II.1 Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là vi khuẩn tụ cầu vàng (S. aureus) trong các
mẫu máu trước khi truyền cho bệnh nhân và mẫu máu cịn sót lại ở túi máu
sau khi đã truyền cho bệnh nhân.
Địa điểm tại bênh viện Nhi TW
II.2 Thiết bị, hoá chất và sinh phẩm
II.2.1 Trang thiết bị
• Máy lắc ổn nhiệt 370C
• Máy khuấy từ (RotoLab, OSI)
• Tủ lạnh sâu -200C, -800C (Sanyo- Nhật Bản)
• Cân điện tử (Mettler Toledo)
• Pipettman các loại (Gilson)
• Xilanh 5ml, bơng, cồn
• Máy xác định trình tự nucleotid tự động – ABI 3100 Avant (Applied
Biosystem, Mỹ)
• Máy chụp ảnh, máy quang phổ tử ngoại
• Máy ly tâm, máy PCR- PTC 100 (MJ Research, Mỹ)
• Bộđiện di ADN, máy soi ADN
• Máy hút chân không –Speed Vac Sc 110A; máy đo pH…
II.2.2 Hoá chất và sinh phẩm
Sinh phẩm
Bộ sinh phẩm tách chiết ADN tổng số QIAamp ADN Mini Kit only của QIA gene
Hoá chất
Các loại hoá chất như Ethidium bromide, trypton, agar, IPTG, X-gal, Ampicillin, cao nấm men, SDS, chloroform, agarose, TAE, isoamylalcohol,
31
EDTA, ethanol và các hoá chất thông dụng khác dung cho sinh học phân tử
của các hãng như New England Biolabs, Merk/ BDH Chemicals (Đức), Sigma (Mỹ)…
II.3 Phương pháp nghiên cứu II.3.1 Thu thập mẫu nghiên cứu II.3.1 Thu thập mẫu nghiên cứu
• Chuẩn bị dụng cụ:
Bơm tiêm nhựa vô trùng dùng một lần, loại 5ml Bông tẩm cồn
Ống nghiệm khơng có chất chống đơng có ghi tên mẫu máu lấy
Găng tay
• Tiến hành
Thu thập 2ml máu ở túi máu trước khi mang truyền cho bệnh nhân: Hàn 1 đoạn dây túi máu; dùng bông cồn sát khuẩn khu vực mà xilanh chọc
vào; rồi dùng xilanh hút 2ml máu cho vào ống nghiệm sạch .
Thu thập máu cịn sót lại ở những túi máu đã được truyền cho bệnh
nhân: treo ngược túi máu vào cọc truyền; dùng bông cồn sát khuẩn phần đầu
túi máu; lấy xilanh hút 2ml máu từ phía đầu túi máu cho vào ống nghiệm
sạch. Mẫu máu sau khi thu thập được bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh.
• Số lượng mẫu và ký hiệu mẫu
Số lượng mẫu là 90 mẫu. Sau khi thu thập các mẫu được mang về
phịng thí nghiệm rồi cho vào tủấm 37oC đểtăng sinh.
