Sử dụng kỹ thuật pcr khảo sát sự nhiễm khuẩn tụ cầu vàng trong chế phẩm máu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ĐẶNG THỊ THANH HUYỀN SỬ DỤNG KỸ THUẬT PCR KHẢO SÁT SỰ NHIỄM KHUẨN TỤ CẦU VÀNG TRONG CHẾ PHẨM MÁU Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: T.S NGUYỄN THỊ THANH MAI PGS.TS KHUẤT HỮU THANH Hà Nội – 2013 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, cố gắng thân, tơi nhận giúp đỡ nhiệt tình thầy cô giáo môn công nghệ sinh học- Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội giúp đỡ cán công tác bệnh viện Nhi TW Đặc biệt, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Thanh Mai PGS TS Khuất Hữu Thanh, người thầy tận tình hướng dẫn, bảo tơi q trình học tập, nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn đến bạn bè người thân động viên, góp ý cho tơi suốt thời gian học tập hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày 25 tháng 03 năm 2013 Sinh viên Đặng Thị Thanh Huyền i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài luận văn thạc sỹ kỹ thuật: “Sử dụng kỹ thuật PCR khảo sát nhiễm khuẩn tụ cầu vàng chế phẩm máu” thực với hướng dẫn TS Nguyễn Thị Thanh Mai PGS.TS Khuất Hữu Thanh Đây chép cá nhân, tổ chức Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm nội dung mà tơi trình bày luận văn Hà Nôi, ngày 25 tháng 03 năm 2013 Học viên Đặng Thị Thanh Huyền ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT v MỞ ĐẦU TỔNG QUAN I.1 Truyền máu I.1.1 Khái quát chung truyền máu I.1.2 Các chế phẩm máu I.2 Nhiễm khuẩn truyền máu I.2.1 Yêu cầu truyền máu I.2.2 Tình hình nhiễm khuẩn truyền máu I.2.3 Nguyên nhân nhiễm khuẩn truyền máu cách phòng tránh I.3 Khái quát Staphylococcus aerus 10 I.3.1 Lịch sử phát tụ cầu vàng 10 I.3.2 Phân loại 11 I.3.3 Đặc điểm tụ cầu vàng 12 I.4 Một số kỹ thuật phát tụ cầu vàng 17 I.4.1.Phương pháp chuẩn đoán vi sinh 18 I.4.2 Kỹ thuật phân tử 20 PHẦN II: VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 30 II.1 Đối tượng nghiên cứu 30 II.2 Thiết bị, hoá chất sinh phẩm 30 II.2.1 Trang thiết bị 30 II.2.2 Hoá chất sinh phẩm 30 II.3 Phương pháp nghiên cứu 31 iii II.3.1 Thu thập mẫu nghiên cứu 31 III.3.2 Phương pháp phân lập 33 III.3.3 Phương pháp PCR xác định gen 16S tụ cầu vàng 34 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 III.1 Phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus 39 III.2 Tách chiết ADN tổng số: 40 III.3 Thực phản ứng PCR phát vi khuẩn S aureus 43 III.4 Tinh ADN 44 III.4 Đọc trình tự so sánh ngân hàng gen quốc tế 45 PHẦN IV: KẾT LUẬN 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC 53 iv DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT AND Axit deoxyribonucleic RNA Axit ribonucleic dNTP Deoxyribonucleotide 5’- triphosphates EDTA Ethylen diamin tetraacetic acid Epd Eppendorf EtBr Ethidium bromide LB Lauria- Bertani mRNA RNA thông tin PCR Polymerase Chain Reaction Rnase Ribonuclease Sol I, Sol II, Sol III Solution I, Solution II, Solution III TAE Tris- acetate- EDTA Taq polymerase Polymerase Thermus aquaticus TE Tris- EDTA X- gal 5- Bomo- chlorua 3- β- D- galactoside ACD Acid citric, citrat natri, dextrose CPD Citrat, phosphat, dextrose v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Nhiễm khuẩn liên quan đến sinh vật, 2005 đến năm 2010 FDA, Mỹ Bảng 1.2 Một số đặc tính sinh hóa vi khuẩn S aureus 14 Bảng 1.3 Bảng phân biệt S aureus S epidemidis, S saprophyticus 18 Bảng 2.1 Bảng lấy mẫu kí hiệu mẫu 32 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 