Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: Ban giám hiệu trường Dai học Nông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh, Ban Lãnhđạo Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường đã tạo điều kiện về cơ sở
Trang 1; BỘ GIAO DỤC VÀ ĐÀO TAOTRUONG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MÌNH
KHOA KHOA HỌC SINH HỌC
KHAO SÁT HIỆU QUA CUA MOT SO LOẠI DAM TỰ NHIÊN DEN SU PHAT TRIEN VÀ KHẢ NANG TÍCH LUY HAM LƯỢNG
ADENOSINE CUA NAM Isaria japonica NUOI CAY
TRONG MOI TRUONG LONG TINH
Nganh hoc : CONG NGHE SINH HOCSinh viên thực hiện : VÕ THÀNH NGỌC PHÚC
Mã số sinh viên : 19126134
Khóa : 2019 — 2023
TP Thủ Đức, 03/2024
Trang 2; BỘ GIAODUCVADAOTAOTRUONG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MÌNH
KHOA KHOA HOC SINH HOC
KHÓA LUẬN TOT NGHIỆP
KHẢO SÁT HIỆU QUA CUA MỘT SO LOẠI DAM TỰ NHIÊN DEN SỰ PHÁT TRIEN VÀ KHẢ NĂNG TÍCH LŨY HAM LƯỢNG
ADENOSINE CUA NAM Isaria japonica NUÔI CAY
TRONG MOI TRUONG LONG TINH
Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện
TS LÊ THỊ DIỆU TRANG VÕ THÀNH NGỌC PHÚC
TP Thu Đức, 03/2024
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp ngành Công nghệ
Sinh học, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu từ phía thầy cô, gia đình và bạn
bè Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
Ban giám hiệu trường Dai học Nông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh, Ban Lãnhđạo Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường đã tạo điều kiện về cơ sở vậtchất, trang thiết bị tạo điều kiện thuận lợi cho em được thực hiện khóa luận tốt nghiệptrong suốt thời gian làm đề tài tốt nghiệp
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Lê Thị Diệu Trang đã đưa ra địnhhướng, tận tình hướng dẫn, hỗ trợ kiến thức chuyên môn, tạo điều kiện giúp em hoàn
thành khóa luận tốt nghiệp
Em xin cảm ơn anh Lê Hữu Minh Sang, các bạn phòng Nghiên cứu và Phát triểnCordyceps, chị Nguyễn Thị Vân Anh và anh Lê Nguyễn Thanh Đông, các bạn phòngPhân tích Hóa Sinh luôn bên cạnh giúp đỡ, động viên em trong suốt thời gian thực hiện
đề tài tốt nghiệp
Con xin cảm gia đình luôn ủng hộ, động viên và tạo điều kiện tốt nhất để con
được học tập và rèn luyện.
Trong quá trình thực hiện đề tài còn nhiều hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm
mà bản thân chưa nhìn nhận được, em rất mong nhận được thêm nhiều ý kiến đóng gópcủa quý thầy cô và các bạn dé khóa luận được hoàn thiện hơn
Em xin chân thành cảm ơn.
Trang 4Tp Hô Chi Minh, ngày 28 thang 02 năm 2024
Người viết cam đoan
V6 Thành Ngọc Phúc
li
Trang 5TÓM TẮT
Nam Isaria Japonica là loài nam dược liệu được sử dụng lâu đời trong nền y học
vì chứa nhiều hoạt chất sinh học có giá trị dược liệu cao, nôi bậc với tác dụng chốngtram cam và suy giảm nhận thức ở người lớn tuổi Bên cạnh đó, nhược điềm của nguồnnhộng tằm: giá thành cao, biến động theo mùa, di ứng do thành phần kitin, vị tanh củanhộng tằm vẫn còn trong Đông Trùng Hạ Thảo ảnh hưởng đến hương vị sản phẩm Vì
lẽ đó đề tài “Khảo sát hiệu quả của một sé nguồn đạm tự nhiên đến sự phát triển và khả
năng tích lũy hàm lượng Adenosine của nam Jsaria japonica được nuôi cấy trong môitrường lỏng tĩnh” được thực hiện nhằm tìm nguồn nguyên liệu thay thế bột nhộng tằm.Thí nghiệm 1 thực hiện khảo sát ảnh hưởng của các loại đạm tự nhiên khác nhau như:
bột đậu nành, cao chiết nắm men, cao chiết thị bò và lòng đỏ trứng gà công nghiệp kết
hợp với peptone, sau 30 ngày nuôi cay trong điều kiện tối, với nhiệt độ 20 + 2°C thuđược kết quả với năng suất cao nhất của nam Isaria japonica như sau: khối lượng tươi
(60,69 + 3,14 g/lo), hiệu suất sinh khối tươi (46,30 + 1,53%), khối lượng khô (5,01 +
0,09 g/lo), hiệu suất sinh khối khô (41,99 + 0,73%), hàm lượng Adenosine (1,79 + 0,01mg/g) được thu từ nguồn đạm cao chiết nam men, thời gian tơ nam lan kín bề mặt môi
trường từ 12 — 14 ngày, từ kết qua cho thấy cao chiết nam men là loại đạm phù hợp nhất
dé thay thé bột nhong tam, kích thích nam /saria Japonica phat trién manh dat hiéu quacao Đối với thí nghiệm 2 tiến hành khảo sát khối lượng cao chiết nam men như sau:11,6 g/L, 16,6 g/L, 21,6 g/L, 26,6 g/L và 31,6 g/L Kết quả thu được với khối lượng caochiết nắm men là 11,6 g/L và thành phần môi trường lỏng tinh: sucrose 49,58 g/L, caochiết nam men 11,6 g/L, peptone 9,9 g/L, tinh bột khoai tây 4 g/L, KHzPO¿ 1 g/L,MgS0O4.7H20 1 g/L, vitamin BI 0,02 g/L là môi trường thích hợp trong việc thu nhậnsinh khối đạt năng suất cao nhất như sau: khối lượng tươi (65,61 + 1,27 g/lo), hiệu suấtsinh khối tươi (40,69 + 0,79%), khối lượng khô (5,24 + 0,22 g/lo), hiệu suất sinh khốikhô (46,63 + 1,96%) và hàm lượng Adenosine (1,63 + 0,01 mg/g), thời gian to nam lankín bề mặt môi trường từ 12 — 14 ngày
Từ khóa: Adenosine, /saria tenuipes, Isaria japonica
ili
Trang 6Isaria japonica is a medicinal mushroom species that has been used for a long
time in medicine because it contains many biologically active ingredients with high medicinal value, and is outstanding in fighting depression and cognitive decline in
adults Besides, the disadvantages of the caterpillar: are high cost, seasonal fluctuations, the use of chitin ingredients, and the position of the caterpillar still in the cordyceps affects the product flavor Therefore, the topic “Ability to monitor the effectiveness of some natural mine sources on the development and ability to accumulate Adenosine function of Jsaria japonica mushroom grown in a static microenvironment" was carried
out to find sources of Substitute materials to replace deep dead ends Experiment 1 investigated the effects of 4 other natural ingredients: soybean powder, yeast extract,
beef extract, and industrial egg yolk combined with peptone, after 30 days of culture in
dark conditions Temperature of 20 + 2°C brings the highest yield of Isaria japonica as
follows: fresh weight (60,69 + 3,14 g/vial), fresh biomass yield (46,30 + 1,53%), dry biomass yield (41,99 + 0,73%), dry weight (5,01 + 0,09 g/vial), Adenosine (1,79 + 0,01
mg/g) obtained from high source male herbal extract The time it takes for mycelium to cover the environment's surface is 12 to 14 days The results of experiment 1 show that
yeast extract is the most suitable among the 4 types of the difficult-to-replace log to stimulate fungal growth and achieve high efficiency For experiment 2, the mass of yeast
extract was investigated at concentrations of 11.6 g/L, 16.6 g/L, 21.6 g/L, 26.6 g/L, and 31.6 g/L, medium | used the lowest content of herbal extract with ingredients (49,58 g/L sucrose, 11,6 g/L yeast extract, 9,9 g/L peptone, 4 g potato starch, | g/L KH2POs,, 1
g/L MgSOq.7H20, 0,02 g/L vitamin B1) is the medium suitable for biomass collection with fresh weight (65,61 + 1,27 g/vial), dry weight (5,24 + 0,22 g/vial); Fresh biomass yield (40,69 + 0,79%), dry biomass yield (46,63 + 1,96%) and Adenosine (1,63 + 0,01 mg/g), mycelium time spreads to the environmental surface within 12 to 14 days.
