Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Khảo sát hoạt tính sinh học của vi khuẩn bacillus spp. và xạ khuẩn và ứng dụng tạo chế phẩm khử khuẩn và khử mùi nước tiểu cho thú cưng

TÓM TẮTNghiên cứu này được thực hiện nhằm khảo sát hoạt tính sinh học của xạ khuẩnStreptomyces và vi khuẩn Bacillus, bước đầu tạo tiền đề cho việc nghiên cứu chế phẩm có khả năng kháng k

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRUONG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HOC

KHAO SAT HOAT TÍNH SINH HỌC CUA VI KHUAN

BACILLUS SPP VA XA KHUAN VA UNG DUNG TAO CHE

PHAM KHU KHUAN VA KHU MUI NUOC TIEU

CHO THU CUNG

Nganh hoc : CONG NGHE SINH HOCSinh viên thực hiện : LÊ HỮU LẺ

Mã số sinh viên : 19126082

Niên khóa : 2019 — 2023

TP Thủ Đức, 03/2024

; BỘ GIÁO DUC VÀ ĐÀO TẠO _TRUONG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CUA VI KHUAN

BACILLUS SPP VA XA KHUAN VÀ UNG DUNG TAO CHE

PHAM KHU KHUAN VA KHU MUI NUOC TIEU

CHO THU CUNG

Hướng dẫn khoa hoc Sinh viên thực hiện

PGS.TS TRAN THỊ LỆ MINH LÊ HỮU LE

TS CAO THỊ THANH LOAN

TP Thủ Đức, 03/2024

LỜI CẢM ƠN

Dé hoàn thành khóa luận và kết thúc khóa học, với tình cảm chân thành, em xinbày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đãtạo điều kiện cho em có môi trường học tập tốt trong suốt thời gian em học tập, nghiên

cứu tại trường.

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Trần Thị Lệ Minh, TS Cao ThịThanh Loan và TS Biện Thị Lan Thanh đã giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu

và trực tiếp hướng dẫn em hoàn thành đề tài tốt nghiệp này

Đồng thời, em xin bày tỏ lòng cảm ơn tới ThS Võ Trần Quốc Thắng, các anh chị,các ban và các em trong phòng thí nghiệm Vi sinh BIO 311 va BIO 305 đã tạo mọi điềukiện, chia sẻ khó khăn, giúp đỡ em rất nhiều trong thời gian thực hiện đề tài

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến cô có van học tập ThS Trần Thị Thu Hà và tậpthé lớp DH19SHB - Công nghệ Sinh học khóa 45 và gia đình của em đã luôn bên cạnh,động viên, giúp đỡ trong quá trình thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn.

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên Lê Hữu Lễ, MSSV: 19126082, Lớp: DH19SHB (Số di động: 0866744703,

Email: 19126082@st.hemuaf.edu.vn) thuộc ngành Công nghệ Sinh học Trường Đại học

Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây là Khóa luận tốt nghiệp do bảnthân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin nghiên cứu là hoàn toàn trung thực

và khách quan Trong quá trình làm bài, tôi có tham khảo một số bài nghiên cứu, bàibáo đề thêm tin cậy cho đề tài Những nguồn tài liệu tôi tham khảo đó đã được trích dẫn

và ghi nguồn theo đúng quy định Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Hội đồng

Tp Hồ Chí Minh, ngày 31 tháng 03 năm 2024

Người viet cam đoan

LÊ HỮU LE

il

TÓM TẮT

Nghiên cứu này được thực hiện nhằm khảo sát hoạt tính sinh học của xạ khuẩnStreptomyces và vi khuẩn Bacillus, bước đầu tạo tiền đề cho việc nghiên cứu chế phẩm

