ADN tinh sạch từ các sản phẩm PCR là TCS1.3, TCS1.4,TCS2.3 và
TCS2.4 được xác định theo phương pháp của Sanger & cộng sự trên máy xác định trình tự ADN tự động ABI 3100 Avant (Applied Biosystems) với bộ kit
xác định trình tự BigDye Terminater v.3.1 Cycle Sequencing Kit của hãng
Applied biosystems. Phương pháp giải trình tự đã được trình bày ở mục II.3.3.6. sau khi phân tích và sử lý số liệu trình tự gen 16s rRNA của các mẫu
được so sánh trên ngân hàng gen quốc tế bằng phần mềm BLAST. Kết quả thu được như hình 3.5 ở phần phụ lục 1.
Kết quả so sánh trình tự trên ngân hàng gen quốc tế cho thấy rằng gen mã hóa 16s rRNA của mẫu TCS5.4 có độ tương đồng 100% với gen 16S rRNA của loài vi khuẩn Staphylococcus aureus, trong khi đó, đoạn gen 16s
Hình 3.4. Điện di ADN tinh sạch của sản phẩm PCR các mẫu tiểu cầu sau truyền ngày 1 và 5
1,2,3,4: sản phẩm PCR của các mẫu TCS1.3, TCS1.4, TCS5.3, TCS5.4 5: Marker ADN
6: Đối chứng (+), sản phẩm PCR của chủng chủng Staphylococcus aureus
1 2 3 4 5 6
1500 bp
46
rRNA từ 3 mẫu TCS1.3, TCS1.4 và TCS5.3 có độ tương đồng 99% với một số loài vi khuẩn trong chi staphylococcus . Kết quả so sánh được thể hiện trong bảng 3.4 và bảng 3.5 ở phần phụ lục 2.
Từ kết quả phân tích trình tự cho thấy 4 mẫu tiểu cầu sau truyền của 2 ngày thứ nhất và thứ năm đã bị nhiễm khuẩn chi Staphylococcus trong đó có
mẫu TCS5.4 đã bị nhiễm tụ cầu vàng. Để biết chính xác 3 mẫu con lại là TCS1.3, TCS1.4 và TCS5.3 bị nhiễm loài nào trong chi staphylococcus và xác
định mối quan hệ giữa các loài của staphylococcus bị nhiễm trong các mẫu tiểu
cầu chúng tôi tiến hành dựng cây phát sinh chủng loại với các đoạn gen 16s rRNA của các chủng trong cùng chi staphylococcus gây bệnh cho người và
động vật gồm có:
- Đại diện cho tụ cầu vàng: Staphylococcus aureus 21193 - X70648.1,
Staphylococcus intermedius - AB626130.1
- Đại diện cho nhóm tụ cầu trắng: S.warneri - L37603.1, S. hominis -
AJ555141.1, S. simulans - D83373.1, S. capitis - AB009937.1, S. Haemolyticus - FR691469.1, S. Saprophyticus - L37596.1
Hình 3.6. Cây phát sinh chủng loại của các chủng vi khuẩn thuộc chi
47
Từ cây phát sinh chủng loại chúng tôi nhận thấy rằng ngồi mẫu TCS5.4 bị nhiễm S. aureus các mẫu cịn lại bị nhiễm các loài vi khuẩn khác nhau trong cùng chi staphylococcus . Trong đó 2 mẫu TCS1.4 và TCS5.3 bị
nhiễm cùng một lồi đó là staphylococcus intermedius một lồi vi khuẩn có khả năng sinh enzyme coagulase cùng nhóm với tụ cầu vàng. Mẫu cịn lại bị
nhiễm loài S. warneri một loài tụ cầu khơng có khả năng sinh enzyme
48