SỬ DỤNG KỸ THUẬT RFLP KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Rhizoctonia solani PHÂN LẬP TỪ NHIỀU CÂY KÝ CHỦ KHÁC NHAU (Nội dung khóa luận)

Đề tài được thực hiện trên đối tượng là nấm Rhizoctonia solani. Đây là nấm có khả năng gây bệnh trên nhiều cây trồng khác nhau, ảnh hưởng rất lớn đến năng suất của cây trồng.

1 Phần I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Rhizoctonia solani (R solani) loài nấm gây hại điển hình, chúng tồn lâu đất gây thiệt hại nghiêm trọng nhiều loài trồng khác nhau, đặc biệt chúng thường xuyên công vào giai đoạn làm chết hàng loạt khiến nhiều diện tích phải gieo trồng lại R solani gây bệnh đốm vằn phổ biến lúa mà gây hại cho nhiều trồng khác, từ dài ngày thông, cà phê, tiêu, sầu riêng đến ngắn ngày họ đậu, bắp, họ cải, v.v kể cỏ dại cỏ ống, cỏ tre, cỏ gừng, cỏ rộng, cỏ Phòng trừ bệnh R solani gây biện pháp sử dụng giống kháng khó nấm có phổ ký chủ rộng Thêm vào biến động độc tính gây bệnh dòng phân lập nấm làm phức tạp đáng kể sàng lọc giống kháng Mặt khác, việc thiếu kiến thức cấu trúc di truyền R solani quần thể tự nhiên làm cản trở phát triển biện pháp phòng trừ an tồn cho mơi truờng với tác nhân gây bệnh Ngày với phát triển công nghệ sinh học, nhiều kĩ thuật đời kĩ thuật PCR, RFLP, AFLP, Southern blot, sequence v.v giúp cho trình nghiên cứu cấu trúc di truyền quần thể nấm R solani nhanh xác Trên giới, kĩ thuật áp dụng thành công việc nghiên cứu đa dạng di truyền nấm R solani Ở nước ta, nghiên cứu cịn Xuất phát từ tình hình trên, phân cơng Bộ mơn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, chúng tơi thực đề tài “Sử dụng kỹ thuật RFLP khảo sát đa dạng di truyền nấm Rhizoctonia solani phân lập từ nhiều ký chủ khác nhau” 1.2 Mục tiêu Cung cấp thông tin đa dạng di truyền quần thể nấm R solani làm dễ dàng cho việc phát triển chiến lược phòng trừ bệnh R solani gây 1.3 Yêu cầu đề tài - Phục hồi nhân sinh khối dịng nấm R solani - Ly trích DNA dòng nấm R solani - Thực phản ứng PCR để khuếch đại vùng rDNA-ITS nấm R solani - Thực phản ứng cắt đoạn rDNA-ITS khuếch đại - Đánh giá đa dạng dòng nấm R solani dựa phân tích RFLP vùng rDNA-ITS 1.4 Giới hạn đề tài Chỉ tiến hành cắt giới hạn với enzyme cắt giới hạn dòng nấm đại diện Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu nấm Rhizoctonia solani Nấm Rhizoctonia nhóm nấm lớn, đa dạng phức tạp, phân bố rộng chia thành nhiều nhóm nấm khác Giai đoạn hữu tính liên quan đến giống: Thanatephorus (giai đoạn vơ tính Rhizoctonia solani Kuhn), Ceratobasidium (giai đoạn vơ tính lồi Rhizoctonia hai nhân), Waitea (giai đoạn vơ tính loài R zeae Voorhees, R oryzae Ryker Gooch loài khác) (Carling Sumner, 1992) Rhizoctonia solani thuộc nấm trơ Mycelia sterilia, lớp nấm bất toàn Fungi imperfecti Giai đoạn sinh sản hữu tính gọi Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk, thuộc lớp nấm đảm Basidiomycetes, nấm kí sinh khơng chun tính, có phổ kí chủ rộng 2.1.1 Đặc điểm hình thái Ở giai đoạn vơ tính, nấm phát triển dạng sợi, tạo hạch Sợi nấm cịn non khơng màu, già chuyển sang màu nâu tích lũy sắc tố nâu Sợi nấm đa bào, có đường kính từ - 13µm, phân nhánh tương đối thẳng góc, chỗ phân nhánh thắt lại, hình thành vách ngăn gần vị trí phân nhánh (Vũ Triệu Mân Lê Lương Tề, 1998) R solani có loại sợi nấm: sợi nấm bị (runner hyphae), sợi nấm phân nhánh (lobate hyphae), tế bào dạng chuỗi (moniloid cells) (dẫn theo Phan Minh Sang, 2003) Lúc già, tế bào tách biến thành hạch Đặc điểm hạch thay đổi Hạch nấm cịn non có màu trắng già có màu nâu, nâu đen, nâu xám, vỏ có lơng Hạch nấm có hình dạng phức tạp, hình cầu, đáy phẳng, bề mặt hạch không trơn mà lồi lõm (Đường Hồng Dật, 1976) Đường kính hạch nấm từ 16 mm Từng hạch nấm liên kết lại với tạo thành hạch nấm to (Ou, 1983) Hạch nấm cịn non chìm nước già lên tế bào phía ngồi hạch trở nên rỗng (dẫn theo Phạm Minh Sang, 2003) Bào tử hậu gặp, phát sinh có ẩm độ cao Sinh sản hữu tính tạo đảm đơn bào, khơng màu, hình bầu dục, có từ - bào tử đảm, hình trứng hình bầu dục dẹt Ở nước ta chưa thấy dạng sinh sản hữu tính (Vũ Triệu Mân Lê Lương Tề, 1998) Bào tử đảm khơng có khả tồn lâu có vai trị lớn biến đổi di truyền nấm (dẫn theo Hồ Viết Thế, 2005) 2.1.2 Đặc điểm sinh lý Theo Vũ Triệu