ra, xử lý dịch kháng sinh thô nhiệt độ khác nhau: 40 oC, 60oC, 80oC 54 100oC khoảng thời gian phút, 10 phút, 15 phút 30 phút Sau đó, dịch kháng sinh xử lý nhiệt thử hoạt tính kháng sinh với vi khuẩn S.aureus Kết tình bày bảng 3.17 Bảng 3.17 Hoạt tính dịch kháng sinh thô chủng S Padanus TB10.2 sau xử lý nhiệt với vi sinh vật kiểm định S aureus (mm) Nhiệt độ Thời gian 40oC 60oC 80oC 100oC phút 13 10 10 10 10 phút 13 10 10 10 15 phút 10 8 30 phút 10 7 Tỷ lệ (%) 2,307 3 Hình 3.14 hoạt tính dịch kháng sinh thơ với vi khuẩn S.aureus sau xử lý nhiệt 100 0C 1: hoạt tính kháng sinh dịch kháng sinh thơ sau xử lý phút 2: hoạt tính kháng sinh dịch kháng sinh thô sau xử lý 10 phút 3: hoạt tính kháng sinh dịch kháng sinh thơ sau xử lý 15 phút 4: hoạt tính kháng sinh dịch kháng sinh thô sau xử lý 30 phút Qua bảng 3.17 cho thấy hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn chủng S padanus TB10.2 nhiệt độ xử lý, hoạt tính kháng sinh bị ảnh hưởng thời gian xử lý giảm dần nhiệt độ tăng Tuy nhiên, vịng vơ khuẩn xuất với độ rộng cao lỷ lệ giảm thấp từ -3% 30 phút sử lý nhiệt độ Điều chứng tỏ chất kháng sinh chịu nhiệt cần tiếp tục nghiên cứu sâu 3.5.3 Ảnh hưởng pH đến độ khuyếch tán dịch kháng sinh thô 55 Để xác định ảnh hưởng pH đến độ khuyếch tán kháng sinh, chủng S padanus TB10.2 tiến hành thử hoạt tính phương pháp đục lỗ với vi sinh vật kiểm định S aureus môi trường pH gradient gồm lớp Lớp thạch có chứa K2HPO4 để tạo pH = để nghiêng, lớp thứ thạch có chứa KH2PO4 pH= 5,6 lớp mơi trường LBA có chứa vi sinh vật kiểm định Sau 24 đo đường kính vịng vơ khuẩn, kết thể bảng 3.18 Bảng 3.18 Ảnh hưởng pH tới khuyếch tán chất kháng sinh pH 5,6 Hoạt tính kháng sinh (D-d, mm) 30 35 27 Hình 3.15 Ảnh hưởng pH tới khuếch tán kháng sinh Qua bảng 3.18 ta thấy chất kháng sinh khuyếch tán tốt pH = pH axit (pH = 5,6) độ khuyếch tán so với pH kiềm ( pH= 8) 3.5.4 Đặc điểm sắc kí dịch kháng sinh thơ chủng xạ khuẩn chủng S padanus TB10.2 số hệ dung môi Giá trị Rf chất kháng sinh thô chủng TB10.2 xác định cách chấm dịch kháng sinh thơ lên giấy sắc kí, chạy sắc kí số hệ dung mơi Sau hình phương pháp hình sinh học với vi sinh vật kiểm định vi khuẩn S aureus kết thu trình bày bảng 3.19, hình 3.16 hình 3.17 56 Hình 3.16 sắc ký đồ dịch kháng sinh thơ chủng TB10.2 Hình 3.17 Biểu đồ giá trị Rf chất kháng sinh thô chủng TB10.2 Bảng 3.19 Giá trị Rf dịch kháng sinh thô số hệ dung môi Hệ dung môi Rf Butanol bão hoà nước 0,227 Butanol: axetic:nước ( 2:1:1) 0,486 butanol bão hoà pyridine 2% 0,963 Nước bão hoà butanol 0,909 Kết thí nghiệm cho ta thấy chất kháng sinh chủng TB10.2 sinh có khả hịa tan tốt hệ dung mơi n-Butanol bão hịa pyridine 2% Vì dùng hệ dung mơi để tách chiêt chất kháng sinh tiến hành lên men sản xuất chất kháng sinh 57 Kết luận Từ 39 mẫu đất thu thập số địa phương thuộc tỉnh Thái Bình 34 mẫu đất rừng ngập mặn thuộc tỉnh Nam Định Chúng tiến hành phân lập từ 47 chủng xạ khuẩn phân lập 79 chủng Xạ Khuẩn NĐ Bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch, thử hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn phân lập sử dụng số vi sinh vật kiểm định gồm nấm mốc: Fusatium oxysporum; vi khuẩn Gram dương: B subtilis, S.aureus vi khuẩn Gram âm E.coli Kết thu 22 chủng xạ khuẩn