Đánh giá ảnh hưởng của nước súc miệng chứa nisin và disodium edta lên các vi khuẩn gram âm gây hơi thở hôi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - PHAN THỊ NHƯ NGỌC ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA NƯỚC SÚC MIỆNG CHỨA NISIN VÀ DISODIUM EDTA LÊN CÁC VI KHUẨN GRAM ÂM GÂY HƠI THỞ HƠI Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Mã ngành: 604280 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2013 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM Cán hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG ……………………………………… Cán chấm nhận xét 1: ……………………………………… ……………………………………… Cán chấm nhận xét 2: ……………………………………… ……………………………………… Luận văn Thạc sĩ bảo vệ “HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA”, ngày 11 tháng 01 năm 2013 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: PHAN THỊ NHƯ NGỌC MSHV: 10310613 Ngày, tháng, năm sinh : 26 – 12 – 1973 Nơi sinh: Đà Nẵng Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 604280 I TÊN ĐỀ TÀI: Đánh giá ảnh hưởng nước súc miệng chứa nisin disodium EDTA lên vi khuẩn Gram âm gây thở hôi II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Nội dung 1: Nghiên cứu in vitro đánh giá ảnh hưởng phức nisin disodium EDTA lên hệ vi khuẩn Gram âm gây thở hôi, với nghiệm thức kết hợp nisin (nồng độ thay đổi từ 6.3 µg/ml đến 43.8 µg/ml) disodium EDTA (nồng độ thay đổi từ 10mM đến 30mM) Xác định nghiệm thức tối ưu Nội dung 2: Khảo sát in vivo ảnh hưởng nghiệm thức tối ưu từ nội dung lên hệ vi khuẩn yếm khí gây thở đối tượng thử nghiệm So sánh hiệu nghiệm thức nisin- disodium EDTA với sản phẩm nước súc miệng diệt vi khuẩn gây hôi miệng thông dụng thị trường III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 02/2012 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 11/2012 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG Tp HCM, ngày tháng năm 2013 Nội dung đề cương Luận văn Thạc sĩ Hội Đồng Chuyên ngành thông qua CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin chân thành cám ơn PGS.TS - Cơ Nguyễn Thúy Hương tận tình hướng dẫn, quan tâm giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi suốt thời gian thực luận văn Xin bày tỏ lòng biết ơn cảm kích giúp đỡ em sinh viên môn Công nghệ thực phẩm K2008, em nhiệt tình cung cấp mẫu thử phục vụ cho thử nghiệm Tôi xin chân thành cám ơn bạn Tạ Thị Tuyến, Cao Xuân Yến giúp đỡ nhiều Cám ơn bạn học viên cao học thực luận văn khoảng thời gian chia sẻ kinh nghiệm q báu Cuối cùng, ln bên cạnh động lực cho gia đình, Ba, Mẹ anh chị em Tôi xin gởi đến họ thành trình học tập, Luận văn Phan Thị Như Ngọc TÓM TẮT LUẬN VĂN Tên đề tài: Đánh giá ảnh hưởng nước súc miệng chứa nisin disodium EDTA lên vi khuẩn Gram âm gây thở hôi Nội dung nghiên cứu: Xác định công thức tối ưu phối hợp nisin disodium EDTA lên hai chủng vi sinh vật Fusobacterium nucleatum Klebsiella pneumoniae nghiên cứu in vitro Đánh giá giảm tổng số vi khuẩn yếm khí gây thở hôi sử dụng công thức tối ưu nisin – disodium EDTA khảo sát in vivo đối tượng So sánh hiệu in vivo công thức tối ưu nisin – disodium EDTA với sản phẩm nước súc miệng diệt vi khuẩn gây hôi miệng thông dụng thị trường Chúng tiến hành thí nghiệm để xác định đường kính vòng kháng khuẩn, chọn nghiệm thức tối ưu in vitro tiến hành nuôi cấy để xác định tổng số vi khuẩn yếm khí mẫu thử nghiệm in vivo Kết thí nghiệm thu cho thấy công thức tối ưu thể rõ hiệu đối tượng