có khả năng kháng khuan và khử mùi trên thú cưng Năm chủng vi khuan Bacillus spp

và hai chủng xạ khuân được cung cấp bởi phòng Vi sinh thực pham- Viện Nghiên cứuCông nghệ Sinh học và Môi trường va các chủng xạ khuẩn được cung cấp bởi phòngNấm ăn và dược liệu- Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường tại TrườngĐại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chi Minh được khảo sát hoạt tinh kháng vi khuẩngây bệnh, khả năng phân giải protein, sinh enzyme protease và kiểm tra khả năng khửmùi khi kết hợp Bacillus spp va xạ khuẩn Bằng phương pháp đục lỗ thạch, thực hiệnkhảo sát hoạt tinh kháng vi sinh vật đối với chủng vi khuan Escherichia coli vàSamonella Typhymurium Sử dụng phương pháp cây điểm dé kiểm tra kha năng phângiải protein và kiểm tra khả năng sinh enzyme protease bằng phương pháp Anson Khảnăng kháng khuẩn với 2 chủng vi khuẩn gây bệnh và khả năng khử mùi được khảo sáttrên mẫu thảm khi phối hợp Bacillus spp và xạ khuẩn Kết quả nghiên cứu đã chọn được

2 chung Bacillus spp được nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ 30°C và 1 chủng xạ khuẩn nuôicay ở 37°C có khả năng kháng Escherichia coli, Samonella Typhymurium Có 3 chủng

Bacillus spp có khả năng phân giải protein với vòng phân giải trên 20 mm và một chủng

Bacillus spp sinh enzyme protease cao với hoạt độ 0,86 UI/mI khi được nuôi cấy trongmôi trường có cơ chất casein Tóm lại, đề tài đã xác định được tỉ lệ phối trộn tối ưu trong

nghiên cứu này là hỗn hợp Bacillus subtilis 1.3, Bacillus licheniformis 4.1 (75%) và xạ

khuẩn Streptomyces coelicolor (25%) có khả năng khang Escherichia coli và Samonella

Typhymurium va cô khả năng giảm mùi hôi của nước tiêu mèo.

Từ khóa: Bacillus spp., xạ khuẩn, kháng khuẩn, enzyme protease, khử mùi

1H

This study was conducted to investigate the biological activity of Bacillus spp and Streptomyces spp., as an initial step towards researching solution with antibacterial and deodorizing properties for pets Five strains Bacillus spp were provided by the Food Microbiology Department - Research Institute of Biotechnology and Environment (RIBE) and two strains Streptomyces spp were provided by the Edible and Medicinal Mushrooms Department — RIBE These straintst were investigated for antibacterial activity, proteolytic ability, protease enzyme production, and deodorizing ability The agar well diffusion method was utilized to assess antimicrobial activity against Escherichia coli and Salmonella Typhimurium strains Use the point culture method to evaluate protein hydrolysis potential and test the ability to produce protease enzymes using the Anson method The mixture of Bacillus spp and Streptomyces spp were evaluated for antibacterial effects and for odor reduction on carpet samples Results identified two Bacillus spp strains cultured at 30°C and one actinobacteria strain grown

at 37°C capable of mhibiting Escherichia coli and Salmonella Typhymurium Three Bacillus spp strains exhibited protein hydrolysis with inhibition zones exceeding 20

mm, while one Bacillus spp strain generated high protease enzyme activity of 0.86 UI/ml when propagated in a casein-containing medium In summary, the optimal mixing ratio was determined to be a mixture of Bacillus subtilis 1.3, Bacillus licheniformis 4.1 (75%) and the Streptomyces coelicolor (25%) which could restrain Escherichia coli and Samonella Typhymurium and reduce cat urine odor.

Keywords: Bacillus spp., actinomycetes, antibacterial, protease enzyme, deodorant.

iv

DANH SÁCH CAC CHU VIET TAT oo ccccssscsscsssessesseesseesessesseeeessesenssnteststessineeneesess viiDAHTT S2 Ste TH TH daeesdeedsdnnokpntiiouopoidigEiogfEeSEINHSTSSGS0001G0001400290ugi viii(SES 58 |) || ne a na ixChurong 1 MO DAU ng ^.-'”Ố 1

39327 Dấu điểm hình THỔT, chon HgnH ghe Hi kh gHH g0 KHE ng 3Eg13 10 g6iceEceie 72.2.2.3 Đặc điểm nuôi cấy - -ccc 1112211111121 11111 2111111251111 x tren 7

