Luận văn : Sử dụng kỹ thuật RFLP khảo sát sự đa dạng di truyền của nấm Rhizoctonia solani phân lập từ nhiều cây ký chủ khác nhau part 4 doc

28 Bảng 4.2. Điều kiện cho phản ứng PCR Thành phần phản ứng Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích PCR Buffer MgCl 2 dNTPs Primer ITS4 Primer ITS5 Taq DNA polymerase DNA khuôn mẫu Nước cất vô trùng 10X 50 mM 2 mM 10 pmol/µl 10 pmol/µl 1UI < 100 ng 1X 1,5 mM 0,2 mM 0,4 pmol/µl 0,4 pmol/µl 0,04 UI 2,5 µl 0,75 µl 2 µl 1 µl 1 µl 1 µl 1 µl vừa đủ V 25 µl Bảng 4.3. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR Các bƣớc của phản ứng Nhiệt độ Thời gian Giai đoạn khởi động Chạy chu kỳ (30 chu kỳ) Tách DNA khuôn Ủ bắt cặp Kéo dài Giai đoạn kết thúc 94 0 C 94 0 C 56 0 C 72 0 C 72 0 C 3 phút 1 phút 45 giây 1 phút 7 phút 4.2.4. Kết quả khuếch đại vùng rDNA-ITS của nấm R. solani Primer ITS 4 và ITS 5 là các universal primer được White và ctv. (1990) thiết kế để khuếch đại vùng ITS nằm trong vùng rDNA của ti thể và nhân của nấm. Vùng rDNA-ITS (gồm ITS1-5,8S-ITS2) có chiều dài khoảng 700 bp. Sau khi chọn được quy trình thích hợp cho phản ứng PCR, chúng tôi đã tiến hành khuếch đại đoạn rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani phục vụ cho mục đích tiếp theo. Kết quả được thể hiện qua hình 4.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR của chúng tôi trên gel agarose cho thấy, chúng tôi đã thu được một sản phẩm có kích thước khoảng 700 bp. Như vậy, chúng tôi đã khuếch đại thành công vùng rDNA-ITS của nấm R. solani 29 Hình 4.5. Ảnh điện di sản phẩm khuếch đại đoạn rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani 1. XL-4; 2. RM-61; 3. BV-61-02; 4. CX-8-02; 5. CTĐ-77; 6. BV-62-03; 7. ĐHL-63; 8. KT-63 4.3. Phân tích RFLP vùng rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani Schneider và ctv (1997), khi sử dụng kỹ thuật RFLP trên vùng rDNA-ITS của nấm R. solani đã xác định được 13 enzyme (Msp I, Hae III, Hinc II, EcoR I, Cla I, Hinf I, Sau3A I, Dde I, Alu I, Hha I, Dra I, Sty I, và Taq I) có thể cho thấy sự đa hình các đoạn cắt giới hạn giữa các nhóm liên hợp của nấm R. solani. Trong điều kiện giới hạn của đề tài, chúng tôi chỉ chọn 3 enzyme Hae III, Alu I, và Taq I để cắt đoạn rDNA-ITS đã được khuếch đại của 9 dòng nấm R. solani. Ba enzyme cắt giới hạn Hae III, Alu I và Taq I đều cắt vùng rDNA-ITS của nấm R. solani thành các phân đoạn DNA nhỏ hơn và cho các kiểu cắt khác nhau phụ thuộc vào dòng nấm. Mỗi kiểu cắt khác nhau được tính là một kiểu gen. Các dòng nấm có bao nhiêu kiểu cắt khác nhau được tính là bấy nhiêu kiểu gen. Với enzyme Alu I, vùng rDNA-ITS của 9 dòng nấm R. solani được cắt thành một trong 4 kiểu cắt sau: kiểu A 1 gồm có hai phân đoạn DNA có kích thước khoảng 500 bp và 220 bp; kiểu A 2 gồm có ba phân đoạn DNA có kích thước khoảng 410 bp, 220 bp, và 80 bp; kiểu A 3 gồm có ba phân đoạn DNA có kích thước khoảng 430 bp, 220 bp, và 70 bp; và kiểu A 4 gồm có 3 phân đoạn DNA có kích thước khoảng 480 bp, 200 bp và 50 bp (Hình 4.6 và Bảng 4.4). 