Keywords: Adenosine, /saria tenuipes, Isaria japonica
Trang 7MỤC LỤC
Trang
TL 1 neeaaeraragerrreieervrdenerorbtroblebsgitohcgitostngossoghhoassuetzssotsrnesyegl i
11 1đ 1⁄2 etwgeegartrurriogartovghoeterettereosernaseneroseye iiTĨM Ot ee iii
| see, iv MỤC LỤC -2-©222222222122212221221122112211221122112211221127112211211121112112112211211211 re Vv
DANH SÁCH CAC BANG 0eeecocsscsscssesssssssssssessessessessesstssesitsstssssessessessetstssessessessesseesees ixDANH SÁCH CAC HÌNH 2-©2252222222E22222212232221221222122121121111211 21121 xe x
CHƯƠNG 1 MO ĐẦU -2- 22 ©22222222E22212221122112211271127112711211211211211 211 |
1.1 Đặt vấn đề + s ST 211212111121111111111 1111112111 1111111121121 211121111 1e 1
eC trái Geeeeeeageartrraaaoaggrgrrgrgriaerrrynttraknnraraanaroeoewersaed 2
1:3; Nội dung nghiÊh GỮUsesscssscnoeronnisititdibittiA541143500061313538810000E8558315850GE20383036 200004 2
CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIỆU 2 2222S2+S2E£EE£EEE2EE2EE2E2E222222E 2x 32.1 Giới thiệu về nắm ϧØri4 Sp - - 2-52-5222 2 2EEeEESEEEtrrerrrrrrerrrrrrrrerrerrree 3
2.2 Tổng quan về nắm 1 j4jOïIÏC4 -2-©222©222225222E++2EE+2EEE22EEEtSEEEeErxesrrrrrrrrrr 3
22:12 Vi tive phan Ì0đllotrasssszsisey2x948980559900)0 1005030 24043030g93380S8g03028S0-91G/ĐESECLSSSISEUDS.SEEGESAMSĐB8 3
””đ®nNg,‡—<';Ằ 3
2.2.1.2 PAN Load a Ả.Ả 3
2.2.2 Đặc điểm hình thái ees eceeecsessesesesseesuesueesecsueesessusssessessueeseessseseesseeees 42.3 Thanh phần hĩa học và giá trị được liệu của nắm 7 jponiea -. - 482.1; nrtnrfi bi bến ÍneeeeesesseesehtgeeeonniotecdoeioEnggtntdtrdggpntgoiS0ngflgg620ont8i62sedrtznhanegyl 4
2.3.2 Giá trị dược liệu 2 2-522+2222222222122112211221127112711271127112112112211211211 21 re 5
2.3.3 Giá trị dược liệu trong dịch nuơi cay M 7DAC ONG (0 ON rs ocr re cea 2ES8:801ã8GN68650602Z00548BSg80881586405938Z623ðGE5ig2EiZEGiiLTHa:3/4001568 ca ma ca 2h28 7
2.5 Hình thức nuơi cấy nhân tạo nam Ƒ jđjoniica -. -2 -22-2525722272225ss2cssScssscs2 92.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuơi trồng nam J jponiea -. -: 5 - 10
2.6.1 Thành phần dinh đưỡng - 2-22 2 222222EE2EE22EE2EE2EE2EE2E12232221221 222222 10
"go c0 8n 10
Trang 82.6.3 Arh 6 ai 102.6.4 DO AM ẺốỐỐốỐẺẼẺẻốỐốẺốỐố.ốẺốẻ.ẻẺố.ẻ.ẻ 102.6.5 D6 sau cla Dinh nnố li2.7 Phương pháp HPLC xác định hàm lượng Adenosine trong sợi nam J japonica được
eG cay lương nid! Irựờtert lông TĨNH seseeesseeeseboropssskssecdbtdbsgc00103036x001g00/0106000Gu80.0 06 11
202 0n bo KAI ATICIND gonssenBingi1050201811g014d3A8058:04881410080343AGI4NSEHHIG88800260186GGSG1399/0103348EEi40090033,10/38048008 11
2.7.2 Quá trình tách chiết hàm lượng A denosine 2 2¿©2z222222z+2++2zzz2zzzx li2.7.3 Các yêu tô ảnh hưởng đến quá trình tách chiết 2 225222z+2zz22zz£2 11
2.8 So luot vé nguồn [TT bung H0 E DA ENEIEIEEIEEEDGEIENGSDEHINIANESIGEESRGRENSSEERSEERSuSô 12
2.8.1 NhGng Tâm dâu Boy 2007 ccs «ch HE HH HH TH HH ga E000 301024006 t2.3.2, LONE dO TUNE $4 CONE MEN ED suuesssasnoosgsibvindibi0eS230601360003369836680081503403048ĐS1010595404401808 12 2.8.3 BOt G8u 0 13
2.8.4 Cao chiết nắm men -22++++2EY+++ttEEEEEErrrtrEELkrrrrrrrrkrrrrrrrrrrrrrrrrrreed 13Ä.#.6, Cans ciiệt THẬP Đồ »seeseesantnoseosiorgrokoionlEbsstuietigsigestanstttoklertus1igigfrsdt0stlstagmnihrne 14
7.9, Che nghiên oữu liên quan đến để Ti eiieiiiiikiiirsdkikstueksbskatsirsdiidizke 14
2.9.1 Ở Việt Nam -¿2+St2E12E221E2121112212111 2112111121111 1EEEEeerrerreee 14
2.9.2 TrOm thé GiGi OỪỦDỌỪŨỤŨỪO 15WHUNG3 TT [LIÊU VÃ PHƯƠNG PHẢÁPácáxadga on hồng 14g Gu0808a6666 17
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu - 2¿2¿2++2E++2E++2E++2E++2z+zzzrzzrrrrrrez 17
Sun: WAG TSU 6 HISTO UE sess cscisteonieacmissseaerectinntonsretianteirnalsa niin onto ttnastnacnutina Tonstenawneastecaamamadna 173.2.1 Đối tượng nghiên cứu - 2 s+2s+2E+2E+2E+2E22E22122122121121211211212121212 c0, 173.3.2 MOi truOng SU UNG 17 17
3.3 Phương pháp nghiên CU sssessseseseescsnenvaesmmsrernnensen naar aaa 19
BA, Chỉ TG đánh: lỗ ee ce en ercceemc mens ystsiraassterscratisimencie is masinea wanewcea tetesnslicoamenieraanarealesieeeenec 20 9.Os- OU AUT ETS DICH OULU, nncsescmnssanserenansirensncinsimiensiasuneiseanesmcadinsbiss nite antmesinunaiciebinnstinrmnanemeatnd ts 213.5.1 Phục hồi giống nam 7 japonica trên môi trường tăng sinh PGA - 213.5.2 Phục hồi giống nam 7 japonica trên môi trường lỏng tăng sinh - 223.5.3 Đặc điểm sinh trưởng nam J japonica trên các môi trường dùng loại đạm thay théSeen) 253.5.4 Khối lượng đạm tối ưu cần cung cấp cho môi trường lỏng tĩnh không sử dụngnguyên liệu bột nhộng tẰm ST 1221 121112121111 21111212111 21111112111211111121 11211 Ee xe 235ñ Pfiươnrritidp xi0 sĩ Theo ng nghhangttngriiiitGRiiiDiStSi024G001001GG8603480200/0.ggg000 24
Trang 9CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN - 222 ©2+222E22E2EE2E2E2E22Ezxcrxze, 254.1 Kết quả nghiên cứu -2 2¿©22222+222122E1222122212211221122112211221122112211211 211 xe 254.1.1 Nam 1 japonica được phục hồi sau khi cấy tăng sinh trên môi trường PGA và môiHUONG LON ssseisssssei1ixs68011051113813414335501333856435135843665133835158134853355335E8SEASE13385E88534 3958558838 253.1 Thao luận kết quã phục hồi BÌNH ceeseeseeidrniianioldidoikinlESigE06000100030803.01-104g0 26
4.1.3 Đặc điểm sinh trưởng nam J japonica trên các môi trường dùng loại đạm thay thébột nhộng {Ằm 5Á 1n 221 1E11112111112111121 1111111011111 2111211112111 111110111 erree 26
4.1.3.1 Tho gian lan tO 26
4.1.3.2, Ham lượng AdeH0sitie caesssssssosiiass916166040463383543803815155555603354161048338551339/95/008 27
EEA cL | ae 272111-97 h: :Ì-HẦO-[UOTuannguagiioG00810103105801010G8030000G013GISNGHGSIBSISSSWGHĐS3030481120001409'080008130360EIBIRBIS-SGSBS2IESi00/04888 28
4.1.4 Khối lượng đạm ảnh hưởng đến sự phát triển của nam DTHT J japonica 32
CN S0) 002 0ã 75 32
4.1.4.2 Hàm lượng dược chất A denosine 7+©++c+2s+xvEEESESEEEECEEEEEEEEEErrrrkrrrex 32
A TAD, Ell°u sera tha i bùng s»sseeeseesssexbsrkeosuieoediok200000gud0indtocrondisrgdtz,giL74g61202/0021/10 0HuE 33
41.4.4 Thao LUan 2.2 “sääa HĂHĂHĂẰ Ả L 34
4.2 Thao ludin Chun o 36
`" Ca na 375.2 Đề hii occ eeecceececsssessssesseessessvessnsssecsssssssssnessnsssnssinssssetsnesssssssesssessesseessessueeeseesseeeees 38I/.100/200802/))84.7 60 — 38PHỤ LỤC
vii
Trang 10DANH MỤC CÁC TỪ VIET TAT
Cong tac vién
Đối chứngĐông trùng hạ thảo Exopolysaccharide High Performance Liquid Chromatography
I japonica
I tenuipes Miligam Milimet
P tenuipes
Potato Glucose Agar
Standard Deviation (Độ lệch chuan)
viii
Trang 11Bảng 3.1.
