2- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen tổng hợp astaxanthin vào cây đậu tương thông qua Agrobacterium tumefaciens.. - Tạo cây đậu tương chuyển
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu
Hạt giống đậu tương MTĐ 176 được cung cấp bởi bộ môn Di truyền giống nông nghiệp, khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng Đại học Cần Thơ Đặc điểm, phẩm chất giống: kháng sâu bệnh tốt; n ng suất cao trong mùa mƣa đạt khoảng 2-3,2 tấn/ha; thích nghi rộng trên c c vùng sinh th i Đông Nam bộ Tây Nguyên và Đồng bằng sông Cửu Long; thời gian sinh trưởng khoảng 80-85 ngày
3.1.2 Chủng vi khuẩn chuyển gen
Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA 105 mang vector plasmid pITB- AST (Phòng Công nghệ Gen, Viện Sinh học Nhiệt đới) Plasmid mang tính bản chất bản quyền của Viện Sinh Học Nhiệt Đới
- Môi trường YEP nuôi vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens: 5 g/l cao nấm men; 10 g/l peptone; 5 g/l NaCl 2 ; pH 7,0 Bổ sung kháng sinh kanamycin và rifampicin ở nồng độ 50 mg/l vào môi trường đã được hấp khử trùng
- Môi trường tái sinh chồi: Môi trường 1X Gamborg B5 cơ bản; 30 g/l sucrose; 0,59 g/l MES [2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid] và 13 g/l agar Nam Hạ Long; pH 5,7
Lọc vô trùng và bổ sung thêm vào môi trường đã được hấp khử trùng các chất sau: kháng sinh cefotaxime (500 mg/l), Augmentin 300mg/l; tổ hợp các chất điều hòa sinh trưởng ở các nồng độ khác nhau gồm BA (1; 2; 3 mg/l); (Gamborg et al., 1968; Paz et al., 2006;
- Môi trường lây nhiễm: (IF) 1/10 X môi trường Gamborg B5 cơ bản; 30 g/l sucrose; 3,9 g/l MES; pH 5,4 Lọc vô trùng và bổ sung thêm vào môi trường đã được hấp khử trùng các chất sau: GA 3 (0,25 mg/l); 40 mg/l acetosyringone; BA; (theo nồng độ khảo sát) (Gamborg et al., 1968; Paz et al., 2006) [34][18]
- Môi trường nuôi chung: (CCM) 1/10X môi trường Gamborg B5 cơ bản; 30 g/l
Sucrose; 3,9 g/l MES và 13 g/l agar Nam Hạ Long; pH 5,4 Lọc vô trùng và bổ sung thêm vào môi trường đã được hấp khử trùng các chất sau đây: GA 3 (0,25 mg/l); cysteine (400 mg/l); dithiothrietol (154,2 mg/l); 40 mg/l acetosyringone; BA; (theo nồng độ khảo sát) (Gamborg et al., 1968; Paz et al., 2006) [34][18]
- Môi trường gieo hạt: (GM) 1X môi trường Gamborg B5 cơ bản, 30 g/L Sucrose,
0.59 g/L MES và 13 g/l agar Nam Hạ Long; pH 5,8
- Môi trường cảm ứng chồi: (SIM) 1X môi trường Gamborg B5 cơ bản, 30 g/L
Sucrose, 0.59 g/L MES và 13 g/l agar Nam Hạ Long; pH 5,7 Lọc vô trùng và bổ sung thêm vào môi trường đã được hấp khử trùng các chất sau đây: BA theo khảo sát, Cefotaxime (100 mg/L), Aumentin 300mg/l, PPT theo khảo sát
- Môi trường kéo dài chồi (SEM) Môi trường 1X MS cơ bản; 30 g/l sucrose; 0,59 g/l
MES [2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid] và 13 g/l agar Nam Hạ Long; pH 5,7 Lọc vô trùng và bổ sung thêm vào môi trường đã được hấp khử trùng các chất sau: kháng sinh cefotaxime (500 mg/l), Aumentin 300mg/l ; tổ hợp các chất Asparagine (50 mg/L), L- Pyroglutamic Acid (100 mg/L), IAA (0.1 mg/L), GA3 (0.5 mg/L), Zeatin-R (1 mg/L), PPT 5mg/l [38] (Gamborg et al., 1968; Paz et al., 2006; Ma et al., 2008) [34][18][13]
