Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Khảo sát ảnh hưởng của TDZ đến sự hình thành mô sẹo và phôi vô tính cây cỏ ngọt (Stevia rebaudiana)

TÓM TẮTNghiên cứu "Khảo sát ảnh hưởng của TDZ đến sự hình thành mô sẹo và phôi vôtính từ cây cỏ ngọt Stevia rebaudiana" được tiên hành tại Phòng Sinh học Tích hợpThực vật, Khoa Khoa học

; BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ;

TRUONG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

KHẢO SÁT ANH HUONG CUA TDZ DEN SỰ HÌNH THÀNH

MÔ SEO VÀ PHÔI VÔ TÍNH CAY CO NGOT

(Stevia rebaudiana)

Nganh hoc : CÔNG NGHE SINH HỌCSinh viên thực hiện : CHU TRAN NHẬT LINH

Mã số sinh viên : 19126084Niên khóa : 2019 - 2023

TP Thủ Đức, 3/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO_

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

KHAO SAT ANH HUONG CUA TDZ DEN SỰ HÌNH THÀNH

MO SEO VA PHOI VO TINH TU CAY CO NGOT

( Stevia rebaudiana)

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

PGS.TS NGUYEN VU PHONG CHU TRAN NHAT LINH

KS BANG HUYNH THUY VY

TP Thủ Đức, 3/2024

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc và đầy biết ơn thầy PGS.TS Nguyễn

Vũ Phong đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức chuyên môn, góp ý chỉnh sửa và

bảo ban em trong quá trình thực hiện đề tài Từ tận đáy lòng em xin cảm ơn Thầy vì đã

cung cấp cho em các điều kiện cơ sở vật chất và luôn động viên em, nhờ vậy em mới

có thể hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp

Em cũng xin chân thành cảm ơn các anh chị, em, các bạn và tập thể phòng PIB,đặc biệt là chị Đặng Huỳnh Thúy Vy và bạn Trần Nguyễn Hải Thọ đã giúp đỡ, góp ý,

hỗ trợ, chỉ bảo, hướng dẫn và động viên em trong suốt khoảng thời gian em thực hiện

XÁC NHAN VA CAM DOAN

Tôi tên: Chu Tran Nhật Linh, MSSV: 19126084, lớp: DH19SHB thuộc ngànhCông nghệ Sinh học, Trường Dai Hoc Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan:

Đây là khoá luận tốt nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin

trong nghiên cứu là hoàn toàn trung thực và khách quan Tôi xin hoàn toàn chiu trách

nhiệm trước hội đồng về những cam kết này

Tp Hồ Chi Minh, ngày 29 tháng 03 năm 2024

Người viết cam đoan

il

TÓM TẮT

Nghiên cứu "Khảo sát ảnh hưởng của TDZ đến sự hình thành mô sẹo và phôi vôtính từ cây cỏ ngọt (Stevia rebaudiana)" được tiên hành tại Phòng Sinh học Tích hợpThực vật, Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM từ tháng 7 đếntháng 12 năm 2023 Mục tiêu của dé tài là xác định nồng độ TDZ tối ưu bổ sung vàomôi trường nuôi cấy để cảm ứng hình thành mô sẹo và phôi vô tính từ lá cây cỏ ngọt.Trong thí nghiệm, mảnh lá in vitro của cây cỏ ngọt, được nuôi cấy trên môi trườngMurashige va Skoog (MS) bồ sung chất điều hòa sinh trưởng TDZ ở các nồng độ 0;

0,2; 0,5; 0,7 va 1 mg/L, ở điều kiện tối Sau 4 tuần, các mô sẹo được hình thành và

phát triển mạnh, có trạng thái rắn chắc và tiềm năng sinh phôi, sau đó được chuyênsang môi trường MS bổ sung TDZ với cùng các nồng độ dé cảm ứng phát triển phôi

dưới điều kiện chiếu sáng 16 giờ mỗi ngày Kết quả cho thấy tỉ lệ hình thành mô sẹo

cao nhất, đạt 100%, được ghi nhận ở môi trường MS bô sung TDZ ở nồng độ 0,5 mg/L

và 0,7 mg/L Mô seo phat triển trên môi trường có bổ sung 0,7 mg/L TDZ có màuvàng nhạt, cấu trúc rắn chắc, và có khả năng cảm ứng tạo phôi mạnh mẽ Trong quátrình tạo phôi, tỉ lệ hình thành phôi đạt mức cao nhất là 100% sau 4 tuần nuôi cay trén

môi trường MS có bổ sung TDZ ở nồng độ 0,5 va 0,7 mg/L

Từ khóa: co ngọt, in vitro, MS, mô sẹo, phôi soma, Stevia rebaudiana, TDZ

ili

The study "Investigating the Effect of TDZ on the Formation of Callus and

Somatic Embryos from Stevia rebaudiana" was conducted at the Plant Integrated

Biology Laboratory, Faculty of Biological Sciences, Nong Lam University, HCMC,

from July to December 2023 The aim of the project was to determine the optimal

concentration of TDZ to be added to the culture medium for inducing the formation of

callus and somatic embryos from Stevia rebaudiana leaves In the experiment, Stevia

rebaudiana leaf segments, approximately lcm in size, were cultured on Murashige and

Skoog (MS) medium with the addition of the growth regulator TDZ at concentrations

of 0; 0.2; 0.5; 0.7, and 1 mg/L under dark conditions After 4 weeks, the formed calluses, which were robust and had the potential for embryogenesis, were transferred

to MS medium supplemented with TDZ at the same concentrations to induce embryo

development under 16 hours of light per day The results showed that the highest callus

formation rate, reaching 100%, was observed on MS medium supplemented with 0.5

mg/L and 0.7 mg/L TDZ The callus developed on the medium supplemented with 0.7

mg/L TDZ exhibited a pale yellow color and a firm structure, demonstrating a strong

potential for embryogenesis In the embryogenesis process, the highest embryo

formation rate of 100% was achieved after 4 weeks of cultivation on MS medium

supplemented with 0.5 and 0.7 mg/L TDZ.

