I.4.1 .Phương pháp chuẩn đoán vi sinh
I.4.2 Kỹ thuật phân tử
I.4.2.1 Kỹ thuật PCR
Khái quát chung
PCR là phương pháp khuếch đại chọn lọc một đoạn ADN theo luật số mũ.
Phản ứng nhân gene được thực hiện với enzyme ADN chịu nhiệt, hai mồi
tổng hợp và 4 loại deoxyribonucleic (dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Mỗi một chu kỳ phản ứng nhân gene gồm 3 bước[6,9]:
- Bước 1: Biến tính ADN, có tác dụng tách hai sợi đơn từ sợi khuôn xoắn kép.
21
- Bước 3: Kéo dài chuỗi theo mồi, chiều 5’ -3’ với quá trình trùng hợp gắn các dNTP dọc theo sợi khuôn để tạo thành phiên bản mới theo nguyên tắc bổ sung.
Tính đặc hiệu của phản ứng được qui định bởi mồi và sự sao chép trực tiếp
theo trình tự sợi khuôn giữa hai mồi. Như vậy, kết quả tạo ra hàng triệu phiên bản sợi khuôn trong vài giờ.
Kỹ thuật PCR dựa trên sự xúc tác của enzym ADN polymerase để nhân bản một đoạn ADN nhờ hai đoạn mồi oligonucleotid (primers) tương hợp với
hai đầu 3’ ở hai mạch đơn của đoạn AND.
Sau khi phân lập bệnh phẩm trên môi trường đặc hiệu, các khuẩn lạc nghi ngờ sẽđược tiến hành ADN làm khuôn mẫu cho PCR để tìm gen [6,10]
Phương pháp này có những ưu điểm là độ đặc hiệu cao, khắc phục được nhược điểm của các thử nghiệm khác. Tuy nhiên đây là một phương pháp địi hỏi phải có máy móc, trang thiết bị và sinh phẩm đắt tiền nên không phải ở đâu cũng có khả năng thực hiện[9,10].
Nghiên cứu mới đây được thực hiện bởi Harbarth và cộng sự thực hiện cho thấy so với kỹ thuật nuôi cấy thường quy, phương pháp PCR giúp làm giảm thời gian phát hiện các chủng tụ cầu vàng kháng Methicillin ở các bệnh
nhân được điều trị tại các đơn vị chăm sóc tích cực nội khoa từ 106 giờ xuống 23 giờ và giảm từ 87 giờ xuống 21 giờ ở các bệnh nhân được điều trị tại các
đơn vị chăm sóc tích cực ngoại khoa [34].
Các thông số kỹ thuật
Bất kỳ một phản ứng PCR nào cũng bắt đầu bằng việc tách ADN làm sợi khn. Nói chung, theo lý thuyết chỉ cần một sợi khuôn cũng đủ cho phản
ứng tạo ra sản phẩn nhưng trong thực tế cần khoảng 10-100 ng/phản ứng. Đôi
khi chuẩn bị ADN theo phương pháp đơn giản không cần tinh sạch cũng phù hợp cho phản ứng PCR. Tuy nhiên, điều quan trọng là tránh sự có mặt của
22
EDTA (acide ethylene- diamine- tetraacetique) hoặc đệm phosphat vì kết quả
sẽ làm giảm Mg++ do EDTA tạo thành muối Mg3(PO4)2 khi nhiệt độ cao. Phản ứng PCR có thể nhân được đoạn gene dài 10Kb nhưng trong thực tế thường dùng để nhân các đoạn có kích thước ngắn hơn (<2Kb).
Số chu kỳ cho phản ứng tạo sản phẩm đặc hiệu từ 20-30 chu kỳ. Điều chú ý là các mồi cho phản ứng phải có nhiệt độ bắt cặp với ADN đích gần nhau, có trình tự không bổ sung nhau để tránh bắt cặp với nhau. Trình tự đầu
3’ của các mồi cũng phải khác với trình tự vùng trung tâm của sản phẩm để tránh tạo thành hiện tượng kẹp tóc. Nói chung, ngày nay người ta có thể tối
ưu hóa nhờ sự trợ giúp của các chương trình máy tính.
Đơi khi cũng xuất hiện hiện tượng nhân sản phẩm PCR không đặc hiệu,
điều này thường xuất hiện khi dùng các cặp mồi suy biến từ chuỗi acid amin.
Tuy nhiên trong hầu hết các trường hợp này thì việc thay đổi điều kiện phản
ứng có thể hạn chế được các sản phẩm không mong muốn. Các thành phần
như nhiệt độ, nồng độ Mg++ và enzyme có ảnh hưởng lớn đến tính đặc hiệu. Sự có mặt của nonidet-40 có tác dụng tăng hiệu suất phản ứng.