tổng số 47 chủng phân lập Thái Bình 36 chủng xạ khuẩn tổng số 79 chủng xạ khuẩn phân lập Nam Định có khả sinh kháng sinh ức chế sinh trưởng phát triển vi sinh vật Đã phân lập chủng vi khuẩn S.aureus bệnh viện đa khoa tỉnh Bắc Ninh Có chủng xạ khuẩn TB có hoạt tính diệt vi khuẩn S aureus chủng TB10.2 TB32.4 có hoạt tính mạnh 19 mm 15 mm Đồng thời từ 10 chủng NĐ chủng có hoạt tính với vi khuẩn S aureus Tuy nhiên vịng hoạt tính có độ rộng thấp từ – 15mm Đã phân loại chủng TB10.2 theo phương pháp truyền thống Gauze cộng năm 1983 phương pháp sinh học phân tử dựa trình tự 16S rRNA xác định chủng TB10.2 giống với lồi Streptomyces padanus có hoạt tính kháng sinh phổ rộng Đã lựa chọn môi trường Gauze – mơi trường thích hợp cho trình sinh trưởng sinh tổng hợp chất kháng sinh Đã xác đinh thời gian lên men tối ưu cho trình sinh tổng hợp chất kháng sinh 120h, thời gian sinh trưởn mạnh chủng TB 10.2 sau 24h pH khuếch tán tốt pH trung tính kiềm Đã xác định hệ dung mơi hịa tan tốt cho chất kháng sinh chủng TB10.2 sinh hệ dung mơi n – Butanol bão hịa pyridine 2% 58 Tài liệu tham khảo Ngơ Đình Bính, Vũ Thị Nhung 1992 Đặc tính phân loại hai chủng xạ khuẩn 5820 THTN23 Tạp chí Sinh học, tập 14, số (9/1992) Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty 1998 Sinh vật học Nhà xuất Giáo dục Đường Hồng Dật.1970 Những nghiên cứu bảo vệ thực vật Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Vũ Thị Minh Đức 2001 Thực tập vi sinh vật học Nhà xuất Đại học Quốc Gia Hà Nội, Hà Nội Egorov N.X 1983 Thực tập vi sinh vật học (người dịch Nguyễn Lân Dũng) Nhà xuất Mir, Moxcova Đại học THCN, Hà nội Lê Gia Hy 1994 Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh Đạo ôn Thối cổ rễ phân lập Việt Nam Luận án phó tiến sĩ khoa học sinh học, Hà Nội Lê Gia Hy cộng 1992 Tính đối kháng xạ khuẩn phân lập từ đất Việt Nam bệnh Đạo ơn, Tạp chí Sinh học, tập 14, số (12/1992) Nguyễn Đức Lượng 1996 Công nghệ vi sinh vật Trường Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Hữu Phúc 1996 Vi sinh vật học công nghiệp Trường Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh 10 Nguyễn Hồi Nam.1966 Xác định hoạt lực kháng sinh phương pháp vi sinh vật Tập Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 11 Н.А.Красилников.1970 Лучитые Грибки Издательство «Наука», Москва 12 Г Ф Гаузе, Т.П.Преображенская, М А Свешникова, Л.П.Терехова, Т.С.Максимова.1983 Определитель Актиномицетов Издательство «Наука», Москва 13 A Seino 1993 Actinomycete culture colection: A brief outline Actinomycetologica 59 14 A L Demain 1981 Industrial Microbiology Sience, 214, 987-995 15 D A Hopwood and M.J.Merrick 1977 Genetics of antibiotic production Bacteriol Rev., 41, 596-636 16 George N Agrios 1999 Plant pathology, fourth edition 17 Michael J Carlile, Sarah C Watkinson, Graham W Gooday 1998 Fungi, 176-195 18 Sherling, E B and D Gottlieb 1966 Methods for characterization of Streptomyces species Intern j Syst.bact 16: 313 – 340 19 Sherling, E B and D Gottlieb 1968 Cooperative description of type cultures of Streptomyces Intern j Syst.bact.19 (4): 391 – 512 20 Sherling, E B and D Gottlieb 1972 Cooperative description of type strains of Streptomyces V Additional descriptions Intern.j Syst.bact., 22: 265 – 394 60