hG-CSF được chỉ định dùng cho bệnh nhân bị ung thư được điều trị bangphương pháp hóa tri, bệnh nhân bị giảm bach cầu trung tính mãn tính nghiêm trọng.Trong nghiên cứu này, đoạn gen hg-cs
Trang 1TRUONG DAI HOC BACH KHOA
KHOA KY THUAT KY THUAT HOA HOC
BO MON CONG NGHE SINH HOC
LUAN VAN THAC SI
TAI TO HOP G-CSF
GVHD: PGSTS Nguyễn Thúy HươngHV: Dang Thị Tuyết An (11310602)
TP Hỗ Chí Minh, tháng 8/2012
Trang 2CÔNG TY TNHH CNSH DƯỢC NANOGENCán bộ hướng dẫn khoa học: PGS TS NGUYEN TH Y HƯƠNG
(Ghi rõ ho, tên, học ham, học vi, chữ ky)
(Ghi rõ ho, tên, học ham, học vi, chữ ky)
Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại tường Đại Học Bách Khoa, ĐHQG Tp Hỗ Chí
Minh ngày 16 tháng 12 năm 2012
Thành phần hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
(Ghi rõ ho, tên, học ham, học vi của hội đông châm bảo vệ luận văn thạc sĩ
Trang 3TRUONG DAI HỌC BACH KHOA Độc lap — Tw do — Hanh phúc
NHIEM VU LUAN VAN THAC SI
Họ tên học viên: DANG THI TUYET ẨN MSHV: 11310602
Ngày, tháng, năm sinh: 24/03/1986 Nơi sinh: Quảng Nam
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 604280I TÊN DE TÀI: KHAO SÁT BIEU HIEN PROTEIN TAI TO HỢP G-CSF
TREN E.COLI VA NGHIEN CUU QUY TRINH TINH SACH PROTEIN TAITO HOP G-CSF
Il NHIEM VU VÀ NOI DUNG:
v Tạo dòng gen hg-csf vào vecto pET-26b(+)
* Dựng đường cong sinh trưởng của chủng biểu hiện BL21DE3 mang vecto tái
Tp Hồ Chi Minh, ngày tháng năm CAN BỘ HƯỚNG DAN CHỦ NHIỆM BỘ MON
(Họ tên và chữ ký) (Họ tên và chữ ký)
Trang 4Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến PGS TS Nguyễn ThúyHuong, TS Đỗ Minh Sĩ, cô và thầy đã định hướng tận tình chỉ dan, giúp đỡ, kiểmtra tiến độ làm việc, động viên tôi rất nhiều trong suốt quá trình thực hiện và viết
em thuộc bộ phận R&D, MP của công ty TNHH CNSH Dược Nanogen lời cám ơn
chân thành Xin cám ơn mọi người đã tạo mọi điều kiện, luôn theo sát và giúp đỡ đểtôi hoàn thành từng phần nhỏ của luận văn
Tôi xin cám ơn các thầy cô trường Đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh đã giúp đỡtôi những năm qua, đặc biệt là các thầy cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã truyềnđạt những kiến thức cũng như những kinh nghiệm quý báu, tạo mọi điều kiện thuậnlợi trong quá trình theo học dé tôi có được như ngày hôm nay — chân thành cảm ơn!Xin cảm ơn bố mẹ, gia đình và những người thương yêu nhất của tôi đã luôn là chỗdựa vững chắc, đã khuyến khích động viên và tạo mọi điều kiện cho chúng tôi trongsuốt thời gian học tập
Cuối cùng, xin gui đến các anh chị, tất cả bạn bè thân thiết của tôi — những người
luôn sát cánh cùng tôi, giúp đỡ, động viên tôi rất nhiều cả trong học tập lẫn trongcuộc sống — lời cảm ơn chân thành nhất
Tp Hỗ Chí Minh tháng 8 năm 2012
Đặng Thị Tuyết Ấn
Trang 5hG-CSF (yếu tố kích thích sự tăng trưởng của tế bào hạt), gồm 174 amino axit, làmột hoocmon kích thích tủy xương sản xuất bạch cầu hat va tế bào gốc, sau đó đưavào máu hG-CSF được chỉ định dùng cho bệnh nhân bị ung thư được điều trị bangphương pháp hóa tri, bệnh nhân bị giảm bach cầu trung tính mãn tính nghiêm trọng.Trong nghiên cứu này, đoạn gen hg-csf được dòng hóa vào vector pET26b(+) dé tạothành vector pET26b(+) G-CSF va được chuyển vào chủng biểu hiện BL21(DE3).Dòng tế bao này sẽ biểu hiện vượt mức trong môi trường LB bồ sung 0,4% glucose,0,5Mm IPTG, lac ở chế độ 250 vòng/phút ở nhiệt độ 37°C trong thời gian 6 giờ.Quá trình tinh sạch protein G-CSF từ thé vùi của tế bao E.Coli có độ tinh sạch >95% và protein tong số thu được > Img/ml ở pH 3,5 — 4,0 Trọng lượng phân tử củaprotein G-CSF sau khi tinh sạch năm trong khoảng 18 — 20 KDa, không có lẫnDNA của tế bào chủ, không có edotoxin và có hoạt tính sinh học.
ABSTRACThG-CSF (human Granulocyte Colony-Stimulating Factor), consisting of 174 aminoacid, is acolony-stimulating factor hormone, to stimulate the bone marrow toproduce granulocytes and stem cells G-CSF then stimulates the bone marrow torelease them into the blood hG-CSF was approved to treat for cancer patientsreceiving myelosuppressive chemotherapy, patients with acute myeloid leukemiareceiving induction or consolidation chemotherapy patients with severe chronicneutropenia In this study, gene endoing for hG-CSF was cloned to pET26b(+)G-CSF expression vector and transformed to E.coli to create E.coli BL21(DE3) G-CSFIT strain used to overexpress hG-CSF in LB medium with 0.4% glucose, 0.5mM
IPTG, 250rpm, 37°C, 6 hours Extraction and purification of hG-CSF procedure
archived the recombinant hG-CSF with purity of >95%, total protein concentration>Img/ml, pH 3.5-4.5, molecular weight of 18-20 KDa, no host cell derived DNAand peptide residue contamination, endotoxin free and the biological activity of
Trang 615 0006 0 55 i
DANH MỤC CAC KI HIỆU, CÁC CHỮ VIET TẮTT < 5 << s << << =seses ivDANH MỤC CAC HINH VE VA ĐỎ THI 5 << < << se se se eseseses viDANH MỤC BANG BIEU VA PHU LUC < << << << ssesesesesssssss se ViiiPHAN 1: TONG QUAN oescsssssssssssssssssvsesssesssesssssssesssesssesssesssesssessssnsesssssssssssesssessseseseseseseeess1.1 Tổng quan về nhân to kích thích dong tế bao bach cầu hat G-CSF 1
1.2.3 Các tác dụng khác trên tế bào bạch cầu hạt trung tính đã trưởng
{hành 0G G5 5.0 ọ Họ 0 00 0.00004000040000 4.06 0009406000 81.2.4 Tac dụng của G-CSF bên ngoài hệ thong tế bào máu -.«- 91.3 Co 00110 70 78 91.4 Ung dung 8 12
1.4.1 — Trong phản Ứng VIÊ¡ co œ5 9 996 66899 9999999994.04 4969606666666 696 13
1.4.2 Trong cay ghép tế bào/mô/€ơ quann 5< 555 << << Ssesesseeeeesesese 141.4.3 G-CSF trong cấy ghép tế bào mầm 5 << << << ceseesesssesese 151.4.4 Trong điều trị bệnh Neutropenia (bệnh giảm bạch cầu trung tính) L51.5 Bệnh giảm bach cau trung tính (Neutropenia), nguy cơ bị bệnh giảm
bạch cầu trung tính trong điều trị hóa trị của bênh nhân ung thư vàCACH 8:I1))0 0 100000057 - 161.5.1 Bệnh giảm bạch câu trung tính -<5ss << << eseseeeseesesesesese 16
Trang 7của bệnh nhân ung (ÌÏư o5 9 99999969595996.88966986669999999966
1.5.3 Cách điều trị -<< «<< SH RE ng 0606 6 6050509561.6 Tình hình sản xuất hG-CSF trên thé giới và nhu cầu ở Việt Nam 1.6.1 Tinh hình sản xuất hG-CSE trên thé giới 5-5-5 << << csessesese1.6.2 Tinh hình ung thư và nhu cầu sản xuất hG-CSF tái to hợp ở Việt1.7 Tổng quan về tao dòng và biểu hiện protein ngoại lai trong E.Coli