- Môi trường tạo rễ: (RS) Môi trường 1/2X MS cơ bản; 20 g/l sucrose; 0,59 g/l MES
[2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid] và 13 g/l agar Nam Hạ Long; pH 5,6 Lọc vô trùng và bổ sung thêm vào môi trường đã được hấp khử trùng các chất sau: kháng sinh cefotaxime (500 mg/l), Aumentin 300mg/l; tổ hợp các chất Indole-3butyric acid (IBA 1mg/l) (Gamborg et al., 1968; Paz et al., 2006; Ma et al., 2008) [34][18][13] , PPT 5mg/l [38]
Plasmid pITB-AST là binary plasmid trong hệ thống binary của Agrobacterium tumefaciens dùng để chuyển gen Plasmid này có khả n ng nhân lên trong E.coli và A.tumefaciens, vùng T-DNA mang các gen chuyển vào thực vật, vùng bên ngoài T-DNA mang gen kháng kanamycin nptII biểu hiện ở vi khuẩn
- Plasmid pITB-AST kích thước 15,5 kb, T- DNA mang tổ hợp gen P glycinin- cbfd2- T glycinin/ P glycinin-hbfd2- T glycinin/ P glycinin -ZmPsy-T glycinin và gen chọn lọc
P nos-bar-T nos biểu hiện ở thực vật
P glycinin : promoter của gen mã hoá glycinin ở đậu tương
T glycinin : terminator của gen mã hoá glycinin ở đậu tương bar : gen quy định tính kháng phosphinothricin cbfd2 : gen mã ho enzyme carotenoid β-ring 4-dehydrogenase ở
Adonis aestivalis hbfd2 : gen mã hoá enzyme carotenoid 4-hydroxy-β-ring 4- dehydrogenase ở Adonis aestivalis
Zm-psy : gen mã hoá enzyme phytoene synthase
P nos : promoter của gen mã hoá enzyme nopalin synthase
T nos : terminator của gen mã hoá enzyme nopalin synthase.
Phương ph p
Khử trùng bằng khí clo: Theo phương ph p của Di và đồng tác giả (1996) [35] , với thời gian khử trùng khác nhau: 16 giờ, 24 giờ
Khử trùng bằng dung dịch Javel: Hạt đậu tương được khử trùng bằng cách ngâm vào dung dịch nước Javel 50% (Hàm lượng clo 38 g/l) trong các thời gian khác nhau: 30, 40 50 phút sau đó rửa sạch mẫu lại 3 lần bằng nước cất vô trùng (Aragao et al., 2000;
Hạt sau khi khử trùng bởi c c t c nhân trên được cấy lên môi trường rắn gồm khoáng MS, vitamin Gamborg B5, pH 5,6 (Murashige và Skoog, 1962; Gamborg et al.,
1968; Paz et al., 2006)[37][34][18] X c định thời gian khử trùng sạch mẫu và tỉ lệ nảy mầm
Các nghiệm thức thực hiện với 10 mẫu/bình môi trường, lặp lại 3 lần Thí nghiệm được bố trí theo kiểu đơn yếu tố và hoàn toàn ngẫu nhiên Theo dõi thống kê tỉ lệ nhiễm, tỉ lệ nảy mầm và độ nảy mầm đồng đều Từ đó lựa chọn phương ph p khử trùng thích hợp cho nghiên cứu
3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đối với sự tái sinh
Mẫu được sử dụng ở quy cách lá mầm theo phương ph p của Hinchee và đồng tác giả (1988) [17] Olhoft và đồng tác giả (2003) [22] với kích thước đoạn trụ hạ diệp khoảng 0,5-1 cm
Mẫu được đặt trên môi trường tái sinh có các tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng khác nhau gồm BA (1; 2; 3 mg/l (Olhoft et al., 2003; Ma et al., 2008; Lee et al.,
Các nghiệm thức thực hiện với 7 mẫu/bình môi trường, lặp lại 3 lần Thí nghiệm được bố trí theo kiểu đơn yếu tố và hoàn toàn ngẫu nhiên
Theo dõi mức độ các lá mầm tái sinh chồi và các yếu tố liên quan nhƣ độ đồng đều tái sinh chồi, hình thái, màu sắc Từ đó chọn tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng cho hiệu quả tái sinh cao nhất