Mân Lê Lương Tề (1998), nấm sinh trưởng thích hợp nhiệt độ 28 – 32oC, nhiệt độ 10oC cao 38oC nấm ngừng sinh trưởng Hạch nấm hình thành nhiều nhiệt độ 30 – 32oC Khi nhiệt độ thấp (12oC) q cao (40oC), nấm khơng hình thành hạch Nấm phát triển phạm vi pH rộng từ 3,4 - 9,2, thích hợp độ pH - Hạch nấm hình thành nhiều ngồi ánh sáng nhiệt độ môi trường giảm đột ngột Các hạch nấm nảy mầm nhiệt độ 16 – 30oC, nhiệt độ tối ưu 28 – 30oC Ẩm độ tương đối 95 - 96% thích hợp cho hạch nấm nảy nầm (Ou, 1983) Hạch nấm có kích thước lớn, số lượng hạch nhiều độc tính cao Hạch nấm sống - tháng đất khô, tháng điều kiện ngập nước (Đường Hồng Dật, 1976) R solani lưu trữ nhiệt độ phòng (20 - 300C) từ - 12 tháng ống nghiệm chứa môi trường PDA (potato dextrose agar), PDYA (potato dextrose yeast extract agar) vật liệu trồng tự nhiên Nấm tồn trữ mơi trường hạt đậu khơ đến năm mà khơng làm tính độc Tính độc chúng bị vịng - tháng tồn trữ nhiệt độ từ - 70C (Carling Sumner, 1992) 2.1.3 Đặc điểm nuôi cấy Nấm R solani khơng địi hỏi nhu cầu dinh dưỡng chuyên biệt, phát triển tốt nhiều loại mơi trường khác Hạch nấm thường hình thành sau 3-4 ngày ni cấy Hạch nấm hình thành nhiều hay ít, có hình thành hay khơng phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy, điều kiện ngoại cảnh phụ thuộc vào nhóm nấm khác Hạch nấm thường mọc rải rác khắp đĩa, có lồi mọc rời, có lồi mọc thành mảng liên kết với Tuy nhiên có lồi khơng hình thành hạch (Nguyễn Minh Nguyệt, 2003) Hạch nấm mọc môi trường ni cấy có kích thước lớn so với hạch nấm mọc kí chủ tự nhiên (Ou, 1983) 2.2 Điều kiện phát sinh bệnh R solani xâm nhập ký chủ gây bệnh mạnh điều kiện nhiệt độ tương đối cao (25 - 300C), ẩm độ 90% đến bão hòa, mưa liên tục Kỹ thuật canh tác: mật độ cây, chăm sóc, phân bón, thủy lợi,…đều liên quan đến việc phát sinh bệnh Nấm xâm nhập vào mơ qua khí khổng xuyên trực tiếp qua cutin (Ou, 1983) Nấm có khả gây bệnh phạm vi nhiệt độ 23 - 310C, nhiệt độ tối thích 310C, ẩm độ tương đối 70 - 90% (dẫn theo Nguyễn Việt Long, 2001) Hình 2.1 Chu kỳ gây bệnh nấm Rhizoctonia solani (Nguồn: Agrios, 1997) 2.3 Phạm vi ký chủ nấm R solani Nấm R solani phổ biến nhiều nơi gây bệnh cho 180 loại thuộc 60 họ thực vật khác (Đường Hồng Dật, 1976) Quốc gia có bệnh nấm gây Ngồi lúa, nấm cịn gây bệnh lúa miến, bắp, mía, đậu nành, đậu xanh Nấm gây bệnh lở cổ rễ cà phê, trà, héo rũ dưa chuột bầu bí, gây lở cổ rễ hại bông, héo vàng khoai tây (dẫn theo Nguyễn Việt Long, 2001) Haque (1975) phát đậu phộng (Arachis hypoaea), ớt (Capcicum annum), cà rốt (Daucus carota), đậu nành (Glycine max), vải (Gossypium sp.), đại mạch (Hordeum vulgar), xà lách (Lactuca savita), lúa (Oryzae sativa), bắp (Zea mays), cà chua (Lycopersicum esculentum) nhiễm R solani (dẫn theo Hồ Viết Thế, 2005) Theo Vũ Triệu Mân Lê Lương Tề (1998), nấm R solani loại nấm bán ký sinh, có tính chuyên hóa rộng, phạm vi ký chủ bao gồm 180 loài trồng khác Ở Việt Nam, đậu nành, bắp, lúa miến (Shorgum vulgare), mía, 27 lồi cỏ dại khác đồng sông Cửu Long ký chủ nấm R solani Trong Mỹ, có khoảng 550 lồi ký chủ nấm R solani ghi nhận (dẫn theo Nguyễn Việt Long, 2001) 2.4 Sự phân nhóm nấm R solani R solani Kuhn lồi nấm phức tạp, khơng đồng Nhiều nghiên cứu cho thấy có khác biệt dòng phân lập nấm mặt hình thái học, sinh lý học khả gây bệnh cho loại trồng Có hai kiểu phân loại R solani: (i) Phân loại dựa khác tốc độ tăng trưởng, hình thành hạch nấm đặc điểm phát triển khuẩn lạc Theo cách phân loại này, Watanabe Matsuda (1966) xếp dịng phân lập nấm R.solani thành nhóm: 1A, 1B, II, IIIA, IIIB,và IIIC (dẫn theo Phạm Minh Sang, 2003) (ii) Phân loại dựa tiếp hợp (Anastomosis) sợi nấm Chúng xếp theo nhóm AG (Anastomosis Group) khác sở phản ứng tiếp hợp chúng Xác định nhóm liên hợp AG dòng phân lập giúp cho việc nhận biết phân nhóm dịng nấm R solani nấm thực dễ dàng (Carling ctv, 1992) Dựa vào liên hợp sợi nấm, R solani (T cucumeris) phân chia làm 11 nhóm tiếp hợp từ AG-1 đến AG-11 AG-BI (Carling Sumner, 1992)  AG-1: nhóm phân bố khắp giới, dựa hình thái ni cấy gây bệnh, dịng phân lập AG-1 phân thành tiểu nhóm: - AG-1-IA: gọi kiểu hay kiểu “sasakii”, gây bệnh cho phận mặt đất bệnh đốm vằn lúa, gây cháy nhiều ký chủ, bệnh đốm nâu cỏ thảm (turfgrass) - AG-1-IB: gọi kiểu hay kiểu “hạch nấm nhỏ”, gây bệnh cho phận mặt đất bệnh tàn rụi bệnh cháy nhiều trồng - AG-1-IC: có đất, gây chết (damping-off) nhiều ký chủ Không thể phân biệt cách rõ ràng ba tiểu nhóm phản ứng tiếp hợp  AG-2: Dựa khả gây bệnh nhu cầu dinh dưỡng, nhóm phân chia thành tiểu nhóm - AG-2-1: cịn gọi kiểu “vụ đơng”, có đất, gây chết con, thối rễ nhiều ký chủ lở cổ rễ cho họ thập tự - AG-2-2 IIIB: cịn gọi kiểu “cây cói” (rush), gây bệnh cho rễ phận mặt đất, gây chết nhiều ký chủ, bệnh đốm nâu cỏ bệnh khô vằn cói - AG-2-2 IV: cịn gọi kiểu “thối rễ”, gây bệnh cho rễ phận mặt đất, gây bệnh cháy thối rễ củ cải đường (Beta vulgaris L.), gây bệnh thối rễ nhiều trồng khác bệnh đốm lớn cỏ thảm  AG-3: tìm thấy nơi trồng khoai tây, nhóm nấm khơng chia thành nhóm nhỏ Những dịng AG-3 mọc chậm nói chung chịu đựng nhiệt độ lạnh nhóm tiếp hợp khác R solani, gây bệnh thối rễ thân khoai tây (Solanum tuberosum L.)  AG-4: gọi kiểu “praticola”, AG-4 phân chia thành hai nhóm HG-I HG-II, dựa khác tính tương đồng DNA, không dựa phản ứng liên hợp AG-4 nhóm nấm đất, làm thối rễ chết nhiều loại trồng Bệnh AG-4 xảy toàn giới  AG-5: nhóm nấm đất nhất, gây bệnh thối rễ thân khoai tây nói chung độc nhóm AG-3 Những dịng AG-5 địi hỏi thiamine môi trường dinh dưỡng Bệnh AG-5 xuất châu Âu, châu Á Bắc Mỹ  AG-6: nhóm khơng gây bệnh, AG-6 có Nhật Bản, chia thành hai tiểu nhóm HG-I GV Hai tiểu nhóm phân biệt với dựa khác tính tương đồng DNA, không dễ dàng phân biệt phản ứng tiếp hợp  AG-7: nhóm nấm đất, gây thiệt hại khơng đáng kể cho số loại rau Nhóm tìm thấy Nhật Bản  AG-8: tác nhân gây bệnh đất, gây bệnh đốm ngũ cốc nguyên nhân gây bệnh thối rễ khoai tây AG-8 tìm thấy nước Úc, Tây Bắc nước Mỹ nước Anh  AG-9: tìm thấy Alaska Oregon, khả gây bệnh yếu, công vào khoai tây rau xanh  AG-10: tìm thấy Tây Bắc Thái Bình Dương, khả gây bệnh chưa biết rõ  AG-BI: gọi nhóm “bridging isolate”, tìm thấy Nhật Bản Những dịng thuộc AG-BI có khả liên hợp mức với dịng phân lập AG-2, AG-3, AG-6, AG-8 AG-BI nhóm nấm đất địi hỏi thiamine mơi trường ni cấy, khả gây bệnh chưa biết rõ Theo Carling (1996); Carling ctv (1999); Sneh ctv (1991), R solani lồi tập hợp, khơng đồng nhất, chia thành 14 nhóm tiếp hợp (AGs) bao gồm từ AG-1 tới AG-13 AG-BI (bridging isolate) Trong 14 dịng AGs cơng nhận, có 24 tiểu nhóm mơ tả (dẫn theo Priyatmojo ctv, 2001) 2.5 Các phƣơng pháp phân tử thƣờng dùng để nghiên cứu đa dạng di truyền nấm R solani 2.5.1 Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Phương pháp PCR phương pháp khuếch đại nhanh nhiều đoạn DNA mà không cần phải qua tạo dòng Phương pháp K Mullis đưa năm 1985 Saiki hoàn thiện năm 1988 Đây phương pháp thực hoàn toàn ống nghiệm thời gian ngắn thu nhiều DNA 2.5.1.1 Nguyên tắc phƣơng pháp PCR Phương pháp thực ống nghiệm với diện enzyme DNA-polymerase, theo nguyên tắc bán bảo tồn nhân DNA Sự khuếch đại thực nhờ chu trình nhiệt lặp lại Phản ứng xảy nhờ enzyme DNA-polymerase DNA tách thành hai mạch từ mạch DNA thành mạch DNA, mạch DNA thành mạch DNA nhân lên đến vô 2.5.1.2 Các thành phần cần thiết để thực phản ứng PCR Trong phản ứng PCR cần thành phần như: DNA khuôn, primer, DNA polymerase chịu nhiệt, dNTPs, dung dịch đệm, MgCl2 - DNA khn: chứa trình tự cần khuếch đại, sợi đơn sợi kép - Primer: thường có độ dài từ 20 – 30 nucleotide, gọi nhân tố khuếch đại (amplifer) - DNA polymerase chịu nhiệt: tách từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus, loài vi khuẩn phát triển điều kiện nhiệt độ từ 80 – 95oC Chỉ enzyme chịu nhiệt hoạt động điều kiện nhiệt độ cao phản ứng PCR - dNTPs: Gồm loại nucleotide ATP, TTP, CTP, GTP cần cho tổng hợp chuỗi DNA - MgCl2: Trong phản ứng PCR, MgCl2 có mục đích: ion Mg2+ tạo thành phức với dNTP để gắn dNTP với enzyme; kích thích hoạt tính polymerase; tăng T m (melting temperature) DNA tương hỗ primer với khuôn Nồng độ cuối phản ứng PCR thường 0,5 – mM, mức tối ưu – 1,5 mM - Dung dịch đệm: Môi trường KCl áp dụng rộng rãi, dung dịch đệm hữu dụng cho phản ứng PCR pH dung dịch đệm xem xét phản ứng PCR Hầu hết dung môi phản ứng đệm môi trường 10 – 200 mM Tris-HCl pH = 8,3, nhiệt độ 20oC Tuy nhiên, pH giảm nhiệt độ tăng Theo chu kỳ nhiệt độ PCR, pH thay đổi từ 7,8 đến 6,8 2.5.1.3 