2.9: ENZYME TDEO LCD SC bi asrereeneeren ren eernee mere Eee 8 2.4 Tinh hình nghiên cứu ở trong va ngoai "ƯỚC 5522 * +2 c+ererrrrrrrrrrrrrre 9 2.4.1 Tình hình nghiên cứu trong NƯỚC - 6 622323 SE + E*EEEkSxrxr nr re 9 2.4.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nƯỚC eceeeeeeeceeecceececeeceeeeceeceeecseeeceeeaees 10

Chương 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP - 2-22 22 22+2z22E2EzzEzzzzzzzez 11

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu - 2 2¿©2222++2E2EE+EE+2EE2EE2EEzExrrrrerxees 11

3.2 Vật liệu va phương pháp nghiên cứu - eee ccc cece cece ecee cess ng 11

B Daa: VI ĐIÌTG Ủoxsssssa14554b 8161028010 86528500638g18G010038893085400360803538030864844L3886:8d6488G3ùG0038G8E24EG3H21 000/8006 li 3.2.1.1 Mẫu thí nghiệm - 2 ¿22225 212SE2EE2E2EE2E221232122121212121211212121121 2.2222 11

3.2.1.2 Thiết bị và dụng cụ - 52-52 522E22112112112121121121111111121121111211 1 ca 11 3.2.1.2 Môi trường và hỗa CA cccsercerssecexesesseveresrasreseessveerntveeumemennionvavncuewus 11

3.2.2 Phuong phap nghién COU 11 12

3.2.2.1 Phương pháp khảo sát hoạt tinh khang sinh của vi khuẩn Bacillus spp 12

3.2.2.2 Phương pháp khảo sat hoạt tính kháng sinh của xa khuan 13

3.2.2.3 Phương pháp khảo sát khả nang phân giải protein cua Bacillus spp 14

3.2.2.4 Phương pháp khảo sát hoạt độ enzyme protease của Bacillus spp 14

3.2.2.5 Phương pháp khảo sát sự tương thích của vi khuan Bacillus spp va xa 0 | {ẽg ` 16

3.2.2.6 Phương pháp khảo sat khả năng kháng khuẩn khi phối trộn vi khuẩn Bacillus Spp- Va Xa to niểễễễ 17

3.2.2.7 Phương pháp khảo sat kha năng khử mùi khi phối trộn vi khuẩn Bacillus spp và xạ khuẩnm + 2s x E9EE2552111211111121111111111111111 1111011111 2111101112121111 2111 re 18 3.3 Phuong 00100100012 07 45 18

Chương 4 KET QUÁ VÀ THẢO LUẬN 2-22 222222EE22E22222EE222222E22Ezzzxcre 19 4.1 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn kiểm nghiệm cua Bacillus spp 19

4.2 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn kiểm nghiệm của xạ khuẩn 21

4.3 Kết quả khảo sát khả năng phân giải protein của Bacillus spp 23

4.4 Kết quả khảo sát hoạt độ enzyme protease của Bacillus subtilis 1.3 25

4.5 Kết quả khảo sát sự tương thích của vi khuân Bacillus spp và xạ khuan 26

4.6 Kết quả khảo sát khả năng kháng vi khuân kiêm nghiệm của hỗn hợp vi khuẩn BaGillus' SP: và xạ KUEN | ssxsesssssesssessissssAE1SiLDTHD SE S1413G38838550010183305585884343144E94505248448838 2] 4.7 Kết quả khảo sát kha năng khử mùi khi phối trộn vi khuẩn Bacillus spp va xạ 0 72Ẽ2Ẽ525Ẽ 5 .L 29 Chương 5 KET LUẬN VÀ DE NGHỊ, -2- 2 2+2E+2E22E2EE22E22E22E222223222222222e2 32 _AÌh lội ri 32 B5, Độ THÍ ceeeeesnanberoerorntoestotnnggtrsbontStgbiOEB00G-9001G80-003800.805/0308G010N1000800g0-2g-Ga0 5

ce Re a St, re xeeeenevaararaaartrhoogroeoarraeraseeornterasadae ki

PE De UC rsscepesormesg emer aurora nelson au sc cas ET SE SU ETE USTED RTRSNSINESS

