Nước khử ion vô trùng 17 Buffer for Taq 10 lần 2.5
dNTP 10mM 2
27F 10pmol/ µl 1
1492R 10pmol/ µl 1
Taq 5U/ µl 0.5
ADN Template 50ng/ µl 1
Cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR nhân đoạn gen mã hóa 16s RNA là cặp mồi 16s universal 27F và 1492R với trình tựnhư sau:
27F: 5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG -3’
1429R: 5’- TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’ Chu trình nhiệt để tiến hành PCR nhân gen:
• 940C – 3 phút
• 940C – 1 phút
• 520C – 1 phút
• 720C – 1 phút 20 giây
• 35 chu kỳ (từ bước 2 đến bước 4)
• 720C – 8 phút
• Kết thúc ở 40C
36
Nguyên tắc: Các đoạn ADN có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương của máy điện di trong một
điện trường có điện thế và cường độ thích hợp.
Tiến hành:
(1) Chuẩn bị gel agaroza 1%: Cân 1g agaroza vào 100ml dung dịch
TAE 1X, đun cho agaroza tan hoàn toàn, để nguội khoảng 50-600C, đổ dung dịch agaroza vào khay điện di có cài sẵn răng lược. Sau 30-60 phút, khi gel đã
đông cứng, gỡ lược ra, đặt bản gel vào bể điện di, đổ đệm TAE 1X ngập cách
mặt gel từ 1-2mm.
(2) Mẫu ADN được trộn với đệm tra mẫu 5X (theo tỉ lệ 5:1), có tác dụng tạo mầu và để mẫu lắng xuống dưới. Tra mẫu vào giếng và chạy điện di
ở điện thế ổn định 100V cùng chỉ thị ADN chuẩn (marker) để xác định trọng lượng phân tử, quan sát sự di chuyển của màu để ngừng quá trình điện di.
(3) Bản gel được lấy nhẹ ra khỏi khuôn, ngâm khoảng 10 phút trong dung dịch ethidium bromide (EtBr) 2µg/ml, sau đó rửa bằng nước, quan sát
dưới ánh sáng tử ngoại 254nm trên máy soi ADN và chụp ảnh.
II.3.3.5. Tinh sạch ADN
ADN được tinh sạch theo QIAGEN Kit gồm các bước sau:
- Thêm 5 lần thể tích Buffer PBI và 1 lần thể tích mẫu sản phẩm cần tinh sạch rồi mix đều
- Chuyển dịch sang cột 2ml, li tâm 9000 vòng/1 phút, loại dịch
- Thêm 750 µl Buffer PE (có tác dụng rửa cặn), li tâm 9000 vòng/1
phút, loại dịch
- Tiếp tục li tâm 9000 vòng/ 1 phút để loại dịch - Chuyển cột sang ống Eppendorf mới
- Thêm 20 µl nước vơ trùng để ở nhiệt độ phịng trong 1 phút rồi li tâm
37
- Điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra
II.3.3.6. Xác định trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động ABI 3100
Trình tự ADN được xác định theo phương pháp của Sanger & cộng sự
[98] trên máy xác định trình tự ADN tự động ABI 3100 Avant (Applied Biosystems) với bộ kit xác định trình tự BigDye Terminater v.3.1 Cycle Sequencing Kit của hãng Applied biosystems. Quy trình xác định trình tự
được tiến hành theo 3 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: Thực hiện phản ứng tổng hợp với các thành phần như
sau:
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR cho giải trình tự gen Thành phần Thể tích/15 µl