1.7.1 Tổng quan về ta0 đòng -<ö 5 5< << << sssseseSSEeseseSeseEssee1.7.2 Biểu hiện protein ngoại lai trong E €OlÏ 5-s-s<sescsesessssssessse1.7.2.1 Hệ thống vector biểu hiện PET-26b(+) <-5-ssscscsesesesessssssessse1.7.2.2 Chủng biếu hiện BL21(DE3) << 5 5 << << sscsesesesesesesesssee1.8 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về HG-CSE <-<s<<cscseseseseee
1.8.1 Cac nghiên CWU fFrOnØ HƯỚC (<< << S 5 9 996 6 6899 909909999699660606606666661.8.2 CA nghiên CHU ngoài HƯỚC c- << << << S 5 9 6 6 6880990994990 696
PHAN 2: NGUYEN VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP - 5< 5 5s sesssse
2.1 Nguyên vật ÏIỆU co œ5 99 9 9.99 9.996 09 990009909000099600008666688869909999999966
2.1.1 Thiết bị, dụng CỤ <<< << << s33 x99 SeSesesesesesee2.1.2 Hóa chất s-e<css s2 neseseresresesske
2.2 Phương PAP c << << << 9 9 00 00000000000000000000000000000000000
2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu chung œ-œ-œ-scscssssssseseseseeeeseseseseses
2.2.2 Nội dung nghiÊn CỨU c << << <6 6 S S 6 6 6 95% 9999999Á.94.9.969608966655956968886666662.2.3 Các phương pháp phân (ÍCH oo 555559 999969666655595996.8666666
PHAN 3: KET QQÙ Ả 5- 5Ÿ 5< s44 AE 1300403090130 040309093001298E3.1 Tao dòng gen hg-csf vào vector PET-26D(+) 0G G5 6656 8669965666563.2 Dựng đường cong sinh trưởng của chúng biểu hiện BL21(DE3) mang
vector tái tổ hợp pET26b((+)-Ïh CS << << << ss se 9E eEeEeseseses3.3 Khảo sát sự biểu hiện protein hG-SE s 5 << s5 << se cscsesesesesesesesese
Trang 8IPTG cho kết qua biểu hiện cao nhất (Thí nghiệm 1) 653.3.2 Khao sát nồng độ IPTG cảm ứng (Thí nghiệm 2) -5-5 683.3.3 Khao sát lượng glucose bo sung trong quá trình nuôi cấy 703.3.4 Khao sát số vòng lắc và nhiệt độ trong quá trình cảm ứng 72
3.3.5 Khao sát thời Gian CAM ỨnØ ooo s55 9999.9.999696666956696888666666 74
3.3.6 Lên men thu nhận G-CSF quy mô 5 lít để tiến hành nghiên cứu
quá trình tỉnh sCH 9 0000000006666666666666666666606 763.4 Tinh sạch protein h-CSÌE co s s s s S999 9 9.90000069696889688866909999999966 76
3.4.1 Tách chiết G-CSE -cssess nrEceesereereeessee 76
3.4.2 Tinh sạch G-CSIE ooo co cá 9 9 0 000000000000 004994999600666666888660996 80
PHAN 4: KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ << 5 5 5 5< << sssseseseseSesesssee 84TÀI LIEU THAM KH ÁOO 5° << << << << s5 S9 S4 E4 9S 99 4xx sesesesese 85
Trang 9Quy đỉnh các chữ viết tat
E.coliEDTAIPTG
KanKan’KbkDAMCSORFPCR
PT7
RNA
Rnase
AmpicilineAmpicilline resistanceAmmonium Persulfatebase pair
Deoxyribonucleoic Acid DeoxyribonucleotideTriphosphate
Escherichia coliEthylenendiamine Tetraacetic AcidIsopropyl-B-D-ThiogalactosideKanamycin
Kanamycin resistancekilobase
kiloDaltoneMulticloning siteOpen Reading FramePolymerase Chain Reacton
Promoter lÝ7
Ribonucleic AcidRibonuclease
Trang 10E Leucine
LysineMethioninePhenylalanineProline
SerinThreonineTryptophan
cr Oo K@ 6 DF A wR > Tyrosine
LeuLysMet
Phe
Pro
SerThr
Trp
Val
7“ 2 xear)
< <2 ¬
Trang 11Hình 1.1: Các tễ bào sản sinh G-CSE th HH 3Hình 1.2: Cau trúc gen g-csf, mRNAG-CSF và protein G-CSF - ¿5c cccccsccsrscee 4
Hình 1.3: Trình tự amino acid của protein -CSÏE chen 5
Hình 1.4: Cau trúc protein G-CSÏF c-k c2 1 12 1111111112111 1111012121111 11 11g tre 5Hình 1.5: Vai trò của G-CSF trong việc hình thành tế bao máu 5-55555555252 8Hình 1.6: Mô hình thụ thể - se cv the 10
Hình 1.7: Phức hop của G-CSEF/GCSF-R HH re 11
Hình 1.8: Các con đường truyền tín hiệu của G-CSE - + + tt SEeEerrkrkrkekrkd 12Hình 1.9: Cơ chễ điều hòa phản ứng viêm - + 2525626 E*EEEEE£E£EEEEEEErkrkrrrrerered 13Hình 1 10: Các sản phẩm G-CSF thương mại ¿5-5 22+ S2 SE+E£E+EeEEErkreerererered 24Hình 1.11: Qua trình kiểm soát của promotor TTC 5-52 525525 Se‡E+EsEErereeeersrered 27Hình 1.12: Anh hưởng của T7lysozyme đến T7 RNA polymerase . - 28Hình 1.13: Cơ chế biêu hiện ở BL21(DIE3) - 22-55 222E2EE2EE2212E12112E12EcEexrrrke 29
Hình 2.1: Thang protein (A) và thang DNA (B) — ƒ@rfm€fIf(% Ặàcc Sài seisireies 38Hình 3.1: Thu nhận đoạn gen hØ-CSỈ” - (<< 9 re 61
Hình 3.2: Sơ đồ của vector PET26b(+) cccccccscscssscscscssssesesssssssscsesescssscsesssssessesesessesssesees 62Hình 3.3: kết qua PCR khuẩn lạc dé san lọc dòng tái tổ hợp ¿-5- 5 cc+cscscscs2 63Hình 3.4: Sơ đồ vector tái tô hợp pET26b(+)-hg €SỸ 5-5565 S* xESEErkrkererrered 63Hình 3.5: Đường cong sinh trưởng của chủng BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp
pETI26b(+)-h CSÍ, nọ gọn 64
Hình 3.6: Khảo sát thời điểm cảm ứng IPTG ¿5-55 EEEESE2E£EEEEErkrkrrrrerered 65Hình 3.7: Khảo sát cảm ứng nồng độ IPTG + c2 5255222 EE2E£ESEEEEErErkrrererered 68Hình 3.8: Kết quả khảo sát nồng độ glucose b6 sung vào môi trường LB trước khi
601i 70
Hình 3.9: Kết quả khảo sát số vòng lắc và nhiệt độ cảm ứng ¿5-5-5 sSsss+ssxsxở 72Hình 3.10: Khảo sát biểu hiện G-CSF theo thời gian ¿2 5-5 cc+csccececesrsrrered 74Hình 3.11: Kết quả lên men 5L trong chai Schott - + 25252 5s+£+£+££ezecezesrrered 76
Trang 12Hình 3.13: pho giai đoạn loại muối - + 6E SE SE 3 E9 E1 12111511 1111111 exrk 81Hinh 3.14: Phé giai đoạn sử dụng cột CM oo ccccccccesssessessesesnnneceeeeeeeeeseseeeeesnnaaeeeeees 82Hình 3.15: SDS-PAGE (A) va Western blot (B) các giai đoạn tinh chế - 82Hình 3.16: Pho chay kiểm tra độ sạch của mẫu tinh chế G-CSF bằng HPLC S3
Trang 13Bảng 1 1: Cac dang G-CSF tái t6 hop và các chỉ định được công nhận 22Bang 3 1: Kết quả ELISA theo thời điểm bố sung chất cảm ứng -5- 67Bang 3 2: Kết qua ELISA theo néng độ IPTG cảm ứng uo es esesesesesesesesessssescsees 69Bang 3 3: Kết qua ELISA theo néng độ glucose cceesecescsscssssessescesscsssssssesesessssscscsees 71Bang 3 4: Kết qua ELISA theo số vòng lắc và nhiệt độ cảm ứng -. -5-5¿ 73Bang 3 5: Kết quả ELISA theo thời gian cảm ứỨng - + 2525226 2E+Es££ezeceseererered 75Bang 3 6: Kết quả ELISA lên men ŠÌL + ¿5E 5252 SE2E£E2EEEEE£EEESEEEEEEErErkrrrrrrered 79Phu lục 1: Số liệu thô của đường cong sinh trưởng - + +c+c+E+EsEererererererered 89Phu lục 2: Kết quả so sánh giải trình tự gen sau khi dòng hóa vào vector pET26b(+)và trình tự gen ban đầu - + + << S331 111151151515 5151515111111 1111111117115 1e 90Phụ lục 3: Kết quả giải trình tự - c5 c c S* S3 1 1E 11111121211 1111 0111012111111 re 91Phụ lục 4: Phố đồ HPLC -s 55c ckc th th HH nh ngư 93
Trang 14Ngày nay, khi xã hội càng phát triển thi nhiều căn bệnh cũng xuất hiện theo Hiệnnay căn bệnh ung thư ở Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung đang rất phổbiến, việc tìm ra các phương pháp cũng như các loại thuốc đặc trị là vẫn đề cấp thiếtđược đặt ra và đó cũng là lúc công nghệ sinh học bắt đầu phát triển.