Tiến hành phản ứng PCR Một phản ứng PCR thường tiến hành qua giai đoạn - Giai đoạn 1: nâng nhiệt độ lên cao, thường từ 94 – 95oC Ở nhiệt độ tất mạch xoắn kép DNA tách - Giai đoạn 2: nhiệt độ hạ nhanh xuống khoảng từ 50 – 60oC, phụ thuộc vào Tm primer Ở nhiệt độ hai primer bắt cặp với hai sợi DNA theo hướng 5’ – 3’ - Giai đoạn 3: nhiệt độ phản ứng nâng lên 72 oC Ở nhiệt độ DNA polymerase hoạt động việc kéo dài mạch DNA Nguyên liệu dùng giai đoạn loại dNTP Cứ sau chu kỳ gồm giai đoạn từ DNA khuôn tạo DNA khuôn Như vậy, sau 30 chu kỳ ta có khoảng 100 triệu DNA khn 10 Ngồi giai đoạn chính, người ta cịn thực chu kỳ khởi động trước thực giai đoạn chu kỳ kết thúc sau thực chu kỳ lặp lại 2.5.1.4 Các nhân tố ảnh hƣởng đến phản ứng PCR DNA khn: có vai trò quan trọng, ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu PCR Phản ứng PCR tối ưu với đoạn khn hồn tồn tinh sạch, đoạn khn khơng lẫn protein, hiệu PCR giảm theo độ tinh DNA khuôn Enzyme DNA polymerase mạnh, phản ứng PCR triệt để Tùy đặc tính enzyme DNA polymerase, tùy thuộc nguồn gốc tách chiết enzyme, hiệu phản ứng PCR khác Primer yếu tố quan trọng định hiệu phản ứng PCR Chọn primer cần tính tốn bảo đảm Tm primer xuôi ngược không chênh lệch lớn Nồng độ loại nucleotide khoảng 20 – 200 M loại, nồng độ nucleotide thấp hiệu PCR giảm mạnh Nồng độ Mg2+ ảnh hưởng nhiều đến hiệu PCR, để có hiệu PCR cao cần lưu ý bảo đảm thành phần dịch đệm, nhiệt độ thành phần cần thiết thực phản ứng PCR 2.5.1.5 Lợi ích phản ứng PCR Phương pháp PCR có ý nghĩa lớn khoa học thực tiễn Đây thực cách mạng lớn kĩ thuật di truyền - Thời gian thực nhanh Ta cần khoảng để khuếch đại trình tự DNA Trong với phương pháp tạo dịng ta phải cần tuần - Đơn giản tốn Phương pháp thực ống epffendorf nhỏ Trong phương pháp tạo dòng cần nhiều vật liệu đắt tiền màng, NTP mang dấu hiệu phóng xạ địi hỏi phải thành thạo thao tác - Độ tinh mẫu khơng cần cao Phản ứng PCR thực với mẫu DNA thô Trong phương pháp tái tổ hợp DNA cần đoạn gen vectơ tương đối tinh khiết Khó khăn phương pháp phải biết trình tự nucleotide đoạn DNA cần khuếch đại Phương pháp không thay phương pháp tái tổ hợp DNA mà góp phần bổ sung cho phương pháp tái tổ hợp DNA 30 M 500bp 200bp Hình 4.6 Ảnh điện di sản phẩm cắt vùng rDNA-ITS nấm R solani enzyme hạn chế Alu I RM-61; BV-61-02; CX-8-02; CTĐ-77; BV-62-03; M Ladder 100 bp; KT-63-01; XL-4; L-73; ĐHL-63 Kết cho thấy, vùng rDNA-ITS dòng nấm R solani (RM-61, BV-61-02, L-73) có vị trí cắt Alu I, dòng (CX-8-02, CTĐ-77, BV-62-03, KT-6301, XL-4, ĐHL-63) có hai vị trí cắt Alu I, tạo đoạn cắt có chiều dài khác Với enzyme Hae III, vùng rDNA-ITS tất dịng nấm R solani nói có hai vị trí cắt enzyme cho ba phân đoạn DNA với chiều dài đoạn cắt khác tùy theo dòng nấm dòng nấm cho kiểu cắt RFLP: kiểu H1 (dòng RM-61, BV-61-02, CTĐ-77, BV-62-03, L-73) với băng có kích thước khoảng 510 bp, 120 bp, 90 bp; kiểu H2 (dòng CX-8-02) với băng có kích thước khoảng 500 bp, 120 bp, 90 bp; kiểu H3 (dòng KT-63-01) với băng có kích thước khoảng 580 bp, 490 bp, 120 bp; kiểu H4 (dòng XL-4) với băng có kích thước khoảng 510 bp, 120 bp, 80 bp; kiểu H5 (dịng ĐHL-63) với băng có kích thước khoảng 530 bp, 120 bp, 80 bp (Hình 4.7 Bảng 4.4) LD LD 31 M M 500bp 500bp 100bp 100bp Hình 4.7 Ảnh điện di sản phẩm cắt vùng ITS rDNA nấm R solani enzyme hạn chế Hae III RM-61; BV-61-02; M: ladder 100 bp; CX-8-02; CTĐ-77; BV-62-03; KT-63-01; XL-4; M Ladder 100 bp; L-73; ĐHL-63 M s Hình 4.8 Ảnh điện di sản phẩm cắt vùng rDNA-ITS nấm R solani enzyme hạn chế Taq I RM-61; BV-61-02; CX-8-02; M: ladder 100 bp; CTĐ-77; BV-62-03; KT-63-01; XL-4 Với enzyme Taq I, chúng tơi thực dịng (hai dòng L-73 ĐHL63 chưa thực hiện) Tất dịng cắt có hai vị trí cắt Taq I tạo thành phân đoạn DNA Kết quả, dòng cho kiểu cắt RFLP: kiểu T1 (dòng RM61, BV-61-02, BV-62-03, KT-63) với phân đoạn DNA có kích thước khoảng 350 bp, 310 bp, 60 bp; kiểu T2 (dòng CX-8-02) với phân đoạn DNA có kích thước khoảng 360 bp, 290 bp, 60 bp; kiểu T3 (dòng CTĐ-77) với phân đoạn 32 DNA có kích thước 340 bp, 320 bp, 60 bp; kiểu T4 (dòng XL-4) với phân đoạn DNA có kích thước khoảng 340 bp, 310 bp, 60 bp (Hình 4.8 Bảng 4.4) Kết hợp kiểu cắt enzyme giới hạn enzyme (Hae III, Alu I Taq I), dòng nấm R