35 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR cho giải trình tự gen 37 Bảng 3.1 Các mẫu nhiễm khuẩn phân lập 40 Bảng 3.2 Nồng độ ADN mẫu thu bệnh viện Nhi TW 41 Bảng 3.3 Nồng độ ADN tinh PCR từ mẫu tiểu cầu sau truyền ngày 44 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh túi máu Hình 1.2 Sơ đồ chế phẩm máu Hình 1.3 Tế bào vi khuẩn Staphylococcus aureus 11 Hình 1.4 Hình thể Staphylococcus aureus 12 Hình 1.5 Các yếu tố độc lực Staphylococcus aureus 15 Hình 1.6 Hình ảnh S aureus bắt màu Gram 19 Hình 1.7 Các bước thực LAMP 26 Hình 3.6 Cây phát sinh chủng loại chủng vi khuẩn thuộc chi staphylococcus 46 vii MỞ ĐẦU Ngày khoa học không ngừng phát triển chưa có chế phẩm thay máu Nhu cầu sử dụng máu chế phẩm máu ngày tăng điều trị nội khoa ngoại khoa Do truyền máu vấn đề nhiều người quan tâm, đặc biệt công tác sàng lọc chống nhiễm khuẩn Một tác nhân gây nhiễm khuẩn truyền máu tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) Tụ cầu vàng có khả gây nhiều bệnh nặng đề kháng kháng sinh chúng mạnh Tụ cầu vàng thường gây bệnh nhiễm trùng da Các ổ nhiễm trùng nhỏ to Tổn thương chố nhẹ nhàng mối nguy phát tán vi khuẩn đến quan xa Trẻ sơ sinh người mắc bệnh mạn tính đối tượng dễ bị tụ cầu xâm nhập Người cao tuổi, bị suy nhược, người lạm dụng thuốc kháng sinh, bệnh nhân đái tháo đường, xơ túi mật…cũng có nguy cao nhiễm loại vi khuẩn Hiểu mối nguy hại mà tụ cầu vàng mang đến truyền máu mà tiến hành đề tài: Sử dụng kỹ thuật PCR khảo sát nhiễm khuẩn tụ cầu vàng chế phẩm máu Đề tài thực Bệnh viện Nhi TW Mục đích đề tài: - Khảo sát nhiễm khuẩn tụ cầu vàng chế phẩm máu truyền cho bệnh nhân phương pháp hiệu mà tiết kiệm thời gian - Định hướng việc sàng lọc vi khuẩn nguốn cung cấp máu cho bệnh nhân Đề tài thực theo sơ đồ sau: Thu ththập mẫu Phân lập Tăng sinh Tách chiết ADN Xác định nồng độ ADN máy quang phổ Tinh PCR Điện di Tinh Giải trình tự gen dựng phân loại Immunother Infect Dis 3:201-210 13 Blajchman, M.A (2000): Reducing the risk of bacterial contamination of cellularn blood components Dev Biol Stand., 102, 183-193 14 Brecher, M.E (2002): Bacterial contaimination of blood products.p 789 In T.L Simon (ed), Rossi’s Principles of Transfusion Medicine 3rd ed Lippincott, Williams and Wilkims, Baltimore, Md 15 Brecher, M E., D Heath, S Hay, S Rothenberg, and L C Stutzman 2002 Evaluation of a new generation culture bottle using the BacT/ALERT 3D® Microbial Detection System on common contaminating organisms found in platelet components Transfusion 42:774-779 16 Bojar RM Treatment of mediastinal treatment Trong: manual of perioperative care in cardiac and thoracic surgery Blackwell science, 1999: 164-168 17 Diagnostic Microbiology Connie R., Mahon M.S., Giorge Manuselis J.R., W.B Saunder Company.1995 18 Dinges MM, Orwin PM, Schlievert PM Exotoxins of Staphylococcus aureus Clin Microbiol Rew 2000; 13: 16-34 19 Diagnostic Procudures for Bacterial, Mycotic, and parasitic infections, 5th Bodily Howard L., Ypdyke, Elaine L, Jame O American Public Health Association, Inc, New York, 1970 20 Dodd, R.Y (2000): Current viral risks of blood and blood components Ann Med.,32, 469-474 21 Fridey, J (ed.) 2003 Standards for blood banks and transfusion services, 22nd ed American Association of Blood Banks, Bethesda, Md 22 Gubernot DM, Nakhasi HL, Mied PA, et al Transfusion-transmitted 50 babesiosis in the United States: summary of a workshop Transfusion 2009;49:2759-2771 23 Gibson, T., and