Keywords: callus, in vitro, somatic embryo, stevia, Stevia rebaudiana, TDZ.

1V

MỤC LỤC

Trang

(CO, Ei bnndibifogliulevftrioxgiolfofrlerSibdoifinideSisdirigiitiuiinidudde iXÁC NHẬN VA CAM ĐOAN 2S2222222212212152122121121211211111121211211 2121 xe ii

TOM TAT eo ceocecsecscsssessesssessesssssueesessnsesesisssetisesussssesussitsisssnssissssseesessuessessussseeenseneeees iii

ABSTRACT oo ceccssssssesssessesssessesssssssssvesisssesssessessssssesssssitssessuesiessessiessessnseaessesssessesseeesees iv MỤC LỤC 22252 222221221211271221121171121121121121111121111211211112111212 211 ca MDANH SÁCH CÁC CHU VIET TẮTT -¿©2¿22222+2E++2E2E+2EE2E++EEzz+zrxrrer viiDANH SÁCH CAC BẰNG „2 0n 0 HH n2 1001 04 140.2/20003406016005000007/66 viiiDANH SÁCH CÁC HÌNH -2- 2¿22222122E22E1221122127122112211211221211211 22121 xe ix

0:10/9))I€008(912710057— à.HHẬH, ÔỎ |1.1 Đặt vấn đề + c- S221 1 11212112121211112111111111121111111111 2111112111211 2112 1

1.2 Mục tiêu của đề tài - 5-52 22221 2122122122122121121212121211111211211 xe 21.3 (0820052401906 00175 2CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIỆU 2-52 ©22S2+E22E2EE2E2£E2EE2E2E2E22E2ZEczxce, 3

3 1, Giới thiệu xẻ trầy gi n0 a en 3

ZA i1 Slee oul oy: eee ee ee ee ee eS.

2.1.2 Ngudn g6c CO NOt eccccccccccscssessessessesssesessesssseseesessestsessessessessessessessessesenseeeeeeees 421.3, Bide GiGra With tHAL neonon.encconevenecossnceneonnnrnaracenenscanenenneonencanentaneneeensnanncananenseanar 52.1.3.1 Thân cành - 2 s2+22+E122E12E1221121127112112111111211211211112111121111 21 e0 5

TT | Te 5

5 lộ 35: Lễ] (or: ee 5 2.1.3.4 Qua a0 75 6

LE ——————————— ỶỸ.—= 6

2.1.4 Thành phan hóa học của cỏ ngot c.cccccceccessesssessesssessesssesseessssesseessessessesseeseessees 621,5, Hoat tinh: cllascay GỖ 180 ksssssecseoiiesssgos)i8485601463336105HfLE300028300039:3080dẦ0010g00,2100800u20H8E 7 Dede WIG SOG kunsvssndtrsviottdgti00G6010314G0058880:9E581SDGSIRHASGE.GIGS0S0ER SiU0tSGNSSE'DBHBISISSEENGSSISSESHGSIAISSHH60000/0882001-À 9 2.2.1 Su hinh 0ì ì)6i 0 9

2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến mô sẹo 2-2 22 ©22+2E+2EE++EE+2EE++EE+z2Ezzrxrze 9

2.2.2.1 Chất điều hòa sinh trưởng 2: 2-©222222222EE22E22EE22E2E1221222122122222xee 92.2.2.2 TuOi Va Mau CY 4‹4 9DDD Cle can Ãz`zÍ 920c PNG WSO 1908 es eetie rece ireeecer str easeeinestrenctende see winerameetea unsremamese renee eee sete teeaceite aes 10 Nat ISTE EA ersesas nn ete tS SE SS I 10

23.2 GIAN Hình thành phối SOI ercescco:scssensescasnenponacenacascenenneanranemmtseemnenaseeean 10

2.3.3 Các giai đoạn phát triển của phôi soma 2 ¿©22222222S2Ezzzzzzzxzz- 10

2.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh phôi soma -2- 22 2222222222222 10

2.3.5 Ứng dung của phôi soma - 2-52-2222 S2222222223213213213211211 2121.116 10

2.3.6 Nghiên cứu về nhân giống cây cỏ ngọỌt -2- 222222222222z+22x2zxzzxesree 11

CHUONG 3 VAT LIEU VA PHƯƠNG PHAP u.0 2 ::ssssssseesssesseseesesseessnneeseseeseees 123.1 Thời gian va địa điểm nghiên Ctr cccccccccsccsessessessessessessessessessessessessessesseeseees 123,2: Vat HỆU NGHI6H CW lessens narsse swan eneeeeer eaten en 12

