Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Khảo sát khả năng nuôi cấy phôi cây cóc đỏ (Lumnitzera littorea (Jack) Voigt.1845) IN VITRO

NHIEM VU VA NOI DUNG:Nhiệm vu: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả nang phát triển của phôi cây Cóc đỏNội dung: - Khảo sát tính sống của phôi cây Cóc đỏ.- Khảo sát ảnh hưởng của môi tr

NGUYEN NHAT NHU THUY

KHAO SAT KHẢ NANG NUÔI CAY PHÔI CAY COC ĐỎ

(Lumnitzera littorea (Jack) Voigt 1845) IN VITRO

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 604280

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HO CHÍ MINH, tháng 01 năm 2017

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI

TRUONG ĐẠI HOC BACH KHOA —DHQG -HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa hoc : PGS.TS Lê Thi Thủy Tiên

(Ghi rõ ho, tên, học hàm, học vi va chữ ký)

Cán bộ chấm nhận xét 1: TS Trần Trung Hiểu

(Ghi rõ ho, tên, học hàm, học vi và chữ ký)

Cán bộ cham nhận xét 2 : TS Nguyễn Tan Trung

(Ghi rõ ho, tên, học hàm, học vi va chữ ký)

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Truong Dai học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCMngày 03 tháng 01 năm 2017.

Thanh phan Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:(Ghi rõ họ, tên, hoc hàm, hoc vi của Hội đồng cham bảo vệ luận văn thạc sĩ)

1 PGS.TS Nguyễn Đức Lượng2 PGS.TS Nguyễn Thúy Huong

3 TS Trần Trung Hiếu4 TS Nguyễn Tan Trung5 PGS.TS Lê Phi Nga

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyênngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nêu có).

CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRƯỞNG KHOA

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIEM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Nguyễn Nhật Như Thủy MSHV: 7140870Ngày, tháng, năm sinh: 17/04/1988 Nơi sinh: Khánh HòaChuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 604280

I TEN DE TÀI: Khảo sát khả năng nuôi cấy phôi Coc đỏ (Lumnitzera littorea (Jack)Voigt 1845) in vitro.

H NHIEM VU VA NOI DUNG:Nhiệm vu: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả nang phát triển của phôi cây Cóc đỏNội dung:

- Khảo sát tính sống của phôi cây Cóc đỏ.- Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng đến sự phát triển của phôi cây Cóc đỏ.- Khảo sát ảnh hưởng của nông độ sucrose đến sự phát triển của phôi cây Cóc đỏ.- Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật (gibberellin, auxin,cytokinin) đến sự phát triển của phôi cây Coc đỏ

- Đánh giá sự tăng trưởng cây Cóc do con thu được in vitro.

Ill NGÀY GIAO NHIỆM VU: 15/7/2016IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VU: 4/12/2016.V CÁN BO HUONG DÂN: PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên

Tp HCM, ngay thang năm 20

CAN BO HUONG DAN CHU NHIEM BO MON DAO TAO

(Ho tén va chit ky) (Ho tén va chit ky)

TRUONG KHOA

(Ho tên và chữ ky)

Ghi chú: Học viên phải đóng tờ nhiệm vụ này vào trang đầu tiên của tập thuyết minh LV

Lời cảm ơn

Trong khuôn khổ một trang giấy này, tôi biết sẽ không thé hiện được hết sựbiết ơn và xúc động như thế nào khi nhận được sự giúp đỡ của mọi người Xin cảmơn tất cả!

Điều đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến giáo viên hướng dẫn củatôi PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên, một giảng viên tận tụy, đã đưa tôi đến đề tài thú vị

này Nhờ có sự hỗ trợ, hướng dẫn của cô mà nghiên cứu này mới đạt được thành quả

như ngày hôm nay.

Nhân cơ hội này tôi xin cảm ơn đến bộ môn Công nghệ Sinh học, thuộc trườngĐại học Bách khoa Tp Hồ Chí Minh đã hỗ trợ tôi về mặt cơ sở vật chất, tạo điều kiệnthuận lợi trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài Đây là cơ hội giúp tôi tích lũy nhiềukinh nghiệm hữu ích cho công việc nghiên cứu sau này.

Và một điều chắc chắn là luận văn này khó mà hoàn thành được nếu không cósự hỗ trợ và tạo điều kiện của các đồng nghiệp từ phòng Thực vật biển, Viện Hải

dương học Đặc biệt, họ đã trợ giúp tôi rất nhiệt tình trong chuyến thực địa thu mẫutrái Cóc đỏ.

Thật may mắn khi bên cạnh tôi luôn có những người bạn sẵn sàng chia sẻnhững khó khăn, quan tâm, động viên trong lúc khó khăn nhất Mặc dù những hànhđộng ấy rất bình di nhưng chúng vô cùng ý nghĩa đối với tôi Cảm ơn các bạn!

Cuối cùng, xin dành lời cảm ơn sâu sắc nhất đến sự hy sinh, cỗ vũ tinh thần

của gia đình thân yêu của tôi Do là chỗ dia dé tôi tìm về mỗi khi vấp váp, chán nản

sau những lần chưa tim được cách giải quyết cho các van dé nay sinh trong thời gianthực hiện đề tài, và tiếp thêm động lực dé tôi tự tin bước tiếp, đối mặt với thử thách

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Trong nghiên cứu này, phôi Cóc đỏ Lumnitzera littorea (Jack) Voigt 1845được nuôi cấy in vitro dé phát triển thành cây con Quá trình thực hiện thông qua hainội dung chính: (1) Xác định điều kiện môi trường thích hợp cho sự nảy mầm củaphôi va (2) Khảo sát môi trường thích hợp cho sự tang trưởng của cây in vitro Quaquá trình nghiên cứu của chúng tôi thu được những kết quả như sau:

Lựa chọn môi trường nuôi cấy phôi Cóc đỏ con

Phôi Cóc đỏ được nuôi cấy trong điều kiện tối, nhiệt độ 25 + 2°C, pH 5,8.Thanh phan môi trường nuôi cấy phôi cho hiệu qua cho sự nảy mam cao nhất là:

- - Môi trường khoáng và vitamin MS- Sucrose 20 g/l

- Kéthop IAA 0,5 mg/l và BA 0,5 mg/1 hoặc GA3 1,5 mg/l.Sw tăng trưởng của cay Cóc đỏ con

Cây Cóc đỏ con được nuôi cay trong điều kiện ánh sảng 2.500 + 100 lux, nhiệtđộ 30 + 2°C, độ mặn 0%o, pH 5,8 Sau 3 tháng, cây con vẫn duy trì tỷ lệ sống 100%,đạt được chiều cao 2,103 cm và có 1 lá thật

Lumnitzera littorea is an endangered mangrove species Poor germinaton isthe major cause for low regeneration of this species With an objective to augmentthe species population in the natural and allied habitats through embryo culture, the

present study focus on: (1) the suitable medium for the germination of Lumnitzera

littorea embryos and (2) the suitable medium for the growth of Lumnitzera littorea

seedlings.

Compositions of suitable media for Lumnitzera littorea embryo

The embyos were cultured in the dark condition, 25 + 2°C and pH 5.8 Thecompositions of suitable media for Lumnitzera littorea embryo are:

- Mineral and vitamins MS medium.

- Sucrose 20 g/l.

- Combination of IAA 0.5 mg/l with BA 0.5 mg/l or GA3 1.5 mg/I.

The growth of Lumnitzera littorea seedling

The seedlings were culture in the light 2,500 + 100 lux, 30 + 2°C, pH 5.8 and

salinity 0%o After three months, the survival rate of Lumnitzera littorea seedlings

remained 100% The average height of seedlings reached 2.103 + 0.159 cm The

growth rate of seedlings was 0.453 + 0.081cm/month The seedling had 1 leave.

LỜI CAM ĐOANTôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được aicông bồ trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận văn

MỤC LỤC

Trang

CHUONG 1 MO ĐẦU - 5-5221 3E E1 1113 3013111111311 131111111 y0, |1.1 Tính cấp thiết của đề tài - 2s xxx EkEEEEkEEEEEEEEETEEEEEkrkerkrkrkerererreee |1.2 Luận điểm mới của dé tài tt ca cư ceESESESE Set EeEeESEEEEErkrkrererereersrsrererrrrs 2

2.1.1 Phân loại khoa ho - EE E E s s s1 v55 42.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh thái và phân bố của loài Cóc đỏ 42.1.3 Những khó khăn trong công tác bảo tồn và phục hồi quan thé Cóc đỏ 62.2 Kỹ thuật nuôi cay phôi thực vậtt - - «5 - s xxvkEExvxkevevxrkrkreerxrerkreeree 8

2.2.1 Phôi thực: vật - + + sSs23S2213E1313215215112113 1311111151111 ce 8

2.2.2 Lịch sử nuôi cẫy phôi thực vật ¿- + s+s+xs+eersrereerererrerersee 102.2.3 Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy phôi + 2 + ss£Ex+kreerererrerersee 112.2.4 Ứng dụng của nuôi cấy phôi - - 2s + skeEs+keEerkreersreesee 13

2.2.4.1 Nuôi cấy phôi yẾu - - tt xe ckererkerererkerees 142.2.4.2 Nuôi cấy phôi lai Xa sex eEeErkekeeererererrsrxes 152.2.5 Các yếu t6 ảnh hưởng đến sự phát triển phôi - 5 se: l6

2.2.5.1 Môi trường nuôi CẤy - - sex eEeEvEeEeErerkrerrsrxee 162.2.5.2 Điều kiện nuôi cấy - «sex EEkErkrkererkrkererkrreee 202.3 Sự nảy mam của HẠT Q5 212.4 Hình thức sinh sản của cây ngập mặnn - - - -ĂSnn S229 1 1 985111 22

CHUONG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP se +keEeExrvevvei 23

3.1 Sơ đồ nghiên CỨU - - 5s x92 391 T999 1v re rered 233.2 Thuyết minh sơ đồ nghiên CỨU - - 2= + + SE k#E+ESEE+EeESEEEEeEvkrkreerererered 24

CUA PhO1 CAY 00040: 25

3.2.5 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến sự phát triển

CUA PHO1 CaY 1609:0177 25

3.2.6 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vậtđến sự phát triển của phôi cây COC đỏ ¿- + s+s+zs+e£Exereerererrerersee 25