700bp 1 2 3 4 30 Hình 4.6. Ảnh điện di sản phẩm cắt vùng rDNA-ITS của nấm R. solani bằng enzyme hạn chế Alu I 1. RM-61; 2. BV-61-02; 3. CX-8-02; 4. CTĐ-77; 5. BV-62-03; M. Ladder 100 bp; 6. KT-63-01; 7. XL-4; 8. L-73; 9. ĐHL-63. Kết quả cho thấy, vùng rDNA-ITS của 3 dòng nấm R. solani (RM-61, BV-61-02, và L-73) có một vị trí cắt của Alu I, và 6 dòng (CX-8-02, CTĐ-77, BV-62-03, KT-63- 01, XL-4, và ĐHL-63) có hai vị trí cắt của Alu I, tạo ra các đoạn cắt có chiều dài khác nhau. Với enzyme Hae III, vùng rDNA-ITS của tất cả 9 dòng nấm R. solani nói trên đều có hai vị trí cắt của enzyme này và cho ra ba phân đoạn DNA với chiều dài các đoạn cắt khác nhau tùy theo dòng nấm. 9 dòng nấm này cho ra 5 kiểu cắt RFLP: kiểu H 1 (dòng RM-61, BV-61-02, CTĐ-77, BV-62-03, và L-73) với các băng có kích thước khoảng 510 bp, 120 bp, và 90 bp; kiểu H 2 (dòng CX-8-02) với các băng có kích thước khoảng 500 bp, 120 bp, và 90 bp; kiểu H 3 (dòng KT-63-01) với các băng có kích thước khoảng 580 bp, 490 bp, và 120 bp; kiểu H 4 (dòng XL-4) với các băng có kích thước khoảng 510 bp, 120 bp, và 80 bp; và kiểu H 5 (dòng ĐHL-63) với các băng có kích thước khoảng 530 bp, 120 bp, và 80 bp (Hình 4.7 và Bảng 4.4) 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 500bp 1 2 LD 3 4 5 6 7 LD 8 9 200bp 31 Hình 4.7. Ảnh điện di sản phẩm cắt vùng ITS rDNA của nấm R. solani bằng enzyme hạn chế Hae III 1. RM-61; 2. BV-61-02; M: ladder 100 bp; 3. CX-8-02; 4. CTĐ-77; 5. BV-62-03; 6. KT-63-01; 7. XL-4; M. Ladder 100 bp; 8. L-73; 9. ĐHL-63. . s Hình 4.8. Ảnh điện di sản phẩm cắt vùng rDNA-ITS của nấm R. solani bằng enzyme hạn chế Taq I 1. RM-61; 2. BV-61-02; 3. CX-8-02; M: ladder 100 bp; 4. CTĐ-77; 5. BV-62-03; 6. KT-63-01; 7. XL-4. Với enzyme Taq I, chúng tôi chỉ thực hiện trên 7 dòng (hai dòng L-73 và ĐHL- 63 chưa được thực hiện). Tất cả 7 dòng được cắt đều có hai vị trí cắt của Taq I và tạo thành 3 phân đoạn DNA. Kết quả, 7 dòng cho ra 4 kiểu cắt RFLP: kiểu T 1 (dòng RM- 61, BV-61-02, BV-62-03, và KT-63) với các phân đoạn DNA có kích thước khoảng 350 bp, 310 bp, và 60 bp; kiểu T 2 (dòng CX-8-02) với các phân đoạn DNA có kích thước khoảng 360 bp, 290 bp, và 60 bp; kiểu T 3 (dòng CTĐ-77) với các phân đoạn 100bp 500bp 100bp 500bp 1 2 3 M 4 5 6 7 1 2 M 3 4 5 6 7 M 8 9 32 DNA có kích thước 340 bp, 320 bp, và 60 bp; và kiểu T 4 (dòng XL-4) với các phân đoạn DNA có kích thước khoảng 340 bp, 310 bp, và 60 bp (Hình 4.8 và Bảng 4.4) Kết hợp các kiểu cắt enzyme giới hạn bởi 3 enzyme (Hae III, Alu I và Taq I), 7 dòng nấm R. solani (trừ 2 dòng L-73 và ĐHL-63) có 6 dạng (rDNA-ITS): Dạng 1 (A 1 , H 1 , T 1 ), dạng 2 (A 2 , H 2 , T 2 ), dạng 3 (A 3 , H 1 , T 3 ), dạng 4 (A 3 , H 1 , T 1 ), dạng 5 (A 3 , H 3 , T 1 ), và dạng 6 (A 2 , H 4 , T 