Ở Việt Nam, tình hình ung thư đang ngảy càng có xu hướng tăng cao, các bệnhnhân ung thư cân điều trị cũng ngày cảng gia tăng Theo thống kê của Bệnh viện K,ty lệ người mac bệnh ung thư máu trên 100.000 dân vào năm 2001-2004 đượcthống kê như sau: tại Hà Nội ghi nhận được 66 ca (30,8%), Hai Phong 12 ca bangsố ca với u lympho ác tính (15,4%), Thái Nguyên 26 ca (46,4%), Thừa Thiên Huế24 ca (30,1%), Cần Thơ 34 ca (30,9%)
Hóa trị liệu ung thư hiện vẫn là một trong những phương pháp điều trị ung thư chủyếu ở Việt Nam, do đó nhu cầu sử dung G-CSF để giảm thiểu các rủi ro gây ra doneutropenia trong quá trình điều trị là rất lớn Hiện nay, sản phẩm G-CSF thươngmại có mặt ở Việt Nam là Neupogen® do công ty Amgen sản xuất và được nhậpchủ yếu từ hãng Hoffmann — La Roche Ở bệnh nhân điều trị bằng phương pháp hóatri bị mac neutropenia, liều Neupogen duoc chỉ định dùng là 0.5MUI(5mcg/kg/ngày) tiêm một lần trong ngày Với một bệnh nhân 60kg lượng thuốccần dùng là 1 lọ Neupogen 30MUI (300mcg hay 0,3mg) Với giá thành một lọ tiêm300mcg/ml Neupogen là 1.760.000 VND, điều trị trong 2 tuần với trường hợp bệnhnhân hóa trị ung thư không liên quan đến tủy Như vậy thi chi phí điều trị là mộtmối lo hàng đầu của các bệnh nhân ung thư Do đó việc sản xuất G-CSF giá thànhrẻ là điều rất cần thiết ở Việt Nam
Trong định hướng sản xuất G-CSE với giá thành rẻ phục vụ cho bệnh nhân mắcbệnh neutropenia trong quá trình hóa trị ung thư, phòng nghiên cứu phát triển thuộc
công ty trách nhiệm hữu hạn công nghệ sinh học dược Nanogen đã thực hiện các
nghiên cứu tạo dòng tế bảo vi sinh vật có khả năng tổng hợp G-CSF phục vụ cho
Trang 15này, chúng tôi thực hiện nghiên cứu “Khảo sát biểu hiện protein tdi tổ hop G-CSFngười trên E Coli và nghiên cứu quy trình tỉnh sạch protein tai tổ hop G-CSF” với
các nội dung như sau:
Dòng hóa gen hg-csf mã hóa cho protein G-CSF của người vào vectơ biểuhiện pET26b(+) và tiến hành biểu hiện trên E.Coli
Khảo sát điều kiện biểu hiện protein G-CSF xoanh quanh các nội dung: thờiđiểm biểu hiện, nồng độ chất cảm ứng, lượng glucose bố sung, số vòng lac
và nhiệt độ trong quá trình cảm tng, thời gian cam ứng.
Lên men 5 lít để thu nhận G-CSFTinh sạch protein G-CSF từ dịch tách chiết của 5 lít lên men.Kiểm tra độ tinh sạch bằng hệ thống HPLC
Trang 16CHƯƠNG 1: TÔNG QUAN
Trang 171.1 Tong quan về nhân tố kích thích dòng tế bao bạch cầu hat G-CSF
1.1.1 Giới thiệuhG-CSF (human Granulocyte Colony-Stimulating Factor) là một cytokine có ban
chất là glycoprotein, bao gồm 174 amino axit, đóng vai trò quan trọng trong phátsinh tế bào máu, biệt hóa các tiền tế bào máu và hoạt hóa các tế bào bạch cầu hạttrung tính trưởng thành G-CSF được sử dụng phổ biến trong điều trị bệnh giảmbach cầu do hóa tri G-CSF của chuột lần đầu tiên được nhận diện và tinh chế tại cvào năm 1983 Năm 1986, Nigata và cộng sự đã sử dụng mẫu dò oligonucleotide đểthu nhận cDNA băng lai Southern Blot và sử dụng cDNA này làm khuôn dé dònghóa và biểu hiện G-CSF, báo cáo nay đã mở ra thời ky sản xuất hG-CSF tái tổ hopvới số lượng lớn Có hai trình tự amino axit của G-CSF, một trình tự bao gồm 174amino axit và một trình tự bao gồm 177 amino axit Sự khác nhau cua hai trình tựnày là do quá trình cắt bỏ các đoạn intron, một mRNA cắt bỏ còn 174 amino axit vàmột mRNA cắt bỏ còn 177 amino axit Nhiều nghiên cứu cho thấy phân tử G-CSFcó trình tự bao gồm 177 amino axit có hoạt tính thấp hơn nhiều so với G-CSE cótrình tự bao gồm 174 amino axit [1,2]
1.1.2 Nguén gốcG-CSF cũng như các nhân tố tăng trưởng khác, được sản xuất ở nhiều loại mô và tếbào khác nhau trong cơ thể như nguyên bào sợi, đại thực bào, những tế bào nội môvà các té bào nền tủy xương qua trung gian là các cytokine (interleukine-l,interleukine-6) và các nhân tố TNFa qua con đường tín hiệu thứ 2 Tuy nhiên, cácmô thông thường chỉ sản xuất G-CSF khi bị kích thích [3]
Sau khi G-CSF được tạo ra, chúng lập tức làm nhiệm vụ biệt hóa những tế bào gốctrong tủy xương thành tế bao bạch cầu hạt trung tính trưởng thành và đồng thờikích thích đưa chúng vào hệ máu ngoại vi để thực hiện nhiệm vụ của chúng [4]Ở điều kiện bình thường nồng độ G-CSF trong huyết thanh của người ở mức khôngphát hiện được hoặc ở mức rất thấp (ít hon 100pg/ml) Tuy nhiên trong các đáp ứng
Trang 18đối với sự xâm nhiễm, nông độ G-CSF tăng cao và có thể đạt đến 2000pg/ml, và chỉhạ xuống mức bình thường sau khi phục hồi [5]
Trang 19Gan C Tủy xương
Erythropoietin
Thrombopoietin
ErythropoietinThrombopoietin
Thrombopoietin
Nguyên bào agi
,
Hinh 1.1: Cac té bao san sinh G-CSF [3]
1.1.3 Vi tri hinh thai
Gen mã hoá cho G-CSF của người tỒn tại ở dạng đơn bản sao, định vi ở vùng ql 22 thuộc nhiễm sắc thé 17, dài khoảng 2,5Kb, bao gồm 5 exon và 4 intron Trongđó, vùng 300bp ở đầu 5 của vị trí khởi sự phiên mã đóng vai trò kiểm soát sự biểuhiện của gen g-csƒ Đoạn trình tự giàu AU trong vùng 3 không mã hóa là vị trí cốtyếu làm mất tính 6n định của phân tử MRNA của G-CSF, ảnh hưởng đến sự biểu
1-hiện ở mức độ phiên mã và hậu phiên mã mRNA của G-CSF sau khi hình thành
trải qua quá trình chế biến từ đó dịch mã thành 2 chuỗi polypeptide khác nhau từ
Trang 20cùng một gen cau trúc Những mRNA nay mã hóa cho hai protein tiền chất lần lượtdài 204 và 207 amino acid Đầu N của chúng có chứa trình tự leader ưa nước dài 30amino acid đặc trưng ở các protein tiết, khi bị cắt sẽ tạo nên hai phân tử protein
trưởng thành với 174 va 177 amino acid Phân tử G-CSF dài 174 amino acid là
phân tử chiếm ứu thế và có hoạt tính mạnh hơn so với phân tử 177 amino acid [6]
Nhiễm sắc thê 17 1;ag11-22
Gen tee i
L 2,5kb 1
Hình 1.2: Cau trúc gen g-csf, MRNAG-CSF và protein G-CSF [6]1.1.4 Cau tric
hG-CSF trưởng thành có 174 amino axit, nặng 18.7 kDa, có 5 gốc cystein: Cys17,Cys36, Cys42, Cys64, Cys74 tạo thành 2 cau nối disulfide Cys36-Cys42, Cys64-
Cys74 và 1 cystein tự do ở vi trí Cys[l7 hG-CSF tự nhiên không có vi trí
N-glycosyl nhưng có một vị trí O-N-glycosyl hóa tại vi trí Thr133 nhằm bảo vệ hG-CSFkhỏi sự kết tủa ở pH trung tính và đảm bảo tính 6n định cho hG-CSF, nhưng nókhông can thiết cho hoạt tính sinh học hG-CSF tái tổ hợp trong E coli được tổchức thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ chứng minh răng chúng có thể được sử dụng như
một lọai thuốc trong điều trị bệnh giảm bạch cầu cấp
Trang 21SOOOSOOODOOOCOOCOO 160 170 SSO mara!