3.2.6.1 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ GAs đến sự pháttriển của phôi cây COC đỎ - - <skckkExkeEvkeverkekererkreersred 253.2.6.2 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ IAA đến sự pháttriển của phôi cây COC đỎ - s5 k+Evx+x+veEvxckeEeevkrkrxrrrerered 263.2.6.3 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự pháttriển của phôi cây COC đỏ ¿- <5 s+tEkcxeEEEEeErkerererkrrrkrsrrered 263.2.6.4 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nồng độ [AA:BA đếnsự phát triển của phôi cây COC đỏ - 5s scs+xx+eersrkeeerereerxee 263.2.7 Chỉ tiêu đo đạc sự phát triển của phôi Cóc đỏ -. 5- sa 273.2.8 Khảo sát ảnh hưởng của độ mặn đến sự tăng trưởng của cây con Cóc đỏUN) VỈẨẨ( Q.0 000v 27

3.2.9 Chỉ tiêu đo đạc sự tang trưởng của cây con Cóc đỏ - 27

3.2.10 Phương pháp xử lý $6 liệu - 2-6 scs SE EEeEsExekeeerrerereerrrees 28

CHUONG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN 2-2 s52+s+xzEerzssred 29

4.1 Tính sống của phôi cây COC đỎ - 5-5 ESExkEEsEEESEkekererkerererkesrre 294.2 Ảnh hưởng của quá trình vô trùng bề mặt hạt đến tính sống của phôi Cóc đỏ 304.3 Sự nảy mắm của hat Cóc đỏ iN VILFO ceccccsceccssssssescscscescssscseescscscssessssscssescsssessesenes 304.4 Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến sự phát triển của phôi cây Cóc đỏ 3 Ì4.5 Ảnh hưởng của nông độ sucrose đến sự phát triển của phôi cây Coc đỏ 32

4.6 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến sự phát triển của phôi cây

4.6.1 Ảnh hưởng của nông độ GAs đến sự phát triển của phôi cây Cóc đỏ 344.6.2 Ảnh hưởng của nông độ IAA đến sự phát triển của phôi cây Cóc đỏ 354.6.3 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự phát triển của phôi cây Cóc đỏ 374.6.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ nồng độ IAA:BA đến sự phát triển của phôi cây

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 2.1 a) Cay Coc đỏ; b) Hoa Coc đỏ; c) Trai Coc đỏ và d) Hat Coc đỏ 5

Hình 2.2 Trai Cóc do: a) không có hạt; b) có hat -sccS<Sssesesssserresss 7Hình 2.3 Cây Cóc đỏ con phát triển trên thé nền đất sau 3 tháng gieo ươm [ 10] 8Hình 2.4 Phôi hạt ngũ cốc cắt dọc, phóng đại x13 a Lúa mì; b Lua mạch; c Daimach; d Yén mach Những phần của phôi bị nhuộm màu sau khi xử lý với tetrazoliumcó khả năng nay mâm được minh họa bang phan gạch nghiêng [21] 10Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu - 5s keE#EEEEEEEEEvEeEeESrkrkrkerrererersee 23Hình 4.1 a) Kết qua thí nghiệm trắc nghiệm tính sống của phôi Cóc đỏ; b) Hạt Cócđỏ nhuộm đỏ một phầhn - + + k#E+EEE*EE+EEEE+E€EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEETEEErkrrrrererrrre 29

Hình 4.2 Sự nảy mầm của hạt Cóc đỏ: a) Hạt trương phông: b) Hạt nứt vỏ, xuất hiện

rễ mam; c) Xuất hiện lá mâm; đ) Cây cOI - 2 - sk+k+EE+EeEE+EeEsverEerererrereeed 31Hình 4.3 Hạt Cóc đỏ nảy mam ở các nghiệm thức: a) 1⁄2 MS; b) MS; c) WPM sau 14ngày nuôi Cấy - - -ccstnTT T11 01T 0T 32Hình 4.4 Hạt Cóc đỏ nảy mam ở các nghiệm thức MS bồ sung: a) sucrose 20 g/l; b)sucrose 30 g/l; c) sucrose 40 g/l; d) đối chứng (MS không bồ sung sucrose) sau 14ngày nuôi CAY vee ceeeccseseceesecessesscsesecscsesecsesecarsesacavsscavsesavsnsecavsesavarsavavsusavensevarsesavanseeas 33Hình 4.5 Hạt Cóc đỏ nay mầm ở các nghiệm thức MS bổ sung sucrose 20g/1 va GA3

ở 4 nồng độ: a) 0,5 mg/l; b) 1,0 mg/l; c) 1,5 mg/l; d) 2,0 mg/l sau 14 ngày nuôi0 34

Hình 4.6 Hạt Cóc đỏ nay mam ở các nghiệm thức MS bồ sung sucrose 20ø/1 va IAAở 4 nông độ: a) 0,5 mg/l; b) 1,0 mg/l; c) 1,5 mg/l; đ) 2,0 mg/1 sau 14 ngày nuôi1 36Hình 4.7 Hat Coc đỏ nay mam ở các nghiệm thức MS bổ sung sucrose 20g/l và BA

ở 4 nồng độ: a) 0,5 mg/l; b) 1,0 mg/l; c) 1,5 mg/l; d) 2,0 mg/l sau 14 ngày nuôiTT 37

Hình 4.8 Hat Coc đỏ nảy mầm ở các nghiệm thức MS bổ sung sucrose 20g/1 và kếthợp giữa BA 0,5 mg/l với IAA ở 4 nông độ: a) 0,5 mg/1; b) 1,0 mg/l; c) 2,0 mg/l; đ)3,0 mg/1 sau 14 ngày nuôi CAY ee ceecssesecscsesescessessscessvssscsesesesscaraneneasavansesnens 39

Hình 4.9 So sánh tỷ lệ phôi hình thành chdi, rễ giữa các nghiệm thức bố sung chấtđiều hòa sinh trƯỞng - - - s31 9v 9E th cv ve re 42Hình 4.10 Cây Cóc đỏ con sau 1 tháng nuôi cấy ¿- +5 5< csccckexerrkrrxes 43Hình 4.11 Cây Cóc đỏ con sau 2 tháng nuôi cẫy - 25c ceecsrkreerererrxee 44Hình 4.12 Cây Cóc đỏ con sau 3 tháng nuôi cẫy -+-5-c+rs+eecsrkeeerrerrxee 44Hình 4.13 So sánh chiều cao cây con ở các nghiệm thức độ mặn khác nhau qua 3tháng nuôi CẤy G2 TH T7 113 11 1111111111511 1 xe ke re 46Hình 4.14 Cây con Cóc đỏ ở các nghiệm thức độ mặn khác nhau: a) 0%o; b) 3%o; c)6%o; đ) 9%o; e) 12%o; f) 15% sau 2 tháng nuôi cấy 5 sccs+kzeeesrerered 48

DANH MỤC BANG

Trang

Bang 4.1 Trắc nghiệm tính sống của phôi Cóc đỏ +2 << s£x+x+E£xcsxei 29

Bảng 4.2 Trắc nghiệm tính sống của phôi Coc đỏ được vô trùng bề mặt 30

Bảng 4.3 Ty lệ phôi Cóc đỏ nảy mam ở các nghiệm thức môi trường khoáng 32

Bảng 4.4 Ty lệ phôi Cóc đỏ nay mam 6 các nghiệm thức bổ sung sucrose 33

Bảng 4.5 Ty lệ phôi Cóc đỏ nay mam ở các nghiệm thức nông độ GA¿ 35

Bang 4.6 Tỷ lệ phôi Cóc đỏ nảy mam ở các nghiệm thức nồng độ [AA 36

Bảng 4.7 Tỷ lệ phôi Cóc đỏ nảy mam ở các nghiệm thức nồng độ BA 38

Bảng 4.8 Ty lệ phôi Cóc đỏ nảy mam ở các nghiệm thức kết hop IAA và BA 40

Bảng 4.9 Theo dõi tăng trưởng của cây Cóc đỏ con IN Vif7O «-<<<<5 43Bảng 4.10 Tỷ lệ sống (%) của cây con ở các độ mặn khác nhau - 45

Bảng 4.11 Tốc độ tăng trưởng (cm/tháng) của cây con ở các độ mặn khác nhau 47

BA:

CDHSTTV:CV (%):

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Hệ số biến thiên (Coefficient of variation)Acid gibberellic

Indole-3-acetic acidTrắc nghiệm phân hang Least Significant DifferenceMôi trường Murashige & Skoog

Giá trị xác suất (Probability)

Môi trường Schenk & Hildebrandt

Triphenyl tetrazolium chloride

Môi trường Lloyd & McCown (Woody Plant Medium)

CHƯƠNG 1 MỞ DAU1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Coc đỏ (Lumnitzera littorea (Jack) Voigt 1845) là loài cây ngập mặn thật sự(true mangrove) thuộc họ Bàng (Combretaceae), bộ Sim (Myrtales), lớp Ngoc Lan

(Magnoliopsida) Cũng như những loài cây ngập mặn khác, Cóc đỏ có vai trò quantrọng đối với 6n định môi trường và phát triển kinh tế - xã hội ở vùng ven bờ [1] Gỗ

Cóc đỏ rất có giá trị vì chúng rất bền chắc, đẹp và có mùi thơm, thường được dùng

để làm cầu, sàn nhà, đóng giường Hoa Cóc đỏ màu đỏ, đẹp nên có giá trị trongnghệ thuật, trang trí [2] Ngoài ra, các hợp chất từ dịch chiết lá Cóc đỏ có khả năngkháng khuẩn [3]

Trên thế giới, loài Cóc đỏ phân bố rất it ở vùng Đông Phi, Bắc Australia,Polynesia và Đông Nam Á [1; 4] Những tác động của con người và thiên nhiên đãlàm cho những quan thé loài này bị cô lập và phân mảnh, điều này có thé dẫn đếngiảm khả nang sinh sản hoặc ton tại của chúng Do bị đe dọa tuyệt chủng cao, loàiCóc đỏ đã được đưa vào sách đỏ cần được bảo tồn ở nhiều quốc gia trên thế giới,

trong đó có Việt Nam [1; 5].