4 ). Dạng 1 có hai dòng RM-61 và BV-61-02; dạng 2 chỉ có một dòng là dòng CX-8-02, dạng 3 – dòng XL-4; dạng 4 – dòng CTĐ-77; dạng 5 – dòng BV-62-03; và dạng 6 – dòng XL-4 (Bảng 4.4). Riêng 2 dòng L-73 và ĐHL-63 vì chỉ mới cắt với 2 enzyme Alu I và Hae III, nên chưa xác định được dạng rDNA-ITS của chúng. Tóm lại khi cắt bằng 3 enzyme Hae III, Alu I và Taq I, chúng tôi đã nhận thấy có sự đa hình các đoạn cắt giới hạn trong vùng rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani phân lập từ các cây ký chủ khác nhau. Bảng 4.4. Chiều dài các đoạn cắt giới hạn vùng rDNA-ITS đƣợc ƣớc tính (bp) của 9 dòng nấm R. solani khi cắt với 3 enzyme Alu I, Hae III, và Taq I Enzyme Dạng 1 (RM-61 và BV-61-02) Dạng 2 (CX-8- 02) Dạng 3 (CTĐ- 77) Dạng 4 (BV- 62-03) Dạng 5 (KT- 63-01) Dạng 6 (XL-4) Dạng ? L-73 Dạng ? ĐHL- 63 Alu I A 1 * A 2 A 3 A 3 A 3 A 2 A 1 A 4 500 220 410 220 (80)** 430 220 (70) 430 220 (70) 430 220 (70) 410 220 (80) 500 220 480 200 (50) Hae III H 1 H 2 H 1 H 1 H 3 H 4 H 1 H 5 510 120 (90) 500 120 (90) 510 120 (90) 510 120 (90) 580 490 120 510 120 (80) 510 120 (90) 530 120 (80) Taq I T 1 T 2 T 3 T 1 T 1 T 4 350 310 (60) 360 290 (60) 340 320 (60) 350 310 (60) 350 310 (60) 340 310 (60) Chưa thực hiện Chưa thực hiện * : A 1 – T 4 chỉ tên các kiểu RFLP với các enzyme Alu I, Hae III, hoặc Taq I. ** : Những băng (band) không nhìn thấy rõ trên ảnh điện di. 33 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận 1. Có thể sử dụng quy trình ly trích DNA của Lee và Taylor (1990) có cải tiến để ly trích DNA tương đối tinh sạch sử dụng cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn rDNA- ITS của nấm R. solani. 2. Đã cải tiến được chu trình nhiệt và các thành phần phản ứng PCR để khuếch đại thành công vùng rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani với cặp primer ITS 4 và ITS 5. 3. Tính đa hình các đoạn cắt giới hạn giữa 9 dòng nấm R. solani (RM-61, BV-61- 02, CX-8-02, CTĐ-77, BV-62-03, KT-63-01, XL-4, L-73, và ĐHL-63) đã được nhận thấy khi cắt vùng rDNA-ITS với enzyme Alu I, Hae III, và Taq I. Phân tích ITS-RFLP cho thấy, 7 dòng nấm R. solani nói trên (trừ 2 dòng L-73, và ĐHL-63) thuộc 6 nhóm khác nhau. 5.2. Đề nghị 1. Hoàn thiện quy trình điện di để đọc được kết quả phản ứng cắt một cách chính xác hơn. 2. Tiếp tục phân tích ITS-RFLP với nhiều enzyme cắt hạn chế hơn và trên nhiều dòng nấm hơn để có thể đánh giá được chính xác hơn sự đa dạng di truyền của các dòng nấm R. solani ở nước ta. 3. Nghiên cứu đọc trình tự vùng rDNA-ITS của 9 dòng nấm R. solani đã được sử dụng trong đề tài để xác định chính xác kiểu gen có thể có của các dòng nấm này. 34 Phần VI TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử: Những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng. NXB Nông Nghiệp, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 2. Đƣờng Hồng Dật, 1976. Sổ tay bệnh hại cây trồng