Bảng 3.2.
Bảng 3.3.
Bảng 3.4.
Bảng 3.5.
Bảng 3.6.
Bảng 4.1.
Bảng 4.2.
Bảng 4.3.
Bảng 4.4.
Bảng 4.5.
Bảng 4.6.
DANH SÁCH CÁC BANG
Trang Nguồn gốc nguyên liệu môi trường lỏng tăng sinh -5- 18
Nguồn gốc nguyên liệu môi trường PGA - 2-22 2222222zzzzzzzzzxe2 18
Nguồn gốc nguyên liệu môi trường lỏng tĩnh -2- 22552552552 19 Điều kiện vận hành hệ thong HPLC tối ưu -252z 552555552 21 Các ñghiệm thức cud thi REHM Ì ‹.s-:-sssssegbeesiiibiiiibaddE Le giEG6156 23 Cacnehiém thức của thi nghiỆ H2 -cscsoscsis6scszesssosl666d0306180626 4624 6SsÓngg aie 24
Thời gian hệ sợi nam 7 japonica lan kín bề mặt môi trường lỏng tĩnh 26
Hàm lượng dược chất Adenosine có trong hệ sợi nam J japonica 27
Chỉ tiêu sinh khối tươi/khô, hiệu suất sinh khối tươi/khô - 28
Thời gian hệ sợi nắm lan kín bề mặt môi trường lỏng tĩnh 32
Hàm lượng dược chất Adenosine có trong hệ sợi nam J JAPONICA 32
Chỉ tiêu sinh khối tươi/khô, hiệu suất sinh khối tươi/khô - 33
Trang 12DANH SÁCH CÁC HÌNH
TrangHình 2.1, Nẵm T japonica tự nhiẾN,, ccccvicsisencsesesexsnsuceraveinenesnenransnninsaeeronniornstouieerivemneses 3Hình 2.2 Hình thái 7 japonica và đặc điểm trên môi trường đĩa thạch - 4Hình 2.3 Cấu trúc hóa học của Adenosine ¿2 +2 +x+E+EE2E2EEE2EEE121E1111212121 11x, 6Hình 2.4 Cấu trúc hóa học của Beauverici - 2s +Sx+E+EEE+E£E2E£EEEEEEEErkrrerxes 6Hình 3.2 Sơ đồ quy trình nghiên cứu nắm J japonica -2-2z552555z<: 19Hình 4.1 Đĩa thạch petri đã được cấy truyền 3 lần, thời gian 26 ngày 25Hình 4.2 Môi trường tang sinh long ủ tơ 15 ngày -5-5555<S2<c+2<sscesrces 25Hình 4.3 Hệ sợi nắm J Japonica trên môi trường dùng đạm cao chiết nắm men đượcnuôi cấy trong tối vào ngày thứ 10 -2- 2¿©2222222222E22E222E2232212212322222Ezrrcrev 29Hình 4.4 Hình dạng hệ sợi nam Ï Japonica sau khi đông khô 30Hình 4.5 Môi trường lỏng tinh dùng đạm cao chiết nam men sau 30 ngày nuôi cấy .31Hình 4.6 Hệ sợi nam 7 japonica sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường lỏng tĩnh 34Hình 4.7 Hình dạng hệ sợi nam 7 japonica sau 30 ngày nuôi cấy 36
Trang 13CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Nam /saria japonica (I japonica) có nhiều tac dung được lý quan trọng đã được
nghiên cứu và chứng nhận trong suốt thập kỷ qua ở một số quốc gia như Thái Lan, Nhật
Ban, Hàn Quốc, Trung Quốc, (Lee va ctv, 1997) Trong nam 7 japonica chứa nhiềuhợp chất sinh học đặc biệt như Adenosine, N6 — Adenosine có kha năng chống rỗi loạnnhịp tim, tăng lưu thông mạch vành, Bên cạnh đó, các hoạt chất khác như Ergosterolperoxide, Acetoxyscirpenediol và Beauvericin được tách chiết từ nấm
L japonica trong nuôi trồng nhân tạo có khả năng ức chế các dòng tế bao ung thư, tế bào
ác tính ở người như tế bào khối u đạ dày, tế bào ung thư gan, tế bào ung thư ruột kết —
ruột thắng, bệnh liên quan thần kinh và bạch cầu (Hong và ctv, 2007)
Trong những năm gần đây, nuôi cấy nam J japonica trên nhộng tam đã đượcnghiên cứu và chuyền giao công nghệ, tuy nhiên nuôi cấy nam J japonica thu nhận sinhkhối trên môi trường lỏng đạt năng suất cao hơn, thời gian ngắn hơn, hạn chế nguy cơnhiễm và có tiềm năng áp được áp dụng ở quy mô công nghiệp (Masuda và ctv, 2014).Nuôi trồng trong môi trường lỏng dược chất được tiết ra và tích lũy trong môi trường
lỏng mà không cần qua quá trình chiết xuất (Das và ctv, 2009, 2010; Fan và ctv 2012,
Kang và ctv, 2014) Theo nghiên cứu của Supothina và ctv (2011) cho thây hàm lượngdược chất Beauvericin nuôi trồng trên môi trường gạo và tự nhiên thấp hơn nhiều so vớinam J japonica được nuôi trồng trong môi trường lỏng
Việc tận dụng nguồn nguyên liệu tự nhiên sẵn có, rẻ tiền, sử dụng tiện lợi, thíchhop cho sự sinh trưởng và phát triển của nắm Đông Trùng Ha Thảo (ĐTHT) đang là một
hướng tiếp cận mới trong các nghiên cứu hiện nay Từ thực tế đó, nhiều nhà nghiên cứu
đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng pháttriển nam J japonica Trong số các loại nguyên liệu chứa hàm lượng đạm cao, cần thiếtcho sự tăng trưởng sợi nam J japonica thì lòng đỏ trứng gà công nghiệp, bột đậu nành,
cao chiết thịt bò và cao chiết nắm men là nguồn nguyên liệu đầy tiềm năng dùng đề nuôi
trồng nam J Japonica
Chinh vi thé, dé tai “ Khao sat hiéu quả của một sỐ nguồn đạm tự nhiên đến sựphát triển và kha năng tích lũy hàm lượng Adenosine của nam J japonica nuôi cấy trong
Trang 14môi trường lỏng tĩnh” được thực hiện nhằm tạo nguồn sinh khối sợi nam từ nhữngnguyên liệu tự nhiên an toàn, nâng cao chất lượng sản phẩm nuôi cấy, đạt hiệu quả kinh
tế và thay thế cho nguyên liệu bột nhộng tằm
1.2 Mục tiêu đề tài
Khảo sát hiệu quả của một số nguồn đạm tự nhiên đến sự phát triển và tích lũy
hàm lượng Adenosine trong hệ sợi nam J japonica nuôi cấy trong môi trường lỏng tĩnh
nhằm tìm nguồn nguyên liệu thay thế bột nhộng tằm
1.3 Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Khảo sát sự phát triển nam 7 japonica trên các loại đạm khác nhau
trên môi trường lỏng tĩnh.
Nội dung 2: Khảo sát khối lượng đạm tối ưu cần cung cấp cho môi trường lỏng
tĩnh không sử dụng nhộng tằm
Trang 15CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU
2.1 Giới thiệu về nam Jsaria sp
Chi nam Jsaria bao gồm các loài côn trùng gây bệnh quan trọng, chiếm số lượnglớn các loài thuộc họ Cordycipitaceae Hiện nay, loài 7saria đã được tìm thay ở khắp các
châu lục trên Trái đất với 284 loài được mô tả nhưng 72 loài được chấp nhận rộng rãi và
có nhiều ứng dụng trong dược phẩm và nông nghiệp Đã có 11 loài Jsaria được ghi nhận
ở Việt Nam Trong nghiên cứu của chúng tôi tại Khu bảo tồn thiên nhiên Copia, tỉnhSơn La và Vườn quốc gia Xuân Son, tỉnh Phú Thọ, đã thu thập được 51 mẫu nam trên
au trùng Lepidoptera và Coleoptera, trong đó có 5 mẫu nam thuộc chi Jsaria Dựa trêncác đặc điểm hình thái và phân tử, các mẫu được xác định là Isaria cicadae, Isaria
fumosorosea, Isaria tenuipes va Isaria amoene — rosea Cần có những nghiên cứu sâu
hon dé làm rõ Jsaria sp (Nguyễn Đình Việt va ctv, 2021)
2.2 Tổng quan về nam I japonica
Loài : Isaria japonica Yasuda Hình 21 Naw ƒ janonicn nền,
FB: quả thể, HI: côn trùng ký chủ,
: (Zhang va ctv, 2019).