solani (trừ dịng L-73 ĐHL-63) có dạng (rDNA-ITS): Dạng (A1, H1, T1), dạng (A2, H2, T2), dạng (A3, H1, T3), dạng (A3, H1, T1), dạng (A3, H3, T1), dạng (A2, H4, T4) Dạng có hai dịng RM-61 BV-61-02; dạng có dịng dịng CX-8-02, dạng – dòng XL-4; dạng – dòng CTĐ-77; dạng – dòng BV-62-03; dạng – dòng XL-4 (Bảng 4.4) Riêng dòng L-73 ĐHL-63 cắt với enzyme Alu I Hae III, nên chưa xác định dạng rDNA-ITS chúng Tóm lại cắt enzyme Hae III, Alu I Taq I, nhận thấy có đa hình đoạn cắt giới hạn vùng rDNA-ITS dòng nấm R solani phân lập từ ký chủ khác Bảng 4.4 Chiều dài đoạn cắt giới hạn vùng rDNA-ITS đƣợc ƣớc tính (bp) dịng nấm R solani cắt với enzyme Alu I, Hae III, Taq I Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng ? Dạng ? (CX-8- (CTĐ- (BV- (KT- (XL-4) L-73 ĐHL- BV-61-02) 02) 77) 62-03) 63-01) A1 * Alu I Dạng (RM-61 Enzyme Dạng A2 A3 A3 A3 500 220 410 220 (80)** 63 A2 A1 A4 430 220 (70) 430 220 (70) 430 220 (70) 410 220 (80) 500 220 480 200 (50) H1 Taq I H1 H1 H3 H4 H1 H5 510 120 (90) 500 120 (90) 510 120 (90) 510 120 (90) 580 490 120 510 120 (80) 510 120 (90) 530 120 (80) T1 Hae III H2 T2 T3 T1 T1 T4 350 310 (60) 360 290 (60) 340 320 (60) 350 310 (60) 350 310 (60) 340 310 (60) Chưa thực Chưa thực * : A1 – T4 tên kiểu RFLP với enzyme Alu I, Hae III, Taq I ** : Những băng (band) khơng nhìn thấy rõ ảnh điện di 33 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Có thể sử dụng quy trình ly trích DNA Lee Taylor (1990) có cải tiến để ly trích DNA tương đối tinh sử dụng cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn rDNAITS nấm R solani Đã cải tiến chu trình nhiệt thành phần phản ứng PCR để khuếch đại thành công vùng rDNA-ITS dòng nấm R solani với cặp primer ITS ITS Tính đa hình đoạn cắt giới hạn dòng nấm R solani (RM-61, BV-6102, CX-8-02, CTĐ-77, BV-62-03, KT-63-01, XL-4, L-73, ĐHL-63) nhận thấy cắt vùng rDNA-ITS với enzyme Alu I, Hae III, Taq I Phân tích ITS-RFLP cho thấy, dịng nấm R solani nói (trừ dịng L-73, ĐHL-63) thuộc nhóm khác 5.2 Đề nghị Hồn thiện quy trình điện di để đọc kết phản ứng cắt cách xác Tiếp tục phân tích ITS-RFLP với nhiều enzyme cắt hạn chế nhiều dòng nấm để đánh giá xác đa dạng di truyền dòng nấm R solani nước ta Nghiên cứu đọc trình tự vùng rDNA-ITS dòng nấm R solani sử dụng đề tài để xác định xác kiểu gen có dịng nấm 34 Phần VI TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang, 1999 Di truyền phân tử: Những nguyên tắc chọn giống trồng NXB Nơng Nghiệp, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam Đƣờng Hồng Dật, 1976 Sổ tay bệnh hại trồng tập NXB Nông Thôn, Việt Nam Nguyễn Thị Huệ, 2003 Khảo sát số đặc tính đánh giá đa dạng mẫu phân lập Rhizoctonia solani thu thập từ số kí chủ khác Luận văn tốt nghiệp ngành Nông Học Đại học Nơng Lâm, Tp.Hồ Chí Minh, Việt nam Nguyễn Thị Hƣơng, 2005 Một số đặc tính dịng nấm Rhizoctonia solani phân lập từ nhiều kí chủ khác Luận văn tốt nghiệp ngành Nông Học Đại học Nơng Lâm, Tp.Hồ Chí Minh, Việt Nam Nguyễn Việt Long, 2001.Hiệu phòng trừ bệnh đốm vằn lúa hai chủng vi khuẩn đối kháng với nấm Rhizoctonia solani ruộng lúa nước Đồng Tháp Luận văn thạc sĩ ngành Nông Học, Đại học Nông Lâm, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam Nguyễn Đức Lƣợng, 2001, Công nghệ sinh học, NXB Đại học Quốc Gia, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam Nguyễn Đức Lƣợng ctv., 2002 Công nghệ gen NXB Đại học Quốc Gia, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam Vũ Triệu Mân Lê Lƣơng Tề, 1998 Giáo trình bệnh nông nghiệp, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, Việt Nam Nguyễn Minh Nguyệt, 2003 Khảo sát số đặc tính nấm Rhizoctonia solani phân lập từ (Gossypium sp.) bắp (Zea may L.) Luận văn tốt nghiệp ngành Nông Học Đại học Nông Lâm, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam 10 Ou S H., 1983 Bệnh hại lúa (Viện Bảo Vệ Thực Vật dịch) Nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội, Việt Nam 11 Phạm Minh Sang, 2003 Hiệu lực chế phẩm vi khuẩn đối kháng kích thích sinh trưởng phịng trừ bệnh khô vằn (Rhizoctonia solani Kuhn) 35 lúa Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp Đại học Nông Lâm, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam 12 Khuất Hữu Thanh, 2003 Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen NXB Khoa Học Kỹ Thuật, Hà Nội, Việt Nam 13 Lê Duy Thành, 2000 Cơ sở di truyền chọn giống thực vật NXB Khoa Học Kỹ Thuật, Hà Nội, Việt Nam Tiếng Anh: 14 Carling D.E and Sumner D.R., 1992 Rhizoctonia pp 157-165 In: Singlton L., Mihail J.D and Rush C.M (eds), Methods for research on soilborne phyto-pathologenic fungi APS Press, St Paul, Minnesota 15 Fenille R C., Ciampi M B., Kuramae E E., and Souza N L., 2003 Identification of Rhizoctonia solani associated with soybean in Brazil by rDNA-ITS sequences Fitopatol bras vol 28 16 Hsiang T and Dean J D., 2001 DNA sequencing for anastomosis grouping of Rhizoctonia solani isolates from Poa annua International turfgrass society 9: 674-678 17 Kunigana S., Natsuaki T., Takeuchi T., and Yokosawa R., 1997 Sequence variation of the rDNA ITS regions within and between anastomosis groups in Rhizoctonia solani Curr Genet 32: 237 – 243 18 Lee S.B., and Taylor J.W., 1990 Isolation of DNA from fungal mycelia and single spores, In: Weising K., Nybom H., Wolff K., and Meyer W., 1995, DNA fingerprinting in plants and fungi CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor, London, Tokyo.p 70-71 19 Liu, Z L Sinclair, J B., 1992 Genetic Diversity of Rhizoctonia solani anastomosis group Phytopathology 82: 778 – 787 20 Liu, Z L Sinclair, J B., 1993.Differentiation of intraspecific groups within anastomosis group of Rhizoctonia solani using ribosomal DNA internal transcribed spacer and isozymecomparisions Can J Plant Phathol 15: 272 – 280 21 Matsumoto M., Furuya N., Takanami Y and Matsuyama N., 1996 RFLP analysis of the PCR-amplified 28S rDNA in Rhizoctonia solani Mycoscience 37: 351 – 356 22 Meinhardt L W., Wulff N A., Bellato C M., and Tsai S M., 2002 Genetic analyses of Rhizoctonia solani isolates from Phaseolus vulgaris grown in the Atlantic Rainforest of Sao Paulo, Brazil Fitopalogia Brasileira 27: 259 – 267 36 23 Priyatmojo A., Escopalao V E., Tangonan N G., Pascual C B., Suga H., Kageyama K and Hyakumachi M., 2001 Characterization of a new subgroup of Rhizoctonia solani Anastomosis Group (AG-1-ID), Causal agent of a necrotic leaf spot on coffee Phytopathology 91:1054-1061 24 Reader U., and Broda, 1985 Rapid preparation of DNA from filamentous fungi Letter in Applied Microbiology 1: 17-20 25 Schneider J H M., Salazar O., Rubio V., and Keijer, 1997 Identification of Rhizoctonia solani associated with field-grown tulips using ITS rDNA polymormphism and pectic zymograms Plant Pathology 103: 607 – 622 26 Sharma S., Rustgi S., Balyan H S., and Gupta P K., (unknown year) Internal transcribed spacer (ITS) sequences of ribosomal DNA of wild barley and their comparsion with ITS sequences in common wheat Molecular Biology Laboratory, Department of Agricultural Botany Ch Sharan University, Meerut-250 004, India 27 White, T.J., Bruns, T., Lee, S., and Taylor, J., 1999 Amplification anhd direct sequencing of fungal ribosome ARN genes for phylogenetics P 315 322 In: Innis M A., Gelfanhd D H., White J J (eds) PCR protocols, a guide to methods and applications Academic Press, New York Web http://plantbio.berkeley.edu/~bruns/ http://www.uoguelph.ca/~thsiang/pubs/ 37 PHẦN VII PHỤ LỤC 7.1 Danh sách dòng nấm Rhizoctonia solani đƣợc sử dụng đề tài Bảng 7.1 Danh sách dòng nấm Rhizoctonia solani đƣợc sử dụng đề tài STT Tên dịng nấm Cây kí chủ Nơi thu thập B-34-01 Bắp Song Phượng, Hoài Đức, Hà Tây B-61-01 Bắp Phước Tân, Long Thành, Đồng Nai B-38 Bắp HTX Quỳnh Vinh, Quỳnh Lưu, Nghệ An BC-63-01 Cải bắp Đà Lạt, Lâm Đồng BN-61-01 Bồ ngót Định Quán, Đồng Nai BĐ-TL Bí đao Thái Lan BV-50-01 Bông vải Cư M Nga, Daklak BV-50-02 Bông vải Cư Jút, Daklak BV-61-01 Bông vải Sông Trầu, Thống Nhất, Đồng Nai 10 BV-61-02 Bông vải Vĩnh Tân, Thống Nhất, Đồng Nai 11 BV-61-04 Bông vải Vĩnh Tâm, Vĩnh Cửu, Đồng Nai 12 BV-61-05 Bông vải Xã lộ 25, Thống Nhất, Đồng Nai 13 BV-61-06 Bông vải Cẩm Đường, Long Thành, Đồng Nai 14 BV-62-01 Bơng vải Bình Thuận 15 BV-62-02 Bông vải Ninh Thuận 16 BV-62-03 Bông vải Ninh Thuận 17 BV-71-01 Bơng vải Ơ Mơn, Cần Thơ 18 BV-71-02 Bông vải Phụng Hiệp, Cần Thơ 19 CB-34-02 Cải bắp Song Phượng, Hà Tây 20 CC-79-01 Cỏ Sóc Trăng 21 CC-72 Cỏ Đức Huệ, Long An 22 