Ở Việt Nam, Coc đỏ phân bồ rất ít ở Thừa Thiên Huế, Cần Giờ, Côn Đảo, PhúQuốc, Khánh Hòa [6; 7] Ở tỉnh Khánh Hòa, loài Cóc đỏ phân bố ở vịnh Cam Ranhvà đầm Thủy Triều Tuy nhiên, quần thể Cóc đỏ quý hiếm nơi đây đang bị đe dọa pháhủy, có nguy cơ biến mất do những tác động của con người như phá rừng ngập mặn

để xây dựng ao, dia nuôi thủy sản, phát triển cơ sở hạ tang, khu dân cư [8]

Trong gân 10 năm qua, các nhà khoa học Việt Nam đã có những công bố liênquan đến khả năng tái sinh tự nhiên của loài Cóc đỏ Độ hữu thụ của hạt phan Coc doở Thừa Thiên Huế rất thấp, chỉ đạt khoảng 9,85% [9] Nghiên cứu về hiện tượng họcsinh sản của loài này ở vịnh Cam Ranh cho thấy chỉ có 52,67% trái không bị sâu [10].Tỷ lệ nảy mầm của hat Cóc đỏ chỉ đạt 2% sau 3 tháng gieo [6] Trong một nghiên

cứu khác, một số nhân tố sinh thái tự nhiên như yếu tố mùa, chất hữu cơ và pH đất

cũng có ảnh hưởng đến khả năng tái sinh tự nhiên của loài Cóc đỏ [11] Thêm vàođó, cây con trong tự nhiên thường bị cua, còng căn đứt [6] Vì vậy, khả năng tái sinh

tự nhiên của loài Cóc đỏ rất kém, làm cho công tác trồng phục hồi các quan thé Cócđỏ gặp rất nhiều khó khăn đo thiếu nguồn giống.

Nuôi cấy phôi là kỹ thuật kích thích phôi phát triển thành cây con trong điềukiện thí nghiệm Phương pháp này phù hợp với những loài mà hạt có tỷ lệ sống thấphoặc thời gian ngủ kéo dai [12] Cho đến nay, nuôi cấy phôi Cóc đỏ vẫn chưa được

nghiên cứu Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát khả năng nuôi cấy phôi câyCoc đỏ (Lumnitzera littorea (Jack) Voigt 1845) in vitro”.

1.2 Luận điểm mới của dé tài

Hiện nay, nghiên cứu nuôi cấy phôi in vitro trên nhiều đối tượng cây lai hoặccó thời gian miên trạng kéo dài đã được công bố Tuy nhiên, việc khảo sát khả năngnuôi cay phôi loài cây ngập mặn vẫn chưa được công bố

1.3 Mục tiêu nghiên cứu

1.3.1 Mục tiéu chung

Đánh giá khả năng nuôi cấy phôi cây Coc đỏ in vitro nhằm tạo nguồn nguyênliệu khởi đầu cho kỹ thuật vi nhân giống loài cây quý này

1.3.2 Mục tiêu cụ thể

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phát triển của phôi cây Cóc đỏ

1.4 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát tính sống của phôi cây Cóc đỏ.- Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng đến sự phát triển của phôi cây

- Đánh gia sự tang trưởng cây con Coc đỏ thu được in vitro.

- Khảo sát ảnh hưởng độ mặn dén sự tăng trưởng của cây con Coc đỏ.

1.5 Giới hạn của đề tài

Nghiên cứu được thực hiện trên đối tượng Cóc đỏ, một loài cây ngập mặn quýhiếm Mẫu trái được thu từ cây đã nghiên cứu hiện tượng học sinh sản trước đây Vì

vậy, sô lượng trái thu về rât hạn chê.

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Loài Céc đỏ (Lumnitzera littorea)

2.1.1 Phan loai khoa hoc

- Giới: Thực vat (Plantae)

- Ngành: Thực vật có mach (Tracheophyta)

- Lớp: Hai lá mầm (Magnoliopsida)- Bộ: Sim (Myrtales)

- Họ: Bàng (Combretaceae)

- Chi: Lumnitzera

2.1.2 Đặc điểm sinh học, sinh thái và phân bố của loài Cóc đó

Coc đỏ (Lumnitzera littorea (Jack) Voigt 1845) là loài cây ngập mặn that sự.

Cây gỗ nhỡ cao từ 2 - 15 m, đường kính tới 20 cm Lá hình trái xoan ngược, đài 6cm, rộng 2 cm và thon nhọn tới tận gốc Hoa màu đỏ, hợp thành cụm ở đầu cành Tráimập, hình trai xoan, dài 1 — 2 cm và chứa 1 hạt (Hình 2.1) Cây mọc ở rừng ngập mặncửa sông ven biển, nơi chỉ ngập triều cao, hoặc ít ngập nước mặn, đất sét hơi chặt[13].

Kết quả nghiên cứu về hiện tượng học sinh sản của quan thé Cóc đỏ ở vịnhCam Ranh cho thấy Cóc đỏ bắt đầu ra hoa vào khoảng cuối tháng 3, hoa nở rộ nhấtvào khoảng tháng 5, 6 Trái xuất hiện vào khoảng tháng 4 cho đến tháng 8 Trái giàthường gặp nhiều nhất vào tháng 7, 8 Đến cuối thang 8 trái thường rụng gan hết, chỉ

còn gặp rất ít trên một số cây ra hoa muộn

Khi nghiên cứu về đặc điểm sinh thái của các loài cây ngập mặn, Tomlinsoncho rằng loài Cóc đỏ chỉ phân bố ở khu vực có độ mặn thấp, đất xốp và lớp mảnh vụnhữu cơ phủ trên sàn rừng dày [14] Điều này rất phù hợp với rừng ngập mặn ở Aurora(Philippines) vì những cây lớn và số lượng cây chiếm ưu thế đều tập trung ở nhữngnơi gần cửa sông và lạch nước nhỏ [2] Cũng tương tự ở vịnh Cam Ranh (tỉnh KhánhHòa), quan thể Cóc đỏ phân bố ở vùng triều cao, it ngập nước, trên thể nền phố biếnlà cát pha mùn bã hữu cơ, ít chịu ảnh hưởng bởi độ mặn cao Quan sát sự phân bốtrên toàn đải Cóc đỏ cho thấy ở những nơi gần các lạch nước ngọt đồ ra vịnh Cam

Hình 2.1 a) Cây Coc đỏ; b) Hoa Cóc đỏ; c) Trai Cóc đỏ và d) Hạt Coc đỏTrên thé giới, loài Cóc đỏ phân bố ở vùng Đông Phi, trai dài từ vùng Đông

Nam Á đến phía Bắc Australia và Polynesia Ở Đông Nam Á, loài này được phát hiệnở các nước Myanmar, Campuchia, Thai Lan, Malaysia, Singapore, Philippines, Đông

Timo, Brunei, Indonesia, Papua New Guinea và Việt Nam [1; 4] O Viét Nam, Cécđỏ phân bố rất it ở Thừa Thiên Huế, Can Giờ, Côn Dao, Phú Quốc, Khánh Hòa [6;7] Tại tiêu khu 7 thuộc rừng ngập mặn Can Giờ (Tp Hồ Chi Minh), 30 cá thé Cóc

đỏ được tìm thấy phân bố trên diện tích 1.000 m2 Ở vịnh Cam Ranh (tỉnh KhánhHòa), Cóc đỏ phân bố ở vùng Cam Lập và Mỹ Ca Quần thể Cóc đỏ ở Cam Lập nhỏ,chỉ gồm 11 cây phân bé rải rác trên điện tích ước khoảng 500 m2 Quan thê Cóc đỏ ởMỹ Ca có khoảng 1.266 cây, phân bố trên diện tích khoảng 1,5 ha Day được coi làquan thé Coc dé rất đặc sắc và lớn nhất trong cả nước.

Cũng như những loài cây ngập mặn khác, Cóc đỏ có vai trò quan trọng đối với

ôn định môi trường và kinh tế - xã hội vùng ven bờ [1] Cóc đỏ rất có giá trị vì gỗ của

chúng rất bên và chắc Gỗ vẫn không bị mục sau 50 năm ngâm trong nước mặn, nhấtlà khi còn lớp vỏ bên ngoài nên thường được dùng dé làm cầu, cầu tàu, trục xe bò,làm sàn nhà, đóng giường Hơn nữa, gỗ cây Cóc đỏ đẹp và có mùi thơm giống nhưhoa hồng càng làm tăng giá trị gỗ Tuy nhiên, cây gỗ có kích thước lớn lại rất hiễm[4] Ngoài ra, loài này đặc biệt được biết đến như là một loài cây ngập mặn tốt nhất

dé dét lay than Đặc điểm của loại than này là nhiệt lượng cao và giữ được nhiệt lâu

hơn các loại than khác [2] Ngoài ra, các hợp chất từ dịch chiết lá Cóc đỏ có khả năngkháng khuẩn [3]

2.1.3 Những khó khăn trong công tác bảo tồn và phục hồi quan thé Cóc đỏ

Những tác động của con người và thiên nhiên đã làm cho những quân thê Cócđỏ bị cô lập và phân mảnh Điều này có thể là nguyên nhân làm suy giảm khả năngsinh sản hoặc tôn tại của chúng Do bị đe dọa tuyệt chủng cao, loài Cóc đỏ đã đượcđưa vào sách đỏ cần được bảo tồn ở nhiều quốc gia trên thế giới, trong đó có ViệtNam [1; 5] Đặt trong tình trang tương tự, quan thé Cóc đỏ phân bố ở vịnh Cam Ranhdang bị de doa phá hủy, có nguy cơ biến mat do những tác động của con người nhưphá rừng ngập mặn dé xây dựng ao, dia nuôi thủy san, phát triển cơ sở hạ tang, khu

dân cư [8].