VI

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TAT

Vil

DANH SÁCH CÁC BANG

Trang

Bảng 2.1 Các phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subfiÏis 55-5: 6Bang 2.2 Các phản ứng sinh hóa của vi khuân Bacillus lichenifOrIis iBang 3.1 Quy trình dung đường chuẩn tyrosine 2: 2¿©2222z22z+22+22xzzzzzzzzzsez 15

Bảng 3.2 Quy trình đo hoạt độ enzyme prOf€ASe SG c2 2k 2e 15

Bang 3.3 B6 trí nghiệm thức tỉ lệ phối trộn Bacillus spp và xạ khuan 17Bảng 4.1 Hoạt tinh kháng vi sinh vật kiểm nghiệm của 5 chủng Bacillus spp 20Bảng 4.2 Hoạt tinh kháng Escherichia coli của 2 chủng xạ khuân 2⁄2Bảng 4.3 Hoạt tính kháng Samonella Typhymurium của 2 chủng xạ khuan 22

Bảng 4.4 Kích thước vòng phân giải protein của 5 chủng Bacillus 25

Bảng 4.5 Kết quả hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm nghiệm của 3 nghiệm thức phối

VII

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 4.1 Kết quả kháng Escherichia coli của 5 chủng Bacillus spp 19Hình 4.2 Kết quả kháng Samonella Typhymurium của 5 chủng Bacillus spp 19Hình 4.3 Kết qua khang Escherichia coli và Samonella Typhymurium của chủng xakhuan Streptomyces coelicolor tăng sinh trong môi trường SCA -2- 21Hình 4.4 Kết quả vòng phân giải protein của 5 chủng Bacillus spp 24Hình 4.5 Kết quả khảo sát sự tương thích của vi khuân Bacillus spp và xạ khuẩnStreptomyces coelicolor khi cây cùng lúc -.25 2222 37Hình 4.6 Kết quả khảo sát sự tương thích của vi khuẩn Bacillus spp và xạ khuẩn

Streptomyces coelicolor khi cây xạ khuẩn trước 3 ngày -5c-555-55c2 27

Hình 4.7 Kết qua khang Escherichia coli và Salmonella typhimurium của 3 nghiệmthức phối trỘn 2-2-2 222221+2E2EE22122122152152122121271212112112111211212121212121 2 xe 28Hình 4.8 Kết quả nghiệm thức mẫu vải + nước (1) và mẫu vải + nước tiểu (II) sau khi

bô sung hôn hop Bacillus và xạ khuân ở tỉ lệ 3:1 (BX 3:I) - -5- 30

1X

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay, nhịp độ cuộc sống ở các thành phố lớn ngày càng tăng nhanh,khối lượng công việc nhiêu khiến con người cảm thấy áp lực hơn Nhiều người lựachọn các hình thức giải toa căng thang khác nhau như chơi thé thao, di du lịch, vàviệc nuôi thú cưng là một trong số đó Theo Pet Fair Asia, doanh số ngành thú cưngtại khu vực Đông Nam Á đạt trị giá 4 tỷ USD Trong đó, Việt Nam chiếm 13%, tươngđơn hơn 500 triệu USD Thái Lan được xem là thị trường lớn nhất về quy mô với43,6% thị phần và cũng giữ tốc độ tăng trưởng hàng năm cao nhất với 13% Việt Namxếp thứ ba với 11%, sau Indonesia là 12% Tuy nhiên, Việt Nam được dự đoán sẽtrở thành một trong những thị trường sôi động nhất về tốc độ tăng trưởng kép hàngnăm Tại đây, nhu cầu nuôi và chăm sóc thú cưng đã trở nên phổ biến và được nhiềungười ưa thích, trở thành một xu hướng mới của giới trẻ Từ đó, việc mua sắm

và sử dụng các dich vụ cho thú cưng cũng ngày càng tăng cao (Huy va ctv, 2022).