khảo sát: - Làm giảm từ 3.3 – 6.1 log10 tổng số vi khuẩn yếm khí gây thở hơi, - Hiệu diệt khuẩn trội sản phẩm nước súc miệng diệt khuẩn thông dụng thị trường (sản phẩm chứng nhận lâm sàng khả diệt vi khuẩn gây hôi miệng, mảng bám viêm nướu), - Thể rõ lực vượt trội in vitro hai chủng nghiên cứu so với sản phẩm nước súc miệng diệt khuẩn thông dụng ABSTRACT Thesis: Evaluate the efficacy of a mouthrinse containing nisin and disodium EDTA on Gram negative bacteria inducing malodour Content: Determine the optimum formulation of nisin in combination with disodium EDTA for antimicrobial activity on Fusobacterium nucleatum and Klebsiella pneumoniae by in vitro evaluation Estimate the population reduction of anaerobic bacteria inducing malodour during the treatment with the optimum nisin – disodium EDTA formulation by in vivo evaluation on human subjects Compare the in vivo antimicrobial efficacy of the optimum nisin – disodium EDTA formulation with a popular clinical proven antibacterial (inducing malodour) mouthrinse (randomly selected) We implemented experiments in order to determine the diameter of inhibitory cirles, the in vitro optimum formulation and tested in vivo samples for total of viable anaerobic bacterial count The results showed that the optimum nisin – disodium EDTA formulation proved its antibacterial efficacy (inducing malodour) for human subjects in this evaluation: - Reducing from 3.3 – 6.1 log10 total of viable anaerobic bacterial count, - Its antimicrobial efficacy is better than the controled antibacterial mouthrinse (this product is clinical proven of antiseptic, antiplaque and antigingivitis), - Proving the superior in vitro antimicrobial efficacy on two study microorganisms in comparison with the controled antibacterial mouthrinse i MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU ………………………………………………….…………… CHƯƠNG – TỒNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bacteriocin 1.1.1 Giới thiệu ……………………………………………………… 1.1.2 Bacteriocin – nhìn lại lịch sử ………………………………… 1.1.3 Phân loại bacteriocin vi khuẩn Gram dương LAB ………… 1.1.4 Ứng dụng bacteriocin……………………………………… 1.2 Nisin – bacteriocin vi khuẩn Lactococcus lactis 1.2.1 Định nghĩa giới thiệu………………………………………… 11 1.2.2 Đặc tính kháng khuẩn phổ kháng khuẩn nisin…………… 12 1.2.3 Đặc điểm hóa lý - Độ ổn định độ hòa tan…………………… 15 1.2.4 Cơ chế kháng khuẩn…………………………………………… 15 1.2.5 Ứng dụng……………………………………………………… 17 1.3 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) …………………………… 18 1.4 Hệ vi sinh vật khoang miệng người khỏe mạnh người bệnh 19 1.5 Các bệnh miệng………………………………………………… 22 1.6 Thành phần nước súc miệng………………………………………… 24 1.7 Các nghiên cứu nước hướng đề tài…………… 27 CHƯƠNG – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu……………………………………………………………… 31 2.2 Công thức nước súc miệng đề nghị………………………………… 32 2.3 Sơ đồ tổng quát nội dung nghiên cứu……………………………… 33 2.4 Mơ hình thí nghiệm ………………………………………………… 34 2.5 Lấy mẫu……………………………………………………………… 35 2.6 Kiểm tra mẫu ………………………………………………………… 35 ii 2.7 Các phương pháp phân tích nghiên cứu áp dụng 2.7.1 Khảo sát đặc điểm hình thái hai chủng vi sinh vật thị …………………………………………………………… 36 2.7.2 Đếm khuẩn lạc………………………………………………… 36 2.7.3 Đo mật độ quang ……………………………………………… 37 2.7.4 Xây dựng đường chuẩn tương quan tuyến tính mật độ quang mật độ tế bào……………………………………… 37 2.7.5 Xác định hoạt tính kháng khuẩn phức nisin disodium EDTA………………………………………………………… 38 2.7.6 Xác định tổng số vi khuẩn yếm khí gây thở ………… 39 2.8 Các yếu tố ảnh hưởng đến khảo sát in vivo ……………………… 40 CHƯƠNG – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Một số thí nghiệm tiền đề tài………………………………………… 41 3.2 Xác định hoạt tính kháng khuẩn phức nisin disodium EDTA hai chủng nghiên cứu…………………….