Ưu điểm của phản ứng PCR
Thử nghiệm PCR có thể phát hiện vi sinh vật gây bệnh có độ nhạy cực cao mà khơng có một thử nghiệm nào trước đây có thể so sánh được. Sở dĩ được
như vậy vì chỉ cần dưới 1 vi sinh vật gây bệnh có mặt trong mẫu thử là có thể
hiện diện acid nucleic đích và được PCR khuếch đại [9,10]
Trong các thử nghiệm huyết thanh hay miễn dịch học, chìa khóa chính của thử nghiệm là có được trong tay các kháng thể hay kháng nguyên đặc hiệu. Nếu không muốn mua sản phẩm thương mại, nhà miễn dịch học phải tự chế và đây là một công việc rất công phu và tốn thời gian. Trong khi đó với PCR, chìa khóa chính của thử nghiệm là vấn đề tìm cho được các đoạn mồi đặc
23
nghiên cứu đã nghiên cứu được và với một phần mềm chuyên dùng, một nhà vi sinh vật học hay sinh học phân tử có thể tự chọn những cặp mồi theo đúng
trình tự đã chọn. Sau khi tổng hợp xong, làm đơng khơ có thể giữ rất bền trong điều kiện bình thường. Cơng việc của nhà nghiên cứu lúc này là thử
nghiệm xem các đoạn mồi được chọn có nhạy cảm và đặc hiệu như mong
muốn hay khơng, nếu khơng thì lại chọn một cặp mồi khác [9,10].
Một ưu điểm khác của PCR trong chẩn đốn bệnh nhiễm khuẩn là PCR chẳng những có thể phát hiện được tác nhân vi sinh vật gây bệnh trực tiếp trong bệnh phẩm mà cịn có thể phân loại type di truyền của các vi sinh vật này, không cần phải nuôi cấy được vi khuẩn. Đây là một đóng góp rất lớn trong nghiên cứu dịch tễ học tìm hiểu mối liên quan của các tác nhân gây bệnh trong cộng đồng.
Ngồi ra PCR cịn có thể phát hiện vi khuẩn kháng kháng sinh, một chìa khóa chủ yếu để bác sỹ điều trị có thể sử dụng phác đồ điều trị đúng cho bệnh nhân.
Một số khó khăn với phản ứng PCR
PCR là kỹ thuật có ý nghĩa lớn trong nghiên cứu sinh học phân tử nhưng
cũng nảy sinh một số vấn đề cần chú ý đặc biệt khi phát hiện một số bệnh
virus hay vi khuẩn. Vấn đề ở đây là acid nucleic của cả tế bào chết và tế bào sống đều cho kết quảdương tính trong phản ứng PCR. Hiện tượng dương tính
giả chủ yếu là do mẫu thử bị nhiễm bởi các sản phẩm PCR trước đó. Chỉ cần mẫu thử bị nhiễm một hoặc vài mảnh sản phẩm PCR thì các mảnh này sẽ
được khuếch đại và mẫu cho kết quả dương tính nhưng là dương tính giả. Để
có thể tránh được kết quả dương tính giả, PCR chẩn đốn phải được thực hiện trong một phịng thí nghiệm có tổ chức chặt chẽ, các giai đoạn thí nghiệm phải được thực hiện tại những khu vực riêng, với các đồ dùng thí nghiệm riêng, sử dụng nhiều vật liệu chỉ dùng một lần (đầu pipette, ống nghiệm phản
24
ứng,…).Ngồi ra cịn phải áp dụng nhiều biện pháp để loại trừ ngoại nhiễm
như: trộn sẵn trong ống nghiệm làm phản ứng men Uracil N Glycosylase (UNG) là men có khả năng phá hủy các sản phẩm PCR ngoại nhiễm trước khi phản ứng PCR xảy ra. Chính nhờ vệc sử dụng UNG mà các thử nghiệm chẩn
đoán phát hiện vi sinh vật gây bệnh có thể thực hiện được tại bất cứ phịng thí nghiệm nào, khơng cần phải tại một phịng thí nghiệm được thiết kế đặc biệt cho PCR chẩn đoán [9,10].
Một số kỹ thuật PCR khác
Một số kỹ thuật phát triển trên cơ sở của kỹ thuật PCR có ý nghĩa quan trọng cho định danh và định typ vi sinh vật
Kỹ thuật PCR ngược (RT-PCR)
RT-PCR là kỹ thuật PCR cải tiến từ kỹ thuật PCR chuẩn, sử dụng để nhân gen (hoặc các đoạn ADN) từ mạch khuôn là mRNA và RNA. Kỹ thuật này gồm 2 giai đoạn: giai đoạn phiên mã ngược từ mạch khuôn RNA tạo đoạn
cADN và giai đoạn thực hiện phản ứng PCR chuẩn để nhân cADN tạo nên số lượng bản sao ADN cần thiết [6].