W Norris 1998 Skin fragments removed by injection needles Lancet 2:983-985 24 Goldman, M., G Roy, N Frechette, F Decary, L Massicotte, and G Delage 1997 Evaluation of donor skin disinfection methods Transfusion 37:309L-312L 25 Grimpel E, Sanchez PJ.et al Use of polymerase chain reaction and rabbit infectivity testing to detect Treponema pallidum in amniotic fluid, fetal and neonatal sera and cerebrospinal fluid J Clin Microbiol 29: 1711- 1718,9991 26 Gibson, T., and W Norris 1998 Skin fragments removed by injection needles Lancet 2:983-985 27 Hof H, Doerries R Staphylokokken Medizinische Mikrobiologie Georg Thieme Verlag Stuttgart 2002 275-284 28 J.B Tapko, Paul Mainu ka and A.I Diarra-Nama Status of blood safety in the who African Region 29 Marie B, Spielvogel C Produits sanguins Trong: Le livre de l’interne anesthésiologie Médecine-Sciences Flammarion 1998, chapitre 11: 182-201 30 Rae MA Transfusion therapy Trong: Clinical Anesthesia procedure of the Massachusetts General Hospital Lippincott-Raven, 2002: 543-547 31 Report of the US Department of Health and Human, Serviecs, op.cit pp 25-28 32 Theo Corey, G Ralph (2011) Staphylococcus aureus Bacteremia and Endocarditis: The Role of Diagnostic Evaluation Infectious Diseases in Clinical Practice: September 2011 - Volume 19 - Issue - pp 30751 312 doi: 10.1097/IPC.0b013e3182309603 NFID Clinical Updates 33 Tonetti L, Eder AE, Dy B, et al Transfusion-transmitted Babesia Microti identified through hemovigilance Transfusion 2009;49:25572563 34 Thekisoe OM, Bazie RS, Coronel-Servian AM, Sugimoto C, Kawazu S, Inoue N (2009) Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome ADN templates J Vet Med Sci 71(4): 471-475 35 Yamamura M, Makimura K, Ota Y (2009) Evaluation of a new rapid molecular diagnostic system for Plasmodium falciparum combined with ADN filter paper, loop-mediated isothermal amplification, and melting curve analysis Jpn J Infect Dis 62(1): 20-25 36 Yomtovian, R (2004): Bacterial contamination of blood: lessons from the past and road map for the future Transfusion, 44,450-460 52 PHỤ LỤC 53 Phụ lục 1: Kết giải trình tự gen mẫu bị nhiễm khuẩn  TCS1.3 ATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAG TCGAGCGAACGGACGAGAAGCTTG CTTCTCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGATAACCT ACCTATAAGACTGGGATAACTTC GGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAATATTTTGAACCGCATGGTTC AAAAGTGAAAGACGGTCTTGCTGT CACTTATAGATGGATCCGCGCTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACG GCTTACCAAGGCAACGATGCATA GCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTC CAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT AGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCG TGAGTGATGAAGGTCTTCGGATCG TAAAACTCTGTTATTAGGGAAGAACATATGTGTAAGTAACTGTGCAC ATCTTGACGGTACCTAATCAGAA AGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGG CAAGCGTTATCCGGAATTATTGGG CGTAAAGCGCGCGTAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCAC GGCTCAACCGTGGAGGGTCATTG GAAACTGGAAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGT GTAGCGGTGAAATGCGCAGAGATA TGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGAC GCTGATGTGCGAAAGCGTGGGGAT CAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGT GCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCC CCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACG 54 ACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGG AATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCG AAGCAACGCGAAGAACCTTACCAA ATCTTGACATCCTTTGACAACTCTAGAGATAGAGCCTTCCCCTTCGG GGGACAAAGTGACAGGTGGTGCA TGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAA CGAGCGCAACCCTTAAGCTTAGT TGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGTTGACTGCCGGTGACAAACC GGAGGAAGGTGGGGATGACGTCA AATCATCATGCCCCTTATGATTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGA CAATACAAAGGGCAGCGAAACCG CGAGGTCAAGCAAATCCCATAAAGTTGTTCTCAGTTCGGATTGTAGT CTGCAACTCGACTACATGAAGCT GGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCATGCTACGGTGAATACGTTCC CGGGTCTTGTACACACCGCCCGT CACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGAGTAACCTTT TAGGAGCTAGCCGTCGAAGGTGGG ACAAATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAGCT  TCS1.4 AGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAAC AGATAAGGAGCTTGCTCCTTTGAC GTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTACCTATAAG ACTGGAATAACTCCGGGAAACCGG GGCTAATGCCGGATAACATGTCGAACCGCATGGTTCTACAGTGAAA GACGGTCTTGCTGTCACTTATAGA TGGACCCGCGCCGTATTAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAA GGCGACGATACGTAGCCGACCTGA 55 GAGGGTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTA CGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTT CCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGA AGGTCTTCGGATCGTAAAGCTCTG TTGTTAGGGAAGAACAAATGTGTAAGTAACTGTGCACATCTTGACG GTACCTTACCAGAAAGCCACGGCT AACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTAT CCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGC GCGTAGGCGGTCTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCG TGGAGGGTCATTGGAAACTGGAA AACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGA AATGCGCAGAGATATGGAGGAACA CCAGTGGCGAAGGCGGCTTTCTGGTCTGCAACTGACGCTGACGTGC GAAAGCGTGGGGATCAAACAGGAT TAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTA GGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCT GCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGA CTGAAACTCATAGGAATTGACGGG GACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTCATTCGAAGCAACGCG AAGAACCTTACCAAATCTTGACAT CCTTTGACCGCTCTAGAGATAGAGTTTTCCTCTTCGGAGGACAAAGT GACAGGGGGTGCATGGTTGTCGT CAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAA CCCTTGAACTTAGTTGCCATCATT CAGTTGGGCACTCTAAGTTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGG TGGGGATGACGTCAAATCATCATG CCCCTTATGATTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAATACAAAG 56 GGCAGCAAAACCGCGAGGTCAAG CAAATCCCATAAAGTTGTTCTCAGTTCGGATTGTAGTCTGCAACTCG ACTACATGAAGCTGGAATCGCTA GTAATCGTAGATCAGCATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGT ACACACCGCCCGTCACACCACGA GAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGAGTAACCATTTTGGAGCTAG CCGTCGAAGGTGGGACAAATGATT GGGGTG  TCS5.3 AGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAAC AGATAAGGAGCTTGCTCCTTTGAC GTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTACCTATAAG ACTGGAATAACTCCGGGAAACCGG GGCTAATGCCGGATAACATGTCGAACCGCATGGTTCTACAGTGAAA GACGGTCTTGCTGTCACTTATAGA TGGACCCGCGCCGTATTAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAA GGCGACGATACGTAGCCGACCTGA GAGGGTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTA CGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTT CCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGA AGGTCTTCGGATCGTAAAGCTCTG TTGTTAGGGAAGAACAAATGTGTAAGTAACTGTGCACATCTTGACG GTACCTTACCAGAAAGCCACGGCT AACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTAT CCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGC GCGTAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCG TGGAGGGTCATTGGAAACTGGAA 57 AACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGA AATGCGCAGAGATATGGAGGAACA CCAGTGGCGAAGGCGGCTTTCTGGTCTGCAACTGACGCTGACGTGC GAAAGCGTGGGGATCAAACAGGAT TAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTA GGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCT GCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGA CTGAAACTCAAAGGAATTGACGGG GACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCG AAGAACCTTACCAAATCTTGACAT CCTTTGACCGCTCTAGAGATAGAGTTTTCCTCTTCGGAGGACAAAGT GACAGGTGGTGCATGGTTGTCGT CAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAA CCCTTGAACTTAGTTGCCATCATT CAGTTGGGCACTCTAAGTTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGG TGGGGATGACGTCAAATCATCATG CCCCTTATGATTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAATACAAAG GGCAGCAAAACCGCGAGGTCAAG CAAATCCCATAAAGTTGTTCTCAGTTCGGATTGTAGTCTGCAACTCG ACTACATGAAGCTGGAATCGCTA GTAATCGTAGATCAGCATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGT ACACACCGCCCGTCACACCACGA GAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGAGTAACCATTTTGGAGCTAG CCGTCGAAGGTGGGACAAATGATT GGGGTG  TCS5.4 TGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAACGGAC 58 GAGAAGCTTGCTTCTCTGATGTTA GCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGATAACCTACCTATAAGACTG GGATAACTTCGGGAAACCGGAGCT AATACCGGATAATATTTTGAACCGCATGGTTCAAAAGTGAAAGACG GTCTTGCTGTCACTTATAGATGGA TCCGCGCTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCA ACGATGCATAGCCGACCTGAGAGG GTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGG AGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGC AATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGT CTTCGGATCGTAAAACTCTGTTAT TAGGGAAGAACATATGTGTAAGTAACTGTGCACATCTTGACGGTAC CTAATCAGAAAGCCACGGCTAACT ACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGG AATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGT AGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGA GGGTCATTGGAAACTGGAAAACT TGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATG CGCAGAGATATGGAGGAACACCAG TGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGATGTGCGAAA GCGTGGGGATCAAACAGGATTAGA TACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGG GGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAG CTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGA AACTCAAAGGAATTGACGGGGACC CGCACAAGCGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAA CCTTACCAAATCTTGACATCCTTT 59 GACAACTCTAGAGATAGAGCCTTCTTCGGGGGACAAAGTGACAGGT GGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGT GTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAAG CTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGG CACTCTAAGTTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATG ACGTCAAATCATCATGCCCCTTAT GATTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAATACAAAGGGCAGCG AAACCGCGAGGTCAAGCAAATCCC ATAAAGTTGTTCTCAGTTCGGATTGTAGTCTGCAACTCGACTACATG AAGCTGGAATCGCTAGTAATCGT AGATCAGCATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCG CCCGTCACACCACGAAGAGTTTG TAACACCCGAAGCCGGTGGAGTAACCTTTTAGGAGCT Hình 3.5 trình từ ADN chủng vi khuẩn thu thập từ mẫu khuếch đại phản ứng PCR 60 Phụ lục 2: Kết so sánh trình tự gen mẫu bị nhiễm khuẩn Bảng 3.5: So sánh trình tự gen 16s rRNA TCS1.3 TCS5.4 Accessi on X7064 8.1 HE579 073.1 HE579 071.1 HE579 069.1 HE579 067.1 HE579 065.1 HE579 063.1 Max Description scor e S.aureus 16S rRNA (partial) 2654 Staphylococcus aureus subsp Aureus ST228 complete 2628 genome, isolate 18583 Staphylococcus