Hình 1.3: Trinh tự amino acid cua protein G-CSF [2|
Trong cau trúc không gian 3 chiều, G-CSF là một bó 4 xoắn ơ nam đối song vớinhau, 4 xoăn được đánh kí hiệu từ A-D bắt đầu từ đầu N Ngoài bốn xoắn chính,cầu trúc G-CSF còn có thêm một xoăn phụ E nhỏ hơn nối xoăn A và xoắn B Haicầu nối disulfide Cys36 — Cys42 và Cys64 — Cys74 năm đối diện nhau trong vòng
nôi giữa xoăn A và xoăn B.
A.
143171
J
Hình 1.4: Cau trúc protein G-CSF [2|A Mô hình cấu trúc phắng B Cấu trúc không gianHoạt tính sinh học của G-CSF được quyết định bởi tính toàn vẹn cau trúc của phântử Sự phá vỡ một hoặc cả hai cầu nối disulfide làm mất cấu trúc gap cuộn vi thélàm giảm hoạt tinh G-CSF một cách đáng kể Tương tự, các đột biến mat đoạn haylặp lại các đoạn nhỏ trong cấu trúc protein nằm trong vùng amino acid 18 đến đầu C(từ amino acid 165 đến 174) làm biến đổi căn bản cấu trúc bậc 4 đều dẫn đến mat
Trang 22hoạt tính G-CSF Ngược lại, khi loại bỏ 11 amino acid đầu tiên không làm ảnhhưởng đến hoạt tính sinh học Đột biến ở Cys17 thành Ser17 đã được chứng minh làtăng hoạt tính sinh học và làm ôn định cau trúc protein.
Các đột biến điểm tại Leu35 va Glu46 cũng làm mat chức năng cua G-CSF Tam
quan trọng cua vung lân cận hai bên những axit amin nay cũng đã được nghiên cứu.
Kháng thể trung hoà G-CSF gắn với G-CSF tại vùng axit amin 20 — 46 bao gồm đầuC của xoăn A và phần vòng nối AB chứa cầu nối disulfide đầu tiên và phần xoăn
phụ Vung 20 — 46 này cùng với vung 165 — 174 được xem là vùng tạo nên vi trí
gan với thụ thé của G-CSF.Các đột biến tại Leu35 và Glu46 sẽ làm mat chức năng của G-CSF, tam quan trọng
của vùng lân cận hai bên các amino acid này cũng đã được làm rõ Người ta nhận
thay dang G-CSF 177 amino acid chứa thêm ba amino acid nam giữa Leu35 vaCys36 đã làm giảm đáng kế hoạt tinh sinh học của nó Các kháng thé của G-CSFgan voi G-CSF tại vùng amino acid 20-46 Cau trúc không gian của vùng aminoacid 20-46 bao gồm dau C của xoăn A và phan vòng nối AB (loop AB) chứa cầunối disulfide đầu tiên và phần xoắn phụ E Vùng 20-46 cùng với vùng 165-174được chứng minh là tạo nên vi trí gan với thu thé của G-CSF [7]
1.2 Chức nang sinh học1.2.1 Cảm ứng sự tăng sinhCảm ứng sự tăng sinh là một hoạt tính đặc trưng cua G-CSF Khi thử nghiệm nuôi
cây không phân đoạn các tế bao tủy người và chuột trên môi trường nuôi cay có bồsung G-CSF, kết quả cho thấy G-CSF kích thích hình thành lượng nhỏ các dòngbach cau hạt trung tính Các nha nghiên cứu cho rang G-CSF đã kích thích sự tăngsinh của các tế bao băng cách chuyển các tế bào ở giai đoạn nghỉ (giai đoạn Go) vàochu trình tế bào dé tiếp tục quá trình phân chia Tuy nhiên, khả năng cảm ứng tăngsinh của G-CSF không giới hạn trong phạm vi tiền bạch cầu hạt trung tính Cácnghiên cứu in vitro đã cho thay G-CSF còn có hoạt tính tăng sinh các tiền bào của
Trang 23các dòng tế bao máu khác Đối với những dòng tế bao này, dường như G-CSF hoạtđộng trong một mô hình kết hợp với các nhân tổ tăng trưởng khác để thúc day sựtăng sinh của các tế bào tiền khởi [8]
1.2.2 Kích hoạt sự biệt hóaSau vài lần kích thích phân chia tăng sinh, G-CSF kích hoạt sự biệt hóa các tế bàotiền khởi tạo nên các dạng tế bào bạch cầu hạt trung tính Với hoạt tính này cùng
với khả năng kích thích sự tăng sinh, G-CSF đóng một vai trò quan trọng trong sự
duy trì ôn định lượng bạch cầu hạt trung tính trong máu, cũng như điều hòa sự tạothành bach cầu hạt trung tinh trong các trường hợp khẩn cấp Thực nghiệm đãchứng minh, khi thiếu G-CSF sẽ dẫn tới sự suy giảm của tế bào bạch cau hạt trungtính trong máu xuống 20% so với bình thường, trong các trường hợp khan cấp nhưcác đáp ứng đối với sự nhiễm trùng hay đáp ứng miễn dịch, lượng G-CSF tăng lênrất nhiều và nhanh chóng (hình 1.5)
G-CSF cũng có vai trò đôi với sự biệt hoa của các tê bào tạo máu khác Tuy nhiên,sự có mặt của G-CSF là chưa đủ cho sự biệt hóa các dòng tê bào này mà cân có sựkết hợp với các nhân tô khác Trong khi đôi với dòng tê bao bạch cau hạt chỉ riêngG-CSF là đủ cho sự tăng sinh và biệt hoá [8]
Trang 24Tiểu cầu q @ Bạch cầu đơn nhân \NA ¿- }i 3
Té bao B
Hong cau Bach cầu trung tinh, Té bào giết tự nhiên
ưa axit, ưa kiềm
Hình 1.5: Vai trò của G-CSF trong việc hình thành tế bào máu [8]
1.2.3 Các tác dụng khác trên tế bào bạch câu hạt trung tính đã trưởng
thànhTrong điều kiện in vitro, sự có mặt của G-CSF tăng cường thời gian sống sót củacác bạch cầu hạt trung tính Các dữ liệu thực nghiệm cho thay G-CSF đóng vai trònhư là một nhân tố chống lai sự phân huỷ tế bào theo chu trình chết của tế bao dẫnđến việc tăng khả năng sống sót của các bạch cầu hạt trung tính cũng như các tiềnbào ở tuỷ xương Một loạt các chức năng của bạch cầu hạt trung tính cũng đượctăng cường bởi G-CSF Đặc biệt, G-CSF làm tăng các quá trình chế biến trong tếbào liên quan đến việc bảo vệ chống lại sự xâm nhiễm của các vi sinh vật, bangcách làm cho các tế bào bạch cầu hat trung tinh trở nên phản ứng nhanh đối vớinhiều tác nhân kích thích
G-CSF tăng khả năng gắn các peptide hướng hoá như N-formyl-Met-Leu-Phe(fMLP) với bạch cầu hạt trung tính, đồng thời tăng khả năng đáp ứng in vitro đỗi
Trang 25với những tác nhân kích thích này G-CSF cũng điều hoà sự biểu hiện thụ thé C3b,
su tao ra các anion superoxide, giải phóng acid arachidonic và sự thực bao của các
tế bào bạch cầu hạt trung tính.G-CSE có thể cảm ứng sự thay đôi ái lực của thụ thé Fe đối với IgA trên bạch cầu
hạt trung tính, giúp quá trình thực bào qua trung gian IgA được dễ dang hơn
G-CSF còn có hoạt tính hướng hoá đối với bạch cầu hạt trung tính và bạch cầu đơnnhân, làm tăng khả năng bám dính mạch của các bạch cầu hạt trung tính [9|
1.2.4 Tác dụng của G-CSF bên ngoài hệ thống tế bào mauG-CSF cũng có ảnh hưởng bên ngoài hệ thống huyết học Các nghiên cứu cho thayG-CSF tăng cường sự tăng sinh va di cư trong in vitro của các tế bào nội mạc tĩnhmạch rốn Trong một mô hình in vivo G-CSF gây phát sinh mạch và hình thành
mạch máu mới ở giác mạc thỏ.