Dù rất yêu thú cưng nhưng đôi khi cũng cảm thấy phiền toái với những mùi hôi khó chịu

từ đồ chơi, nệm, chuồng, quần áo hay mùi nước tiêu của chúng, lúc này xịt khử mùi làmột phương án nhanh gọn hiệu quả nhất Không chỉ là khả năng khử mùi mà còn cầntác dụng làm sạch và diệt vi khuẩn từ phân và nước tiêu gây ra môi đe dọa cho con người

do tiếp xúc với Salmonella va Escherichia coli có trong phan (Drózdz và ctv, 2022).Đối với các chất khử mùi có chứa các thành phần hoá học nói chung, hầu hết mọi ngườiđều sử dụng các chất này trong một không gian khép kín nên sẽ rất có hại cho sức khoẻcủa các thành viên trong gia đình và cả vật nuôi đồng hành, hiện nay những sản phẩmkhử mùi từ thiên nhiên và sinh học đang được quan tâm và nghiên cứu nhiều hơn như:

xà phòng từ tinh dau chúc (Đặng và ctv, 2022), nước xịt phòng từ dược liệu (Hồ và ctv,2016), chế phẩm vi sinh vật dé xử lý phế thải rắn (Nguyễn va ctv, 2016), chế phẩm visinh chứa vi khuẩn bacillus xử lí phân chim cut (Thị Vân va ctv, 2021), chế phẩm visinh được sản xuất từ các chung vi khuẩn Bacillus va xạ khuẩn Streptomyces ưa nhiệt

xử lí chất thải rắn chăn nuôi (Chính và ctv, 2021) Xa khuẩn có các đặc tính sinh lý vàchuyền hóa đa dạng, có khả năng sinh tong hợp nhiều loại enzyme ngoại bao, enzyme

có nguồn góc từ xạ khuẩn thường hoạt động tốt ở nhiệt độ cao và trong khoảng pH rộngnên được ứng dụng nhiêu trong các ngành công nghiệp sản xuât, các chât chuyên

1

hóa từ xạ khuẩn có tác dụng kháng khuẩn, kháng nam, chống oxy hóa, chống ung thu,chống giun san, chống sốt rét và chống viêm nên xạ khuẩn là loài vi sinh vật luôn đượcchú trọng trong các nghiên cứu (Thị va ctv, 2021) Bacillus được biết đến là vi sinh vật

có khả năng sản xuất các loại enzyme có lợi trong công nghiệp, enzyme sản xuất bởi cácdòng vi khuan thuộc chi này chiếm khoảng 60% tổng thị trường enzyme, Bacillus cònsản xuất kháng sinh polypeptide, chang hạn như bacitracin, gramicidin S, polymyxin vàtyrotricidin có khả năng chống lại nhiều loài vi khuẩn Gram dương và Gram âm (Naidu,2011; Tâm & Thịnh, 2020) Nghiên cứu này được thực hiện nhằm khảo sát khả năngsinh enzyme protease và kháng khuẩn của xạ khuẩn và vi khuẩn Bacillus, bước đầu tạotiền đề cho việc nghiên cứu chế phâm có kha năng kháng khuẩn và khử mùi nước tiểu

mẻo.

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Khảo sát khả năng sinh enzyme protease của Bacillus và khả năng kháng khuẩncủa xạ khuẩn nhằm và xác định tỉ lệ phối trộn giữa hỗn hợp vi sinh vat (Bacillus subtilis

và Bacillus licheniformis ) và xạ khuẩn có khả năng kháng khuẩn và giảm mùi hôi nướctiêu mèo

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của vi khuan Bacillus spp và xạ khuẩnNội dung 2: Đánh giá hoạt độ enzyme protease của vi khuẩn Bacillus spp và khả năngphân giải protein của vi khuẩn