Trong những năm gan đây, song song với công việc bảo tồn và phục hồi hệsinh thái rừng ngập mặn ở nhiều nước, việc phục hồi và bảo tồn một số loài cây ngậpmặn có nguy cơ tuyệt chủng như Cui biển (Heritiera littoralis), Gõ biển (Intsiabijuga), Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) cũng được chú trọng [6] Ở Sri Lanka, loàiCóc đỏ cũng đã được ươm trồng cho mục đích phục hồi và bảo tồn Ở đảo Pohnpei(Liên bang Micronesia) đã thành lập các khu vực bảo tôn loài Cóc đỏ cùng với các

loài cây ngập mặn quý hiếm khác [15] Các quan thé Coc đỏ tự nhiên ở Nam Trung

Quốc, bán đảo Mã Lai, và Bắc Australia đã được nghiên cứu về tính đa dạng và cautruc di truyén phuc vu cho viéc bao ton chung [1]

Trong gan 10 năm qua, các nhà khoa học Việt Nam đã có những công bố liênquan đến khả năng tái sinh tự nhiên của loài Cóc đỏ Thứ nhất, độ hữu thụ của hạtphan Coc đỏ ở Thừa Thiên Huế rất thấp, chỉ đạt khoảng 9,85% [9] Thứ hai, nghiên

cứu về hiện tượng học sinh sản của loài này ở vịnh Cam Ranh cho thấy chỉ có 52,67%

trái không bị sâu, không còn hạt (Hình 2.2) [10] Thứ ba, tỷ lệ nảy mầm của hạt Cócđỏ chỉ đạt 2% sau 3 tháng gieo [6] Trong một nghiên cứu khác, một số nhân tố sinhthái tự nhiên như yếu t6 mùa, chất hữu cơ và pH đất cũng có ảnh hưởng đến khả năng

tái sinh tự nhiên của loài Cóc đỏ [11] Thêm vào đó, cây con trong tự nhiên thường

bi cua, cong căn đứt [6] Vì vậy, khả năng tái sinh tự nhiên của loài Cóc đỏ rất kém,khiến cho công tác trồng phục hồi các quan thể Cóc đỏ gặp rất nhiều khó khăn dothiêu nguồn giông.

a 56/7 606: 272/3 3 6¡

Hình 2.2 Trái Cóc đỏ: a) không có hạt; b) có hạt.Do bị đe dọa tuyệt chủng, các quân thé Coc đỏ dang được quan tâm quan lývà bảo tồn bởi chính quyền và cộng đồng dia phương Mặt khác, nhằm đáp ứng nguồngiống phục vụ mục tiêu phục hồi quan thé Cóc đỏ ở tự nhiên, nâng cao tỷ lệ nảy mamcủa hạt Cóc đỏ được xem là một giải pháp Tỷ lệ nảy mam của hạt Cóc đỏ đã đượccải thiện rõ rệt bằng phương pháp xử lý dung dich acid gibberellic (GA3) 70 mg/l vànước 4m 50°C trong 24 giờ Sau 3 tháng gieo ương, tỷ lệ nảy mam của hạt được xửly bằng nước 4m và GA: lần lượt đạt 5% và 4,5%, cao hơn gan gap hai lần so vớinghiệm thức đối chứng (2,5%) [10] Cây con sau 3 tháng đạt chiều cao trung bình từ

7,37 đến 8,50 cm và có 1 lá thật (Hình 2.3) Tuy nhiên, tỷ lệ nảy mâm vẫn còn thấp

SO VỚI yêu câu về nguôn giông trông phục hồi.

—

wW

Xxit gibbercti oY xuóc A Nước lã

† +4 (Đôi chứng) is

Hinh 2.3 Cay Céc do con phat trién trén thé nén dat sau 3 thang gieo wom [10]

Ngay nay, nhằm đáp ứng mục tiêu bảo tồn đa dạng sinh học thực vật, những kỹ

thuật nhân giống nhanh ứng dụng công nghệ sinh học bao gồm nuôi cấy mô từ đỉnhsinh trưởng hoặc chéi bên, tạo phôi soma, nuôi cấy tế bào và nuôi cấy phôi [16] Cuốinăm 2011, Dự án Bao tồn và Phát triển Khu dự trữ sinh quyền Kiên Giang (GIZ) đãthử nghiệm nuôi cấy mô 2 loài cây ngập mặn quý hiếm là Lumnitzera littorea và

Xylocarpus granatum Cay Coc đỏ con được thu ở rừng ngập mặn tự nhiên trên đảo

Phú Quốc Tiếp đó, cây được trông ở vườn ươm trong 4 tuân để tạo nguồn nguyên liệuthu mẫu cấy Sau khi thu, các mẫu chéi ngọn và chéi bên được tiệt trùng và nuôi cấytrong môi trường MS có bồ sung 2,4-D và BA theo 4 tỷ lệ khác nhau Tuy nhiên, sau20 ngày nuôi cay, các mẫu chổi không có dấu hiệu tái sinh [17]

2.2 Kỹ thuật nuôi cấy phôi thực vật

2.2.1 Phôi thực vật

Đối với thực vật, phôi có cấu trúc đa bào có khả năng hình thành một câynguyên vẹn mới Phôi có thể phát sinh từ tế bảo biệt hóa như hợp tử (phôi hợp tử)hoặc tế bao soma (phôi soma hoặc phôi vô tinh) Phôi có cấu trúc lưỡng cực với cựcchéi và cực rễ, dẫn tới các vùng mô phân sinh ngọn chéi và rễ [18; 19] Thông thường,dưới điều kiện thích hợp, phôi non sẽ trưởng thành và phát triển thành cây Tuy nhiên,một số trường hợp nhất định, sự phát triển bị cản trở Vi vậy, điều này trở thành mối

quan tâm khi phôi là những kiểu gen mong muốn Trong những trường hợp như vậy,phôi (hoặc tiền phôi) có thé được tách ra trước khi bị hỏng và nuôi cấy trong điềukiện thích hợp.

Raghvan (1976, 1980) cho rằng sự phát triển phôi có 2 giai đoạn di đưỡng vàtự đưỡng Ở giai đoạn dị đưỡng, phôi (gọi là tiền phôi) có kích thước nhỏ hơn so vớiở giai đoạn tự dưỡng, phụ thuộc vào nội nhũ, đòi hỏi môi trường nuôi cây phức tạp,

có áp suất thâm thấu cao Phôi non tiếp tục phát triển trên môi trường cần được bố

sung kết hợp các loại vitamin, amino acid, chất điều hòa sinh trưởng và trong một sốtrường hợp là dịch chiết tự nhiên như nước cà chua, nước dừa dé hỗ trợ phát triển[20] Ở giai đoạn tự đưỡng, phôi có thé nảy mam và sinh trưởng trên môi trường vôcơ đơn giản có bố sung nguồn carbon Trong pha thứ hai này, sự phát triển của phôikhông phụ thuộc vào các chất điều hòa sinh trưởng ngoại sinh [20]

Ngoài ra, một số yếu tố bảo quan hat tác động đến ty lệ phôi nảy mầm như

phương pháp, thời gian, nhiệt độ Vì vậy, tính sống của phôi cần được kiểm tra trướckhi đưa vào nuôi cay Sử dụng phương pháp tetrazolium liên quan đến việc chuẩn bịphôi của các loài khác nhau theo một cách mà tất cả những bộ phận là quyết địnhtrong việc ước lượng kha năng nay mam có thé được quan sát Đối với ngũ cốc, mặttrước của phôi có thé thấy Phôi được nhuộm sau 24 giờ trong tối ở nhiệt độ phòng.Phản ứng sau đó có thé được xác định một cách chính xác Chỉ những phôi có mô

chéi và sơ khởi rễ liền kề được nhuộm màu mới có khả năng nảy mầm Những vùng

này được xác định bằng phần gạch nghiêng trong Hình 2.4 Ở lúa mì (Hình 2.4a) vàyến mạch (Hình 2.4d) (phôi có vỏ), đường ranh giới năm giữa phác thể thân và rễsong song với vỏ phôi Còn đối với lúa mạch (Hình 2.4b), đường này nằm ở gốc sơkhởi rễ; trong đại mạch (Hình 2.4c) đường này có thé nhận thấy là eo thắt giữa phácthé chổi và rễ [21]

Hình 2.4 Phôi hạt ngõ cốc cắt đọc, phóng đại x13 a) Lúa mì; b) Lúa mạch; c) Đạimạch; d) Yến mạch Những phần phôi bị nhuộm mau sau khi xử lý với tetrazolium

có khả năng nảy mầm được minh họa bằng phần gạch nghiêng [21]

2.2.2 Lich sử nuôi cay phôi thực vật

Kỹ thuật nuôi cấy phôi đã được sử dung trong công tác lai tạo giống kê từ thékỷ 18 khi Charles Bonnet thực hiện tách phôi của cây lai giữa Phaseolus x Fagopyrumvà trồng trong đất [18] Những phôi này đã hình thành nên cây lùn Môi trường đinhdưỡng nuôi phôi được sử dụng trong những năm 1890 bởi Brow & Morris Cho đếnthế kỷ 19, Hannig (1904) đã thành công khi thu được cây con từ việc nuôi cấy phôi

được lay từ một số loài cây cải bắp như Raphanus spp và Chochlearia daminca trong

môi trường chứa muối khoáng và đường ở điều kiện vô trùng Nghiên cứu đã mở ramột lĩnh vực nghiên cứu cơ bản về phôi Điểm nhắn ở đây đã lý giải về khía cạnhsinh lý, phát triển và ảnh hưởng của những cơ chất sinh trưởng Brown (1960) đãđánh giá hiệu quả tương quan của nhiều hợp chất N hữu cơ đến sự sinh trưởng vàphát triển của phôi lúa mì nuôi trên môi trường chứa muối khoáng và đường Knudson(1922) đã thành công khi nuôi cay phôi cây phong lan thành cây nguyên vẹn trên môi

trường agar chứa đường và không có nắm cộng sinh Kết qua cho thay trong trường

hợp không có đường, phôi không phát triển qua giai đoạn protocorm Xác định vaitrò đặc biệt của đường dẫn đến giả thuyết rang nắm cộng sinh đã chuyền hóa tinh bộtthành đường [22].

