Bigdye 3 ADN (150-300ng) X Mồi (3.2pmol) 1.275 Đệm 2.5X 3 H2O Bổ xung đến tổng thể tích 15 µl
Chu trình nhiệt được thực hiện trên máy chu kỳ nhiệt ABI 9700 (Applied Biosystems)
• Bước 1: 960C 1 phút
• Bước 2: 960C 10 giây
• Bước 3: 500C 5 giây
• Bước 4: 600C 4 phút, lặp lại 25 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4.
• Bước 5: 60oC 8 phút
• Bước 6: 4oC ∞
38
+ Bổ sung 5 µl EDTA 12,5 mM, pH=8. Ly tâm 4000v/ph trong 45 giây. + Bổ sung 60µl cồn 100%. ủ ở nhiệt độ phịng trong 15 phút.
+ Ly tâm 4500v/ph trong 45 phút để thu cặn.
+ Rửa cặn bằng 60 µl cồn 70%. Ly tâm 10.000v/ph để thu cặn. + Làm khô cặn trong 3 phút.
+ Hồ cặn trong 10 µl Hidiformamide. + Biến tính ở 95oC trong 3 phút.
+ Đưa mẫu cần phân tích vào máy giải trình tự gen tự động ABI 3100 - Giai đoạn 3: Phân tích kết quả giải trình tự gen bằng phần mềm PC/GENE.
Việc giải trình tự gen 16S được tiến hành bởi dịch vụ của cơng ty
Macrogen (Hàn Quốc), mỗi mẫu được trình tự với 2 phản ứng dùng mồi P1 và P2. Trình tự thu được từ hai phản ứng được lắp ráp lại bằng chương trình
SeMan trong bộ phần mềm Lasergene 7.0, đối chiếu kết quả lắp ráp với dữ
liệu giải trình tự ABI để xác định. Trình tự gen đã lắp ráp được so sánh tại
ngân hàng dữ liệu gen NCBI và số liệu được xử lý bằng phần mềm BLAST của NCBI. Kết quả được chọn là kết quả có Max Ident và Querry coverage cao nhất.
39
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN III.1. Phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus III.1. Phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus
Các mẫu hồng cầu, huyết tương, tiểu cầu trước khi truyền và sau truyền
được lấy về từ Bệnh viện Nhi TW, được cấy chải trên môi trường đăc hiệu
Chapman nhằm phát hiện các vi khuẩn staphylococcus aureus. Những khuẩn lạc vi khuẩn S. aureus là những khuẩn lạc khi phát triển trên môi trương trường chapman sẽ tạo nên một vòng màu vàng. Nguyên nhân do vi khuẩn
S.aureus có khả năng chuyển hóa đường manitol trong mơi trường cịn các vi
khuẩn khác dưới lồi Staphylococcus thì khơng có khả năng này. Kết quả
phân lập thu được thể hiện qua hình 3.1 và bảng 3.1
Hình 3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus
40