2.2.1.2 Phan loai
I japonica thuộc giỗng DTHT, chủ yêu lây nhiễm trên côn trùng Lepidopteran và
dẫn đến cái chết cho chúng Sau đó, sinh sản quả thê từ xác côn trùng và giải phóng bào
tử màu trắng nên có tên gọi khác là bông tuyết trùng thao (Che va ctv, 2014)
Trong tự nhiên, loài nam này tồn tại 2 giai đoạn: giai đoạn hữu tính có tên làCordyceps takaomontana Yakushiji Kumayawa, còn giai đoạn vô tính tên là /sariatenuipes Peck Samson (Yokoyama, 2003), nhiều nghiên cứu đã đưa ra các tên đồng
Trang 16nghĩa như ?saria japonica Yasuda hoặc Paecilomyces tenuipes (Peck.) Samson (Statafora va ctv, 1993).
2.2.2 Đặc điểm hình thái
Hình thái của thé quả nắm gồm 2 phan chính: cuống nam và tế bào sinh bao tử vôtính Cuống nam có màu vàng chanh, kích thước biến động tùy thuộc vào điều kiện phát
triển và số lượng quả thể có trong một ký chủ, thường 0,5 — 4,5 mm Phía trên của cuống
nam là tế bào sinh bao tử vô tính, phân nhiều nhánh ở phía đầu của sợi nắm va gần như
phủ toàn bộ phía đầu sợi nắm, bào tử vô tính vách dày, không màu, không vách ngăn,
hình hạt đậu hơi cong ở giữa, kích thước 0,5 — 1 x 2,5 — 3 um (Pham Quang Thu va ctv).
ane ay
Se ee
Hình 2.2 Hình thái 7 japonica và đặc điểm trên môi trường đĩa thạch (a) bào tử đượctạo ra ở dau phialide theo chuối; (b) bào tử hình thoi; (c) bào tử có thành nhăn sự phat trién
nam trên môi trường (d) PDA;(e) CMA;(f) CZA sau 4 ngày cấy nam (Kassam va ctv, 2022).
2.3 Thành phan hóa học và giá trị dược liệu của nấm LI japonica
2.3.1 Thành phần hóa học
Adenosine và Beauverincin: hàm lượng Adenosine đạt 0,76 mg/g va
Beauverincin 1,68 mg/g khô Với ham lượng hoạt chat Adenosine và Beauverincin được
Trang 17coi là tiềm năng dé phat triển thực phẩm chức năng và dược liệu (Đỗ Tiến Mạnh và ctv,2016).
Acid béo: quả thé của 7 japonica rất giàu axit béo không bão hòa với khoảng 79%tổng lượng axit béo Các hàm lượng axit béo chính là 38,35% axit oleic, 28,30% axit
linolenic và 12,35% axit linoleic trong axit chưa bão hòa và 17,08% axit palmitic trong
axit bão hòa (Hong va ctv, 2007).
Acid amin: tổng hàm lượng 17,09 mg/g trong qua thé nam 7 japonica nhưAspartic acid 0,76 mg/g, Serine 1,19 mg/g, Glutamic acid 0,85 mg/g Glycine 1,77 mg/g,
Histidine 0,61 mg/g, Arginine 2,21 mg/g, Threonine 1,07 mg/g, Alanine 0,97 mg/g,
Proline 1,68 mg/g, Tyrosine 1,51 mg/g, Valine 0,87 mg/g, Methionine 0,36 mg/g, Lysine 0,53 mg/g, Isoleucine 0,64 mg/g, Leucine 1,08 mg/g, Phenylalanine 0,99 mg/g (Hong
va ctv, 2007) Nhiều nghiên cứu cung cho thay nam 7 japonica va DTHT C sinesis cóthành phan axit amin tương tự nhau nhưng về số lượng 1 số axit amin của nam 7.japonica nuôi nhân tạo cao hơn nam C sinesis tự nhiên (Chen va Chen, 1990)
Nguyên tổ khoáng và vitamin: các nguyên tố trung lượng K, Ca, Na và các nguyên
tố vi lượng Fe, Cu, Zn, Mn, Se trong nam, trong đó hàm lượng Zn rất cao đạt từ 193 đến
255 ng/Kg 7 loại vitamin A, B1, B3, B6, C, D, E có mặt trong nắm DTHT tằm dâu J.japonica, trong đó vitamin D có hàm lượng cao hơn cả, đạt 242 mg/10g (Nguyễn MậuTuấn, 2011)
Đường: tông số đường hòa tan trong quả thé là 24 mg/g: 3,71 mg/g Glycerol, 9,21
mg/g Glucose, 8,4 mg/g Mannitol và 2,67 mg/g Sucrose (Hong va ctv, 2007).
Các hợp chat quan trọng khác: 15 hợp chất từ dich chiết methanol của sợi nam kí
sinh côn trùng nam 7 japonica kết hợp phương pháp chiết xuất và sắc kí cho thay 123
mg ergosterol, 38 mg Adenosine, 31 mg ergosterol peroxide, 30 mg Uracil, 25 mg Beauveriolide I, 16,5 mg d— mannitol, 15 mg tricin, 14,5 mg axit 3 — mino butanoic, 13
mg isarin, 13 mg axit 2 — hydroxyl — 3 — phenylpropanoic, 9,5 mg (17R) — 17 —
methylincisteriol, 8 mg 4,4 — dimethyl — 5a — ergosta — 8,24(28) — dien — 3B — ol, 7 mg
3 — O — ferulylcycloartenol, 6,4 mg 118,22 — dihydroxyhopan, 5,7 mg Fungisterol((3B,5a,22E) — ergosta — 6,8,22 — trien — 3 — ol) (Nguyễn Ngọc Tuan, 2017)
2.3.2 Gia tri dược liệu
Adenosine có chức năng quan trọng như điều chế giải phóng chat dẫn truyền thankinh (Sebastiao và ctv, 2000), tính dẻo của khớp thần kinh (Mendonca va ctv, 2001) và
5
Trang 18bảo vệ thần kinh trong các trường hợp thiếu máu cục bộ, thiếu oxy và stress oxy hóa
(Cunha, 2001; Ferreira va ctv, 2001; Fredholm và ctv, 2001) Ngoài ra, Adenosine đóng
các vai trò khác nhau trong nhiều loại mô khác nhau Trong hệ thống tim mạch,Adenosine tạo ra sự co mạch hoặc giãn mạch của tĩnh mạch và động mạch (Li va ctv,1998) Adenosine điều chỉnh sự tăng sinh tế bào T và sản xuất cytokine (Hasko và
Pacher, 2008) Các nucleoside cũng ức chế quá trình phân giải mỡ và kích thích co thắt
phế quản (Bouma và ctv, 1994; Graaf, 1999)
Beauvericin là một loại độc tố nam mốc nỗi tiếng được sản xuất bởi nhiều loại
nam như Beaveria bassiana và Fusarium spp (Hamill và ctv, 1969) Beauvericin gây
độc nhiều dong tế bao ung thu, khang 10 loại vi khuẩn gram đương và 9 loại vi khuẩn
gram âm (Wang và ctv, 2012) Là một chất kháng khuẩn tiềm nang, Beauvericin có thé
sử dụng dé giải quyết các van đề kháng thuốc, nhiém trùng do vi khuan (Nilanonta và
Trang 19Isariotins G — J, được đánh giá về hoạt tính chống lại ký sinh trùng sốt rét
Plasmodium falciparum K1, và ba dong té bào ung thư (KB, MCF - 7, và NCIH187) và
các tế bao Vero không ác tinh
(3R,6R) — 4 — metyl — 6 — (1 — metyletyl) — 3 — phenylmetyl — perhydro — 1,4 —oxazine — 2,5 dione: chất gây chết tế bào theo chương trình từ quả thé của 7 japonica
trong tế bào ung thư bạch cầu ở người (HL — 60) phụ thuộc vào liều lượng, nằm trong
khoảng từ 5 microg/ml đến 100 microg/ml (Oh và ctv, 2002)
Protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) được coi là chất điều chỉnh âm tính của
tín hiệu thụ thé insulin, là mục tiêu thuốc tiềm năng đề điều trị bệnh tiêu đường tuýp II
và các hội chứng chuyên hóa liên quan khác Trong nghiên cứu Tren va ctv, năm 2014
đã phát hiện các dẫn xuất Penostatin, một loại chất ức chế PTP1B mới được phân lập từ
môi trường nuôi cấy rắn của nắm DTHT Isaria tenuipes (I tenuipes)
Naturido là một peptide tuần hoàn mới trong qua thé 7 japonica, chất điều biến
tế bao thần kinh đệm day hứa hen dé điều trị không chỉ bệnh lão hóa mà còn cả bệnhAlzheimer và các bệnh thoái hóa thần kinh khác (Ishiguro và ctv, 2021)
2.3.3 Giá trị dược liệu trong dịch nuôi cấy
Exopolysaccharide (EPS) là những polysaccharide được tổng hợp trong tế bào rồitiết ra môi trường xung quanh, được công bồ đầu tiên vào năm 1861 bởi Pasteur, mô tả
như là các chất chuyên hóa thứ cấp được téng hợp chủ yếu từ cuối giai đoạn tăng trưởng
đến ồn định của vi sinh vật Sự tiết EPS giúp sinh vật ton tại trong điều kiện môi trườngkhắc nghiệt, bất lợi trong quá trình phát triển do đó EPS có một số ưu điểm vượt trộinhư tổng hợp số lượng lớn trong thời điểm ngắn, dé phân lập và thu nhận (Li va ctv,2016).