3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của chất chọn lọc phosphinothricin lên sự tái sinh chồi từ lá mầm
Tái sinh lá mầm (in vitro) trên môi trường có bổ sung PPT ở các nồng độ 1; 2; 3; 4;
Các nghiệm thức thực hiện với 5 mẫu/bình môi trường, lặp lại 3 lần Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu đơn yếu tố và hoàn toàn ngẫu nhiên Đ nh gi ảnh hưởng của PPT lên mẫu thông qua tỉ lệ lá mầm tái sinh Từ đó chọn nồng độ PPT gây ức chế hoàn toàn tái sinh chồi để chọn lọc chồi chuyển gen
3.2.4 Chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens và chọn lọc chồi kháng
Khử trùng và gieo hạt: Hạt đậu tương MTĐ 176 được xử lí vô trùng theo phương thức đã khảo s t Sau đó được gieo trong môi trường GM với mật độ 10 hạt / bình tam giác 250ml chứa 50ml môi trường Gieo hạt trong 5 ngày Ghi nhận tỉ nảy mầm
Chuẩn bị lá mầm: Hạt đậu tương sau nảy mầm được xử lí cắt lấy 2 lá mầm và đoạn
0,5 - 1cm đoạn trụ hạ diệp Đoạn trụ hạ diệp đƣợc chẻ đôi để tách hẳn khỏi lá mầm Lá mầm được tạo vết thương ở phần gần đoạn trụ hạ diệp bằng mũ dao nhọn
Lây nhiễm Agrobacterium tumefaciens: Dịch vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đƣợc ly tâm trong 10 phút ở 10 o C với tốc độ 4000 vòng/ phút Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens sau ly tâm được lắc trong 50ml môi trường IFM có bổ sung acetosyringone với nồng độ 40mg/l Các lá mầm đƣợc lây nhiễm trong dung dịch Agrobacterium tumefaciens ở 28 o C trong 30 phút Các lá mầm đƣợc ngâm chìm trong dung dịch vi khuẩn
Nuôi chung: Sau 30 phút cho nhiễm Agrobacterium tumefaciens, các lá mầm đƣợc gắp ra đĩa petri có giấy thấm để khô Sau đó c c l mầm đƣợc nuôi chung trong môi trường CCM trong đĩa petri với mật độ 6 l /đĩa Thời gian nuôi chung là 5 ngày ở 24 o C ở điều kiện chiếu sáng 18h sáng : 6h tối
Cảm ứng chồi: Các lá mầm sau thời gian nuôi chung được chuyển sang môi trường cảm ứng chồi SIM với mật độ 5 lá mầm / bình tam giác 250ml chứa 50ml môi trường
Thời gian cảm ứng chồi là 4 tuần trong điều kiện chiếu sáng 18h sáng : 6h tối ở 24 o C Sau mỗi 2 tuần cấy chuyền sang môi trường SIM mới
Kéo dài chồi: Sau thời gian cảm ứng chồi, các chồi phát triển từ 0,5 – 1cm đƣợc tách ra khỏi lá mầm và chuyển sang môi trường kéo dài chồi SEM với mật độ 3 chồi / bình tam giác 250ml chứa 50ml môi trường Thời gian kéo dài chồi là 8 tuần trong điều kiện chiếu sáng 18h sáng : 6h tối ở 24 o C Sau mỗi 2 tuần cấy chuyền sang môi trường SEM mới
Tạo rễ: Chồi chọn lọc được kéo ít nhất từ 3 cm được chuyển sang môi trường tạo rễ RM Thời gian kéo tạo rễ là 2 tuần trong điều kiện chiếu sáng 18h sáng : 6h tối ở 24 o C
Sau mỗi 2 tuần cấy chuyền sang môi trường tạo rễ mới
Chuyển ra vườn ươm: Sau khi tạo rễ trong 2 tuần, cây hoàn có ít nhất 2 rễ lớn đƣợc chuyển ra trồng trong vườn ươm trong túi plastic trong điều kiện chiếu sáng 18h sáng : 6h tối ở 24 o C
Trong quá trình tiến hành chuyển gen, mẫu lá mầm được tạo vết thương bằng mũi dao ở phần cuống lá hỗ trợ khả n ng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Hình 3.1 Lá mầm được tạo vết thương ở phần gần đoạn trụ hạ diệp bằng mũi dao nhọn
3.2.5 Tách chiết DNA thực vật