Đặc biệt gần đây, nhiều vai trò của G-CSF đối với hệ thần kinh trung ương cũng đãđược phát hiện G-CSF có tác dụng bảo vệ các tế bào thần kinh khỏi tác dụng củaglutamate, G-CSF đóng vai trò giúp các tế bào thần kinh thoát khỏi sự chết theochương trình trong mô hình đột quy cấp tính in vivo G-CSF cũng có tác dụng ứcchế quá trình apoptosis làm tăng khả năng sống sót của các tế bao thần kinh cũngnhư các tế bào gốc tổ tiên của chúng
Đồng thời G-CSF còn kích hoạt các tế bào gốc hình thành các tế bào thần kinh khácnhau trong điều kiện in vitro cũng như in vivo Các nghiên cứu khác cũng cho thayG-CSF tăng cường khả năng hồi phục chức năng của các tế bảo thần kinh sau khixảy ra chứng thiếu máu cục bộ ở vỏ não [10]
1.3 Cơ chế hoạt độngG-CSF thực hiện chức năng thông qua tương tác với thụ thể GCSF-R (G-CSFreceptor) để hoạt hóa con đường tín hiệu trong tế bào tiền thân của bạch cầu hạt
trung tính trong tủy xương.
Trang 26(>) Vang globulin miễn địch IgZ \ 2
GCSF-R là một protein xuyên màng chứa 812 amino acid, nặng 140kDa hiện diện
trên những tế bào tiền thân trong tủy xương, thường có khoảng 300-1000 GCSF-Rtrên bề mặt mỗi tế bào bạch cầu hạt trung tính Cau trúc của G-CSFR có đặc trưngcủa họ thụ thé cytokine nhóm I bao gồm 3 vùng, mỗi vùng có chức năng khác nhau:
vùng ngoại màng, vùng năm trong tê bào chât và vùng xuyên màng.
- Vung ngoại mang của thụ thể G-CSFR chứa 603 axit amin bao gồm mộtvùng globulin miễn dịch (Ig), một vùng thụ thể tạo máu (CRH), và 3 vùnglặp lại fibronectin type 3 (Hình 1.6) Vùng CRH chứa cấu trúc tương đồngđặc trưng của thụ thé cytokine nhóm I, bao gồm 4 gốc cystein bảo tồn cao và
đoạn lặp lại tryptophan-serine (WSXWS).
- Vung năm trong tế bao chất của GCSF-R chia làm 2 phần: phần năm ganmang dài 57 amino acid chứa Box! và Box2 phân phối tín hiệu tăng sinh chotế bào Phần năm xa màng có vai trò thực hiện chức năng bình thường củathụ thể Phần này có 150 amino acid chứa box3 và 4 gốc tyrosine (Tyr704,
Trang 27Tyr729, Tyr744, Tyr764), khi các gốc này bị phosphoryl hóa chúng sẽ cung
cap các vi tri docking cho các tín hiệu khác gan vào.- Vung xuyên màng giúp định vị GCSF-R trên màng.
Hình 1.7: Phuc hợp của G-CSF/GCSF-R(A) Câu trúc phức hợp 2:2 của G-CSF/GCSF-R [TT]
(B) Phóng to của liên kết giữa G-CSF và G-CSFR (a vị trí II; b vị
tri IID)
(C) Mô hình cau trúc của phức hop G-CSF/GCSF-R [12]G-CSF tương tác với thụ thé (GCSE-R) theo phức hợp 2:2 Trong phức hop này,mỗi phân tử G-CSF gan với hai GCSF-R (2 G-CSF cùng gắn với 2 GCSF-R) vàcảm ứng GCSE-R chuyển sang dạng hoạt động homodimer GCSF-R không có
vung mang hoạt tính xúc tác nhưng chúng cảm ứng sự phosphoryl hóa tyrosine cua
nhiều cơ chất trong tế bào Nhu vậy sự truyền tín hiệu sẽ được thực hiện bang cachkết hợp và hoạt hóa các kinase trong tế bảo Các tín hiệu được lan truyền bang haicon đường JAK/STAT (hay con đường chủ yếu) va MAP kinase (Hình 1.8) [12]
Trang 28Con đường truyền tín hiệu JAK/START: tín hiệu từ G-CSER được truyền đến JAKkinase thông qua Box1 và Box2 Jak kinase tiếp tục phosphoryl hóa gốc Tyr704 của
GCSF-R và STAT3 (protein liên lạc và khởi động phiên mã gen đích) Sau đó
STAT3-P gan với thụ thể Tyr704-P nhận các tín hiệu tương ứng Cuối cùng
STAT3-P tách khỏi GCSF-R nhờ phức hop homodimer hay heterodimer với
STAT3 va truyén tín hiệu vào nhân kích thích sự tăng sinh của tế bao.Con đường truyền tín hiệu bởi các kinase (MAP kinase): phức hợp hoạt động G-CSF/GCSF-R (2:2) khởi động phức hợp chuyền đổi tín hiệu bằng cách gan với gốcTyr764-P của thụ thể Sau đó, G-protein Ras được hoạt hóa bởi phức hợp chuyểnđối tín hiệu và kích hoạt serine/threonine kinase Rafl Chuỗi phosphoryl hóa liên
tục xảy ra với tín hiệu kinase ngoại bào/kinase hoạt hóa sự phân bào va kinase hoạt
hóa phân bao tyrosine/threonine Sau đó tín hiệu được truyền vào nhân nhờ kinase
hoạt hóa sự phân bào (MAP kinase) Nơi đây, kinase hoạt hóa sự phân bào sẽ
phosphoryl hóa các nhân tố phiên mã như TF (Transcription Factor) thúc day sự
biêu hiện gen mục tiêu.
1.4 Ứng dụng
Trang 291.4.1 Trong phản ứng viêmKiểm soát vùng viêm: Phản ứng viêm là một hình thức của miễn dịch không đặchiệu xảy ra khi các mô của cơ thé bị thương tốn, bị nhiễm khuẩn Phản ứng viêmgiúp ngăn ngừa sự lan rộng của tác nhân gây hại đến các mô lân cận, loại bỏ mảnh
vụn của tế bào và khử các mầm bệnh, tạo cơ sở cho quá trình phục hồi Trong đó,
vai trò của hG-CSF là kích thích tuỷ xương sản xuất bạch cầu hạt trung tính thamgia vào phan ứng viêm Nhờ tác động của hG-CSF, bach cầu hạt trung tính đượcsản xuất, trưởng thành gấp rút Sau đó, hG-CSF cùng các tác nhân hóa học hướngđộng tai vi trí viêm lôi cuốn bạch cầu hạt trung tính từ tuỷ xương vào máu Tín hiệuhóa học tiếp tục làm bạch cầu hạt trung tính ép qua vách mao mạch, dẫn dắt chúngđến vùng viêm Sự có mặt của bạch cau hạt trung tính ở nơi bị tổn thương giúp “tiêu
hóa” tích cực các vi khuan, chat độc va cả các tê bào chết.