Mỗi lần lấy 5 mẫu trong đó có 2 mẫu là khối hồng cầu (HC), 2 mẫu là tiểu cầu (TC), một mẫu là huyết tương (HT)
32
Bảng 2.1. Bảng lấy mẫu và kí hiệu mẫu Lần lấy mấu Mẫu trước truyền Mẫu sau truyền Lần lấy mấu Mẫu trước truyền Mẫu sau truyền
Lần 1 HCT1.1 HCS1.1 HCTT1.2 HCS1.2 TCT1.3 TCS1.3 TCT1.4 TCS1.4 HTT1.5 HTTS1.5 Lần 2 HCT2.1 HCS2.1 HCT2.2 HCS2.2 TCT2.3 TCS2.3 TCT2.4 TCS2.4 HTT2.5 HTS2.5 Lần 3 HCT3.1 HCS3.1 HCT3.2 HCS3.2 TCT3.3 TCS3.3 TCT3.4 TCS3.4 HTT3.5 HTS3.5 Lần 5 HCT4.1 HCS4.1 HCT4.2 HCS4.2 TCT4.3 TCS4.3 TCT4.4 TCS4.4 HTT4.5 HTS4.5 Lần 5 HCT5.1 HCS5.1 HCT5.2 HCS5.2 TCT5.3 TCS5.3 TCT5.4 TCS5.4
33 HTT5.5 HTS5.5 Lần 6 HCT6.1 HCS6.1 HCT6.2 HCS6.2 TCT6.3 TCS6.3 TCT6.4 TCS6.4 HTT6.5 HTS6.5 Lần 7 HCT7.1 HCS7.1 HCT7.2 HCS7.2 TCT7.3 TCS7.3 TCT7.4 TCS7.4 HTT7.5 HTS7.5 Lần 8 HCT8.1 HCS8.1 HCT8.2 HCS8.2 TCT8.3 TCS8.3 TCT8.4 TCS8.4 HTT8.5 HTS8.5 Lần 9 HCT9.1 HCS9.1 HCT9.2 HCS9.2 TCT9.3 TCS9.3 TCT9.4 TCS9.4 HTT9.5 HTS9.5
III.3.2 Phương pháp phân lập
Mẫu sau khi thu thập sẽ được tăng sinh trong điều kiện 370C sau đó cấy
trải trên mơi trường chapman, kiểm tra sự phát triển của vi khuẩn trên bề mặt thạch sau 24h. Sau đó thu nhận những khuẩn lạc có vịng vàng phân giải
34
III.3.3 Phương pháp PCR xác định gen 16S của tụ cầu vàng
Mẫu sau khi thu thập sẽ được bổ sung nước cất rồi cho vào tủ ấm 37oC trong vòng 24 giờ để tăng sinh rồi tiến hành tách chiết ADN tổng số
II.3.3.1 Tách chiết ADN của vi khun S. aureus
ã 200 àl mỏu c a vào ống eppendorf 1,5 ml
• Bổ sung 20 àl proteinase K
ã B sung 200àl PBS.
ã B sung 200 àl buffer AL v vontex trong vịng 15S
• Ủ hỗn dịch ở 56 0C trong 10 phút
• Ly tâm nhẹ (spin) để các giọt bám trên nặp rơi xuống
• Bổ sung 200µl Ethanol 96% - 100% và votex đều sau đó spin xuống,
• Đưa lên cột, đóng nắp và ly tâm 6000v/p trong thời gian 1 phỳt, (b
dch).
ã B xung 500àl buffer AW1, ly tâm 8000 V/p trong thời gian 1 phút,
• Bổ sung 500µl AW2, ly tâm 14000 V/p trong thời gian 3 phút,
• Chuyển cột sang ống eppendord 1,5 ml. Bổ sung 20µl bufrer AE hoặc
nước vơ trùng.
• Ủ 1 phút ở nhiệt độ phịng (15-25oC).
• Ly tâm 8000 vịng/phút, 1phút.
• Điện di kiểm tra trên gel agarose 1%
II.3.3.2 Xác định nồng độ ADN bằng máy quang phổ
Nguyên tắc của phương pháp này dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm của các bazơ purin và primidin. Mức độ hấp thụ
ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm (A260) của mẫu cho phép xác định nồng
độ ADN trong mẫu.
35
Để đánh giá mức độ sạch của dung dịch người ta tính tỉ số OD260/OD280 = T. Nếu 1,8 < T < 2,0 thì dung dịch axit nucleic đó được coi là sạch.
II.3.3.3 Kỹ thuật PCR
Sau khi tách chiết và tinh sạch ADN tiến hành thực hiện phản ứng PCR theo bảng thành phần sau :
Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng PCR Thành phần phản ứng Nồng độ Lượng (µl) Thành phần phản ứng Nồng độ Lượng (µl)
Nước khử ion vô trùng 17 Buffer for Taq 10 lần 2.5
dNTP 10mM 2
27F 10pmol/ µl 1
1492R 10pmol/ µl 1
Taq 5U/ µl 0.5
ADN Template 50ng/ µl 1
Cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR nhân đoạn gen mã hóa 16s RNA là cặp mồi 16s universal 27F và 1492R với trình tựnhư sau:
27F: 5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG -3’
1429R: 5’- TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’ Chu trình nhiệt để tiến hành PCR nhân gen:
• 940C – 3 phút
• 940C – 1 phút
• 520C – 1 phút
• 720C – 1 phút 20 giây
• 35 chu kỳ (từ bước 2 đến bước 4)
• 720C – 8 phút
• Kết thúc ở 40C
36
Nguyên tắc: Các đoạn ADN có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương của máy điện di trong một
điện trường có điện thế và cường độ thích hợp.