Dieterich (1924) rút ra kết luận từ nghiên cứu của mình rằng phôi nuôi trongông nghiệm nảy mâm ngay mà không qua giai đoạn ngủ và nhu câu dinh dưỡng của

Thông thường, phôi phải được tach ra trước khi bi hong trong trường hợp phôibị thiếu dinh đưỡng hoặc phôi có được từ kết quả lai xa Ở những trường hợp như

vậy, phôi hỏng thường không nảy mam nhưng có thé được tách ra và nuôi trong ốngnghiệm theo một quy trình thích hợp Laibach (1925, 1929) đã nhẫn mạnh tầm quantrọng của nuôi cấy phôi từ cây lai khác loài giữa Linum perenne x L austriacum Cácphôi phải được tách ra nếu không chúng sé bị phá hủy và/hoặc thoái hóa nội nhữ [18]

Năm 1933, việc nuôi cấy phôi quả anh đào của Turkey đánh dấu bước ngoặt

của nuôi cấy phôi cây ăn quả Môi trường và quy trình nuôi cấy phôi của ông đã đượcchấp nhận và ứng dụng thành công ở nhiều loài cây ăn quả khác Đến nay, kỹ thuật

này được ứng dụng rộng rãi ở nhiều đối tượng như nho (Emershad & Ramming,1982), táo (Dantas và cs., 2006; Druart, 2000), chuối (Bakry, 2008; Uma và cs.,

2011), cam (Viloria và cs., 2005; Xie và cs., 2013, 2014), xoài (Krishna & Singh,2007), dưa bở (Ezura và cs 1994; Nunez Palenius và cs., 2006), dao (Anderson va

cs., 2002; Pinto và cs., 1994), hồng (Hu và cs., 2013; Leng & Yamamura, 2006;Yamada & Tao, 2007), dưa hấu (Taskin và cs., 2013), với nhiều mục đích như tạo

cây ăn quả không hạt, cay tam bội va cây lai xa [22].

2.2.3 Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy phôi

Phôi thực vật được tách ra dé tránh bị phá hủy băng cách cắt lay chúng từ bầunhụy (ovaries) hoặc noãn (ovules) Trong một số trường hợp, khả năng tách phôi rấtkhó thực hiện Để cứu những phôi này, toàn bộ bầu nhụy hoặc noãn chứa phôi được

nuôi cây Đối với nuôi cây bầu nhụy, sau khi thụ phan, dai hoa, canh hoa, hat phanđược loại bỏ dé thu bầu nhụy Tiếp đó, những bầu nhụy này được vô trùng bề mặt,

cắt phan cuỗi cuống hoa và nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng Nếu suôn sẻ, baunhụy phát triển thành trái với đầy đủ hạt Đối với nuôi cấy noãn, bầu nhụy vô trùngđược mở ra và noãn đã thụ tinh được đặt trên bề mặt môi trường nuôi cây [23] Một

số đối tượng đã được nuôi cấy phôi như: thuốc lá (Reed & Collins, 1978; Nikova &Zagorska, 1990), cây bóng nước (Arisumi, 1980), bông vải (Stewart, 1981), Brassica

spp (Bajaj và cs., 1986; Agnihotri và cs., 1988, 1990a, 1990b), Brassica x Raphanus

(Takeshita và cs., 1980); nuôi cấy lát cắt quả như: Lilium (Hayashi va cs., 1986 ;

Knoh va cs., 1988), nho khéng hat (Cain va cs., 1983 ; Bouquet & Davis, 1989).

Mathias va cs (1990) đã công bố một kỹ thuật mới có thé tránh khỏi sự phá hủy phôirất sớm sau khi lai giữa 2 loài Cuphea paucipetala ssp greenwoodii x C.laminuligera Phôi của noãn đã thụ tinh được nuôi trong ống nghiệm trên môi trường2 lớp rắn/lỏng chứa than hoạt tính ở pha rắn Cây lai thu được sau đó được chuyểnphôi dang phát triển sang môi trường rắn Kỹ thuật này có thé được ứng dụng ở cácđối tượng khác Ngoài ra, kỹ thuật tạo lỗ thủng trên noãn và hệ thống hỗ trợvermiculite cho hiệu quả cao hơn môi trường nuôi cấy trong việc khởi động sự sinh

trưởng của phôi chưa trưởng thành (chiều dài < 10 mm) trong ống nghiệm ở cây đào

sau 15 ngày thụ phan Như vậy, nội nhũ chưa trưởng thành có thể cung cấp đủ dinh

dưỡng và cảm ứng phôi nảy mầm ngay Tuy nhiên, kỹ thuật này không được ứngdụng nhiều [18]

Nuôi cấy in vivo/in vitroPhôi của cây lai được nuôi bằng kỹ thuật ghép in vivo/in vitro Người di tiênphong trong kỹ thuật này là Kruse (1973, 1974) Ông đã thu nhận thành công cây lai

từ việc lai tạo Hordeum x Triticum, Hordeum x Secale và Hordeum x Agropyron.

Phôi cua cây lai phat triển trên nội nhũ lúa mạch trong điều kiện in vitro Nội nhũđược thu bang cách ép hạt lúa mạch 14 — 18 ngày tuôi và loại bỏ phôi gắn trên đó.Những nội nhũ này được nuôi cấy trong môi trường Phôi của cây lai được ghép trên

nội nhũ ở đúng vi trí của phôi lúa mạch Thông thường, phôi của cây lai được tách rasau 9 — 12 ngày thụ phan Tuy nhiên, nếu những phôi non hơn thì được ghép trên nộinhũ trưởng thành, lên đến 10 phôi gan trên 1 nội nhũ Kruse (1974) chỉ ra rằng việcphép nhiều hon 1 phôi tốt cho việc phục hồi cây lai hơn so với chỉ ghép 1 phôi Môitrường nuôi cay đơn giản và không ảnh hướng đến hiệu quả việc thu nhận cây lai Kỹthuật này có thê cứu những phôi non mà không thể sinh trưởng trên môi trường nhân

tạo Bằng kỹ thuật này, De Lautour và cs (1978), Williams (1978), Williams và cs

(1982) đã thu nhận thành công cây lai Trifolium spp và Asano (1980) đối với cây

Lilium [18].

Nuôi cấy in vitroKỹ thuật in vitro được sử dung phô biến nhất như là một công cụ đắc lực đểcứu phôi, kế cả với những phôi chưa trưởng thành hoặc thiếu nội nhũ Sự thành công

của việc trồng cây từ phôi yếu và chưa trưởng thành phụ thuộc rất nhiều vào giai đoạntrưởng thành và thành phần môi trường Cho đến nay, giai đoạn phát triển vẫn là một

mối quan tâm, ngay cả khi phôi rất non đã được nuôi cấy thành công khi sử dụng môitrường phức tạp Phôi dang phát triển là một hệ thống động, nó liên tục thay đôi nhucầu trong suốt quá trình sinh trưởng và phát triển Phôi càng nhỏ, môi trường nuôicấy càng phức tạp [18]

White (1932) nuôi phôi Protulaca oleracea ở giai đoạn hình tim trong môitrường chứa muối khoáng, glucose và huyết thanh, đã cảm ứng phát triển phôi đến

giai đoạn gần trưởng thành có rễ mâm và lá mầm Maheshwari & Baldev (1962) đãnuôi cấy phôi non loài Cuscuta reflexa trên môi trường chứa IAA và casein thủyphân Phôi tăng sinh dé hình thành một số phôi khác Sau đó, khi chuyên sang môitrường không chứa IAA va casein, mỗi phôi hình thành chồi bình thường Kết quảtương tự đối với nuôi cấy tiền phôi loài Dendrophthoe falcata (Johri & Bajaj, 1962),

Amylotheca, Amyema và Scurrula (Johri & Bajaj, 1964) [18].

2.2.4 Ung dung của nuôi cay phôi

Nuôi cấy phôi bao gồm những nghiên cứu cơ bản cũng như ứng dụng về phávỡ miên trạng hạt, kiểm tra khả năng sống của hạt, rút ngắn chu trình nuôi cấy Hơnnữa nuôi cấy phôi còn là kỹ thuật tách kịp thời những phôi có nguy cơ không hình

thành cây con Trường hợp này thường gặp ở phôi yếu hoặc là kết quả của phép lai

Xa.

2.2.4.1 Nuôi cấy phôi yếu

Trong trường hợp này, hạt có khả năng nảy mam thấp vì thiếu dinh đưỡnghoặc yếu tố sinh lý Ví du, ở nhiều loài cây ăn qua, hạt của qua đầu mùa không nảymam Đối với quả hạch và nho chín sớm, khả năng nay mam của hạt cũng rất thấp.Tukey (1933) quan sát thấy một số giống sơ ri ngọt chín sau 50 ngày nở hoa nhưnghạt của chúng chứa phôi chưa phát triển hoàn thiện đều không nảy mầm Tuy nhiên,phôi được tách ra, nuôi cấy và phát triển thành cây nguyên vẹn Ké từ đó nuôi cayphôi được thực hiện như là phương pháp phố biến ở lĩnh vực trồng cây ăn quả như

bo (Skene & Barlass, 1983; Torres và cs., 1986), đào, xuân dao va man (Ramming,1985), nho (Gray va cs., 1987; Tsolova, 1990), Pelargonium (Scemama & Raquin,

1990) và Ornithogalum (Niederwieser và cs., 1990) Có lẽ ứng dụng thú vị nhất củakỹ thuật này là ở cây lai giữa các giỗng nho không hột (Ramming, 1990) Để tạo racây lai giữa giống nho không hột với những tính trạng mong muốn nhất định thôngqua nhân giống truyền thống, giống có hạt được sử dụng làm cây mẹ Khả năng nảymam của hạt nho chín sớm này thấp vì phôi kém phát triển Phôi được tách và nuôicấy từ những giống dao (Tukey, 1934) va Vitis (Ramming & Emershad, 1984) chínsớm, nên chúng được sử đụng làm cây mẹ Nhiều giống nho không hột chính là phôingừng phát triển Mỗi nhà trông nho đều mong muốn lai những giống nho lép hạt vớinhau Kỹ thuật này hứa hẹn việc loại bỏ bước lai cây mẹ có hạt với thế hệ thứ hai củaphép lai hoặc lai chéo Thêm vào đó, nhu cầu về đất, nhân công, phân bón và nước

cho trồng một thế hệ khoảng 5 nắm sẽ được tiết kiệm Nghiên cứu đã thành công

trong việc nuôi cấy phôi và tạo thành cây nguyên vẹn từ những giỗng nho hạt lép(Emershad & Ramming, 1984; Spiegel-Roy và cs., 1985; Emershad và cs., 1989;

Gribaudo và cs., 1993) [18].