tập 1. NXB Nông Thôn, Việt Nam. 3. Nguyễn Thị Huệ, 2003. Khảo sát một số đặc tính và đánh giá sự đa dạng của các mẫu phân lập Rhizoctonia solani thu thập từ một số cây kí chủ khác nhau. Luận văn tốt nghiệp ngành Nông Học. Đại học Nông Lâm, Tp.Hồ Chí Minh, Việt nam. 4. Nguyễn Thị Hƣơng, 2005. Một số đặc tính của các dòng nấm Rhizoctonia solani phân lập từ nhiều cây kí chủ khác nhau. Luận văn tốt nghiệp ngành Nông Học. Đại học Nông Lâm, Tp.Hồ Chí Minh, Việt Nam. 5. Nguyễn Việt Long, 2001.Hiệu quả phòng trừ bệnh đốm vằn trên lúa của hai chủng vi khuẩn đối kháng với nấm Rhizoctonia solani trên ruộng lúa nước ở Đồng Tháp. Luận văn thạc sĩ ngành Nông Học, Đại học Nông Lâm, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 6. Nguyễn Đức Lƣợng, 2001, Công nghệ sinh học, NXB Đại học Quốc Gia, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 7. Nguyễn Đức Lƣợng và ctv., 2002. Công nghệ gen. NXB Đại học Quốc Gia, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 8. Vũ Triệu Mân và Lê Lƣơng Tề, 1998. Giáo trình bệnh cây nông nghiệp, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, Việt Nam. 9. Nguyễn Minh Nguyệt, 2003. Khảo sát một số đặc tính của nấm Rhizoctonia solani phân lập từ cây bông (Gossypium sp.) và cây bắp (Zea may L.). Luận văn tốt nghiệp ngành Nông Học. Đại học Nông Lâm, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 10. Ou S. H., 1983. Bệnh hại lúa (Viện Bảo Vệ Thực Vật dịch). Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Hà Nội, Việt Nam. 11. Phạm Minh Sang, 2003. Hiệu lực của chế phẩm vi khuẩn đối kháng và kích thích sinh trưởng trong phòng trừ bệnh khô vằn (Rhizoctonia solani Kuhn) 35 trên lúa. Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp. Đại học Nông Lâm, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 12. Khuất Hữu Thanh, 2003. Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen. NXB Khoa Học và Kỹ Thuật, Hà Nội, Việt Nam. 13. Lê Duy Thành, 2000. Cơ sở di truyền chọn giống thực vật. NXB Khoa Học và Kỹ Thuật, Hà Nội, Việt Nam. Tiếng Anh: 14. Carling D.E. and Sumner D.R., 1992. Rhizoctonia pp 157-165. In: Singlton L., Mihail J.D. and Rush C.M. (eds), Methods for research on soilborne phyto-pathologenic fungi. APS Press, St. Paul, Minnesota. 15. Fenille R. C., Ciampi M. B., Kuramae E. E., and Souza N. L., 2003. Identification of Rhizoctonia solani associated with soybean in Brazil by rDNA-ITS sequences. Fitopatol. bras. vol 28. 16. Hsiang T. and Dean J. D., 2001. DNA sequencing for anastomosis grouping of Rhizoctonia solani isolates from Poa annua. International turfgrass society 9: 674-678. 17. Kunigana S., Natsuaki T., Takeuchi T., and Yokosawa R., 1997. Sequence variation of the rDNA ITS regions within and between anastomosis groups in Rhizoctonia solani. Curr Genet 32: 237 – 243. 