Tiến hành:
(1) Chuẩn bị gel agaroza 1%: Cân 1g agaroza vào 100ml dung dịch
TAE 1X, đun cho agaroza tan hoàn toàn, để nguội khoảng 50-600C, đổ dung dịch agaroza vào khay điện di có cài sẵn răng lược. Sau 30-60 phút, khi gel đã
đông cứng, gỡ lược ra, đặt bản gel vào bể điện di, đổ đệm TAE 1X ngập cách
mặt gel từ 1-2mm.
(2) Mẫu ADN được trộn với đệm tra mẫu 5X (theo tỉ lệ 5:1), có tác dụng tạo mầu và để mẫu lắng xuống dưới. Tra mẫu vào giếng và chạy điện di
ở điện thế ổn định 100V cùng chỉ thị ADN chuẩn (marker) để xác định trọng lượng phân tử, quan sát sự di chuyển của màu để ngừng quá trình điện di.
(3) Bản gel được lấy nhẹ ra khỏi khuôn, ngâm khoảng 10 phút trong dung dịch ethidium bromide (EtBr) 2µg/ml, sau đó rửa bằng nước, quan sát
dưới ánh sáng tử ngoại 254nm trên máy soi ADN và chụp ảnh.
II.3.3.5. Tinh sạch ADN
ADN được tinh sạch theo QIAGEN Kit gồm các bước sau:
- Thêm 5 lần thể tích Buffer PBI và 1 lần thể tích mẫu sản phẩm cần tinh sạch rồi mix đều
- Chuyển dịch sang cột 2ml, li tâm 9000 vòng/1 phút, loại dịch
- Thêm 750 µl Buffer PE (có tác dụng rửa cặn), li tâm 9000 vòng/1
phút, loại dịch
- Tiếp tục li tâm 9000 vòng/ 1 phút để loại dịch - Chuyển cột sang ống Eppendorf mới
- Thêm 20 µl nước vơ trùng để ở nhiệt độ phịng trong 1 phút rồi li tâm
37
- Điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra
II.3.3.6. Xác định trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động ABI 3100
Trình tự ADN được xác định theo phương pháp của Sanger & cộng sự
[98] trên máy xác định trình tự ADN tự động ABI 3100 Avant (Applied Biosystems) với bộ kit xác định trình tự BigDye Terminater v.3.1 Cycle Sequencing Kit của hãng Applied biosystems. Quy trình xác định trình tự
được tiến hành theo 3 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: Thực hiện phản ứng tổng hợp với các thành phần như
sau:
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR cho giải trình tự gen Thành phần Thể tích/15 µl Thành phần Thể tích/15 µl Bigdye 3 ADN (150-300ng) X Mồi (3.2pmol) 1.275 Đệm 2.5X 3 H2O Bổ xung đến tổng thể tích 15 µl
Chu trình nhiệt được thực hiện trên máy chu kỳ nhiệt ABI 9700 (Applied Biosystems)
• Bước 1: 960C 1 phút
• Bước 2: 960C 10 giây
• Bước 3: 500C 5 giây
• Bước 4: 600C 4 phút, lặp lại 25 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4.
• Bước 5: 60oC 8 phút
• Bước 6: 4oC ∞
38
+ Bổ sung 5 µl EDTA 12,5 mM, pH=8. Ly tâm 4000v/ph trong 45 giây. + Bổ sung 60µl cồn 100%. ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.
+ Ly tâm 4500v/ph trong 45 phút để thu cặn.
+ Rửa cặn bằng 60 µl cồn 70%. Ly tâm 10.000v/ph để thu cặn. + Làm khô cặn trong 3 phút.
+ Hồ cặn trong 10 µl Hidiformamide. + Biến tính ở 95oC trong 3 phút.
+ Đưa mẫu cần phân tích vào máy giải trình tự gen tự động ABI 3100 - Giai đoạn 3: Phân tích kết quả giải trình tự gen bằng phần mềm PC/GENE.