Kỹ thuật PCR lồng (Nested PCR)
Nested PCR là kỹ thuật thực hiện 2 lần PCR chuẩn kế tiếpthuật PCR lồng (Nested PCR). Nó có thể làm tăng thêm độ nhạy của thử nghiệm một khi acid
nucleic đích hiện diện khá ít trong mẫu thử.
Nested PCR là kỹ thuật thực hiện 2 lần PCR chuẩn kế tiếp nhau. Trong đó, lần PCR thứ nhất sử dụng cặp mồi không mấy đặc hiệu để khuếch đại nucleic
đích đến một số lượng nào đó đủ để vào giai đoạn kế, khuếch đại đoạn acid
nucleic đích bằng cặp mồi đặc hiệu cao có vị trí bắt cặp nằm bên trong các
đoạn acid nucleic được khuếch đại trong giai đoạn đầu. PCR lồng được sử
dụng phổ biến trong phân loại phân tử, cho phép khuếch đại các đoạn ADN
25
động thực vật, các chủng vi sinh vật...[6]. Kỹ thuật PCR đảo (Inverse PCR)
Kỹ thuật PCR đảo là phương pháp PCR để nhân một đoạn ADN chưa biết trên phân tử ADN, nằm trước hoặc sau một đoạn ADN đã biết một trình tự. Ngồi ra cịn có kỹ thuật PCR dạng neo (Achored PCR), kỹ thuật PCR phức (Multiplex PCR), kỹ thuật PCR tại chỗ.
I.4.2.2 Kỹ thuật Lamp
LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification) là phương pháp khuếch đại nucleic acid đơn giản, nhanh chóng và tiết kiệm. Sử dụng 4 mồi khác nhau được thiết kế đặc biệt nhận ra 6 đoạn riêng biệt trên gen đích và
quá trình phản ứng xảy ra ở nhiệt độ cố định dùng phản ứng thay thế mạch. Khuếch đại và phát hiện gen có thể được hồn thành chỉ trong 1 bước. Bằng
cách ủ hỗn hợp mẫu, primers, ADN polymerase có hoạt tính thay thế mạch và chất nền ở nhiệt độ cố định (khoảng 650C). Phương pháp này cho hiệu quả
khuếch đại cao với lượng ADN được khuếch đại đến 109-1010 lần trong vòng 15-60 phút. Bởi vì tính đặc hiệu cao, sự hiện diện của sản phẩm khuếch đại có thể chứng tỏ sự có mặt của đoạn gen quan tâm [34,35]
26 Hình 1.7 Các bước thực hiện LAMP
Đặc điểm
- Không cần bước làm tách mạch đôi thành dạng mạch đơn.
- Cả phản ứng khuếch đại xảy ra liên tục dưới điều kiện đẳng nhiệt. - Hiệu quả khuếch đại rất cao.
- Thiết kế 4 primers nhận ra 6 đoạn riêng biệt, phương pháp LAMP có thể khuếch đại đặc hiệu đoạn gen cần quan tâm.
- Tổng giá thành có thể được giảm giá vì LAMP khơng địi hỏi hóa chất
đặc biệt và thiết bị phức tạp. Nguyên tắc phản ứng
Khi đoạn gene quan tâm và hoá chất được ủ ở nhiệt độ cố định khoảng 60-
65°C trong vòng 45-60 phút và kết thúc phản ứng bằng cách ủ ở nhiệt độ 80
độ trong 2-10 phút [35].
Ưu điểm và nhược điểm của LAMP
Phương pháp LAMP khơng địi hỏi điều kiện phịng thí nghiệm hiện đại,
27
thích hợp cho chẩn đốn phân tử virus, vi khuẩn và ký sinh trùng gây bệnh ở các nước đang phát triển vùng nhiệt đới [34,35].
Nếu như PCR\RT-PCR bao gồm cả multiplex-PCR, cho sản phẩm đặc hiệu là ADN mạch thẳng thuận lợi cho các phương pháp sinh học phân tử
phân tích đặc tính của gen hay hệ gen sau khi tách dòng và giải trình tự thì LAMP\RT-LAMP cho sản phẩm đặc hiệu là ADN bắt cặp các chuỗi lại với nhau tạo mạch vịm khơng thuận lợi cho tách dòng và xem xét thành phần gen hay hệ gen. Nhưng LAMP có lợi thế cực kỳ to lớn là sản phẩm hiển thị ở
dạng vẩn đục trắng do sản sinh muối pyrophosphate hoặc với chất huỳnh quang nhìn thấy bằng mắt thường phục vụ nhanh chóng cho chẩn đoán. Trong trường hợp LAMP sử dụng làm Kit chẩn đoán, người ta thiết kế thêm một cặp mồi đặc hiệu bám vào hai đầu biên của vùng gen đích để thực hiện phản ứng PCR\RT-PCR, thu sản phẩm ADN-thẳng, rồi tách dịng, giải trình tự để kiểm nghiệm tính đặc hiệu cho chắc chắn. Phương pháp kiểm tra giả nghiệm cũng được thực hiện với các nguồn khuôn khác nhau vủa vi sinh vật cùng giống để đảm bảo chắc chắn tính chính xác và đặc hiệu của kit chẩn đoán LAMP
[34,35].