18. Lee S.B., and Taylor J.W., 1990. Isolation of DNA from fungal mycelia and single spores, In: Weising K., Nybom H., Wolff K., and Meyer W., 1995, DNA fingerprinting in plants and fungi. CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor, London, Tokyo.p. 70-71. 19. Liu, Z. L. và Sinclair, J. B., 1992. Genetic Diversity of Rhizoctonia solani anastomosis group 2. Phytopathology 82: 778 – 787. 20. Liu, Z. L. và Sinclair, J. B., 1993.Differentiation of intraspecific groups within anastomosis group 1 of Rhizoctonia solani using ribosomal DNA internal transcribed spacer and isozymecomparisions. Can. J. Plant Phathol 15: 272 – 280. 21. Matsumoto M., Furuya N., Takanami Y. and Matsuyama N., 1996. RFLP analysis of the PCR-amplified 28S rDNA in Rhizoctonia solani. Mycoscience 37: 351 – 356. 22. Meinhardt L. W., Wulff N. A., Bellato C. M., and Tsai S. M., 2002. Genetic analyses of Rhizoctonia solani isolates from Phaseolus vulgaris grown in the Atlantic Rainforest of Sao Paulo, Brazil. Fitopalogia Brasileira 27: 259 – 267. 36 23. Priyatmojo A., Escopalao V. E., Tangonan N. G., Pascual C. B., Suga H., Kageyama K. and Hyakumachi M., 2001. Characterization of a new subgroup of Rhizoctonia solani Anastomosis Group 1 (AG-1-ID), Causal agent of a necrotic leaf spot on coffee. Phytopathology 91:1054-1061. 24. Reader U., and Broda, 1985. Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Letter in Applied Microbiology 1: 17-20. 25. Schneider J. H. M., Salazar O., Rubio V., and Keijer, 1997. Identification of Rhizoctonia solani associated with field-grown tulips using ITS rDNA polymormphism and pectic zymograms. Plant Pathology 103: 607 – 622. 26. Sharma S., Rustgi S., Balyan H. S., and Gupta P. K., (unknown year). Internal transcribed spacer (ITS) sequences of ribosomal DNA of wild barley and their comparsion with ITS sequences in common wheat. Molecular Biology Laboratory, Department of Agricultural Botany Ch. Sharan University, Meerut-250 004, India. 27. White, T.J., Bruns, T., Lee, S., and Taylor, J., 1999. Amplification anhd direct sequencing of fungal ribosome ARN genes for phylogenetics. P 315 - 322. In: Innis M. A., Gelfanhd D. H., White J. J. (eds) PCR protocols, a guide to methods and applications. Academic Press, New York. Web http://plantbio.berkeley.edu/~bruns/ http://www.uoguelph.ca/~thsiang/pubs/ . 3. Nguyễn Thị Huệ, 2003. Khảo sát một số đặc tính và đánh giá sự đa dạng của các mẫu phân lập Rhizoctonia solani thu thập từ một số cây kí chủ khác nhau. Luận văn tốt nghiệp ngành Nông Học Taq I, chúng tôi đã nhận thấy có sự đa hình các đoạn cắt giới hạn trong vùng rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani phân lập từ các cây ký chủ khác nhau. Bảng 4. 4. Chiều dài các đoạn cắt giới. Lâm, Tp.Hồ Chí Minh, Việt nam. 4. Nguyễn Thị Hƣơng, 2005. Một số đặc tính của các dòng nấm Rhizoctonia solani phân lập từ nhiều cây kí chủ khác nhau. Luận văn tốt nghiệp ngành Nông Học. Đại