Ramming & Tanner (1987) đã thực hiện tuyển chọn từ những cây dao con pháttriển từ kỹ thuật nuôi cay phôi Hai giống “Goldcrest” và “Mayfire” thu được từ nuôicấy phôi và trở thành giống thương phẩm sớm nhất ở California Hu và cs (1991) đã

được nuôi cấy phôi (Cox và cs., 1960) Trong những trường hợp này, nuôi cấy phôi

có khả năng gia tăng biến di đi truyền chứ không như nhân giống vô tinh [18]

Đối với lan, hạt bị rụng khi phôi chi mới ở giai đoạn hình cau Hau hết cácgiống có giá trị đều khó nhân giống, vì hạt của chúng bị khuyết mô bảo vệ và phôi ởdạng trần mà không có nội nhũ Knudson (1922) đã thành công trong việc cho phôilan nảy mam thành cây con trên một môi trường đơn giản Sau đó, nhân giống lan

băng cách sử dụng nuôi cấy phôi đã trở thành phương pháp thương mại Thực tế, đây

là một trong những ứng dụng công nghệ sinh học đầu tiên và sau này được hoàn thiệnbởi Morel (1960) Tương tự, phôi yếu của những đối tượng thực vật khác cũng có thểđược nuôi cấy thành công một cách trực tiếp hoặc thông qua mô sẹo (Pental &

Grunckel, 1980) [18].

2.2.4.2 Nuôi cấy phôi cây lai xa

Laibach (1925) đã ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy phôi nhằm phục dựng cây lai

từ phép lai giữa Linum perenne x L austriacum Mặc dù quả nang của cay lai phat

triển bình thường, nhưng hạt lại bị teo và nhẹ hơn hạt bình thường nhiều Những hạtnày không thé nảy mam trong đất Phôi được tách ra từ hat lại nảy mầm bình thườngtrên miếng bông gòn thấm dung dịch sucrose Thành công này là viên gach đầu tiên,mở ra hướng đi mới cho hàng loạt những ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy phôi trong phụcdựng cây lai của nhiều chi khác như Solanum (Jorgensen, 1928), Lycopersicon

(Smith, 1944), Oryza (Niles, 1951), Phaseolus (Honma, 1955), Brassica (Nishi vàcs., 1959; Harberd, 1969), Medicago (Fridriksson & Bolton, 1963), Hordeum (Kasha& Kao, 1970; Bozorgipour & Snape, 1991), Agropyron (Alonso & Kimber, 1980),Triticum (Sharma & Gill, 1983), Arachis (Bajaj va cs., 1982; Halward & Stalker,1987), Gossypium (Altman va cs., 1987), Glycine (Broue et al , 1982), Allium

(Gonzalez & Ford-Lloyd, 1987), Trifolium (Hyrkas và cs., 1986), Populus (Thakur& Khosla, 1991; Raquin va cs., 1993), Helianthus (Krauter & Friedt, 1990; Krautervà cs., 1991) va Lotus (O'Donoughue & Grant, 1988) va vượt qua rào can từ phép lai

khi phôi bi hủy trước khi nay mầm (Chen và cs., 1983 ; Contolini & Hughes, 1989;

Van Tuyl va cs., 1991; Muramatsu va cs., 1992) [18].

2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát trién phôi2.2.5.1 Môi trường nuôi cấy

Một số công thức thành phần môi trường muối khoáng được sử đụng trongnuôi cấy phôi gồm Murashige & Skoog và B5 của Gamborg cơ bản hoặc có cải tiễn

được sử dụng rộng rãi Bên cạnh thành phân muối khoáng thiết yếu, một số cơ chất

thúc đây sinh trưởng cũng cần được bổ sung vào môi trường nuôi cấy Chúng baogôm:

ĐườngĐường sucrose được sử dụng phô biến nhất với vai trò là nguồn carbon và chatôn định thâm thấu Phần lớn sucrose cho kết quả tốt hơn các loại đường khác Tuynhiên, ở một vài nghiên cứu, các loại đường khác cũng có hiệu quả tốt Chang hạnnhư, phôi Datura stramonium sinh trưởng tốt ở môi trường chứa sucrose 4%, trongkhi phôi D metaloides đều sinh trưởng tốt ở các môi trường chứa sucrose cũng nhưglucose, mannose hoặc glycerol Nhìn chung, sucrose trong môi trường nuôi cay phôi

chưa trưởng thành có nông độ cao hơn so với phôi trưởng thành Nông độ nay đóngvai trò là chất điều hòa thâm thấu nhiều hơn là cung cấp dinh đưỡng Điều này được

chứng minh bởi nghiên cứu của Raghavan & Torey (1964) Với nhu cầu sucrose 12%(Rijven, 1952), phôi Capsella vẫn có thé sinh trưởng tốt ở môi trường chứa sucrose2% và một vài chất điều hòa sinh trưởng Néng độ thâm thấu trong môi trường caongăn cản phôi non nảy mầm sớm và hỗ trợ sự sinh trưởng phôi bình thường Tukey(1933) khẳng định môi trường chứa glucose 2% hỗ trợ sự tích lũy chlorophyll và giatăng kích thước lá mầm của phôi ở giai đoạn phát triển sớm và ức chế sinh trưởngcủa phôi đã phát triển Tác động này có thé được gây ra bởi sucrose (Nostog, 1956),casein thủy phân (Ziebur & Brink, 1951), mannitol hoặc glycerol (Rietsema và cs.,1953) Nồng độ sucrose được sử dung trong nuôi cay phôi nằm trong khoảng rất

lớn, từ 0,5% đến 18% Phôi trưởng thành thường sinh trưởng tốt trên môi trường chứasucrose ở nồng độ 2 — 3%, trong khi đối với phôi chưa trưởng thành nông độ này tănglên khoảng 8 — 12% Tuy nhiên, giá thành của sucrose tinh sạch cao nên đường nàythường được sử dụng ở nông độ thấp hơn và bé sung thêm các cơ chất kích thích sinhtrưởng, hoặc sucrose có độ tinh sạch thấp hơn [18]

Chất bồ sung có nguồn gốc thiên nhiênTrong nuôi cay phôi in vivo/in vitro, các thành phan của nội nhũ hỗ trợ sự sinhtrưởng của phôi Điều này đã được chứng minh khi phôi Datura trưởng thành có thésống trên môi trường đơn giản chứa glucose nhưng phôi ở giai đoạn hình tim và cáđuối lại chỉ tn tại trên môi trường chứa glycine, thiamine, pyridoxine, acid ascorbic,adenine, acid nicotinic, acid succinic và acid pantothenic Tuy nhiên, đối với nhữngphôi nhỏ hon, môi trường phức tap nay không còn tác dung, mà nước diva lai có thégiúp chúng nảy mam Từ đó, nước dừa được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy phôimặc dù nó vẫn ức chế sinh trưởng phôi của một số loài như bắp, lúa mach [18]

Tương tự như nước dừa, dịch nội nhũ được bé sung vào môi trường nuôi câyphôi Tác dụng của dịch chiết nội nhũ hiệu quả đối với một số loài đã được công bốLi, 1934 ; Li & Shen, 1934 ; Voss, 1939; Kent & Brink, 1947) Mặc dù thành phanhóa học của nội nhũ phụ thuộc vào yếu tố loài, nhưng thông thường nội nhũ chứamyo-inositol, sorbitol, auxin, cytokinin, hợp chất nitơ [18]

Bên cạnh nước dừa, dich casein thủy phân (Ziebur & Brink, 1951), dịch chiếtmalt (Blakeslee & Satina, 1944) cũng được sử dung để bé sung vào môi trường nuôicấy phôi nhăm kích thích phôi sinh trưởng Dịch chiết malt tiệt trùng lạnh chứa zeatinvà zeatin riboside (Van Staden & Drewes, 1975) Dịch casein thủy phân cung cấp cácamino acid, trong khi cao nắm men lại giàu vitamin [18]

Chất diéu hòa sinh trưởngMặc dù chất điều hòa sinh trưởng như GAs, auxin, cytokinin, được sử dụngrộng rãi, nhưng hiệu quả của chúng không thống nhất và có khi đối ngược nhau Bởivì tác dụng của những cơ chất này không phải ở mặt dinh dưỡng, mà ở nông độ thâmthấu Hoạt động của chúng liên quan với tính thắm của tế bào và hấp thụ ion Nhìnchung, đối với nuôi cấy phôi, nồng độ auxin thấp kích thích sự sinh trưởng bình

thường, trong khi nông độ auxin cao hơn lại ức ché sinh trưởng hoặc tạo mô sẹo [20].GAa có tác dung đến sự gia tăng kích thước phôi (Iyer và cs., 1959) Cytokinin lạithường ức chế sinh trưởng phôi (Raghavan & Torrey, 1964; Kano, 1965) Pinfield &Stobart (1972) sử dung kinetin để kích thích sinh trưởng phôi Acer [18]

Nghiên cứu của Zdrujkovskaja-Richter (1981) cải thiện tính khả thi trong nuôi

cấy phôi anh đào in vitro bằng cách bồ sung cơ chất kích thích sinh trưởng và dich

chiết thực vật vào môi trường Kinetin với nồng độ 0,5 mg/1 kích thích lá mầm tăng

trưởng, nồng độ 0,1 mg/1 kích thích tạo rễ và chi từ phôi quả anh dao Tác đụng củanhững cơ chất này thê hiện rõ hơn ở nhiệt độ thấp (8 — 10°C) Trong điều kiện tươngtự với GA3 2 mg/l, sự tăng trưởng của lá mầm và chồi được kích thích Zdrujkovskaja-Richter (1982) đã thu được phôi cây anh dao lai lớn gấp 10 lần sau 2 tuần nuôi cay ởgiai đoạn phôi hình tim trên môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) chứa dich

casein thủy phân 400 mg/l, cao nắm men 200 mg/l và bé sung GA3 2 mg/l hoặc kinetin

0,1 mg/l Kasten & Kunert (1991) đã nuôi cấy phôi cây lai giữa các dòng Lupinusspp trên môi trường lỏng bồ sung acid abscisic [18]

Năm 1987, Bauchan đã nuôi cấy phôi 2 loài Medicago scutellata va M sativa,khởi đầu cho nghiên cứu tao dòng lai kháng mot và ray Phôi của 2 loài được nuôicay trên môi trường MS bỗ sung kết hợp 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D),

indolacetic acid (IAA), 6-benzylaminopurin (BAP), và kinetin (KIN) hoặc trên môitrường Schenk & Hildebrandt (SH) bổ sung L-glutamine và L-proline Phôi hình timvà cá đuối loài M scutellata sinh trưởng tốt nhất (tỷ lệ thu được cây con: 27,5%) ở

môi trường MS bé sung IAA 0,05 mg/l va BAP 0,05 mg/1 Sau 15 — 30 ngày, phôichi sinh chồi nên được chuyển qua môi trường MS không chứa chất điều hòa sinhtrưởng thực vật để tạo rễ Sự tạo rễ xuất hiện trong ngày 15 đến 30 và cây con có thểđưa ra trông ở đất trong vòng 2 — 4 tuần Đối với loài M sativa, phôi phát triển tốtnhất (tỷ lệ thu được cây con 31%) trên môi trường SH chứa L-glutamine 50 mM.Phôi loài này phát triển cả thân và rễ [24]