I.4.2.3 Kỹ thuật lai phân tử
Các phân tử ADN sợi kép có một tính chất đặc biệt là khả năng biến tính (phân tách thành hai mạch đơn) và hồi tính (hai mạch đơn có trình tự bổ
trợ có xu hướng liên kết trở lại khi vắng mặt các tác nhân gây biến tính). Khả
năng liên kết bổ trợ giữa các bazơ nitơ cũng cho phép hai mạch ADN có
nguồn gốc khác nhau nhưng có trình tự bổ trợ liên kết với nhau trong điều kiện phù hợp (về nhiệt độ, độ pH, ion hoá p) để tạo nên một phân tử ADN mới [6].
Hiện tượng liên kết như vậy cũng có thể xảy ra giữa hai mạch ADN với nhau, hoặc giữa hai mạch RNA hoặc giữa ADN và RNA. Phân tử axit nucleic
28
sợi kép mới hình thành gọi là phân tử lai và quá trình kết cặp giữa các bazơ
thuộc hai mạch đơn axit nucleic có nguồn gốc khác nhau theo nguyên tắc bổ
trợ như vậy được gọi là quá trình lai phân tử [6].
I.4.2.4 Chip sinh học
Một trong những kỹ thuật hàng đầu trong các công nghệ sinh học phải kể đến là kỹ thuật Chip sinh học (còn gọi là Gen-Chip, ADN-Chip, Bio-Chip). Nhiều chuyên gia cho rằng, chip sinh học sẽ thay đổi toàn bộ các phương
pháp nghiên cứu hiện nay trong lĩnh vực tìm kiếm các loại thuốc trị bệnh.. Với Chip sinh học các cơng ty có thể giảm thời gian nghiên cứu và phát triển từhai đến ba năm và như vậy chi phí sẽ giảm đi hằng trăm triệu Euro.
Chip sinh học là một miếng vuông nhỏ bằng thuỷ tinh hay bằng nhựa nhân tạo. Trên đó được chia thành nhiều ơ cực nhỏ giống như một bàn cờ và mỗi một ô của chip sinh học chứa một đoạn ADN đã biết. Để đưa một đoạn
ADN vào các khung nhỏ người ta dùng phương pháp quang học hoặc cơ học với kỹ thuật phun.
Trung bình mỗi ơ chip sinh học chứa khoảng 10 triệu phân tử nucleotid.
Đầu năm 2000 người ta chế tạo được một chip sinh học với 64000 nucleotid
khác nhau, trên một diện tích 1,28cm x 1,28 cm.
Để xác định sự hoạt động của gen các nhà nghiên cứu dựa vào hai yếu tố: loại và số lượng của phân tử mRNA xuất hiện trong tế bào. Phân tử
mRNA là bản sao của ADN. Trong quá trình thể hiện tính trạng của một gen (một hay nhiều đoạn ADN), mRNA có nhiệm vụ mang thơng tin của ADN trong nhân tế bào đưa đến, “nhà máy” sản xuất protein là ribosom để tổng hợp
các protein tương ứng. Vì vậy, việc xuất hiện của mRNA là một bằng chứng về sự hoạt động của gen. Tuy nhiên trên thực tế phân tử mRNA khó sử dụng nên các nhà khoa học thường dùng bản sao của mRNA là phân tử cADN.
29
một hay nhiều loại tế bào của người hay một sinh vật nào đó. Nhưng trước khi
đưa lên chip sinh học các phân tử cADN của mẫu sẽ được đánh dấu bằng một loại ánh sáng màu (fluorescent) để dễ nhận diện. Theo ngun tắc “chìa khố và ổ khố” các màng ADN phù hợp sẽ được ADN của chip giữ lại. Với một
loại đèn phát quang đặc biệt người ta có thể phân biệt chúng một cách dễ
dàng.
Chip sinh học không chỉ dùng để xác định sự hoạt động của gen mà người ta còn áp dụng để khám phá các loại vi trùng gây bệnh. Điểm lợi của phương pháp dùng chip sinh học so với các phương pháp chẩn đoán cổ diển là
30