……………………… 45 3.3 Các kết khảo sát in vivo…… ………………………………… 51 3.4 So sánh hiệu chăm sóc miệng nước súc miệng nisindisodium EDTA với nước súc miệng diệt khuẩn thị trường đóng góp cụ thể đề tài………………………………………………… 60 CHƯƠNG – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………… 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO ……………………………………………… 68 PHỤ LỤC……………………………………………………………… 74 iii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Dữ liệu nồng độ ức chế danh nghĩa …… ………………….… 14 Bảng 1.2 Hệ vi sinh vật miệng…………………………………… 21 Bảng 2.1 Công thức nước súc miệng đề nghị cho khảo sát in vivo……… 32 Bảng 2.2 Các công thức kháng khuẩn tỉ lệ thành phần………… 33 Bảng 2.3 Cách chuẩn bị 10 ml công thức kháng khuẩn từ dung dịch gốc nisin disodium EDTA 100mM………………………… 38 Bảng 3.1 Đường kính vịng kháng khuẩn chủng K pneumoniae … 45 Bảng 3.2 Đường kính vịng kháng khuẩn chủng F nucleatum…… 48 Bảng 3.3 Kết tổng số vi khuẩn yếm khí (CFU/ml x 106) điều kiện thường (không sử dụng nước súc miệng)……………………… 52 Bảng 3.4 Kết tổng số vi khuẩn yếm khí (CFU/ml x 106) 10 ngày sử dụng giả dược………………………………………… 53 Bảng 3.5 Kết tổng số vi khuẩn yếm khí (CFU/ml x 106) 10 ngày sử dụng nước súc miệng chứa 25µg/ml nisin-20mM disodium EDTA ……………………………………………… 55 Bảng 3.6 Kết tổng số vi khuẩn yếm khí (CFU/ml x 106) 10 ngày sử dụng nước súc miệng diệt khuẩn thị trường ………… 57 Bảng 3.7 Đường kính vịng kháng khuẩn nước súc miệng nisindisodium EDTA nước súc miệng diệt khuẩn hai chủng nghiên cứu……………………………………………………… 61 Bảng 3.8 So sánh hiệu chăm sóc miệng nisin- disodium EDTA nước súc miệng diệt khuẩn thị trường……………… 62 iv DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Các mơ hình tạo lỗ ……………………………………………… 16 Hình 1.2 Cấu trúc răng…………………………………………………… 28 Hình Sơ đồ tổng quát nội dung nghiên cứu……………………………… 40 Hình 3.1 Chủng Klebsiella pneumoniae qua kính hiển vi………………… 41 Hình 3.2a, b Khuẩn lạc Klebsiella pneumoniae môi trường Columbia blood agar base môi trường Thioglycollate agar ………… 41 Hình 3.3 Chủng Fusobacterium nucleatum qua kính hiển vi…………… 42 Hình 3.4 Khuẩn lạc Fusobacterium nucleatum mơi trường Columbia blood agar base……………………………………………… 43 Hình 3.5 Khuẩn lạc Fusobacterium nucleatum môi trường Thioglycollate agar…………………………………………… 43 Hình 3.6 Đường chuẩn tương quan mật độ quang mật độ tế bào chủng Klebsiella pneumoniae……………………………… 44 Hình 3.7 Đường chuẩn tương quan mật độ quang mật độ tế bào chủng Fusobacterium nucleatum………………………… 44 Hình 3.8 Biến thiên đường kính vịng kháng khuẩn chủng Klebsiella pneumoniae theo nồng độ nisin………………………………… 46 Hình 3.9 Biến thiên đường kính vịng kháng khuẩn chủng Fusobacterium nucleatum theo nồng độ nisin ………………… 49 75 76 77 Kết từ đồ thị đối tượng cho thấy, tổng số vi khuẩn yếm khí giảm trung bình từ 3.3 – 6.1 log10 sử dụng nước súc miệng nisin-disodium EDTA PHỤ LỤC Các đồ thị biểu diễn so sánh biến thiên tổng số vi khuẩn yếm khí nước súc miệng nisin-disodium EDTA nước súc miệng diệt khuẩn Để so sánh biến thiên tổng số vi khuẩn yếm khí nước súc miệng nisin-disodium EDTA nước súc