Trong những năm gan day, EPS đã thu hút sự quan tâm trên thé giới do hoạt tínhsinh học cao như kháng oxi hóa, kháng ung thư, giảm cao huyết áp, điều hòa miễn dịch
và giảm cholesterol trong máu (Mahapatra và Banerjee, 2013).
Theo nghiên cứu của Takano và ctv, năm 1996 cho thấy môi trường lỏng nuôi cấynam J japonica kích thích sản xuất kháng thé dich thé ở chuột qua đường uống ở mức
10 và 30 mg/kg/ngay Năm 2005 theo nghiên cứu của Fumihide và ctv về dich nuôi cấynam Paecilomyces tenuipes (Peck) Samson (P tenuipes) điều chỉnh phản ứng củacytokine Th1 và Th2 trong tế bao vá của Peyer ở chuột in vitro va ex vivo
Trang 202.4 Công dụng
Chống ung thư: các hoạt chất Ergosterol peroxide và Acetoxyscirpenediol được
tách chiết từ nam 7 japonica nuôi cay nhân tạo, tác dụng điều trị ung thư của hợp chatnày không chi có làm chết tế bao ung thư mà còn ức chế quá trình sinh tong hợp protein,
vì vậy quá trình điều trị đã đạt hiệu quả cao (Paea và ctv, 2003) có hiệu quả tiêu diệt tế
bào khối u da dày, tế bào ung thư gan, tế bào ung thư ruột kết — ruột thang và hiệu quả
được xác định gap 4 — 6,6 lần hoạt chat cisplatin chất được dùng trong điều trị bệnh ungthư hiện nay (Nam và ctv, 2001).
Tăng cường miễn dịch: nam J japonica được sử dụng hàng trăm năm như là thực
phẩm chức năng dé tăng cường hệ thống miễn dịch và phục hồi sức khỏe (Ji va ctv,2011) Ở phía Đông Himalaya, J japonica được sử dụng như một loại thuốc bổ dé phục
hồi người bệnh lao và phụ nữ sau khi sinh con (Chhetri va ctv, 2020)
Điều trị bệnh tiêu đường: chiết xuất từ nam P tenuipes N45 có tác dụng chốngbệnh tiểu đường tuýp 1 (Du và ctv, 2015) Ngoài ra, đã đánh giá tác dụng chống bệnh
tiểu đường ở bệnh nhân đái tháo đường tuýp 2 trên chuột mắc bệnh tiéu đường sau 4
tuần, nồng độ glucose trong máu, nồng độ insulin và chỉ số HOMAIR (chỉ số kháng
insulin theo phương pháp đánh giá cân bằng nội môi) của nhóm thử nghiệm đã giảm sovới nhóm đối chứng phụ thuộc vào liều dung (Seo va ctv, 2013)
Chống béo phì: nghiên cứu đã báo cáo rằng cathepsin S có liên quan đến bệnhbéo phì Cả tế bào mỡ của chuột và người đều sản xuất ra enzyme này trong giai đoạn
đầu của quá trình biệt hóa tế bào mỡ Biểu hiện gen Cathepsin S tăng cao trong mô mỡcủa chuột béo phì so với chuột gầy Chiết xuất từ nắm P tenuipes (PTW) được chứng
minh có tác dụng ức chế hoạt động của enzyme cathepsin S Hơn nữa, PTW còn làm
giảm sự tăng cân, tăng trưởng mô mỡ dưới da, mức chất béo trung tính trong huyết thanh
và cholesterol toàn phần ở những con chuột được cho chế độ ăn nhiều chất béo (Myoung
§
Trang 21nhận thức ở người lớn tuôi bị suy giảm nhận thức nhẹ Phần lớn các thuốc chống tram
cảm hiện nay đều có nguy cơ tác dụng phụ cao (Ma và ctv, 2013; Kang và ctv, 2011;Cui và ctv, 2014) và hơn 30% bệnh nhân trầm cảm không đáp ứng với điều trị bằng
thuốc chống trầm cảm Vì thế, do tính an toàn và hiệu quả trong việc làm giảm các triệuchứng tram cảm nam 7 japonica đã được coi như nguyên liệu thay thé
2.5 Hình thức nuôi cấy nhân tạo nam L japonica
Hiện nay, để đáp ứng nhu cầu sử dụng ngày càng tăng của con người, do đó đã
có nhiều nỗ lực tìm ra phương pháp nuôi cấy nhân tạo thay cho nguồn tự nhiên vì loài
nam nay rất khó thu nhận, thời điểm tăng trưởng chậm và tùy thuộc nhiều vào điều kiện
khí hậu Nghiên cứu cho thấy nam được phân lập từ tự nhiên được nuôi cấy trên: môitrường lỏng, môi trường bán rắn và nuôi trên ký chủ nhộng tằm
Môi trường lỏng: nhìn chung nuôi cấy trên môi trường lỏng được chia thành: lênmen chìm, lên men bề mặt gồm có: lỏng tĩnh và lắc — tĩnh hai bước
Đối với lên men chìm thì nam ĐTHT được nuôi cấy trong môi trường lỏng trong
đó lắc hoặc khuấy trộn dé hòa tan oxi và đinh dưỡng trong nồi lên men Nuôi cấy ngập
nước được sử dụng rộng rãi trong nuôi trồng thử nghiệm và công nghiệp nhiều loại vi
sinh vật, bao gồm nam men (Vlaev va ctv, 2013), vi khuẩn (Gullo va ctv, 2014) và cácloại nam khác (Vieira và ctv, 2008)
Nuôi cấy lỏng tĩnh là phương pháp được nghiên cứu và tối ưu hóa nhiều nhấttrong số ba phương pháp được mô tả trong tổng quan này Với lên men lỏng tĩnh thì nắm
DTHT được nuôi cây trong điều kiện giống như bán ran, các sợi nam được hình thànhphía trên bề mặt thu bằng cách lọc dịch nuôi cấy, sau đó say khô và nghiền thành bột
min Sau khi say khô, bột có thé sử dụng trực tiếp hoặc tiếp tục xử lý bằng nước nóng
hay một số dung môi khác
Phương pháp nuôi cấy lắc — tĩnh hai bước là phương pháp kết hợp nuôi cấy chim
và nuôi cay lỏng tĩnh với nhau Sau khi được cay vào môi trường, nam DTHT được phép
phát triển trong điều kiện rung lắc nhằm thúc đây sản xuất sinh khối trong một thời gian
ngắn Sau đó, nim ĐTHT được tiếp tục nuôi cay trong điều kiện tinh dé thúc đây sự tích
lũy dược chất So sánh giữa ba phương pháp nuôi cấy lỏng, các nghiên cứu chỉ ra rằngnuôi cấy lỏng tĩnh và nuôi cấy lắc — tinh hai bước là phương pháp hiệu quả được ápdụng cho canh tác công nghiệp vì có thể thu được sản lượng dược chất cao hơn
Trang 22Nuôi cấy bán rắn thường là hạt ngũ cốc hoặc hỗn hợp ngũ cốc thường dùng như
gạo, lúa mì (Adnan và ctv, 2017; Chiang va ctv, 2017; Gregori, 2014; Kang va ctv, 2017),
au trùng côn trùng (phan còn lại của con tam) được trộn lẫn trong chat nền ran dé mô
phỏng các điều kiện tự nhiên (Jian va Li 2017) Nhược điểm môi trường bán ran là thờigian nuôi cấy kèo dai, do đó làm tăng chi phí cũng như đòi hỏi phải kiểm soát chặc chẽ
các điều kiện nuôi cấy
Phương pháp nuôi cấy trên ký chủ nhộng tằm thu nhận quả thê tương đối giốngvới tự nhiên, tuy nhiên yêu cầu kỹ thuật và chỉ phí cao
2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi trồng nam J japonica
2.6.1 Thành phần dinh dưỡng
Theo nghiên cứu của Park và ctv, năm 2004 về điều kiện thuận lợi cho sự phát
triển sợi nam P tenuipes cho thấy nguồn carbon và nito tốt nhất lần lượt là dextrose vàtryptone, trong khi KH2POs là nguồn khoáng chat tốt nhất cho sự phát triển của sợi nam
Sự tăng trưởng sợi nam cao nhất được quan sát thay khi tỷ lệ C/N là 20:1
2.6.2 Nhiệt độ và pH
Nhiệt độ thích hợp sợi nam phát triển thuận lợi từ 23 — 28°C, tối ưu là 25°C, sựphát triển sợi nắm giảm nhanh chóng khi nhiệt độ trên 27°C, pH = 7 tối ưu của môitrường rắn cho sự phát triển của sợi nắm (Ban và ctv, 1998) Đều này cũng tương tự vớinghiên cứu của ShuangShuang và ctv (2021) cho thấy nhiệt độ thích hợp trong môitrường lỏng tăng sinh và môi trường rắn là nhất quán tốt nhất ở 25°C và pH = 7
2.6.3 Ánh sáng
Đối với quá trình cảm ứng thể quả, điều kiện sáng/tối là quan trọng với cường độ
ánh sáng từ 700 — 1000 Ix, 16 giờ sáng, 8 tối (Lê Phước Tho, 2013) Chiếu sáng bằng
ánh sáng trang trong một thời kỳ quan trong cụ thé trước thời kỳ tối tạo ra các thé quả
Giai đoạn quan trọng được xác định là khoảng 6 — 14 ngày sau khi tiêm chủng 6 20°C ( Akihito và ctv, 1999).