Năm 2007, Pech Y Aké và cs đã nghiên cứu ảnh hưởng acid gibberellic đếnsự nay mam in vitro của phôi hợp tử dừa (Cocos nucifera L.) Có 4 nghiệm thức gồmmôi trường bán ran, môi trường lỏng có hoặc không GA3 Phôi được nuôi cây trong

5 tuân, sau đó tiếp tục chuyên sang môi trường mới không chứa GA; trong 32 tuầncòn lại Kết qua cho thấy phôi được nuôi cấy trong môi trường có GAs có tỷ lệ nảymam cao hon và thời gian nảy mâm nhanh hon so với đối chứng Ở nồng độ GAs tốiưu trong môi trường lỏng là 0,46 uM, tỷ lệ nay mầm dat 80% trong khi đối chứng chỉđạt 62% Còn đối với môi trường bán rắn, GA3 4,6 uM tăng ty lệ nay mam từ 71%(đối chứng) lên 98% Như vậy, GA3 có tác dụng kích thích nảy mầm phôi dừa trong

điều kiện in vitro [25]

Năm 2008, nho không hột (Vitis vinifera L.) được trồng rộng rãi ở châu Âu,châu Á và châu Mỹ nhưng chúng lại bị nhiễm bệnh nắm Trong khi đó, loài nho hoang

dại Trung Quốc lại có khả năng kháng nhiều bệnh nắm Vì vậy, nghiên cứu lai tạo ragiống nho không hột kháng nam được thực hiện Kỹ thuật cứu phôi trong noãn đượcsử dụng để tạo cây con Phôi được tách từ quả chưa chín sau 7 tuần thụ phấn, nuôi

cấy trên môi trường 2 pha Emershad & Ramming (ER, 1994) có bé sung sucrose 6%và than hoạt tính 0,3% Sau 8 — 12 tuần, phôi được tách ra khỏi bầu noãn và chuyểnsang môi trường WPM chứa benzyladenine (BA) 1,0 uM, sucrose 2% va than hoạt

tính 0,2%, agar 0,6% Sau 8 tuần, phôi nảy mam và sinh trưởng thành cây nguyênvẹn Với các điều kiện tối ưu, tỷ lệ hình thành phôi đạt 34%, tỷ lệ phôi nảy mầm đạt

91,2%, tỷ lệ thu được cây nguyên vẹn đạt 77,4% [26].

Chi Jatropha có hơn 200 loài và có tỷ lệ thụ phan chéo cao nhưng sự đa dang

trong cùng một loài lại bị hạn chế Nuôi cấy phôi hứa hẹn trở thành phương pháp cógiá trị kinh tế cao trong việc thu nhận cây từ kết quả lai tạo giống Mohan và cs (2001)đã sử dụng môi trường MS bồ sung BA 0,1 mg/1 dé tạo chdi và IBA 0,5 mg/1 dé tạo rễtrong nuôi cấy phôi cây Jatropha curcas [27]

Đậu lăng (Lens culinaris Medik.) là cây lương thực quan trong ở Nam châu A,

Đông Bắc châu Phi, vùng Trung Đông, Đông Nam Úc, các đồng bằng phía Bắc HoaKỳ, và đồng cỏ phía Tây Canada Việc canh tác đậu lăng đang bị đe dọa bởi nhiều loại

bệnh nấm Sự đa dạng kiểu gen có thé kháng lại những bệnh này Năm 2015, Saha và

cs đã nuôi cấy thành công phôi cây đậu lăng lai trong môi trường b6 sung chloroindole-3 acetic acid (4-CI-LAA) 0,2 mg/l, ty lệ phôi nay mầm dat 43% [28]

Kết hợp cytokinin nồng độ thấp và auxin nồng độ cao làm giảm khả năng pháttriển không bình thường về mặt hình thái của cây con trong nuôi cấy phôi Crofonscabiosus Bedd (Euphorbiaceae) là một loài đặc hữu ở miền Đông Nam Ghats củaAndhra Pradesh, Ấn Độ Vấn đề liên quan đến bệnh của hạt, tỷ lệ nảy mầm kém vàcháy rừng tái diễn ở hệ sinh thái bản địa là những nguyên nhân chính dẫn đến tỉ lệ táisinh của loài này thấp Với mục tiêu gia tăng quan thé loài Croton scabiosus trong tự

nhiên, Salamma & Rao (2013) tập trung vào phát triển quy trình tiêu chuẩn nhân giống

bang kỹ thuật nuôi cay phôi Môi trường MS chứa auxin kết hợp với cytokinin theo tylệ 1:6 (0,5 mg/l BA + 3,0 mg/1 IAA) được sử đụng Kết quả cho thay cây con phát triểntừ phôi đạt tỷ lệ cao nhất (90%) và khỏe mạnh [29]

Chất làm đặc môi trườngAgar là chất làm đặc môi trường nuôi cấy phô biến nhất Nông độ từ 0,5 —1,5% thường được sử dụng trong nuôi cấy phôi Nông độ agar cao có thé gây ức chếsinh trưởng do các nguyên nhân như bị mất nước, chất lượng agar, hoặc muỗi bị tạpnhiễm Thay thé agar, hệ thống vermiculite hỗ trợ những phôi nhỏ [18]

2.2.5.2 Điều kiện nuôi cấy

Ánh sáng và nhiệt độ là hai yếu tố môi trường được quan tâm chủ yếu trongnuôi cấy phôi Phôi sinh trưởng tốt nhất trong tối khoảng 1 — 2 tuần đầu tiên và chuyểnqua điều kiện nuôi cấy có ánh sáng dé hình thành điệp lục tố Anh sáng trong nhữngngày đầu nuôi cấy được loại bỏ để cảm ứng sự nảy mầm sớm Tuy nhiên, cường độánh sáng cao cũng ngăn cản nảy mầm sớm trong một số trường hợp [30]

Phôi được tách ra nảy mầm trong khoảng nhiệt độ rộng hơn là hạt nguyên vẹn.Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của phôi phụ thuộc và từng loài, nhưng thường từ25 — 31°C [30] Phôi của cây mùa đông yêu cầu nhiệt độ thấp hon so với phôi của câymùa hè Chang hạn như, nhiệt độ tôi ưu của phôi khoai tây là 20°C trong khi phôibông vải lên đến 32°C Một số phôi cần xử lý lạnh ở 4°C dé phá trạng thái ngủ Đốivới nuôi cay phôi cây đào, anh đào, mận và lê, xử lý nhiệt độ thấp là yếu tố cần thiết.Phôi không được cảm ứng bởi nhiệt độ thấp, sẽ bị giảm ty lệ sống và nảy mam, hìnhthành cây có lá bất thường và nhanh chóng vượt giai đoạn ngủ Nếu phôi được đặt

trong hộp lạnh ở 1 — 5°C, sau đó chuyển sang môi trường nuôi cấy trong 40 ngày,

chúng hình thành cây con sinh trưởng bình thường [18].

Khoảng pH môi trường nuôi cấy phôi thông thường từ 5 — 6 [18].2.3 Sự nảy mầm của hạt

Hạt có nhiệm vụ chủ yếu là phát tán thế hệ mới Cấu tạo từ ngoài vào trongbao gồm vỏ hột, tiếp theo là nội nhũ có nhiệm vụ cung cấp chất dinh dưỡng cho sựphát triển của phôi Phôi chính là mầm mống của thế hệ kế tiếp của cây Một phôihoàn chỉnh gồm có rễ mam, chổi mầm, thân mầm và lá mầm Ở nhiều loài đơn tửdiệp, phôi nhũ rất lớn và chiếm gan hết thé tích của hạt Ở hạt song tử điệp, chất đinhdưỡng dự trữ trong 2 lá mầm

Sự nay mam của hạt là quá trình tái lập tăng trưởng của phôi dé đưa rễ mamra ngoài vỏ hột Sự nảy mam xảy ra gồm ba giai đoạn chính: giai đoạn hấp thu nước,giai đoạn nảy mam và giai đoạn tăng trưởng của cây mam Đầu tiên, hat bắt buộc hapthu nước dé khởi động sự nảy mam Tiếp đến, giai đoạn nảy mầm xảy ra khi hạt bãohòa nước, cường độ hô hấp cao, chất dự trữ trong hạt bắt đầu các quá trình chuyênhóa Phôi bắt đầu sự phân chia tế bào, rễ mầm và thân mâm kéo dài và lú ra khỏi vỏhạt khoảng 1 — 2 mm Cuỗi cùng, ở giai đoạn tăng trưởng của cây mam, hạt tiếp tụcthu thêm nước, các hoạt động biến dưỡng trong hạt xảy ra mạnh, các chất dự trữ giảmdan Cây mam tăng trưởng, nhô lên khỏi mặt đất và chuyển sang trạng thái sống tự

dưỡng [31].