miệng diệt khuẩn sở đánh giá hiệu nước súc miệng nisin-disodium EDTA, kết hợp đường biểu diễn biến thiên tổng số vi khuẩn yếm khí vào đồ thị, cho đối tượng Kết trình bày hình đây: 78 79 80 Kết từ đồ thị đối tượng cho thấy, đa số thời điểm, đường màu xanh (đường liền nét) biểu thị tổng số vi khuẩn yếm khí sử dụng nước súc miệng nisin-disodium EDTA nằm đường màu đỏ (đường đứt nét) biểu thị tổng số vi khuẩn yếm khí sử dụng nước súc miệng diệt khuẩn Điều cho thấy rằng, 81 điều kiện khảo sát in vivo đối tượng mà thực hiện, hiệu diệt vi khuẩn yếm khí gây miệng trội cơng thức nisin-disodium EDTA PHỤ LỤC Các hình ảnh đường kính vịng kháng khuẩn chủng Klebsiella pneumoniae với công thức từ A đến K, ĐC1 (nisin đơn lẻ) ĐC2 (disodium EDTA đơn lẻ) Công thức A Công thức B Công thức C Công thức D Công thức E Công thức F 82 Công thức G Công thức H Công thức I Công thức J Công thức K 83 ĐC1 – Nisin đơn lẻ ĐC2 – disodium EDTA đơn lẻ PHỤ LỤC Các hình ảnh đường kính vịng kháng khuẩn chủng Fusobacterium nucleatum với công thức từ A đến K, ĐC1 (nisin đơn lẻ) ĐC2 (disodium EDTA đơn lẻ) Công thức A Công thức B 84 Công thức C Công thức D Công thức E Công thức F Công thức G Công thức H 85 Công thức I Công thức J Công thức K ĐC1 – Nisin đơn lẻ 86 ĐC2 – disodium EDTA đơn lẻ PHỤ LỤC Các hình ảnh đường kính vịng kháng khuẩn thử với cơng thức đề nghị (gồm 25µg/ml nisin-20mM disodium EDTA tá dược) chủng K pneumoniae (trái) F nucleatum (phải) PHỤ LỤC Các hình ảnh đường kính vịng kháng khuẩn thử với nước súc miệng diệt khuẩn chủng K pneumoniae (trái) F nucleatum (phải) 87 PHỤ LỤC Kết Paired Sample t-test cho hai dãy đường kính vịng kháng khuẩn ABC (tương ứng disodium EDTA 10mM) DEF (tương ứng disodium EDTA 20mM) chủng K pneumoniae: PHỤ LỤC Kết Paired Sample t-test cho hai dãy đường kính vịng kháng khuẩn FGH (tương ứng disodium EDTA 20mM) IJK (tương ứng disodium EDTA 30mM) chủng K pneumoniae: 88 PHỤ LỤC Kết Paired Sample t-test cho hai dãy đường kính vịng kháng khuẩn ABC (tương ứng disodium EDTA 10mM) DEF (tương ứng disodium EDTA 20mM) chủng F nucleatum: PHỤ LỤC 10 Kết Paired Sample t-test cho hai dãy đường kính vịng kháng khuẩn FGH (tương ứng disodium EDTA 20mM) IJK (tương ứng disodium EDTA 30mM) chủng F nucleatum: 89 SƠ YẾU LÝ LỊCH Họ tên: PHAN THỊ NHƯ NGỌC Ngày, tháng, năm sinh : 26 – 12 – 1973 Nơi sinh: Đà Nẵng Địa liên lạc: 82/22C Đinh Bộ Lĩnh, phường 26, quận Bình Thạnh, Tp HCM QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO 1991 – 1996: Theo học Trường Đại học Bách khoa Đà Nẵng, khoa Hóa Thực phẩm 2010 – 2012: Theo học chương trình Cao học, ngành Công nghệ sinh học Trường Đại học Bách khoa , Đại học Quốc gia Tp HCM Q TRÌNH CƠNG TÁC 1996 – 2009: Cơng tác Công ty Dược United Pharma 2009 – 2012: Công tác Công ty Dược Farmapex Tranet ... TÀI: Đánh giá ảnh hưởng nước súc miệng chứa nisin disodium EDTA lên vi khuẩn Gram âm gây thở hôi II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Nội dung 1: Nghiên cứu in vitro đánh giá ảnh hưởng phức nisin disodium EDTA. .. rộng phổ lẫn hoạt lực kháng khuẩn nisin lên vi khuẩn Gram âm Trên sở đó, đề tài ? ?Đánh giá ảnh hưởng nước súc miệng chứa nisin disodium EDTA lên vi khuẩn Gram âm gây thở hôi? ?? hướng đến mục tiêu nội... tài: Đánh giá ảnh hưởng nước súc miệng chứa nisin disodium EDTA lên vi khuẩn Gram âm gây thở hôi Nội dung nghiên cứu: Xác định công thức tối ưu phối hợp nisin disodium EDTA lên hai chủng vi sinh