Trang 232.6.5 Độ sâu của bình
Đối với môi trường lỏng tĩnh nắm được nuôi cấy mà không khuấy trộn nên độsâu của môi trường được cho là có ảnh hưởng đến việc sản xuất dược chất Masuda vàctv (2006) nhận thay rằng thời gian cần thiết dé đạt giá trị không đổi tăng theo độ sâutrung bình cho thấy hiệu quả sử dung mang sinh học bề mặt của nắm DTHT giảm khi
tăng độ sâu trung bình.
2.7 Phương pháp HPLC xác định hàm lượng Adenosine trong sợi nắm ! japonica
được nuôi cấy trong môi trường lỏng tĩnh
2.7.1 Khái niệm
Tách chiết là quá trình tách một hay một số chất tan trong chất lỏng chất rắn bằngmột chất lỏng khác còn gọi là dung môi (Nguyễn Thị Vân Anh, 2010)
2.7.2 Quá trình tách chiết hàm lượng Adenosine
Chuan bị mẫu chiết xuất ĐTHT được thực hiện theo Wang và ctv năm 2015 MẫuĐTHT được sấy khô trong lò sấy ở 50°C trong 24 giờ, sau đó nghiền thành bột BộtDTHT được hòa tan trong nước khử ion hoặc ethanol theo tỉ lệ rắn và dung môi khảo
sát Đặt mẫu lên bé siêu âm trong 2 giờ ở 50°C, chất nôi phía trên thu được sau khi lytâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 20 phút, đưa qua bộ lọc 0,22 wm Sau đó, phân tíchsắc lý lỏng hiệu nâng cao (HPLC) được thực hiện trên dịch chiết thu được
Xác định hàm lượng Adenosine bằng HPLC: nghiên cứu được thực hiện tại bướcsóng 260 nm, nhiệt độ cột 25, Tốc độ dòng 0,6 mL/phút, thé tích tiêm 20 ml (NguyénThị Thu Hà và Nguyễn Thiện Thao, 2020)
2.7.3 Các yếu tổ ảnh hưởng đến quá trình tách chiết
Dung môi chiết là yếu tố quan trọng trong quá trình tách chiết có tác dụng thâmthấu vào mẫu, hòa tan và khuếch tán các hợp chất hữu cơ trong mẫu ra ngoài Mỗi dung
môi có khả năng hòa tan các hợp chất khác nhau ở mức độ khác nhau nên việc lựa chọn
dung môi ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất thu hồi (Chiếng Sủi Sín, 2019)
Nhiệt độ tăng thì hệ số khuếch tán tăng, cũng làm giảm độ nhót của dung môi tạođiều thuận lợi cho quá trình ly trích Tuy nhiên nhiệt độ cao có thé phá hủy một số chat
Độ hòa tan của hợp chất nghiên cứu tăng cũng đồng nghĩa với các tạp chất tăng lên,hoặc làm tăng độ nhớt của dịch chiết do sự trương nở hồ tỉnh bột gây khó khăn cho
việc tách chiết Những dung môi dễ bay hơi thì nhiệt độ cao sẽ dẫn đến hao hụt nên cầnphải có thiết bị kín và có bộ phận hồi lưu (Nguyễn Hoàng Tuấn, 2012)
11
Trang 24Thời gian chiết phải đảm bảo đủ đề các chất cần nghiên cứu khuếch tán vào dung
môi nhưng cũng không quá dài vì có thể tăng các tạp chất gây khó khăn cho quá trình
tinh chế cũng như tiêu phí năng lượng (Nguyễn Hoàng Tuan, 2012)
Ngoài các yếu tố nêu trên thì trong nghiên cứu để tăng hiệu quả tách chiết người
ta sử dụng sóng siêu âm nhằm làm tăng diện tích tiếp xúc giữa mẫu và dung môi, góp
phần phá vỡ màng tế bào và tăng nhiệt độ cũng như sự xáo trộn của hỗn hợp (Nguyễn
Hoàng Tuan, 2012)
2.8 Sơ lượt về nguồn đạm
2.8.1 Nhộng tằm dâu Bombyx mori
Tam dâu Bombyx mori là côn trùng được thuần hóa nuôi lay tơ thuộc chi Bombyx,
họ Bombyxcidae, bộ lepidotera, lớp Insectera và ngành Arthropoda Bên cạnh vai trò
chủ yếu trong nghề diệt lụa tơ tằm thì ấu trùng của nó là nhộng — sản phẩm phụ cũng có
hàm lượng dinh dưỡng cao và được ứng dụng rộng rãi như sử dụng làm thực phẩm, thức
ăn chăn nuôi và được sử dụng trong nuôi cay nam DTHT
Môi trường nuôi cấy nắm dùng các loại nhộng và sâu khác nhau nhưng hau hết
sử dụng nhộng tằm Bombyx mori (Hong và ctv, 2010) Việc bổ sung côn trùng trong
nuôi cây nắm ở quy mô lớn cho thấy nhiều hạn chế về nguyên liệu có sẵn, sự biến độngtheo mùa Do đó, việc tận dụng các nguồn nguyên liệu hữu cơ tiềm năng được sử dụng
dé thay thế côn trùng
2.8.2 Lòng đỏ trứng gà công nghiệp
Theo nghiên cứu của Yadunandan và Joseph (2014) cho thấy lòng đỏ trứng gàchứa hàm lượng nước 48%, 17,5% protein, 32,5% chất béo và 2% khoáng chất Với
52% chất khô (trong đó 65% chất béo, 31% protein và 4% carbohydrate, vitamin và
khoáng chất) (Guilmineau và ctv, 2005) Lòng đỏ quả trứng chứa các chất dinh dưỡngthiết yêu như vitamin (B6, B12, A, D, E và K) và nguồn khoáng chất phong phú (canxi,
magiê, sắt và selen) Lòng đỏ cũng chứa caroten mang lại màu vàng và hoạt động như
chất chống oxy hóa giúp cải thiện thị lực (Huizen, 2017) No cũng cho thấy khả năngchống viêm do sự hiện diện của vitamin tan trong nước (choline) có trong lòng đỏ trứng
và giúp điều hòa chức năng tim mạch của cơ thể (Huizen, 2017)
Theo nghiên cứu của Lee va ctv, năm 2006 về ảnh hưởng của quả thé nam
P tenuipes được nuôi cấy trên môi trường lòng đỏ trứng gà (PTE) trong quá trình chuyểnhóa lipid và chất chống oxy hóa ở chuột có chế độ ăn nhiều chất béo/cholesterol Bốn
12
Trang 25mươi con chuột đực 8 tuần tuéi được cho ăn chế độ nhiều chất béo/cholesterol cao (đối
chứng) và chế độ ăn nhiều chất béo/cholesterol cao với PTE ở nồng độ 1%, 3% hoặc
5% trong 5 tuần PTE được phát hiện là làm giảm đáng kê lipid toàn phần trong huyếttương, cholesterol toàn phần, cholesterol lipoprotein tỷ trọng thấp và chỉ số xơ vữa tronghuyết tương so với nhóm chứng Nam P tenuipes được nuôi cấy trên lòng đỏ trứng có
thé cải thiện cấu hình lipid và quá trình peroxy hóa lipid ở chuột được cho ăn chế độ ăn
nhiều chất béo/cholesterol cao
2.8.3 Bột đậu nành
Việc sử dụng nguồn nitơ đơn giản tương tự như là bột đậu nành có thê giúp giảm
giá thành so với sử dụng cao chiết nắm men và pepton Đối với khách hàng ăn chay việcnuôi trồng nắm ĐTHT sử dụng nguồn dinh dưỡng nhộng tằm sẽ không được chấp nhận,
do đó sử dụng bột đậu nành là một phương án có thể được xem xét
Theo nghiên cứu của Sripilai và ctv năm 2023 về nghiên cứu ảnh hưởng của điều
kiện nuôi cay và bột chiết xuất hạt rau như một nguồn bổ sung nitơ không có động vậtđến quá trình sản xuất cordycepin của C militaris trong nuôi cấy bề mặt chat lỏng Sản
lượng Cordycepin cao nhất được quan sát từ bổ sung 80 g/L SBEP đã làm tăng sản xuất
Cordycepin lên 2,52 g/L, lớn hơn so với đối chứng (peptone) Trong điều kiện nuôi cấytối ưu, mô hình dự đoán sản xuất Cordycepin tối đa là 2,64 g/L ở thé tích là 147,5 ml,
kích thước cấy là 8,8% v/v và thời gian nuôi cấy là 40 ngày
Park va ctv, 2007 về đánh giá tác dụng của nam P tenuipes được trồng trên đậunành (SD) đối với tôn thương DNA do dimethylhydrazine (DMH) gây ra và stress oxyhóa ở chuột đực F344 Các con vật được chia thành 3 nhóm và được cho ăn chế độ ăn
giàu chất béo, ít chất xơ dựa trên casein mà không có hoặc với 13% (w/w) đậu nành
Một tuần sau khi bắt đầu chế độ ăn kiêng, chuột được điều trị hàng tuần bằng DMH (30mg/kg, sc) trong 6 tuần; phương pháp điều trị bằng chế độ ăn kiêng được tiếp tục cho
toàn bộ thí nghiệm và điểm cuối được đo ở thời điểm 9 tuần sau lần tiêm DMH đầu tiên
Bồ sung SD làm giảm tốn thương DNA do DMH gây ra trong tế bào ruột kết và giảmquá trình peroxid hóa lipid huyết tương Do đó, SD có thê có tiềm năng điều trị ung thưruột kết giai đoạn đầu
2.8.4 Cao chiết nắm men
Theo nghiên cứu Sumalee va ctv năm 2011 dùng môi trường lỏng tinh: glucose
20 g/L, yeast extract 1 g/L, NHaNO: 3 g/L, KH›:PO¿ 0,5 g/L, MgSO4.7H20 0,5 g/L,
8
Trang 26CaCl2 0,5 g/L, nam được ủ ở 25°C trong 40 — 120 ngày, cho đến khi đạt khối lượng caohợp lý với sợi nam dày nồi bao phủ hoàn toàn bề mặt môi trường.