Việc giải trình tự gen 16S được tiến hành bởi dịch vụ của công ty
Macrogen (Hàn Quốc), mỗi mẫu được trình tự với 2 phản ứng dùng mồi P1 và P2. Trình tự thu được từ hai phản ứng được lắp ráp lại bằng chương trình
SeMan trong bộ phần mềm Lasergene 7.0, đối chiếu kết quả lắp ráp với dữ
liệu giải trình tự ABI để xác định. Trình tự gen đã lắp ráp được so sánh tại
ngân hàng dữ liệu gen NCBI và số liệu được xử lý bằng phần mềm BLAST của NCBI. Kết quả được chọn là kết quả có Max Ident và Querry coverage cao nhất.
39
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN III.1. Phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus III.1. Phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus
Các mẫu hồng cầu, huyết tương, tiểu cầu trước khi truyền và sau truyền
được lấy về từ Bệnh viện Nhi TW, được cấy chải trên môi trường đăc hiệu
Chapman nhằm phát hiện các vi khuẩn staphylococcus aureus. Những khuẩn lạc vi khuẩn S. aureus là những khuẩn lạc khi phát triển trên môi trương trường chapman sẽ tạo nên một vòng màu vàng. Nguyên nhân do vi khuẩn
S.aureus có khả năng chuyển hóa đường manitol trong mơi trường còn các vi
khuẩn khác dưới lồi Staphylococcus thì khơng có khả năng này. Kết quả
phân lập thu được thể hiện qua hình 3.1 và bảng 3.1
Hình 3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus
40
Bảng 3.1 Các mẫu nhiễm khuẩn khi phân lập
Lần lấy mẫu Mẫu trước truyền Lượng mẫu nhiễm Tên mẫu nhiễm
HC TC HT 1 2 2 1 2 TCS1.3, TCS1.4 2 2 2 1 0 3 2 2 1 0 4 2 2 1 0 5 2 2 1 2 TCS5.3, TCS5.4 6 2 2 1 0 7 2 2 1 0 8 2 2 1 0 9 2 2 1 0
Từ kết quả phân lập trên chúng tôi nhận thấy từ 90 mẫu đã thu thập từ
bệnh viện Nhi TW chỉ có 4 mẫu là TCS1.3, TCS1.4, TCS5.3, TCS5.4 có sự
phát hiện của vi khuẩn Staphyloccus aureus. Các mẫu bị nhiễm tập trung và các mẫu tiểu cầu sau truyền của lần 1 và lần 5.
Để khẳng định chính sác các mẫu trên bi nhiễm trong quá trình lấy máu hoặc bị nhiễm sau khi truyền hay do bi nhiễm trong quá trình phân lập. Chúng tôi tiến hành tách chiết ADN của các mẫu và tiến hành chạy PCR với cặp mồi 16S universan để phát hiện vi khuẩn S.aureus.
III.2. Tách chiết ADN tổng số:
Từ 90 mẫu máu thu thập trước và sau khi truyền trong 9 lần tại bệnh viện Nhi TW chúng tôi tiến hành tách chiết ADN tổng số của vi sinh vật trong mẫu theo phương pháp đã được nêu trong mục II.3.3.1 và nồng độ ADN được
xác định theo mục II.3.3.2 của vật liệu phương pháp. Kết qủa thu được như
41
Theo kết quả thu được có 4 mẫu nghi ngờ là TCS1.3, TCS1.4, TCS5.3 và TCS5.4. Thực hiện phản ứng PCR với 4 mẫu nghi ngờ.