VIÊMt hoá mono === =o
+
a 0
4
Tế bao nội mô,
nguyên bào tuỷ, Âm tính
Trang 30các đầu mút thần kinh gây cảm giác dau, tạo mủ, đồng thời thân nhiệt cơ thé tăngcao do sốt Khi đại thực bào tiêu hóa vi sinh vật làm giải phóng các nội độc tố
(polysaccharide, peptidoglycan) kích thích thực bào giải phóng IL-1, cũng là tác
nhân gây sốt nội bào Nhiều loại sốt không dứt cơn, gây co giật đe dọa tính mạngbệnh nhân cho đến khi nồng độ IL-1 trong máu giảm
Để xác định các tế bào điều khiển chương trình viêm có bị hG-CSF tác động trựctiếp hay khong, người ta dùng phương pháp RT-PCR va Flow Cytometry phân tíchsự hiện diện của G-CSFR trên bề mặt các tế bao nay Kết quả mật độ G-CSFR ởbạch cầu hạt trung tính từ 200 đến 3.000, còn ở bạch cầu đơn nhân là 130 đến2.000 Có thé kết luận rằng hG-CSF đã ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng gây viêmcủa bạch cầu đơn nhân hG-CSF ức chế quá trình phân giải tiền IL-1B thành IL-1B
có hoạt tính.
Ngược lại, sự tiết TNF-a bị hG-CSF ức chế bằng điều hòa sau phiên mã Một vàinghiên cứu cho thấy sự tiết INF-y bị hG-CSF tác động gián tiếp băng cách giảm cácnhân tô cảm ứng tạo INF-y từ tế bao lympho là TNF-a, IL-12, IL-18
1.4.2 Trong cấy ghép tế bào /mô /cơ quanTrong cay ghép tế bào/mô/cơ quan, các nghiên cứu về protein và bản sao mRNA ởcác mảnh ghép trong quá trình thải bỏ cho thấy sự có mặt của IL-2, IEN-y nhưngkhông thấy xuất hiện IL-4 Người ta kết luận tế bào Ty, điều khiến chương trình
thai bỏ mảnh ghép vì nó có chức năng hoạt hóa T-CD8 cùng các đại thực bao thông
qua kha năng tiết IL-2 và IFN-y của tế bao nảy.Những phát hiện ở người và chuột cho thay sự biệt hóa va phát triển của tế bao Ty,và Ty nam dưới sự kiểm soát của G-CSF G-CSF tăng cường phiên mã nhân tốGATA-3 thúc day sự biệt hóa tế bào lympho T thành Ty» Ngoài ra, G-CSF kiểmsoát sự biệt hóa tế bào T qua trung gian các tế bào bạch tuột Tế bào bạch tuột đóngvai trò là tế bào trình diện kháng nguyên của hệ miễn dịch giúp khởi động đáp ứngmiễn dịch của tế bào T chống lại kháng nguyên Có hai dạng tế bào DC tham gia
Trang 31vào cảm ứng biệt hóa tiền tế bao T là DC, (myeloid DC) và DC; (plasmocytoid DC)theo thứ tự tạo thành Ty, và Tyo Những nghiên cứu về tạo máu cho thay G-CSF cóxu hướng tăng sinh chọn loc tế bao DC; trong máu ngoại vi và trong tế bào/mô/cơquan cay ghép Chức năng của DC, khi có tác động của G-CSF sẽ kích thích Tựa
thực hiện đáp ứng miễn dịch
1.4.3 G-CSF trong cấy ghép tế bào mầmG-CSF tái tổ hợp người được sử dụng rộng rãi dé huy động các tế bào mam từ tủyxương tạo thành tế bao máu Trong thập niên qua, kích thích bởi G-CSF hầu nhưđược nguồn tế bao mâm trong tủy xương để điều trị các bệnh ác tính và không áctính Một vai thuận lợi của cay ghép tế bào mầm so với cay ghép tủy xương baogồm thu nhận tế bào mầm dễ dàng hơn, lượng tế bào tiền chất được cải thiện, chépnhanh va khỏe bang cách giảm các tế bao chết do cay ghép
1.4.4 Trong điều trị bệnh Neutropenia (bệnh giảm bạch cầu trung tính)Hiện nay, G-CSF được sử dụng nhiều nhất để điều trị bệnh Neutropenia, đặc biệtNeutropenia do hóa trị liệu điều trị ung thư gây ra Việc sử dung G-CSF lam giảm50% nguy cơ nhiễm khuẩn và các rủi ro tương tự đối với các bệnh nhânNeutropenia Hiện nay hầu hết các phương pháp hóa trị liệu ung thư điều kết hợpvới việc sử dung G-CSF Các ứng dụng lâm sàng của hG-CSF tái tổ hợp trong điềutrị Neutropenia là kích thích nguyên bào tủy tạo máu, biệt hóa, hồi phục số lượngbạch cầu hạt trung tính Đồng thời, hG-CSF kéo dài đời sống bạch cầu hạt trungtính ngặn chan sự chết tế bao, rút ngăn thời gian trưởng thành, tăng cường chứcnăng (thực bào, tính oxi hóa, tính hóa hướng động ) Sau đó, bạch cầu trưởngthành được hG-CSF vận động từ tủy xương vào máu ngoại vi để thực hiện chứcnăng.
Khi hệ miễn dịch phục hồi, sức khỏe day đủ thì các bệnh nhân ung thư tiếp tục tiếntrình hóa trị, có thé tăng liều lượng thuốc và tăng hiệu quả điều trị Đôi khi, hG-CSFđược khuyên dùng trong tiền điều trị trước khi áp dụng hóa trị Điều đó giúp tủy
Trang 32xương tao nhiêu tê bào mâm Sau hóa tri liệu, tê bào mâm tạo máu sông sót sẽ biệt
hóa, khôi phục lượng bạch cầu hạt trung tính bảo vệ cơ thê.Ngoài ứng dụng để điều tri Neutropenia, G-CSF còn được sử dụng cho các bệnhnhân cấy ghép tủy xương G-CSF làm tăng khả năng sống sót của các bạch cầu hạttrung tính, đồng thời làm giảm thời gian trưởng thành của các bạch cầu hạt trungtính từ 5 ngày xuống còn 1 ngày nên làm tăng lượng bạch câu hạt trung tinh sảnxuất trong tủy xương Do vậy G-CSF giúp hồi phụ nhanh chóng số lượng bach cầuhạt trung tính trong máu của các bệnh nhân mới cay ghép tủy Hơn nữa G-CSF còncó thé được sử dụng cho các bệnh nhân bị bệnh tự miễn, các bệnh nhân bị thiếu hụtmiễn dịch, các bệnh nhân AIDS hay các bệnh nhân bị nhiễm trùng
Bên cạnh đó với những phát hiện mới về hoạt tính và chức năng của G-CSF trên cáctế bào than kinh, G-CSF còn hứa hen là một liệu pháp đây triển vọng cho các bệnhvề thần kinh, đặc biệt là đối với các bệnh nhân bị tốn thương hệ thân kinh [13]1.5 Bệnh giảm bạch cầu trung tính (Neutropenia), nguy co bị bệnh giảm
bạch cầu trung tính trong điều trị hóa trị của bênh nhân ung thư vàcách điều trị
1.5.1 Bệnh giảm bạch cầu trung tínhBệnh lý giảm bạch cầu trung tính còn gọi là neutropenia, là tình trạng giảm bấtthường mật độ của loại bach cau trung tính (neutrophil) trong dòng tuần hoàn máu.Trong máu, neutrophil chiếm từ 65-70% tổng số bạch cầu lưu thông Chúng đượctạo ra từ quá trình sinh tạo máu trong tủy xương, đi vào máu ngoại vi va tuần hoàntừ 7 đến 10 giờ trước khi di chuyển vao các mô va tôn tại ở đó vài ngày Khi có sựhiện diện của tác nhân gây bệnh, tủy xương tạo ra nhiều neutrophil hơn so với bìnhthường Neutrophil nhanh chóng có mặt tại vị trí bị xâm nhiễm dé tan công vi khuẩn
xâm nhập.
Một người trưởng thành tạo ra trung bình khoảng 60 ty tế bao neutrophil mỗi ngày,cùng với một lượng tương đương lưu thông trong máu Khi sự sản xuất neutrophil
Trang 33giảm xuống hay neutrophil trong máu bị phân huỷ nhanh hơn sẽ làm lượngneutrophil lưu thông trong máu giảm, dẫn đến bệnh lý neutropenia.
