KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Ly trích DNA tổng số của nấm R solan
4.2.4. Kết quả khuếch đại vùng rDNA-ITS của nấm R solan
Primer ITS 4 và ITS 5 là các universal primer được White và ctv. (1990) thiết kế để khuếch đại vùng ITS nằm trong vùng rDNA của ti thể và nhân của nấm. Vùng rDNA-ITS (gồm ITS1-5,8S-ITS2) có chiều dài khoảng 700 bp.
Sau khi chọn được quy trình thích hợp cho phản ứng PCR, chúng tôi đã tiến hành khuếch đại đoạn rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani phục vụ cho mục đích tiếp
theo. Kết quả được thể hiện qua hình 4.5.
Kết quả điện di sản phẩm PCR của chúng tôi trên gel agarose cho thấy, chúng tôi đã thu được một sản phẩm có kích thước khoảng 700 bp. Như vậy, chúng tôi đã khuếch đại thành công vùng rDNA-ITS của nấm R. solani
Hình 4.5. Ảnh điện di sản phẩm khuếch đại đoạn rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani
1. XL-4; 2. RM-61; 3. BV-61-02; 4. CX-8-02; 5. CTĐ-77; 6. BV-62-03; 7. ĐHL-63; 8. KT-63 5. CTĐ-77; 6. BV-62-03; 7. ĐHL-63; 8. KT-63
4.3.Phân tích RFLP vùng rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani
Schneider và ctv (1997), khi sử dụng kỹ thuật RFLP trên vùng rDNA-ITS của nấm R. solani đã xác định được 13 enzyme (Msp I, Hae III, Hinc II, EcoR I, Cla I, Hinf I, Sau3A I, Dde I, Alu I, Hha I, Dra I, Sty I, và Taq I) có thể cho thấy sự đa hình
các đoạn cắt giới hạn giữa các nhóm liên hợp của nấm R. solani. Trong điều kiện giới hạn của đề tài, chúng tôi chỉ chọn 3 enzyme Hae III, Alu I, và Taq I để cắt đoạn
rDNA-ITS đã được khuếch đại của 9 dòng nấm R. solani.
Ba enzyme cắt giới hạn Hae III, Alu I và Taq I đều cắt vùng rDNA-ITS của nấm R. solani thành các phân đoạn DNA nhỏ hơn và cho các kiểu cắt khác nhau phụ thuộc
vào dòng nấm. Mỗi kiểu cắt khác nhau được tính là một kiểu gen. Các dòng nấm có bao nhiêu kiểu cắt khác nhau được tính là bấy nhiêu kiểu gen.
Với enzyme Alu I, vùng rDNA-ITS của 9 dòng nấm R. solani được cắt thành một
trong 4 kiểu cắt sau: kiểu A1 gồm có hai phân đoạn DNA có kích thước khoảng 500 bp và 220 bp; kiểu A2 gồm có ba phân đoạn DNA có kích thước khoảng 410 bp, 220 bp, và 80 bp; kiểu A3 gồm có ba phân đoạn DNA có kích thước khoảng 430 bp, 220 bp, và 70 bp; và kiểu A4 gồm có 3 phân đoạn DNA có kích thước khoảng 480 bp, 200 bp và 50 bp (Hình 4.6 và Bảng 4.4).
700bp
Hình 4.6. Ảnh điện di sản phẩm cắt vùng rDNA-ITS của nấm R. solani bằng enzyme hạn chế Alu I
1. RM-61; 2. BV-61-02; 3. CX-8-02; 4. CTĐ-77; 5. BV-62-03; M. Ladder 100 bp; 6. KT-63-01; 7. XL-4; 8. L-73; 9. ĐHL-63. M. Ladder 100 bp; 6. KT-63-01; 7. XL-4; 8. L-73; 9. ĐHL-63.
Kết quả cho thấy, vùng rDNA-ITS của 3 dòng nấm R. solani (RM-61, BV-61-02,
và L-73) có một vị trí cắt của Alu I, và 6 dòng (CX-8-02, CTĐ-77, BV-62-03, KT-63- 01, XL-4, và ĐHL-63) có hai vị trí cắt của Alu I, tạo ra các đoạn cắt có chiều dài khác nhau.
Với enzyme Hae III, vùng rDNA-ITS của tất cả 9 dòng nấm R. solani nói trên đều có hai vị trí cắt của enzyme này và cho ra ba phân đoạn DNA với chiều dài các đoạn cắt khác nhau tùy theo dòng nấm. 9 dòng nấm này cho ra 5 kiểu cắt RFLP: kiểu H1 (dòng RM-61, BV-61-02, CTĐ-77, BV-62-03, và L-73) với các băng có kích thước khoảng 510 bp, 120 bp, và 90 bp; kiểu H2 (dòng CX-8-02) với các băng có kích thước khoảng 500 bp, 120 bp, và 90 bp; kiểu H3 (dòng KT-63-01) với các băng có kích thước khoảng 580 bp, 490 bp, và 120 bp; kiểu H4 (dòng XL-4) với các băng có kích thước khoảng 510 bp, 120 bp, và 80 bp; và kiểu H5 (dòng ĐHL-63) với các băng có kích thước khoảng 530 bp, 120 bp, và 80 bp (Hình 4.7 và Bảng 4.4)
1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 500bp 500bp