3.2.2 MOi trudng KhOang 1177 12

3.3 Phuong phap nghién 000) 0157 23.3.1 Cam ứng tạo mô seo từ mẫu lá in Vitro với TÌDZ 5-5222 +s+zzz£z£z£zzzczcxz 123.3.2 Cam ứng tạo phối võ tinh từ M0 $60 18 sascssseeesiiadiE)515343658935561835655680888 133.4 Phân tích số liệu -2+-©+++evrxrtErkttrrrkrtrrrkrtrrkrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrkrrrrked 13CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN -22222+222E22E22222222222222xcze2 144.1 Ảnh hưởng của nồng độ TDZ cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu lá in vitro cây cỏ ngọt 144.2 Ảnh hưởng của TDZ đến sự tạo phôi vô tính từ mô sẹo cây cỏ ngọt - 17

CHƯƠNG 5 KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ -2222ccc2cccccrrrrrrreee 21

DANH SÁCH CÁC CHU VIET TAT

DANH SÁCH CÁC BANG

Trang

Bang 2.1 Thành phần % các chat trong cây cỏ ngọt -222222z22zz2zz22zze: 6Bảng 2.2 Các steviol glycosid đã được phan lập từ lá cỏ ngọt Ÿ

Bảng 4.1 Tỉ lệ mẫu tạo sẹo trên TIDZ +: ¿5225222 2E2S2SE2E2EE2E2EEEE2EEEEzxrrrrrrrrrr 14

Bang 4.2 Ảnh hưởng của TDZ đến hình thái mô sẹo -2 2-©5225225522 15

Blue 4⁄3 KHI lượng: sạo THÍ «««eeesasceieookienonnaodegiksinndoejegtuuiouftirtdgkdgidhontretgininEtul2/e: l6

Bảng 4.4 Tỉ lệ mau mô sẹo tạo phôi sau 28 ngày nuôi cấy -5- 18

Vill

Hình thái mẫu quan sát dưới kính hién vi soi nổi sau 10 ngày nuôi cấy l6

Hình thái mau quan sát dưới kính hiển vi soi nổi sau 14 ngày nuôi cấy L7Hình thái mẫu quan sát đưới kính hién vi soi nổi sau 21 ngày nuôi cấy l7Hình thái mẫu quan sát đưới kính hién vi soi nổi sau 28 ngày nuôi cấy l7Hình thái phôi hình cầu ¿2-22 2222E2E£2E22E22E2E22E22E22E2222222222e2 19Hinh:thấi Khác Ga THÍ ssncsusssg- ae een aS 20Cụm chồi phát sinh từ phôi vô tính -222222+2z+22+2E2Ezz22zzz22z+2 20

1X

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Đường là một loại gia vị thiết yếu trong cuộc sống hằng ngày của con người.Nhưng ngày này con người đang ngày càng sử dụng quá nhiều đường so với mức tiêu

thụ cần thiết dẫn đến nhiều ảnh hưởng đến sức khỏe như: tiểu đường, béo phì, tăng

huyết áp Đồng thời, do một số vấn đề về bệnh lí, hoặc do có căn bệnh bam sinh, nên

người ta hướng đến việc sử dụng các nguồn đường thay thế Đặc biệt tỉ lệ người bệnh

đang ngày một nhiều và trẻ hóa hơn, lượng sử dụng cũng ngày càng nhiều và gần như

tiểu đường đang trở thành căn bệnh mà dường như trong mỗi gia đình đều có người thânmac phải, vì vậy ma việc một ra được nguồn đường an toàn, hiệu quả, đáp ứng được nhu

cầu của thị trường ngày nay và tương lai trở nên càng cấp thiết và thiết thực hơn

Trên thị trường hiện nay có rất nhiều sản phẩm hóa học tạo vị ngọt thay thếđường, những chất này có vị ngọt hơn đường cả trăm lần và lại rất ít calo: saccharin,

Natri cyclamate, Sucralose, Acesulfame kali và phổ biến nhất là Aspartam các chất này

thường có trong các thức ăn và đồ uống dành cho người ăn kiêng Tuy nhiên chúng lại

là chất không tốt cho sức khỏe khi dùng trong thời gian dài Đã có nghiên cứu cho thaySucralose là chất có thé gây ung thư, và có nhiều nghiên cứu chứng minh rang tiêu thụ

nhiều Sucralose sẽ gây một số bệnh về đường ruột và tim mach Aspartame là chất có

thể gây ung thư và được khuyến nghị nên sử dụng có chừng mực và cân nhắc vì nógây dị ứng và mãn cảm với một số người, ngoài ra Aspartame còn gây tác động xấuđến não và thần kinh Chính vì những lẽ đó mà các nhà khoa học muốn tìm kiếm một

sản phẩm được ly trích từ thực vật dé thay thé các loại đường hóa học và sử dụng an

toàn và tốt hơn đang là vấn đề được quan tâm

Đề đáp ứng được những kì vọng đó thì một trong những loài thực vật lý tưởng có

thể đáp ứng đó là cây cỏ ngọt Dựa trên một số chất ngọt tự nhiên có trong cỏ ngọt:

stevioside và rebaudiana (từ A đến F), steviolmonoside, rubusoside, dulcoside A vasteviolbioside cùng một số loại đường khác Trong đó, stevioside và rebaudioside A làthành phần được tìm thấy nhiều và là thành phần chính tạo ngọt của stevia Hầu hếtđường có trong cỏ ngọt là rất tốt và an toàn, chúng có độ ngọt cao hơn đường sucrosekhoảng 250 - 300 lần, nhiều nghiên cứ đã chứng minh rang không chỉ ngọt mà chúng

còn rất an toán và tốt, chúng có tác dụng chống tăng huyết áp, chống béo phì, chống tiêu