Mức độ trầm trọng của neutropenia nhìn chung có thé tính trên lượng neutrophiltuyệt đối đếm được (ANC) va được chia thành 3 loại như sau:
= Neutropenia cấp độ nhẹ: 10°/L <ANC< 1,5 x10°/L
= Neutropenia cấp độ vừa: 0,5 x 10°/L <ANC < 1,0 x 10°/L
= Neutropenia cấp độ nặng: ANC< 0,5 x 10°/LThời gian mac bệnh neutropenia có thé rất ngăn, được gọi là neutropenia cấp Nếu
bị neutropenia hơn 3 tháng, gọi là neutropenia mãn.
Triệu chứng của neutropenia thay đối phụ thuộc vào lượng neutrophil Lượngneutrophil càng thấp, khả năng nhiễm trùng càng cao Nguy cơ này tăng nếu lượngneutrophil thấp tồn tại hơn 3 ngày Dạng nhiễm trùng thường là viêm tai giữa, viêm
amidan, viêm hong, ung nhọt miệng nhiễm trùng nứu, rỗ da Neutropenia mãn có
thé dẫn đến những van dé nghiêm trọng.Dựa theo nguyên nhân, neutropenia được phân thành neutropenia bam sinh (do ditruyền) hay mắc phải (không do di truyền)
Neutropenia bam sinh gồm ba loại:- Neutropenia theo chu kỳ: di truyền theo kiểu gen trội trên nhiễm sắc thể
Trang 34Neutropenia liên quan đên miên dich: do sự xuât hiện của các kháng thê
kháng neutrophil, dẫn đến sự thực bào các neutrophil bi opsonin hoá.Neutropenia mạn tinh tự phái: là một dang không liên quan đến miễn dịch,gây ra do cơ thể đáp ứng lại đối với một căn bệnh nào đó
Neutropenia liên quan dén sự xám nhiêm cua các vi sinh vat: nhiều nhóm tac
nhân gây bệnh, gồm vi khuẩn, ký sinh tring, virus Neutropenia do dinh dưỡng: Sự thiếu hụt một số nhân tố dinh dưỡng, đặcbiệt là vitamin B12 và folate sẽ dé dẫn đến các rối loạn về máu, bao gồm cả
neutropenia.
Neutropenia do thuốc: là nguyên nhân pho bién nhất gây ra neutropenia Mộtsố loại thuốc như arninopyrine, penicillin, clozapine, methimazole,sulfasalazine có tac dụng ức chế sự sản sinh bạch cầu dẫn đến neutropenia.Các loại thuốc chống ung thư và khối u có tác dụng kìm hãm ức chế nguyênbào tủy xương tăng sinh và biệt hóa thành các tế bảo chức năng cũng gây
neutropenia [14]
Nguy cơ bị bệnh giám bach cầu trung tính trong điều trị hóa trị của
bệnh nhân ung thư
Trong các loại neutropenia, loại được quan tam hang đầu hiện nay là tình trạngneutropenia do hoá trị liệu ung thư Ảnh hưởng rõ nhất của việc dùng hóa trị ở bệnh
nhân ung thư là làm tê liệt khả năng tăng sinh, biệt hóa của nguyên bào tủy, giảmtram trọng lượng bạch câu, hông câu và tiêu câu trong máu, dân dén neutropenia và
suy giảm hệ thống miễn dịch Việc mac neutropenia trong quá trình hóa trị ung thưgây ra những biến chứng phức tạp khi điều trị
Khi bị mắc neutropenia sau khi hoá trị, bệnh nhân ung thư có nguy cơ bị nhiễmtrùng cao Khi lượng neutrophil trong máu càng thấp, bệnh nhân ở trong tình trạng
thiêu neutrophil càng lâu, càng có nguy cơ nhạy cảm với sự xâm nhiễm vi khuân,
nam và de dọa tính mạng bệnh nhân Khi lượng neutrophil trong máu giảm xuống
Trang 35còn 1,0; 0,5 và 0,1 x 10°/L, nguy cơ tử vong đối với bất kỳ sự xâm nhiễm nào tănglên từ 10%, 19% và 28% Do vậy, khi bị sốt bệnh nhân ung thư bị neutropenia cầnphải được tiêm một số loại kháng sinh và cần tuân thủ một số qui định chặt chẽ ởbệnh viện cho đến khi lượng tế bào neutrophil trong máu quay trở về trạng thái bình
thường.
Mặt khác, khoảng 50% bệnh nhân ung thư chỉ thực hiện được 85% kế hoạch hóa trịung thư do mắc neutropenia Các nghiên cứu cho thấy các biến chứng củaneutropenia đã làm hoãn kế hoạch hóa trị liệu của 40% bệnh nhân ung thư vú vàgiảm 25% liều điều trị ở những bệnh nhân này Do vậy neutropenia làm kéo dải thờigian, công sức và chi phí điều trị của bệnh nhân [15, 16]
1.5.3 Cách điều trịViệc điều trị nhằm kiểm soát các dang neutropenia bao gồm
- Sử dụng nhân tố kích thích hình thành khuẩn lạc (Colony Stimulating
Factors - CSFs)
- Cay tuỷ xương
- Su dung cac cytokine khac, khang sinh, vitamin
Trong đó, chi định CSFs là phương pháp điều tri neutropenia chủ yếu.Các nhân tố kích thích hình thành khuẩn lạc (CSFs) đã được phát hiện 4 thập kytrước bởi 2 nhóm nghiên cứu khi đang nghiên cứu kích thích sự biệt hóa bạch cầu
Sau đó, những phương pháp mới trong sinh học phân tử đã cho phép xác định, dòng
hóa các gen mã hóa CSFs và sản xuất lượng lớn những nhân tố nay Từ đó, CSFs đãđược sử dụng rộng rãi cho mục tiêu ngăn ngừa va điều trị bệnh lý giảm bạch cầu
trung tính (neutropenia) gây ra do hóa tri liệu ung thu và các dang neutropenia gâyra do các bệnh khác.
Hai nhóm CSF được sản xuất làm thuốc điều trị neutropenia là nhân tố kích thíchsản xuất bạch cầu hat (G-CSF) và nhân tố kích thích sản xuất đại thực bào (GM-CSF) Nhóm thuốc G-CSF gồm các biệt dược là filgrastim, pegfilgrastim,
Trang 36lenograstim Nhóm thuốc GM-CSF gồm các biệt dược sareramostim,
molgramostim và regramostim [ L7|
Các nghiên cứu điều tri neutropenia bằng G-CSF bat đầu từ năm 1987, và đã cóhiệu quả trong việc kéo dài đời sống bệnh nhân Trước khi có phương pháp điều trịnày, hầu hết bệnh nhân đều chết do bị nhiễm vi khuẩn trim trọng vì không có cáchnào khôi phục trạng thái neutrophil trong cơ thể về dạng bình thường do cácphương pháp trị liệu kháng sinh chỉ có thể kéo dài đời sống bệnh nhân này trong
thời gian rat ngăn.
G-CSF được sử dụng phô biến hơn GM-CSF vì có ít tác dụng phụ hơn G-CSFfilgrastim được sử dụng pho biến nhất, giúp điều trị thành công neutropenia gây ra
khoang miệng (CHU-2) Tuy nhiên, lượng G-CSF thu được không cao, với 5 lít
dịch nuôi cấy tế bào CHU-2 chỉ thu được khỏang 600ug G-CSE Với sự phát triểncủa công nghệ sinh học, đặc biệt là công nghệ protein tái tô hợp Năm 1986, hG-CSF tái tổ hợp đầu tiên được sản xuất thành công bang công nghệ gen trong E colibởi công ty Amgen (Hoa Ky) Nam 1991, G-CSF tái tổ hợp của Amgen đã đượcFDA (Food & Drug Administration — Cục Quản lý Thuốc và Thực phẩm Hoa Kỳ)cấp phép lưu hành với tên thương mại là Neupogen (Filgrastim), được chỉ định chocác bệnh nhân ung thư điều trị bằng phương pháp hóa trị bị neutropenia Năm 1994,G-CSF được cấp phép sử dung cho các bệnh nhân cay ghép tủy xương dé thúc daysự hồi phục số lượng bạch cau hat trung tinh [18]
Trang 37Hiện nay, trên thé giới có ba dạng thuốc G-CSF thương mại phô biến là: Neupogen,
Neulasta và Lenograstim.