Nghiên cứu của Jennier (2009) đã sử dụng 7 tenuipes sản xuất Beauvericin trên
ba môi trường: môi trường muối tối thiểu (cao chiết nam men 1 g/L, glucose 20 g/L,
NHaNO: 3 g/L, KH2PO4 0,5 g/L, NaH:PO¿ 0,5 g/L, MgSO4.7H20 0,5 g/L, CaC]› 0,5
g/L, trong nước cất), môi trường M102 (chiết xuất mạch nha 20 g/L, cao chiết nắm men
1 g/L, bactopeptone 2 g/L, sucrose 30 g/L, KCI 0,5 g/L, KHaPOx 0,5 g/L, MgSO4.7H20
0,5 g/L, trong nước cat) và môi trường sucrose (chiết xuất nam men 20 g/L, sucrose 150
g/L, trong nước cất)
2.8.5 Cao chiết thịt bò
Trong nghiên cứu Du va ctv năm 2012, áp dụng phương pháp thống kê tuần dé
tối ưu hóa môi trường trong nuôi cấy chìm Ð tenuipes N45 Giá trị mong muốn nhằm
nâng cao năng suất của sợi nắm, Adenosine, polysaccharide và axit Dựa trên chiến lượctối ưu hóa một yêu tô, đã thu được nguồn carbon, nguồn nito và muối vô cơ phù hợp.Sau đó, các thành phần môi trường chính được xác định bằng thiết kế Plackett— Burman
và được tối ưu hóa hơn nữa bằng thiết kế Box — Behnken Cuối cùng, phương pháp bề
mặt đáp ứng và mạng lưới thần kinh nhân tạo — thuật toán di truyền đã được sử dụng dé
mô hình hóa va tối ưu hóa các kết qua thực nghiệm thu được Thành phan tối ưu của
môi trường dinh dưỡng gồm (g/L): glucose 40, cao chiết thịt bò 10, pepton đậu nành 10,
KH:PO¿ 0,688, MgSO4.7H20 1, NaCl 0,5, Vitamin B1 0,201, Vitamin B12 0,13.
2.9 Các nghiên cứu liên quan đến đề tài
2.9.1 Ở Việt Nam
Năm 2011, nghiên cứu của Phạm Quang Thu về phân bố nam 7 tenuipes (Peck.)Samson ở Việt Nam, lần đầu tiên được phát hiện và mô tả ở Việt Nam Loài nam nayphân bố ở rừng nhiệt đới va á nhiệt đới rộng thường xanh ở độ cao từ 400 — 1800m so
với mực nước biến Tần số xuất hiện rất khác biệt giữa các địa điểm điều tra Phân bốrat phổ biến ở vườn Quốc gia Hoàng Liên và Vườn Quốc gia Ba Vi, khá phổ biến tại
Vườn Quốc gia Tam Đảo và Khu Bảo tồn Thiên nhiên Copia, ít rất gấp và không gặp tạiVườn Quốc gia Bidou — Núi Bà và Vườn Quốc gia Bach Mã
Đỗ Thị Thiên Lý và ctv, năm 2015 bước đầu trong nghiên cứu chi nam Isaria tạinúi Langbian thuộc Cao Nguyên Lâm Viên, Việt Nam Kết quả qua phân tích giải phẫuhình thái và phân tích sinh học phân tử cho phép chúng tôi đi đến kết luận các mẫu nam
14
Trang 27Isaria đã thu thập tại núi Langbian thuộc Cao nguyên Lâm Viên có ba loài chính: ?saria
tenuipes, lsaria javanicus va Isaria amoenerosea.
Theo nghiên cứu của Nguyễn Anh Thư, 2017 về tối ưu hóa thành phan môi trườnglỏng tĩnh sản xuất sinh khối và quả thé nam J tenuipes với mục tiêu tối ưu hóa môitrường lỏng tĩnh nhằm thu nhận cả sinh khối và quả thê Tiến hành khảo sát trên các hàm
lượng nito và cacbon đã xác định được công thức môi trường tối ưu cho sự hình thànhcủa quả thể Sau 55 ngày nuôi cấy tiễn hành khảo sát và thu dịch EPS với hàm lượng
khoảng 3,36 g/L.
2.9.2 Trên thế giới
Năm 1998, để phục vụ sản xuất đại trà Ban và ctv đã tiến hành nghiên cứu môitrường nuôi cấy nam J japonica trên các loại môi trường lỏng, ran Kết quả cho thấy hệ
SỢI nắm phát triển thuận lợi ở nhiệt độ 23 — 28°C trên môi trường MYG với pH 7,0 Quả
thê của nam 7 japonica được tạo ra bên dưới trong môi trường long MYG (glucose menmach nha) dưới ánh sáng huỳnh quang Trong môi trường nền MYG trộn với bột nhộngtằm, khối lượng tươi của quả thể tăng lên
Năm 2000, Bae và ctv đã thực hiện nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện nuôi cay chim
dé sản xuất exo — polime của nam P japonica cho thay Maltose, chiết xuất men va kaliphotphat lần lượt là những nguồn carbon, nito và muối vô cơ phù hợp nhất cho cả quá
trình sản xuất exo — biopolyme và sự phát triển của sợi nắm Điều kiện nuôi cấy tối ưu
là pH = 5,0, 25°C và 150 vòng/phút trong môi trường chứa, tính bang g/l: 30 maltose, 6chiết xuất nắm men, 2 polypeptone, 0,5 K2HPOs, 0,2 KH;PO¿, 0,2 MnSO4.5H20 , 0,2MgSOa.7HaO.
Theo nghiên cứu của Supothina và ctv (2011) về sản xuất Beauvericin bởi nam J
japonica trong tự nhiên, nuôi trồng trên môi trường gạo và sợi nam từ quá trình lên menlỏng Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng Beauvericin ở sợi nam được nuôi trồng
trên môi trường gạo chứa hàm lượng cao hơn nhiều so với mẫu tự nhiên, tuy nhiên hàm
lượng này vẫn thấp hơn so với sợi nắm từ quá trình lên men lỏng
Năm 2012, theo nghiên cứu của Du về tối ưu hóa môi trường lên men cho nam ?tenuipes N45 sử dụng phương pháp thiết kế Plackett - Burman (PBD) và được tối ưuhóa bằng thiết kế Box — Behnken (BBD) với kết quả môi trường gồm 40 g/L glucose,
10 g/L chiết xuất thịt bò, 10 g/L peptone đầu nành, 0,688 g/L KH¿POa, 1 g/L
MgSOx.7H2O, 0,7 g/L NaCl.
15
Trang 28Theo nghiên cứu của Yang năm 2021 về tối ưu hóa môi trường nuôi cây nhân tạo
I japonica kết qua thử nghiệm cho thấy thành phần dinh dưỡng tối ưu cần thiết cho sự
phát triển của sợi nắm Cordyceps trong điều kiện nuôi cấy rắn và lỏng là nhất quán Thinghiệm công thức là 30g/L sucrose, 15 g/L bột men, 2 g/L KH›aPOa, 2 g/L MgSOu vađiều kiện nuôi cấy tối ưu là nhiệt độ 25°C, pH = 7
16
Trang 29CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1 Thời gian va địa điểm nghiên cứu
Địa điểm: đề tài được thực hiện tại Viện nghiên cứu Công Nghệ Sinh Học và MôiTrường, Trường Dai Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh
Thời gian thực hiện: từ thang 8/2023 đến tháng 11/2023
3.2 Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Đối tượng nghiên cứu
Ching nam 7 japonica được cung cap từ công ty Dược phẩm Nhật Bản Osaka,được nuôi trồng và lưu trữ giống tại Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi
trường, trường Đại học Nông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh
Các loại đạm dùng trong nghiên cứu gồm:
Lòng đỏ trứng gà công nghiệp từ công ty cô phần Ba Huân trang trại tại Cụm 1,thị trấn Phúc Thọ, huyện Phúc Thọ, thành phố Hà Nội Đạt chuẩn an toàn vệ sinh thựcphẩm, TCVN 5603 : 2008, ISO 9001 : 2005
Bột đậu nành từ công ty Goce Việt Nam, sản phẩm đạt tiêu chuẩn an toàn quốc tếISO 22000 : 2018 và VSATTP.