1

đường, chống oxy hóa, chống ung thư, chống viêm, kháng khuẩn và cải thiện chức năngthận Ngoài ra, các dẫn xuất của chúng còn đươc nghiên cứu trong nhiễu ứng dụng thực

phẩm, chế pham và y hoc; ngừa sâu răng, điều hòa miễn dịch, Ở Việt Nam, cỏ ngọt

được coi là một loài thảo dược, thường xuất hiện trong các loài thảo mộc và thuốc đông

y Với các tác dụng to lớn và tích cực như thế, nhưng hiện nay trồng cỏ ngọt dang gặpmột số van đề bởi tuy cỏ ngọt là loài thân thảo dé trồng nhưng dé đáp ứng được nhu cầu

thì khá khó Cỏ ngọt có thể được trồng bằng hạt nhưng tỉ lệ nảy mầm khá thấp, lại phụ

thuộc quá nhiều vào thời tiết, khí hậu và kỹ thuật cũng là yếu tố đáng quan tâm khôngchỉ vậy cây nảy mầm thường dễ bệnh, èo uột, chậm phát triển Hiện nay chủ yếu cỏ ngọt

được trồng chủ yếu bằng phương pháp giâm cành, mặc dù có thé cho số lượng lớn, thời

gian ngắn nhưng cây cũng không được tốt, cây dễ bị bệnh chết do thối rễ và lá, cây haynhiễm bệnh, thường cây không đều, không đồng nhất, cây cũng khá yếu và dễ chết, dễ

bị thoái hóa năng suất và chất lượng bị giảm đi nhanh chóng, đáng kể, thường khôngđược giâm nhiều đời Chính vì vậy, nuôi cấy mô là phương pháp tốt nhất khi cho được

cây sạch bệnh, đảm bảo chất lượng và số lượng, cây đều đồng, khỏe Phương pháp nuôi

cấy phôi vô tính là một phương pháp kĩ thuật trong nuôi cấy mô nhằm nhân giống

phôi hoặc cây con từ một nhóm tế bào sinh dưỡng, phương pháp cho hệ số nhân giống

cao khi cho phép nuôi cấy số lượng lớn phôi soma, cây tái sinh cho cả chdi và rễ, đặcbiệt thường được ứng dụng đề làm vật liệu ban đầu cho các thí nghiệm chuyên gen

Dé tài “Khảo sát ảnh hưởng của TDZ đến sự hình thành mô sẹo và phôi vô tính

từ cây cỏ ngọt (Stevia rebaudiana)” được thực hiện nhằm tạo phôi vô tính cây cỏ ngọtphục vụ cho việc nhân giống cũng như tạo tiền đề cho các nghiên cứu ứng dụng sau này.1.2 Mục tiêu của đề tài

Xác định nồng độ TDZ bổ sung vào môi trường nuôi cấy thích hợp tạo mô sẹo

và phôi vô tinh từ mẫu lá cây Cỏ ngọt (Stevia rebaudiana)

1.3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ TDZ đến tạo mô sẹo từ mẫu lá

in vitro cay cỏ ngọt.

Nội dung 2: Khao sat ảnh hưởng TDZ đến sự tạo phôi vô tính từ mô sẹo cây cỏngọt.

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TAI LIEU

2.1 Giới thiệu về cây cỏ ngọt

2.1.1 Phân loại

Cỏ ngọt là thực vật có chứa steviol — một hoạt chất có thể thay thế đường ăn vừa

lạnh manh, an toàn và rất tốt cho sức khỏe Nó không chứa calo nhưng vị ngọt gấp 250 —

300 lần so với đường ăn tinh luyện Cỏ ngọt có tên khoa học là Stevia rebaudiana là một

loài thực vật có hoa thuộc họ Asteraceae.

Giới (regnum): Plantae

Ngành (Division): Magnoliophyta Lớp (Class): Magnoliopsida Phân lớp (Subclass): Asteridae

Bộ (Ordo): Asterales

Ho (Familia): Asteraceae / Compositea

Chi (Genus): Stevia

Loai (Species): Stevia rebaudiana Tên gọi khác: Cúc ngọt, cúc mật, co duong,

Co ngọt được đặt theo tên của người bac sĩ, nhà thực vật người Tây Ban Nha

Petrus Jacobus Stevus (1500 -1556) một giáo sư thực vat tại Dai học Valencia Năm

1899, Moises Santiago Bertoni, nhà thực vật học người Thuy Si khi nghiên cứu ở đã

mô tả kỹ lưỡng Cây cỏ ngọt Phải đến năm 1931, hai nhà hóa học Pháp Reseback vàDieterich đã chiết tách được các glycoside có vị ngọt từ lá của cây này Chúng đượcgọi là Steviol và cấu trúc chính xác được công bố vào năm 1955 (Abeer ctv, 2019;Chesterton và Yang, 2016)

Một số loài cỏ ngọt tiêu biểu:

Stevia eupatoria (Willd, 1804)

Stevia ovata (Willd, 1809) Stevia plummerae (A.Gray, 1882) Stevia rebaudiana (Bertoni, 1899) Stevia salicifolia, Stevia serrata (Cav, 1797)

2.1.2 Nguồn gốc cỏ ngọt

Cỏ ngọt đã được con người biết đến từ xưa Người da đỏ Guarani thường gọi là

“Ka-a He-e”, có nghĩa là cỏ ngọt, nhưng không dùng dé làm ngọt ma dé thưởng thức

đồ uống CÓ VỊ đẳng như mate Và từ thời cô đại, An Độ đã sử dụng cỏ ngọt làm dược

liệu trong hệ thống y học cô truyền Ayurvedic Cỏ ngọt được biết ở Tây Ban Nha vàothé ki thứ 16 Tuy nhiên, những người Châu Âu chỉ biết đến loại cây này vào cuối thé

kỷ 19, khi được nhà thực vật hoc Moises Santiago Bertomi giới thiệu và quảng bá.