CG-73 Cỏ gừng Chợ Gạo, Tiền Giang 23 CLV-72-02 Cỏ lồng vực Đức Huệ, Long An 38 24 CN1 Cải Nhập 25 CO-79-01 Cỏ ống Sóc Trăng 26 CO-61-02 Cỏ ống Phước Thiền, Nhơn Trạch, Đồng Nai 27 CP-50-02 Cà phê Eakmak, Daklak 28 CTĐ-77 Cam thảo đất Rạch Giá, Kiên Giang 29 CX-76 Cải xanh Chợ Mới, An Giang 30 CX-8-02 Cải xanh Tp.Hồ Chí Minh 31 KT-63-01 Khoai tây Đà Lạt, Lâm Đồng 32 Đcv-63-02 Đậu cove Đơn Dương, Lâm Đồng 33 ĐHL-63 Đậu hà lan Đà Lạt, Lâm Đồng 34 ĐP-34 Đậu phộng Chương Mỹ, Hà Tây 35 ĐP-38 Đậu phộng Nam Thịnh, Diễn Châu, Nghệ An 36 ĐT-77 Đậu trắng Vĩnh Thuận, Kiên Giang 37 ĐX-61-01 Đậu xanh Thống Nhất, Đồng Nai 38 PT-66 Phát tài Tây Ninh 39 RM-61 Rau muống Phước Tân, Long Thành, Đồng Nai 40 SR-61-01 Sầu riêng Phước Tân, Long Thành, Đồng Nai 41 SR-650 Sầu riêng Phú Giáo, Bình Dương 42 T-651 Tiêu Bình Phước 43 TL-72 Thuốc Đức Hịa, Long An 44 XL-4 Xúp lơ Đơng Anh, Hà Nội 45 XL-76 Xà lách Chợ Mới, An Giang 7.2 Danh sách primer đƣợc sử dụng để nghiên cứu rDNA nhân nấm Bảng 7.2 Những trình tự primer tiểu đơn vị nhỏ rDNA Những trình tự primer tiểu đơn vị nhỏ rDNA BMB-'A' (Lan) GWA TTA CCG CGG CKG CTG BMB-'B' (Lan) CCG TCA ATT CMT TTR AGT TT BMB-'C' (Lan) ACG GGC GGT GTG TRC ssu ref 583-566 11471128 1641- nb pb 18 20 15 39 1637 BMB-BR (Lan) CTT AAA GGA ATT GAC GGA A 11311149 19 BMB-CR (Lan) GTA CAC ACC GCC CGT CG 16371643 17 nssu97a (Kau) 75-97 23 79-97 705-684 897-914 19 22 18 TAT ACG GTG AAA CTG CGA ATG GC nssu97b (Kau) CGG TGA AAC TGC GAA TGG C nssu634 (Kau) CCC CAG AAG GAA AGI CCC GIC C nssu897R (Kau) AGA GGT GAA ATT CTT GGA nssu1088 (Kau) TGA TTT CTC GTA AGG TGC CG 10881069 10691088 20 nssu1088R (Kau) CGG CAC CTT ACG AGA AAT CA nssu131 (Kau) CAG TTA TCG TTT ATT TGA TAG TAC C 107-131 25 NS1 (Whi) NS2 (Whi) GTA GTC ATA TGC TTG TCT C GGC TGC TGG CAC CAG ACT TGC 20-38 573-553 19 21 NS3 (Whi) GCA AGT CTG GTG CCA GCA GCC CTT CCG TCA ATT CCT TTA AG (sim to BMBb) AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G (sim to BMB-BR) 553-573 11501131 11291150 14361413 14131436 17881769 21 NS4 (Whi) NS5 (Whi) 20 20 22 NS6 (Whi) GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC NS7 (Whi) GAG GCA ATA ACA GGT CTG TGA TGC NS8 (Whi) TCC GCA GGT TCA CCT ACG GA NS17 (Gar) NS18 (Gar) CAT GTC TAA GTT TAA GCA A CTC ATT CCA ATT ACA AGA CC 54-72 516-497 19 20 NS19 (Gar) NS20 (Gar) NS21 (Gar) CCG GAG AAG GAG CCT GAG AAA C CGT CCC TAT TAA TCA TTA CG GAA TAA TAG AAT AGG ACG 22 20 18 NS22 (Gar) AAT TAA GCA GAC AAA TCA CT NS23 (Gar) GAC TCA ACA CGG GGA AAC TC 381-402 871-852 802-819 13121297 11841203 NS24 (Gar) AAA CCT TGT TAC GAC TTT TA SR1 (VilU) ATT ACC GCG GCT GCT (similar to BMB-'A') 17691750 581-567 24 24 20 20 20 20 15 40 SR1R (Vil0) TAC CTG GTT GAT TCT GC 21-1 21 SR2 (Elw) CGG CCA TGC ACC ACC 12771263 15 SR3 (VilU) GAA AGT TGA TAG GGC T 321-306 16 SR4 (VilU) AAA CCA ACA AAA TAG AA 841-825 17 SR5 (VilU) GTG CCC TTC CGT CAA TT SR6 (VilU) TGT TAC GAC TTT TAC TT SR7 (VilU) SR7R (VilU) GTT CAA CTA CGA GCT TTT TAA TTA AAA AGC TCG TAG TTG AAC 637-617 617-637 21 21 SR8R (VilU) SR9R (Elw) GAA CCA GGA CTT TTA CCT T YAG AGG TGA AAT TCT 19 15 SR10R (VilU) TTT GAC TCA ACA CGG G SR11R (Spa) GGA GCC TGA GAA ACG GCT AC (DeP) GCT CTT TCT TGA TTT TGT 732-750 896-910 11811196 389-408 12411258 (DeP) TTT GAG GCA ATA ACA GGT (DeP) CAT CTA AGG GCA TCA CAG (DeP) TTG TCT CTG TCA GTG TAG (DeP) CAA CGA GGA ATT CCT AGT (DeP) AAT GAT CCT TCC GCA GGT 11551139 17631747 17 17 14101427 14451428 14821465 15661583 17971780 16 20 18 18 18 18 18 18 Bảng 7.3 Những trình tự primer tiểu đơn vị lớn rDNA Những trình tự primer tiểu đơn vị lớn rDNA lsu ref nb pb 275-300 25 379-403 26 661-685 24 GUADET P1 (Gua) GUADET P2 (Gua) GAG TCG AGT TGT TTG GGA ATG CAG C GAA AAG AAC TTT GAA AAG AGA GTG AA GUADET P3 (Gua) CCC GTC TTG AAA CAC GGA CCA AGG P2R (Reh) CTC TCT TTT CAA AGT TCT TTT CAT 1412- 17 41 LR0R (VilU) CT ACC CGC TGA ACT TAA GC 1396 26-42 17 LR0R (Reh) GTA CCC GCT GAA CTT AAG C 24-42 19 LR1R (Mon) AGG AAA AGA AAC CAA CC 57-73 17 LR2 LR2R TTT TCA AAG TTC TTT TC AAG AAC TTT GAA AAG AG 395-379 382-398 17 17 LR3 (Vil0) LR3R GGT CCG TGT TTC AAG AC GTC TTG AAA CAC GGA CC 677-661 664-680 17 17 LR4 LR5 (Vil0) LR5R (VilU) ACC AGA GTT TCC TCT GG ATC CTG AGG GAA ACT TC GAA GTT