aureus subsp Aureus ST228 complete 2628 genome, isolate 18412 Staphylococcus aureus subsp Aureus ST228 complete 2628 genome, isolate 18341 Staphylococcus aureus subsp Aureus ST228 complete 2628 genome, isolate 16125 Staphylococcus aureus subsp Aureus ST228 complete 2628 genome, isolate 16035 Staphylococcus aureus subsp Aureus ST228 complete 2628 genome, isolate 15532 61 Tota l scor e Query covera ge E value 2654 100% 0.0 1311 1309 1311 1309 1311 1311 Max iden t 100 % 100% 0.0 99% 100% 0.0 99% 100% 0.0 99% 100% 0.0 99% 100% 0.0 99% 100% 0.0 99% Accessi on Max Description scor e HE579 061.1 Staphylococcus aureus subsp Aureus ST228 complete 2628 genome, isolate 10497 Tota Query l covera scor ge e 1311 E value 100% 0.0 Max iden t 99% Bảng 3.6 So sánh trình tự gen 16s rRNA TCS1.4 TCS5.3 Ac Ma Tot ces x al sco sco re re sio Description n AB62 Staphylococcus GU05 7859 GU05 7858 covera ge E Max value ident intermedius 6130 gene for 16S rRNA, partial 2684 Query 2684 99% 0.0 99% 2682 2682 100% 0.0 99% 2682 2682 100% 0.0 99% 2663 2663 100% 0.0 99% sequence, strain: JCM 2422 Staphylococcus pseudintermedius strain 200801-6468-4 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Staphylococcus pseudintermedius strain 200801-4672-6 16S ribosomal RNA gene, partial sequence GU05 Staphylococcus sp 2008-01- 7857 1056-2 16S ribosomal RNA 62 Ac Ma Tot ces x al sco sco re re 2652 2652 99% 0.0 99% 2617 2617 99% 0.0 99% 2617 2617 99% 0.0 99% 2615 2615 100% 0.0 99% 2610 2610 97% 0.0 99% sio Description n Query covera ge E Max value ident gene, partial sequence Staphylococcus delphini strain NR_0 24666 ATCC 49171 16S ribosomal RNA, partial sequence >dbj|AB009938.1| Staphylococcus delphini rrn gene for 16S ribosomal RNA NR_0 37009 Staphylococcus subsp Schleiferi strain DSM 4807 16S ribosomal RNA, partial sequence S8356 16S 8.1 schleiferi rRNA [Staphylococcus schleiferi, Genomic, 1554 nt] Staphylococcus hyicus strain D Sompolinsky NR_0 36905 ribosomal no RNA, 16S partial sequence >dbj|D83368.1|STA16SRR16 Staphylococcus hyicus gene for 16S rRNA, partial sequence, strain: ATCC 11249 FJ536 Staphylococcus 63 Ac Ma Tot ces x al sco sco re re 2604 2604 97% 0.0 99% 2601 2601 97% 0.0 99% sequence 2601 2601 99% 0.0 99% 2591 100% 0.0 98% sio Description n Query covera ge E Max value ident 213.1 pseudintermedius strain ATCC 46052 16S ribosomal RNA, partial sequence Staphylococcus FJ536 pseudintermedius strain ATCC 212.1 51874 16S ribosomal RNA, partial sequence Staphylococcus FJ858 pseudintermedius strain ATCC 975.1 49051 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Staphylococcus lutrae strain NR_0 M340/94/1 16S ribosomal RNA, 36791 partial >emb|X84731.1| Staphylococcus sp gene for 16S ribosomal RNA JN64 Staphylococcus agnetis strain 4511 JB2_2A 16S ribosomal RNA 2591 gene, partial sequence 64 ... đề tài: Sử dụng kỹ thuật PCR khảo sát nhiễm khuẩn tụ cầu vàng chế phẩm máu Đề tài thực Bệnh viện Nhi TW Mục đích đề tài: - Khảo sát nhiễm khuẩn tụ cầu vàng chế phẩm máu truyền cho bệnh nhân phương... Huyền i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài luận văn thạc sỹ kỹ thuật: ? ?Sử dụng kỹ thuật PCR khảo sát nhiễm khuẩn tụ cầu vàng chế phẩm máu? ?? thực với hướng dẫn TS Nguyễn Thị Thanh Mai PGS.TS Khuất... cho PCR chẩn đoán [9,10]  Một số kỹ thuật PCR khác Một số kỹ thuật phát triển sở kỹ thuật PCR có ý nghĩa quan trọng cho định danh định typ vi sinh vật  Kỹ thuật PCR ngược (RT -PCR) RT -PCR kỹ thuật