Bertino đã bắt đầu nghiên cứu vào 1884, sau khi tìm thấy cỏ ngọt tại Sông Paraná ở

Paraguay ở vùng biên giới giáp với Brazi, Argentina và công bố khoa học lần đầu tiên

vào năm 1899 với tên gọi là Eupatorium rebadinum, năm 1905 cỏ ngọt được đôi tên

thành Stevia rebaudiana Vào những năm đầu thé ky thứ 20, tại nơi được coi là nguồngốc của cỏ ngọt — Paraguay, người ta đã biết sử dụng cỏ ngọt như một loại nước giải

khát, làm dịu ngọt các loại thức ăn và cũng dùng dé điều tri một số bệnh béo phì, tim

mạch, huyết áp cao Nhưng mãi đến năm 1920, cỏ ngọt mới bắt đầu được trồng với sốlượng lón tại cá đồn điền tại Paraguay, Brazil va được thương mai bởi bai viết củaBertoni, khi ông viết rằng một vào lá cỏ ngọt đủ để làm ngọt một tách trà lớn — năm

1901 Năm 1931, nhà hóa học người Pháp Briedel và Lavielle đã phân lập được

glycoside — chất mang lại vị ngọt trong cỏ ngọt, hợp chất này được đặt tên stevioside,

từ đây những nghiên cứu về cỏ ngọt bắt đầu xuất hiện và cỏ ngọt được biết đến nhiềuhơn Lần đầu tiên cỏ ngọt được giới thiệu và sử dụng thương mại như một chất làmngọt ở Nhật Bản vào những năm 1970 cùng với các nghiên cứu đã bắt đầu đánh giátiềm năng mang lại lợi ích của nó đối với sức khỏe con người, đặc biệt vào những năm

1980 sau khi những người Mỹ bị ám ảnh bởi chế độ đã chú ý đến “chất làm ngọt tựnhiên cổ xưa” này Ké từ đó đến nay, các nước trên thế giới (đặc biệt Nhật Bản) đã tích

cực sử dụng chất làm ngọt này trong nhiều loại thực phẩm và trở thành thành phần cótrong hầu hết các thực phẩm ăn kiêng Năm 2013, 47% người Mỹ có sản phẩm chứa

thành phần từ cỏ ngọt ở trong nhà, tại năm đó Công ty Coca-Cola bắt đầu sản xuất đồuống có chứa Stevia thay vì đường và lượng calo ít hơn 30% Hiện nay, ngoài những

nơi tiêu thụ và trồng nhiều cỏ ngọt như Trung Quốc, Nhật Bản, Hoa Kỳ, Paraguay, cỏ

ngọt còn trồng và tiêu thụ ở hầu hết các nước trên thế giới bao gồm cả Ukraine,

Colombia, Án Độ và Việt Nam (Abeer và ctv, 2019; Chesterton va Yang, 2016)

2.1.3 Đặc điểm hình thái

Co ngọt là cây thân thảo nhỏ, sống lâu năm, cao 0,5 — 0,6, có khi đến 1,0m.Thân cứng, mọc thang, có rãnh dọc, cây có tuôi đời từ 6 tháng tuôi thường có phần gốc

hóa gỗ Cành phân tại gốc, lá và cành non đều có long mịn bao phủ Cây ưa 4m va ưa

sáng, có thể chịu bóng, ưa bóng vào thời kì cây con Ở Việt nam, cỏ ngọt phát triển tốt

vào vụ xuân hé, mùa hoa khoảng tháng 5 — 9, mùa đông có hiện tượng rụng lá va lui.

Nhiệt độ từ 25 — 30°C thích hợp để cỏ ngọt sinh trưởng và phát triển (Võ Thị Thừa,

2010; Đỗ Huy Bích và ctv, 2004)

2.1.3.1 Thân cành

Dạng thân bụi, chiều cao thu hoạch là 0,5 — 0,6 m, thâm canh tốt có thé đạt0,8 —1,2 m, phân cảnh cấp I nhiều, thường xuất hiện từ các đốt lá cách mặt đất 10 cm,khi ra hoa mới phân cành cấp II, III Thân cành tròn có nhiều long, đường kính thân to

nhất 0,5 — 0,8em, cỏ ngọt thường có 25 — 30 cành, tổng số cành trên cây có thể đạt 140

cành, cành thân non màu xanh, thân già có màu tím nâu có khả năng ra rễ nhất định, có

hệ thân mầm phát triển mạnh (Võ Thị Thừa, 2010; Đỗ Huy Bích và ctv, 2004)

2.1.3.2 Lá

Moc đối xứng từng cặp hình chữ thập, mép lá thường có từ 12 — 16 răng cưa

nhọn ở phần nửa phía đầu lá, hai mặt có lông trắng mịn, lá hình trứng ngược, mác hoặcbầu dục, gốc thuôn, đầu tù hoặc hơi nhọn, dai 5 — 7 cm, rộng 1,0 — 2,0 cm, mặt lá hiệnthị rõ 3 gân song song bắt nguồn từ cuống lá Cây con gieo từ hạt có 2 lá mam tròn, tớicặp lá thứ 4 mới có răng cưa ở mép lá, cuống lá ngắn (Võ Thị Thừa, 2010; Đỗ HuyBích và ctv, 2004).