Neupogen (Filgrastim) là dang G-CSF tái t6 hợp thé hệ thứ nhất Filgrastim là mộtG-CSF tái tổ hợp của người, chứa 175 amino axit với trình tự amino axit tươngđồng với trình tự G-CSF tự nhiên, trọng lượng phan tử khoảng 18,8kDa, cùng vớimột methionine (ở vị trí -]) cần thiết cho sự biểu hiện trong E coli, không bi
glycosyl hoa.
Neulasta, là G-CSF tái tổ hop thứ hai của công ty Amgen, là một dạng gan
polyethylene glycol lên G-CSF filgrastim tạo thành phân tử pegfilgrastim Neulasta
có thời gian bán hủy từ 15 — 80 giờ, tăng hon 20 lần so với neupogen Sự tăng tinhbền, làm giảm liều trong điều tri neutropenia là một ưu điểm lớn làm cho thị phần
của sản phâm này tăng đột biên.Một dang G-CSF được thương mại khác là Lenograstim Day là dang G-CSF
glycosyl hoá biểu hiện trong tế bào trứng chuột đồng Trung Quốc, do công tyChugai Pharmaceutical, Tokoyo, Nhật Bản sản xuất, đã được chấp nhận và lưu hànhở châu Âu từ năm 1993 Khác với hai loại trên, Lenograstim là G-CSF tái tô hợp
được sản xuất trên thế tế bào trứng chuột đồng, do được sản xuất trên tế bao động
vật hữu nhũ nên Lenograstim có cấu trúc tương tự như G-CSF tự nhiên, báo gồm174 acid amin và có một vị tri glycosyl hóa, do vậy Lenograstim có tính bền vững
cao hơn Filgrastim.
Gan đây một dang G-CSF tái tô hợp khác sản xuất từ nam men cũng đã được côngnhận quốc tế và sử dụng rộng rãi bởi tổ chức NIBSC (National Institute for
Biological Standards and Control, UK) Dang G-CSF này đã được công nhận ban
quyén bởi tổ chức WIPO (World Intellectual Property Organization) [19]Hiện nay trên thé giới có trên 20 công ty sản xuất G-CSF tái tô hợp va thi trường G-CSF tái tổ hợp vẫn đang không ngừng được mở rộng vả tăng cao Năm 2005, lượngG-CSF tái tổ hợp tiêu thụ trên toàn thế giới đạt 4,6 tỷ đôla Nếu chỉ tính riêng hai
Trang 38sản phẩm Neupogen (Filgrastim) và Neulasta (Pegfilgrastim) của công ty Amgendoanh số cũng đã lên đến 3.5 tỷ đôla với mức tăng trưởng 20%.
Các chỉ định chính của Neupogen, Neulasta và Lenograstim được trình bày trongBang 1.1 [17]
Bang 1 1: Các dang G-CSF tái tổ hop và các chỉ định được công nhận
Chỉ định Liều lượngFilgrastim = Điều trị ức chế tủy chuẩn bị cho = 10ug/kg/ngay truyền(Neupogen) ghép tuy tinh mach 4-24h
= Giam bạch cau đa nhân trung tính = Ó/g/Kg/ngày truyềnbam sinh dưới da 2 lần/ngày= Giảm bach câu chu kỳ "_5/;g/Kg/ngày truyền
dưới da 1 lần/ngày
= Giam bạch câu trung tính nặng ở " 3//g/kg/ngày truyềnbệnh nhân ung thư nhận hóa tri gây dưới da | lân/ngày
suy tủy "_5/;g/Kg/ngày truyền
= Rối loạn bạch cầu trung tính tự phát dưới da | lan/ngay
Pegfilgrastim | Neutropenia ở bệnh nhân u ác tính 6mg truyền dưới da(Neulasta) không liên quan tủy, điều trị hóa trị gây | trong 1 chu kỳ hóa trị
suy tủy, găn liên với sốt neutropenia
Lenograstim | Chỉ định như filgrastim 5g/Kg/ngày
1.6.1.2 Thị trường hG-CSF trên thế giớiSự phát triển, thị trường va quyển sở hữu trí tuệ của Neupogen diễn biến rất phứctạp Có rất nhiều công ty liên quan đến sự phát triển thị trường dạng thuốc này, baogôm Amgen, Roche, Kirin, Kirin-Kujnpeng, Sankyo, Sloan-Kettring, Royalty
Trang 39Pharma, Drug Royalty Corp, Inwest Investments, Genentech và trường đại họcColumbia.
Neupogen được thương mai hoá tại Mỹ và rất nhiều các quốc gia khác boi Amgen.Sản phẩm này đang mở rộng thị trường trên toàn thế giới Neupogen được thươngmại hoá ở cộng đồng các nước cộng đồng chung châu Âu (EU), Thụy Sĩ và Na Uybởi công ty Hoffmann-La Roche Thang 5/2002, Amgen yêu cau Roche trả tiền bảnquyền và trả no cho các nước hội đồng châu Au, Thuy Sĩ va Na Uy khoảng 137,5triệu USD Roche tiếp tục kinh doanh mặt hàng này ở một số nước Trung Đông,châu Phi, châu Á và Mỹ Latinh Neupogen cũng được đồng thương mại hoá bởi
Dompe ở Y, Kirin ở Nhật Bản và một sô công ty ở Trung Quéc.
Tháng 4/2005, Pliva (Croatia) cộng tác với Mayne Pharma (Australia) để phát triểncác sản phẩm G-CSF hết bản quyền, cùng với việc Mayne trả Pilva 21 triệu Eurotrong 3 năm dé dành thị trường đối với G-CSF, cung cấp độc quyền G-CSF ở TâyÂu, Bắc Mỹ, Trung Đông, Châu Á Thái Bình Dương
Theo Tap chí Công nghệ Sinh học của Nature, trong xu thé phát triển các loại thuốctrị liệu tái tổ hợp từ năm 2003 đến năm 2010, Neupogen và Neulasta năm trong 10protein tái tổ hợp dùng làm thuốc hàng dau trên thế giới Đặc biệt doanh thu củaNeuslasta (Pegfilgrastim) tăng đột biến từ 0,464 tỷ USD/năm 2002 lên 1,255 tỷUSD/năm 2003 (tốc độ tăng trưởng 170,5%) đã cho thấy tiém năng của thé hệ thứhai G-CSF tái tổ hợp trên thị trường thé giới [20]
1.6.2 Tinh hình ung thư và nhu cầu sản xuất hG-CSF tái tổ hợp ở Việt NamỞ Việt Nam, tình hình ung thư đang có xu hướng tăng cao, các bệnh nhân ung thưcần chữa trị ngày càng gia tăng Phương pháp chữa trị ung thư ở Việt Nam hiện naychủ yếu là hóa trị liệu nên nhu cầu sử dụng G-CSF để giảm thiểu rủi ro trong quatrình điều trị là tất yếu Sản phẩm G-CSF thương mại có mặt ở Việt Nam hiện naylà Neupogen® do công ty Amgen đã hết hạn vào tháng 3/2006 là cơ hội cho việcsản xuất G-CSF giá thành rẻ ở Việt Nam
Trang 40OP) Cao RANOCYTE
b = = r
:
Neupogen =
mỹ
Hình 1 10: Các sản pham G-CSF thương mai [20, 21]
Công ty trách nhiệm hữu hạn công nghệ sinh học dược Nanogen là công ty tiên
phong đi đầu trong lĩnh vực sản xuất protein tái tô hop ở Việt Nam Sản phẩmprotein tái tổ hợp đầu tiên của công ty này đang được lưu hành trên thị trường ViệtNam và một số quốc gia khác trên thế giới là Feronsure (IFN) và Pegnano(PegIFN) Hiện nay công ty này đã nghiên cứu thành công một số protein tái tổ hợpbiểu hiện trên dòng tế bào động vật và trên tế bao E.coli trong đó G-CSF trongnghiên cứu này cũng là nghiên cứu thành công của công ty Sản phẩm G-CSE của
nanogen dang duoc đưa ra thi trường với tên thương mai là Ficocyte.
1.7 Tổng quan về tạo dòng và biểu hiện protein ngoại lai trong E.coli1.7.1 Tổng quan về tạo dòng
Đây là quá trình hình thành một dòng tế bảo chứa một hay nhiều bản sao của DNAmục tiêu ở dạng tái tô hợp với một vector Mục đích của tao dong nhằm thu nhậnlượng lớn dòng tế bào có khả năng biểu hiện gen mục tiêu
Các bước của quá trình tạo dòng:
Thu nhận và xử lý DNA mục tiêuChọn và xử lý vector phù hợp
Tạo vector tái tổ hợpDua vector tái tổ hợp vào dòng tế bào chủ