Có thé chia sự nảy mam của hạt thành hai kiểu theo hiện tượng hình thái Sự

nảy mam thượng địa xảy ra ở cây song tử điệp Rễ mầm chui ra khỏi vỏ hat bị nứt ởvị trí noãn khẩu và đâm thăng vào đất dù hạt năm ở bất kỳ tư thế nào đo rễ có khuynhhướng địa hướng động thuận Rễ mầm mang lông hút và đầu rễ phân hóa tạo thànhchóp Thân mâm tăng trưởng ngược chiều với rễ mầm, mọc thăng đứng đưa tử điệplên khỏi mặt đất Diệp lục tố thành lập đo tử diệp tiếp xúc với ánh sáng Tử điệp nởra và teo dan theo sự tăng trưởng của cây mầm Khi chéi mầm tăng trưởng, phác thélá tăng trưởng thành lá sơ khởi Lúc này thân được chia thành hai đoạn: đoạn từ chéingọn đến tử điệp gọi là trụ thượng diệp và đoạn từ tử diệp đến rễ gọi là trụ hạ diệp.Sự nay mam hạ địa xảy ra ở cây đơn tử diệp Đây là sự nay mam mà phôi nhũ không

được đưa lên mặt đất mà bị giữ lại trong vỏ hột dé nuôi cây con tăng trưởng Chéimam tăng trưởng thắng đứng (quang hướng thuận) nhô lên khỏi mặt đất Bao lá mamnứt ở một bên, các lá non phát trién và đưa ra ánh sáng Thân mam không chia thànhhai đoạn như cây song tử điệp vì chồi mầm, thân mâm và rễ mâm năm trên cùng mộttrục, không bi chia cắt bởi tử điệp [31]

2.4 Hình thức sinh sản của cây ngập mặn

Sống trên nền bùn mém, thiếu oxy, nhiễm mặn mạnh, hàng ngày chịu tác động

của thủy triều, các loài cây ngập mặn đã có những hình thức thích nghi độc đáo

Tomlinson (1986) đã mô tả các hình thức sinh sản của cây ngập mặn: sinh sản sinh

dưỡng, nảy mam trong lúc phân tán bởi nước, “sinh con” trên cây mẹ (viviparity).Thực tế các loài cây ngập mặn it có điều kiện sinh sản sinh dưỡng mà phụ thuộc vàosự phân bố và phát tán quả hoặc cây con Phát tán bởi nước là cách thức chủ yếu mà

cây ngập mặn phát tán hạt, quả hoặc trụ mầm Trong quá trình phát tán, sự nảy mầmcủa hạt thường xuất hiện Các loài thuộc chi Cóc (Lumnizera), Ban (Sonneratia) sinh

sản theo hình thức này Một đặc điểm khá thú vị của các loài cây ngập mặn là hiệntượng sinh con Hạt của các loài này không có thời kỳ nghỉ mà nảy mâm ngay trêncây me, tạo ra cây con nỗi liền với quả gọi là trụ mam Kích thước và độ dài của trụmam ở các loài cây khác nhau nhưng đều có dạng hình trụ, phân bung hơi phình to.Trụ mầm màu xanh lục có nhiều lỗ vỏ Khi trụ mam già thì xuất hiện một vòng côgiữa quả và trụ mầm Khi vòng cô chuyên từ màu xanh lục sang các màu khác là trụmam bat đầu chín và sắp rời quả cũng như cây mẹ Các loài thuộc chi Đước

(Rhizophora, 8 loài), Da (Criops, 2 loài), Trang (Kandelia, 1 loài), Vet (Bruguiera, 6

loài) đều sinh san theo hình thức này Các loài thuộc chi Mam (Avicennia), Sú

(Aegiceras), Aegialitis, Nypa và Pelliciera còn có hiện tượng sinh con kín

(cryptovivipary), hạt cũng nảy mam trên cây mẹ nhưng trụ mâm nằm kín trong vỏ

quả, không ló ra ngoài.

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Sơ đồ nghiên cứuKhảo sát tính sống

của phôi cây Cóc đỏ

đến sự phát triểnphôi cây Cóc đỏ

Khảo sát ảnh hưởngnông độ sucrose đếnsự phát triển phôi cây

Ỷ

Nuôi cấy phôi trên các

môi trường: MS, 1⁄2 MSvà WMP.

Vv

Môi trường khoáng phù hợpvới sự phát triên phôi Cóc đỏ.

Nuôi cấy phôi trên môi

trường khoáng + sucrose(20, 30 và 40 g/l)

Môi trường khoáng + sucrosephù hợp với sự phát triên phôiCóc đỏ

Ỷ

Nuôi cấy phôi trên môi

trường khoáng + sucrose

+ GAa (0,5; 1; 1,5 và 2

mg/l)Nuôi cấy phôi trên môi

trường khoáng + sucrose

+ IAA (0,5; 1; 1,5 và 2

mg/l)

Nuôi cấy phôi trên môi

trường khoáng + sucrose

+ BA (0,5; 1; 1,5 và 2

mg/l)Nuôi cấy phôi trên môi

trường khoáng + sucrose

môi trường khoáng +NaCl (0, 3; 6; 9; 12 và

15%)

Độ mặn phù hợp với sự pháttriên của cây con Cóc đỏ

Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu

3.2 Thuyết mỉnh sơ đồ thí nghiệm

3.2.1 Vật liệu

Trai Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) được thu từ rừng ngập mặn tự nhiên ở khu

vực vịnh Cam Ranh (tinh Khánh Hòa) Thời điểm thu trái vào tháng 6/2016 Ước tínhthời gian ra hoa đến khi thu trái khoảng 60 ngày Số lượng trái thu được khoảng 1.000trái Mẫu trái Cóc đỏ được rửa sạch, hong khô trong mát và bảo quản trong túi nhựaPE ở nhiệt độ phòng Thời gian thu trái về cho đến khi tiến hành các thí nghiệm khảosát tính sống và nuôi cây khoảng 30 ngày

3.2.2 Thí nghiệm khảo sát tính sống của phôi cây Cóc dé

Ngâm hat đã cắt dọc với triphenyl tetrazolium chloride — TTC (CisHisCINs)1% trong toi Thời gian ngâm 24 giờ [21] Sự sống của phôi được ghi nhận khi có sựxuất hiện màu đỏ trên hạt Số hạt mỗi lần trắc nghiệm là 15 hạt, lặp lại 3 lần Xác

định tỷ lệ phôi sống theo công thức sau:

Tỷ lệ phôi sống (%) = (số hạt hiện màu đỏ/ tổng số hạt ngâm) x 100.3.2.3 Xứ lý hạt Cóc dé trước khi cấy

3.2.3.1 Kỹ thuật tách lay hat Cóc đỏ

Trái được lột bỏ lớp vỏ xơ bên ngoài Sử dụng kém bam nhỏ tach vỏ cứng làmđôi, thu hạt một cách cân thận, tránh làm tổn thương hạt Hạt Cóc đỏ có kích thướcrất nhỏ, chiều đài khoảng 4 - 5 mm, đường kính khoảng 1 mm (Hình 2.2b) Vì vậy,

để tránh làm tổn thương phôi trong quá trình tách, hạt được sử dụng trong các thí

nghiệm nuôi cấy tiếp theo.3.2.3.2 Kỹ thuật vô trùng bê mặt hạt Coc đỏ

Hạt được vô trùng bằng hóa chất trong tủ cấy vô trùng Cho hạt vào nước cấtrồi thêm vài giọt Tween 20 và lắc mạnh trong 10 phút Sau đó, lắc hạt trong cồn 70%(v/v) với thời gian 1 phút Tiếp đến, hat Coc đỏ được lắc trong NaOCl 10% (v/v)khoảng 5 phút và rửa lại 6 lần bằng nước cất tiệt trùng

Tiến hành trắc nghiệm tính sống của phôi cây Cóc đỏ nhằm xác định tỷ lệ phôisống sau quá trình vô trùng bề mặt hạt Số hạt mỗi lần trắc nghiệm là 15 hạt, lặp lại 3lần Xác định tỷ lệ phôi sống (%)

IN va HCI 1N Agar 0,8% được thêm vào và dun ở 100°C trong 2 - 3 phút Môi

trường được đồ vào ống nghiệm nuôi cấy và hap tiệt trùng trong autoclave ở nhiệt độ121°C trong 15 phút Phôi Cóc đỏ được nuôi cấy trong ống nghiệm ở điều kiện tối

hoàn toàn và nhiệt độ 25 + 2°C.

Mỗi nghiệm thức gồm 12 phôi, được lặp lại 3 lần Thời gian thí nghiệm kéodài 14 ngày Đánh giá ty lệ nay mầm của phôi Cóc đỏ Sự nảy mầm được ghi nhậnkhi có sự xuất hiện của rễ mầm, lá mầm

3.2.5 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến sự phát triển của

Đối với 4 nghiệm thức sử dụng chất điều hòa sinh trưởng GAa, GAs được lọc

vô trùng bằng màng lọc 0,2 wm (Merck, Đức) và bố sung vào môi trường nuôi cấy

trong tủ cây vô trùng với 4 nông độ khác nhau 0,5 mg/l, 1,0 mg/l, 1,5 mg/l và 2,0mg/l Cuối cùng, môi trường với các nông độ GA3 tương ứng được đồ vào ống nghiệmtiệt trùng, đậy nút bông, dé nguội

Mỗi nghiệm thức gồm 12 phôi, được lặp lại 3 lần Thời gian thí nghiệm kéodài 14 ngày Đánh giá ty lệ nay mam của phôi Cóc do.

3.2.6.3 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nông độ BA đến sự phát triển của

phôi Coc do

Đối với 4 nghiệm thức sử dụng chất điều hòa sinh trưởng BA, BA được bésung vào môi trường nuôi cay voi 4 nồng độ khác nhau 0,5 mg/I, 1,0 mg/l, 1,5 mg/lva 2,0 mg/l Cuối cùng, môi trường với các nồng độ BA tương ứng được đồ vào ốngnghiệm tiệt trùng, đậy nút bông, hấp tiệt trùng và dé nguội

Mỗi nghiệm thức gồm 12 phôi, được lặp lại 3 lần Thời gian thí nghiệm kéodài 14 ngày Đánh giá ty lệ nay mầm của phôi Cóc đỏ

3.2.6.4 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của ty lệ nông độ LAA:BA đến sự pháttriển của phôi Coc đỏ

Đối với 4 nghiệm thức kết hợp auxin và cytokinin theo các tỷ lệ nồng độ khác

nhau, BA 0,5 mg/l được bé sung vào môi trường nuôi cấy Sau đó, LAA được lọc vô

trùng bằng màng lọc 0,2 wm (Merck, Đức) và bố sung vào môi trường đã có BA 0,5mg/l trong tủ cây vô trùng với 4 nồng độ khác nhau 0,5 mg/l, 1,0 mg/l, 2,0 mg/l, va3,0 mg/l Cuối cùng, môi trường với các tỷ lệ nồng độ IAA:BA tương ứng được dé

vào ống nghiệm tiệt trùng, đậy nút bông, dé ngudi

Mỗi nghiệm thức gồm 12 phôi, được lặp lại 3 lần Thời gian thi nghiệm kéodài 14 ngày Đánh giá ty lệ nảy mam của phôi Cóc đỏ