2.1.3.3 Hoa

Cum hoa mọc thành bông đơn hoặc phân nhánh tự nhóm dày đặc trên dé hoa,trong đó có 4 — 7 hoa đơn lưỡng tính, có mùi thơm nhẹ Mỗi hoa đơn hình ống có cautrúc gồm một dé hoa với 5 đài màu xanh, 5 cánh mau trắng khoảng 0,5 cm, nhị 4 — 5

dính trên trang có mau vàng sang Bau ha 1 6, 1 noãn, vòi nhụy mãnh chẻ đôi, lòi hắn

ra ngoài, các nhánh cao hơn bao phan do đó mà khả năng tự thụ phan thấp hoặc không

có (Võ Thị Thừa, 2010; Đỗ Huy Bích và ctv, 2004)

2.1.3.4 Quả và hạt

Quả và hạt nhỏ thuộc loại quả bế, khi chin màu nâu thẫm, 5 cạnh dai từ 2 — 2,5

mm Hạt có 2 vỏ hat, có phôi, nhưng nội nhũ trần do vậy tủ lệ nảy mầm thấp (Võ Thị

Thừa, 2010; Đỗ Huy Bích và ctv, 2004)

2.1.3.5 Rễ

Là cây có rễ lâu năm có thân rễ khỏe, mọc nông từ 0 — 30 em tùy thuộc vào độphì nhiêu, tơi xốp và mực nước ngầm của đất, ít phân nhánh Rễ cây gieo từ hạt ít phát

triển hơn rễ từ cành giậm Hệ rễ chum lan rộng ở đường kính 40 cm và ở độ sâu từ 20

— 30 cm, hệ rễ phát triển tốt trong điều kiện đất tơi xốp, đủ âm (Võ Thị Thừa, 2010; ĐỗHuy Bích ctv, 2004).

2.1.4 Thành phần hóa học của cỏ ngọt

Các loài cây cỏ ngọt đã được nghiên cứu bởi các nhà hóa sinh và công nghệ

sinh học về các thành phần hóa học của cây và đã chỉ ra có khoảng 110 loài, trong đó

có 18 loài có tính năng tốt Steviosid là một thành phần chính trong cây cỏ ngọt vàSteviosid chứa nhiều nhất trong lá của cây cỏ ngọt Cùng với Steviosid, một số hợpchất khác như: Steviobiosid, Rebaudiosid A, B, C, D, E, F va Dulcosid A cũng đã được

tìm thấy trong lá của cỏ ngọt

Bảng 2.1 Thành phần % các chất trong cây cỏ ngọt

Chât Thành phân (%)

Protein 6,2 Lipid 5,6

Carbonhydrat tông số 52,8

Steviosid 15Các chat hòa tan trong nước 42(Nguyễn Duy Công, 2009)

Ngoài ra, trong cỏ ngọt còn có các chất khác với khỏi lượng rất nhỏ:

+3 Sterol: Stigmasterol, Sitosterol, Campesterol

+ 8 Flavonoid: Rutin

+2 chat dé bay hoi: Caryophyllen, Spathuienol

Một số kim loại như theo thứ tự từ nhiều đến it: Ca, Mg, Fe, Mn, Sr, Cu, Cr, Cd

Thành phần hóa học của cỏ ngọt rất phức tạp, nhóm hợp chất đáng chú ý trong cây cỏngọt là các steviol glycosid - chiếm 10 — 20% khối lượng lá cỏ ngọt khô.

O-R2

CHạ COO-R1

%

CH2

Hình 2.1 Cấu trúc steviol glycosid

Bang 2.2 Các steviol glycosid đã được phân lập từ lá cỏ ngọt

Hợp chất Chuỗi R1 Chuỗi R2 Paget Em trấn

Sucrose Steviosid

(C38H60018) B-Gle | B-Gle- B -Gle (21) 300

(C44H170022.31H20) |B -Gle B -Gle 391) Lưng

Eubaudiuddn | PANS P= |§-Bisÿ-Giuỗ-#) 250 —450

2.1.5 Hoạt tính của cây cỏ ngọt

Các quá trình kiểm tra độc tính của Steviosid đều hầu hết cho kết quả làSteviosid rất an toàn và tốt cho sức khỏe, không có độc trong quá trình sử dụng TheoCurry và ctv, 2008 sử dụng Steviol với liều lượng cao ở chuột cho thấy trọng lượng

chuột giảm di đáng kể, nhưng không có bằng chứng mạnh mẽ về độc tính Hagiwara

và ctv, 1984 nghiên cứu tác dụng gây ưng thư của Steviosid trên bang quang thấy rằng

không có tiền ung thư hoặc ung thư

Dịch chiết cũng như các chất tách được từ cỏ ngọt có tác dụng rất lớn trongđiều hòa quá trình chuyển hóa glucose va insulin trong cơ thể Theo Chen va ctv, 2005

với 0,5 mg/kg Steviosid sẽ làm giảm lượng đường glucose trong máu đồng thời hạnchế sự kháng insulin ở chuột bị tiêu đường Tác gia Ferreira cũng chỉ ra rằng dich

nước cỏ ngọt (20 mg/kg/ngày) cũng có tác dụng làm ức chế quá trình chuyên hóaglucose trong gan trên chuột thí nghiệm (Arayjo va ctv, 1986) Trước đó vào năm

1986, Curi đã thử nghiệm tác dụng của dịch cỏ ngọt trên một nhóm người tình nguyện.