Cao chiết nam men mã sản phẩm Q/YB21478, công ty tập đoàn Angel
Cao thịt bò mã sản phim BICA4A0I1, công ty Titan Biotech Ltd
3.3.2 Môi trường sử dụng
Thanh phan 250 ml môi trường lỏng phục hồi giống: 1/2 long trắng trứnggà/trứng, peptone 2,5 g, KH¿PO¿a 0,375 g, Na;HPO4 0,25 g, MgSO¿ 0,225 g, skim milk 2,5 g, glucose 2,5 g.
Long trắng trứng được đánh tan đều trong nước va dun sôi 3 phút Sau đó, loc layphan nước trong bằng giấy lọc (Uni — sci, 12,5 em) Cho các thành phần môi trườnglỏng phục hồi giống vào dung dịch nước trong (ngoại trừ glucose), khuấy hòa tan đều,hấp tiệt trùng (Autoclave, Inolabtech) ở nhiệt độ 121°C trong thời gian khoảng 20 phút.Sau đó, tiễn hành lọc loại bỏ phần rắn, thu được dung dịch trong
Cho 2,5 g glucose vào dung dịch thu được phía trên Tiến hành, khuấy hòa tan,
điều chỉnh pH của dung dich và định mức 250 ml môi trường lỏng bằng nước cất Cho
dung dịch đã định mức vào lọ nuôi trồng, đậy kín bằng bọc nilon, hấp tiệt trùng ở nhiệt
lờ
Trang 30độ 121°C, ở áp suất 1 atm, trong vòng khoảng 20 phút, sau đó để nguội Bảo quản môi
trường ở điều kiện vô trùng tối, nhiệt độ khoảng 4°C để chuẩn bị cho thực hiện thí
nghiệm.
Bảng 3.1 Nguồn gốc nguyên liệu môi trường lỏng tăng sinh
Tên hóa chất Nguồn gốc
Peptone Cas#73049 — 73 — 7, Xilong Scientific
KH2PO4 Cas#7778 — 77 — 0, Scharlab S.L.
Na2HPO4 Nacalai tesque
MgSO, Cas#10034 — 99 — 8, Scharlab S.L.
Skim milk Sigma — Aldrich
Glucose Cas#50 — 99 — 7, Bio Basic
Thanh phan 1 lít môi trường PGA: tinh bột khoai tây 4 g, glucose 20 g, agar 20
ø, MgSO42 g, KH¿PO¿ | g.
Cho tinh bột khoai tây hòa tan với 200 ml nước cat, tiếp đó cho 600 ml nước cất
được đun sôi và khuấy đều Tiến hành, bổ sung các thành phần môi trường PGA vào
dung dịch trên, khuấy đều và định mức lên 1 lit Dem môi trường đã chuẩn bị hấp khửtrùng thời gian khoảng 20 phút ở nhiệt độ 121°C Cuối cung tiễn hành đồ đĩa petri sạch
và bảo quản ở điều kiện vô trùng đề chuan bị cho thí nghiệm
Bảng 3.2 Nguồn gốc nguyên liệu môi trường PGA
Tên hóa chất Nguồn gốc
Tinh bột khoai tay Emsland taerke GmbH
Glucose Cas#50 — 99 — 7, Bio Basic
Agar Bio Basic
MgSO Cas#10034 — 99 — 8, Scharlab S.L.
KH2PO,4 Cas#7778 — 77 — 0, Scharlab S.L.
Thanh phan 1 lít môi trường lỏng tinh: sucrose 49,58 g, bột nhộng 16,6 g, peptone9,9 g, tinh bột khoai tây 4 g, KH2PO4 1 g, MgSOz.7H20O 1 g, vitamin BI 0,02 g (NguyễnAnh Thu, 2017).
Cho tinh bột khoai tay hòa tan với 200 ml nước cat, tiếp đó cho 600 ml nước cấtđược đun sôi và khuấy đều Tiến hành, bồ sung các thành phan môi trường lỏng tĩnh vào
dung địch trên, khuấy đều và định mức lên 1 lít
18
Trang 31Sau đó, cho 150 ml dung dich môi trường lỏng phía trên đều vào các lọ nuôi cấy,hap khử trùng trong khoảng 20 phút ở nhiệt độ 121°C, dé nguội và bảo quản trong đềukiện vô trùng chuẩn bị dé cho thí nghiệm.
Bảng 3.3 Nguồn gốc nguyên liệu môi trường lỏng tĩnh
Tên hóa chất Nguồn gốc
Sucrose Cas#57 — 50 — 1, Xilong Scientific
Bot nhộng Huyén Lam Ha, tinh Lam Đồng
Peptone Cas#73049 — 73 — 7, Xilong Scientific
Tinh bột khoai tây Emsland taerke GmbH
KH2PO4 Cas#7778 — 77 — 0, Scharlab S.L.
MgsS0Oq4.7H20 Cas#10034 — 99 — 8, Scharlab S.L.
Vitamin B1 Cas#67 — 03 — 8, HiMedia Laboratories Pvt, Ltd.
3.3 Phuong pháp nghiên cứu
Các thí nghiệm trong dé tài được tóm tat qua hình 3.1
Nam giống J japonica
J
Phục hồi giống trên
môi trường PGA
|
Phục hồi giống trên Nhiệt độ 20 — 22°C,
môi trường lỏng ủ trong tôi
l
Nuôi cấy trong điều Cấy giống lên
kiện tối trong 30 ngày môi trường lỏng tĩnh
|
Thu hoạch sợi nam
Hình 3.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu nam J japonica
Nam L japonica được lưu trữ trong ống nghiệm ở nhiệt độ thấp lâu ngày sẽ bịthoái hóa hoặc nhiễm khuẩn vậy cần khôi phục dé làm thuần Giống nam được cay tăngsinh trên môi trường PGA 15 — 20 ngày, phục hồi trên môi trường lỏng phục hồi giốngkhoảng 15 — 20 ngày, cay nam 7 japonica đã được phục hồi sang dia petri dé chuẩn bi
19
Trang 32tiễn hành cay sang môi trường sản xuất Nam I japonica sau khi được phục hồi sẽ được
chuẩn bị các thí nghiệm
3.4 Chỉ tiêu đánh giá
Thời gian lan tơ: sau khi cấy sợi nam 7 japonica vào các lọ nuôi cấy sẽ tiên hành
ủ tơ trong điều kiện tối, ở nhiệt độ khoảng 20°C + 2 Lọ nuôi cay nam được theo dõi và
ghi nhận hàng ngày về chỉ tiêu thời gian hệ sợi nam 7 japonica lan kín trên bền mặt
dung dịch môi trường lỏng.
Khối lượng sinh khối nam: sau thời gian 30 ngày nuôi cấy nam trong điều kiện
tối, bằng phương pháp lỏng tĩnh Tiến hành thu lớp sợi nam 7 japonica nỗi phía trên bềmặt dung dịch môi trường nuôi cấy lỏng, sau đó ghi nhận khối lượng tươi (đơn vị gram)
trên một lọ Cuối cùng, đem lớp sợi nam đã thu được tiến hành sấy đông khô và ghi
nhận khối lượng khô
Hiệu suất sinh học: sau khi đã thu được chỉ tiêu về khối lượng khô và khối lượng
tươi của hệ sợi nam J japonica, tiến hành tính hiệu suất khối nam Hiệu suất sinh học
được tính theo Shrestha và ctv (2012) với công thức:
BE (%) " a
Trong do:
SDW : trọng lượng khô của nam thu được trên mỗi bình nuôi cấy (g/bình).MDM : khối lượng cơ chất khô của mỗi bình
BE : hiệu suất sinh học
Hàm lượng Adenosine: các mẫu hệ sợi nam đã thu từ các lọ nuôi cay sẽ đượcchọn hoàn toàn ngầu nhiên Số mẫu phân tích gồm 5 mẫu, mỗi mẫu có 3 lần lặp lại
Quy trình phân tích: mẫu được gửi đến và thực hiện theo quy trình phân tích hàm
lượng Adenosine tại PTN Phân tích Hóa sinh, Viên Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và
Môi trường, trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh
Xây dựng đường chuẩn với dung dịch chuẩn gồm các nồng độ lần lượt 10, 20, 30,
40 mg/l được pha từ dung dịch chuẩn stock Adenosine (CAS: 58 — 61 - 7, SigmaAldrich) Các nồng độ được bom vào hệ thống HPLC dé tìm diện tích peak tương ứngvới các nồng độ dé là cơ sở xác định nồng độ Adenosine trong mẫu Đồ thị đường chuẩnAdenosine được xây dung bang phần mềm Excel với trục tung là điện tích peak (mAU),
trục hoành là nồng độ chất khảo sát Phương trình đường chuẩn có dạng y = ax + b với
20