TCC CTC AGG AT 887-871 997-981 981-997 17 17 17 LR6 (Vil0) CGC CAG TTC TGC TTA CC 11731157 17 LR7 (Vil0) TAC TAC CAC CAA GAT CT LR7R (Vil0) AGA TCT TGG TGG TAG TA LR8 CAC CTT GGA GAC CTG CT LR8R AGC AGG TCT CCA AGG TG LR9 AGA GCA CTG GGC AGA AA LR10 AGT CAA GCT CAA CAG GG LR10R GAC CCT GTT GAG CTT GA LR11 GCC AGT TAT CCC TGT GGT AA LR12 (Vil0) GAC TTA GAG GCG TTC AG LR12R (VilU) CTG AAC GCC TCT AAG TCA GAA LR13 CAT CGG AAC AAC AAT GC LR14 AGC CAA ACT CCC CAC CTG LR15 LR16 (Mon) TAA ATT ACA ACT CGG AC TTC CAC CCA AAC ACT CG 14831467 14651481 19171901 19011917 22922276 25082492 24902506 29192900 32213204 32053225 34643448 27012694 161-145 716-700 17 17 17 17 17 17 17 20 17 21 17 18 17 17 42 10661083 3058GTG AGA CAG GTT AGT TTT ACC CT 3080 LR17R TAA CCT ATT CTC AAA CTT LR20R 18 23 LR21 LR22 ACT TCA AGC GTT TCC CTT T CCT CAC GGT ACT TGT TCG CT 442-424 371-352 19 20 F377 AGA TGA AAA GAA CTT TGA AAA GAG AA 375-400 26 R377 LIC15R (Mia2) CTC TCT TTT CAA AGT TCT TTT CAT 400-375 CT GGA GGA AAA GAA ACC AAC AG 55-74 * LIC24R (Mia1) GAA ACC AAC AGG GAT TG LIC2044 (Kau) ACG CCT GCC TAC TCG CC 26 20 64-80 26-42 17 17 Bảng 7.4 Những trình tự primer vùng IGS 5S rDNA Những trình tự primer vùng IGS 5S rDNA 5S RNA (VilU) 5S RNAR (VilU) NS1R LR13R ATC AGA CGG GAT GCG GT ACQ GCA TCC CGT CTG AT GAG ACA AGC ATA TGA CTA C GCA TTG TTG TTC CGA TG 17 17 38-20 (SSU) 19 34483464(lsu) 17 Bảng 7.5 Những trình tự primer vùng ITS 5,8S rDNA Những trình tự primer vùng ITS 5,8S rDNA ITS1 (Whi) TCC GTA GGT GAA CCT GCG G 17691787(ssu) 19 ITS1F (Gad) CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A 22 ITS2 (Whi) GCT GCG TTC TTC ATCG ATG C (sim to 5.8S) 20 GCA TCG ATG AAG AAC GCA GC (sim to 5.8SR) ITS4 (Whi) TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 60-41(lsu) ITS3 (Whi) ITS4B CAG GAG ACT TGT ACA CGG TCC AG 20 20 23 43 (Gad) ITS4S (Kre) CCT CCG CTT ATT GAT ATG CTT AAG 59-36 (lsu) ITS5 (Whi) GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G (sim to SR6R) ITS5R CCT TGT TAC GAC TTT TAC TTC C 17451766(ssu) 1766-1745 (ssu) 5.8S (Vil0) CGC TGC GTT CTT CAT CG 5.8SR TCG ATG AAG AAC GCA GC (Vil0) SR6R AAG TAP AAG TCG TAA CAA GG (VilU) LR1 (Vil0) GGT TGG TTT CTT TTC CT SLG-1 TTG CGC AAC CTG CGG AAG GAT (Gro) NS24R TAA AAG TCG TAA CAA GGT TT 24 22 22 17 18 17471766(ssu) 73-57(lsu) 17731793(ssu) 17501769(ssu) ssu ref Mankin et al., 1986 Gene 44:143-145 lsu ref Lapeyre et al., 1993 Nucleic Acids Res 21:3322-3322 Những primer thiết kế phịng thí nghiệm Lutzoni: - (DeP) DePriest,1993 Gene 134:67-74 - (Elw) Elwood et al., 1985 Mol Biol Evol 2:399-410 - (Gad) Gardes and Bruns, 1993 Mol Ecol 2:113-118 - (Gar) Gargas and Taylor, 1992 Mycologia 84(4): 589-592 - (Gro) Groner and LaGreca, 1997 Lichenologist 29(5):441-454 - (Gua) Guadet et al., 1989 Mol Biol Evol 6:227-242 - (Kau) Kauff and Lutzoni, 2002 Mol Phylogen Evol 25:138-156 - (Kre) Kretzer et al., 1996 Mycologia 88(5): 776-785 - (Lan) Lane et al., 1985 PNAS USA 82:6955-6959 - (Mia1) Miadlikowska and Lutzoni, 2000 Int J Plant Sci 161(6) - (Mia2) Miadlikoska, McCune, Lutzoni,2001 Bryologist 105:1-10 - (Mon) Moncalvo et al., 1993 Mycologia 85(5):788-794 - (Reh) Rehner and Samuels, 1994 Mycol Res 98(6):625-634 - (Spa) Spatafora et al, 1995 J Clinical Microbiol 33:1322-1326 20 17 21 20 44 - (Vil0) Vilgalys and Hester, 1990 Journal of bacteriology 172:4238-4246 - (VilU) Vilgalys unpublished [http://www.botany.duke.edu/fungi/mycolab] - (Whi) White et al., 1990 pp 315-322 in PCR protocols: A guide to methods and applications 7.3 Nuôi thu sinh khối nấm R solani Hình 7.1 Ảnh sợi nấm R solani sau nuôi lắc ngày ... dại khác đồng sơng Cửu Long ký chủ nấm R solani Trong Mỹ, có khoảng 550 lồi ký chủ nấm R solani ghi nhận (dẫn theo Nguyễn Việt Long, 2001) 2.4 Sự phân nhóm nấm R solani R solani Kuhn loài nấm. .. 2.6.2 Sử dụng vùng rDNA để nghiên cứu đa dạng di truyền rDNA chứa vùng bảo tồn (18S, 28S, 5,8S) vùng bảo tồn (ITS) vùng biến động (IGS) Những vùng sử dụng để phân tích phát sinh loài đa dạng di truyền. .. hạn chế nhiều dòng nấm để đánh giá xác đa dạng di truyền dòng nấm R solani nước ta Nghiên cứu đọc trình tự vùng rDNA-ITS dòng nấm R solani sử dụng đề tài để xác định xác kiểu gen có dịng nấm 34