Kết quả cho thấy với dịch chiết 5g lá dùng liên tục trong 2 ngày, hàm lượng đường

glucose trong máu giảm rõ rệt (Curi và ctv, 1986) Các nghiên cứu này mở ra khả nang

ứng dụng cỏ ngọt trong việc chữa trị bệnh tiểu đường và các bệnh liên quan đến việcchuyển hóa glucose Ngoài ra, cùng với tác dụng giảm đường huyết Steviosid còn có

tác dụng hạ huyết áp trên chuột bị tiểu đường (Xiao va ctv, 2003).

Hop chat Steviosid còn được sử dung trong tri liệu chữa tiêu chảy Khởi nguồncủa việc này lá từ kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và kháng virus của dịchchiết nóng cây cỏ ngọt cho thấy tác dụng mạnh lên chủng E coli — nguyên nhân chủyếu gây tiêu chảy Các nghiên cứu tiếp đó khang định tác dụng và khả nang ứng dụng

rất cao của cỏ ngọt cũng như nhóm chất Steviosid trong việc chữa trị tiêu chảy

(Takahashi và ctv, 2001).

Các ứng dụng của cỏ ngọt trong y học hiện nay:

Hỗ trợ điều trị đau dạ dày: Trong cỏ ngọt có khà nhiều hoạt chất giúp giảm cáccơn đau và chứng bệnh ở đường tiêu hóa, đặc biệt là rỗi loạn dạ dày Một sỐ nghiên

cứu cũng cho thấy cỏ ngọt rất tốt cho men tiêu hóa và hệ vi sinh đường ruột

Chăm sóc da: Cỏ ngọt được xem là một nguyên liệu tự nhiên chăm sóc da khá

tốt với các tác dụng như giảm tiết bã nhờn, làm giảm các nếp nhăn, giúp da trở nên

trắng sang hơn, chống viêm da và ngăn ngừa mụn trứng cá

Giải nhiệt, lợi tiểu: Có thé kết hợp cỏ ngọt với các loài nhân tran, cam thảo, tràartiso uống mỗi ngày, không chỉ giúp thanh nhiệt, giải độc mà còn có dụng lợi tiêu hiệuquả Đây là loại thức uống khá tốt cho những bệnh nhân tiểu đường Tuy nhiên, vớinhững người mang thái, cao huyết áp hay có bệnh về tim mạch thì không nên cho cam

thảo.

Trị tiểu đường, béo phì, cao huyết áp: Đây là lí do đầu tiên cỏ ngọt được mọi

người chú ý, nghiên cứu và kỳ vọng Cỏ ngọt rất tốt trong việc trị tiêu đường, béo phì và

§

cao huyết áp, cùng với đó là khả năng phòng ngừa, hỗ trợ các bệnh liên quan đến timmạch.

Ngoài ra cỏ ngọt còn có các tác dụng khác: kháng khuẩn, ngừa sâu răng, hỗ trợthần kinh, ngừa ung thư, chống lão hóa (Peteliuk va ctv, 2021; Roberto và ctv,2012)

2.2 Mô sẹo

2.2.1 Sự hình thành mô sẹo

Mô sẹo là một mô nhu mô chưa biệt hóa, hình thành từ sự phân chia không

kiểm soát của tế bào thực vật Kỹ thuật nuôi cay mô seo dựa trên việc tạo ra các khối

tế bào từ cơ quan thực vật, nuôi đưỡng chúng trong môi trường thích hợp đề phát triển

thành các cụm tế bào chưa biệt hóa, có khả năng phân chia mạnh mẽ và có thể biệt hóa

thành rễ, chi, và phôi tạo thành cây hoàn chỉnh (Bhatia và ctv, 2015; Bùi Trang Việt,

2000; Vũ Văn Vụ và ctv, 2012).

Quá trình hình thành mô sẹo bao gồm ba giai đoạn chính: cảm ứng mô sẹo,

phân chia tế bào, và biệt hóa Giai đoạn cảm ứng liên quan đến việc kích thích tế bàochuẩn bị phân chia, phụ thuộc vào tình trạng sinh lý của mô và điều kiện nuôi cay(Yeoman & Aitchison, 1973) Giai đoạn phân chia tế bào dan đến sự hình thành khối

mô sẹo từ sự tăng sinh tế bào không kiểm soát Trong giai đoạn biệt hóa, mô sẹo phát

triển thành cấu trúc có khả năng tạo ra các cơ quan mới của thực vật

2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến mô sẹo

2.2.2.1 Chất điều hòa sinh trưởng

Chất điều hòa sinh trưởng là yêu tố cần thiết cho việc nuôi cấy mô sẹo, Với việc

bổ sung các hormone như cytokinin và auxin tuỳ theo mẫu và mục dich của việc nuôi

cay (Bhatia va ctv, 2015; Ikeuchi, Sugimoto, và Iwase, 2013)

2.2.2.2 Tuôi và mẫu cấy

Tuổi mẫu và lựa chọn mẫu cấy ảnh hưởng đến khả năng hình thành và pháttriển của mô sẹo Mẫu cấy non có khả năng tạo mô sẹo tốt hơn từ các cơ quan non củacây, phát triển và biệt hóa mạnh mẽ hơn so với mẫu già, với của cây (Bandopadhyay

và ctv, 1999; Chandimali va ctv, 2023; Smith, 2012).