Bảng 3.2. Nồng độ ADN của các mẫu thu được tại bệnh viện Nhi TW Lần Tên mẫu Nồng độ AND Lần Tên mẫu Nồng độ AND
ng/10µl Lần Tên mẫu Nồng độ ADN ng/10µl Lần 1 HCT1.1 47 Lần 5 (tiếp) HCS5.1 65 HCT1.2 65 HCS5.2 62 TCT1.3 83 TCS5.3 83 TCT1.4 76 TCS5.4 79 HTT1.5 62 HTS5.5 75 HCS1.1 46 Lần 6 HCT6.1 57 HCS1.2 55 HCT6.2 78 TCS1.3 57 TCT6.3 72 TCS1.4 68 TCT6.4 76 HTS1.5 71 HTT6.5 54 Lần 2 HCT2.1 76 HCS6.1 58
Hình 3.2. Điện di sản phẩm tách chiết ADN tổng số trong mẫu máu 1-3: ADN tổng số của vi khuẩn tách từ các mẫu TCS1.3, HCT1.2, TCS1.4 4: marker ADN
5,6: ADN tổng số của vi khuẩn tách từ các mẫu TCS5.3, TCS5.4 1 2 3 4 5 6
42 HCT2.2 82 HCS6.2 71 TCT2.3 68 TCS6.3 49 TCT2.4 55 TCS6.4 66 HTT2.5 57 HTS6.5 62 HCS2.1 51 Lần 7 HCT7.1 71 HCS2.2 66 HCT7.2 77 TCS2.3 69 TCT7.3 65 TCS2.4 72 TCT7.4 61 HTS2.5 51 HTT7.5 73 Lần 3 HCT3.1 72 HCS7.1 79 HCT3.2 77 HCS7.2 68 TCT3.3 67 TCS7.3 50 TCT3.4 62 TCS7.4 55 HTT3.5 79 HTS7.5 78 HCS3.1 56 Lần 8 HCT8.1 71 HCS3.2 55 HCT8.2 62 TCS3.3 58 TCT8.3 55 TCS3.4 51 TCT7.4 58 HTS3.5 64 HTT7.5 72 Lần 4 HCT4.1 66 HCS7.1 79 HCT4.2 49 HCS7.2 56 TCT4.3 72 TCS7.3 53 TCT4.4 53 TCS7.4 57 HTT4.5 55 HTS7.5 72 HCT4.1 57 Lần 9 HCT9.1 77 HCT4.2 64 HCT7.2 74
43 TCT4.3 58 TCT7.3 65 TCT4.4 49 TCT7.4 67 HTT4.5 61 HTT7.5 83 Lần 5 HCT5.1 46 HCS7.1 79 HCT5.2 81 HCS7.2 58 TCT5.3 63 TCS7.3 50 TCT5.4 72 TCS7.4 59 HTT5.5 59 HTS7.5 78
III.3. Thực hiện phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn S. aureus
Sau khi tách chiết được ADN của vi các mẫu chúng tôi tiến hánh thực hiện phản ứng PCR với ADN đã tách được và cặp mồi 16s rRNA universal của vi khuẩn đã được nêu ở mục II.3.3.3 phần vật liệu phương pháp. Theo
như tính tốn lý thuyết của đoạn gen 16s rRNA được tổng hợp từ cặp 27F và 1492r có kích thước khoảng 1500 bp. Kết quảthu được như sau:
Từ kết quả thực hiện phản ứng PCR chúng tơi xác định chỉ có 4 mẫu tiểu cầu sau truyền của ngày thừ 1 và 5 có xuất hiện băng có kích thước
Hình 3.3. Điện di sản phẩm PCR của đoạn gen 16s rRNA từ ADN 1 số
mẫu tách từ viện nhi trung ương
1,2,3,5: sản phẩm PCR của các mẫu TCS1.3, TCS1.4, TCS5.3, TCS5.4 4: Marker ADN
6: Đối chứng (+), sản phẩm PCR của chủng chủng Staphylococcus aureus
1 2 3 4 5 6 bp
44
khoảng 1,5 kb đúng với kích thước lý thuyết của đoạn gen có thể tổng hợp bằng căp mồi 27F và 1492r, các mẫu cịn lại khơng thấy xuất hiện băng sau khi điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel Agarose 0,8 %. Điều này có thể
giái thích ngun nhân là do mẫu đã bị nhiễm khuẩn sau khi truyền cho bệnh.
Điều kiện bên ngoài của bênh viên chua được đảm bảo. Để xác định chính xác các mẫu trên bị nhiễm lồi vi khuẩn nào, đăc biệt có là nhiễm vi khuẩn
staphylococcus aureus hay không chúng tôi tiến hành chạy PCR các với
lượng lớn các mẫu trên để tiến hành tinh sạch ADN, đọc trình tự trực tiếp từ
sản phẩm PCR tinh sạch và so sánh với trình tự gen 16s rRNA trên ngân hàng gen quốc tế. Đồng thời dựng cây phát sinh chủng loại để xác định mối quan hệ giứa các chủng vi khuẩn này.
III.4. Tinh sạch ADN
Sản phẩm PCR lương lớn của các mẫu tiểu cầu ngày thứ nhất và ngày thứ 2 nghi nhiễm vi khuẩn tụ cầu vàng được tinh sạch theo QIAGEN Kit đã được trình bày ở mục II.3.3.5 và xác định nồng độtheo phương đã được trình bày ở mục II.3.2 sử dụng máy đo quang phổ ở bước sóng A260. Kết quả thu