2.2.2.3 Các yếu tố khác

Ánh sáng, môi trường khoáng cơ bản, nhiệt độ, và điều kiện vô trùng là nhữngyếu tố quan trọng khác trong sự hình thành mô sẹo Môi trường nuôi cấy thường sử

dụng là MS và BS, tùy thuộc vào loại thực vật và mục dich của việc nuôi cấy (Campos

và ctv, 2017; Murashige & Tucker, 1969).

2.3 Phôi soma

2.3.1 Khai niém

Theo Dương Tan Nhựt va ctv (2008),phôi soma được định nghĩa là quá trìnhhình thành cấu trúc lưỡng cực giống phôi hữu tính từ một tế bào sinh dưỡng mà không

qua giao tử, không kết nối mao mạch với tế bào gốc Quá trình này diễn ra thông qua

các giai đoạn tương tự như phát triển của phôi hữu tính, qua đó tế bào soma biệt hóathành phôi với cực rễ và cực chéi sau khi tiếp xúc với kích thích thích hợp, thường làhormone thực vật.

2.3.2 Cảm ứng hình thành phôi soma

Phôi soma có thể hình thành qua hai con đường: trực tiếp và gián tiếp Con

đường gián tiếp, qua mô sẹo hoặc khối tiền phôi, thường được ưu tiên do tỉ lệ thành

công cao Con đường trực tiếp, tạo phôi từ tế bào mà không qua trung gian, ít đượcứng dụng hơn.

2.3.3 Các giai đoạn phát triển của phôi soma

Giai đoạn phát triển của phôi soma bao gồm cảm ứng và trưởng thành, kiểm

soát bởi thành phan môi trường nuôi cấy Giai đoạn cảm ứng bat đầu với việc bổ sungauxin, tiếp theo là giai đoạn trưởng thành với sự biệt hóa không theo khuôn mẫu cố

định nhưng sau đó diễn ra tương tự như phôi hợp tử

2.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh phôi soma

Quá trình này chiu sự kiểm soát của các chất điều hòa sinh trưởng, đặc biệt là

auxin Tuy nhiên, yếu tố quan trọng nhất là kiểu gen của mau vật, vì không phải loài

thực vật nào cũng có kha năng phát sinh phôi soma Các yếu tố khác như tuổi mau,nguồn mẫu, nhiệt độ, và ánh sáng cũng ảnh hưởng đến quá trình này

2.3.5 Ứng dụng của phôi soma

Phôi soma hiện là phương pháp nhân giống vô tính hiệu quả, đặc biệt với cây

thân gỗ, cây ăn quả, và cây lâu năm Ngoài việc nhân giống, phôi soma còn được ứng

dụng trong chuyền gen, công nghệ tế bào trần, và phát triển hạt nhân tạo, mở ra triển

vọng lớn trong tương lai của nông nghiệp và công nghệ sinh học.

10

2.3.6 Nghiên cứu về nhân giống cây cỏ ngọt

Từ khi Moises Bertino bắt đầu nghiên cứu và giới thiệu cỏ ngọt, đã có rất nhiềucông trình nghiên cứu và ứng dụng liên quan đến loại cây này được thực hiện Nồi bật

trong số đó, Lưu Thị Huyền Trang và ctv (2020) đã phát triển thành công phương pháp

xác định đồng thời 7 loại steviol glycoside sử dụng sắc ký lỏng hiệu suất cao, va ápdụng quy trình phân tích tối ưu dé định lượng steviol glycoside trong các mẫu cỏ ngọt

và nguyên liệu đường từ cỏ ngọt Trước đó, Nguyễn Duy Công (2019) và Nguyễn KimĐông (2015) cũng đã thực hiện các nghiên cứu quan trọng về ứng dụng của cỏ ngọt

Trong năm 2013, Lê Thị Như Quỳnh đã nghiên cứu xây dựng quy trình nhân

giống in vitro cây cỏ ngọt (Stevia rebaudiana), đạt được kết quả ấn tượng với môitrường nuôi cấy tối ưu cho sự phát triển của chồi và rễ Cùng năm đó, Nguyễn Thi

Nhật Hạ cũng tiến hành nghiên cứu tạo mô seo từ lá co ngọt và khảo sát sự phát triển

chồi từ mô seo, mang lại những hiểu biết mới về quá trình nhân giống cây cỏ ngọt

Ngoài ra, các nghiên cứu về phôi vô tính (phôi soma) và sự phát sinh phôi tính

cỏ ngọt cũng đã được thực hiện rộng rãi và cho thấy kết quả kha quan Đặc biệt, nam

2009, Banerjee và Sarkar đã thành công trong việc nhân giống cỏ ngọt từ phôi soma,

và năm 2018, Keshvari và ctv cũng đã tạo phôi soma gián tiếp từ mô sẹo Điều này

mở ra những hướng mới cho nghiên cứu và ứng dụng của cỏ ngọt Tuy nhiên, tại Việt Nam, hiện van chưa có báo cáo nghiên cứu nào về phôi vô tính của cây cỏ ngọt.

11