Nội dung 3: Đánh giá hiệu quả khử mùi và khử khuân của nghiệm thức phối trộn

Chương 2 TONG QUAN TÀI LIEU

21 Tổng quan về xạ khuẩn

2.1.1 Giới thiệu chung và sự phân bố xạ khuẩn trong tự nhiên

Xa khuẩn là nhóm vi khuẩn đặc biệt, thuộc nhóm vi khuẩn gram dương, phân bốchủ yếu trong dat Xa khuẩn thuộc lớp Actinobacteria, bộ Actinomycetales, bao gồm 10dưới bộ, 35 họ, 110 chi và 100 loài Hiện nay có 478 loài được công bố thuộc chỉStreptomyces và hơn 500 loài thuộc các chi còn lại và được xếp vào nhóm xạ khuanhiếm Trong số khoảng 1000 chi và 5000 loài đã công bố có khoảng 100 chi và 1000loài xạ khuẩn được công bố Xa khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên, sé lượng đơn vikhuẩn lạc trong đất có thê lên đến hàng triệu, theo Waksman thì trong 1 gam đất cókhoảng 29000 - 2400000 CFU xạ khuẩn, chiếm 9 - 45% tổng số vi sinh vat Xa khuẩnđóng vai trò quan trong trong chu trình tuần hoàn vật chất trong tự nhiên, sử dụng axithumic và các hợp chất hữu cơ khó phân giải khác trong đất (Nguyễn và ctv, 2002)

2.1.2 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn

Giống như các loại vi sinh vật khác, khi nuôi cay xa khuẩn trên môi trường thạch,

xạ khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc Tuy nhiên, tùy theo loài và môi trường nuôicay khác nhau mà kích thước, mau sắc khuẩn lạc có thé khác nhau như: đỏ, da cam,vàng, nâu, tím, trang, xám Khuan lạc của xạ khuan rat đặc biệt, không trơn ướt như vikhuẩn hay nắm men, khuẩn lạc thường khô, chắc, xù xi, có dạng da, dạng nhung tơ, haydạng màng dẻo và đa số có hình dang phóng xạ có các nếp gap tỏa ra những khuẩn thélại có dang phân nhánh như nắm (Nguyễn và ctv, 2002)

Xa khuẩn có thé mọc thành dang màng hay dạng vòng trên thành bình nuôi cấykhi nuôi cấy trong môi trường dịch thể, trên bề mặt môi trường hay thành dạng bọt hoặckết tủa kiểu vi khuan Khi nuôi cấy chìm trên máy lắc hoặc nồi lên men được khuấy đảothì xạ khuẩn phát triển thành dạng sợi bông hoặc cặn xốp Thường gặp hơn cả là xạkhuẩn phát triển thành những quả cầu nhỏ chứa day môi trường

2.1.3 Sự hình thành các hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn

Xa khuẩn là nhà sản xuất các chất chuyên hóa có hoạt tính kháng khuẩn, chống

ký sinh trùng, kháng virus, chống ung thư, gây độc tế bào, có cấu trúc hóa học là duynhất Streptomyces là nguồn cung cấp các chất chuyền hóa thứ cấp dồi dào tạo ra nhiềuloại kháng sinh, hơn 80% thuốc kháng sinh trên thị trường là từ Streptomyces (Rajan &

3

Kannabiran, 2014).

Chat kháng sinh (Antibiotic) là những chat có tính chống lại các vi sinh vật gâyhại, chúng có hoạt tính sinh lý cao, có tác động chọn lọc và được các vi sinh vật tiết ra

đi vào môi trường sống trong mối quan hệ đối kháng với các vi sinh vật khác trong đó

có vi khuân, nam, xạ khuẩn là những vi sinh vật sinh ra nhiều chat kháng sinh nhất Chấtkháng sinh có tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác mộtcách có chọn lọc ngay khi ở nồng độ thấp, có thé can thiệp vào hoạt động sinh lý củamột chất khác bằng cách kết hợp đặc hiệu với thụ thể, kềm hãm hoặc ức chế sự pháttriển của vi sinh vật khác (Lân Dũng va ctv, 2002)

Chất kháng sinh được tong hop từ một, hai, ba chất trao đổi bậc một khác nhau,

hay bằng cách polyme hóa các chất trao đổi bậc 1 sau đó tiếp tục biến đổi qua các phảnứng enzyme khác đề tạo thành các dạng kháng sinh khác nhau

Chất kháng sinh còn là chất tham gia cạnh tranh của xạ khuẩn trong môi trườngsong tự nhiên Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều chatkháng sinh có cấu trúc hóa học và tác dụng tương tự nhau Quá trình sinh tổng hợp chấtkháng sinh phụ thuộc vào cơ chế điều khiển gen ngoài các gen chịu trách nhiệm tonghợp chất kháng sinh, còn có cả các gen chịu trách nhiệm tông hợp các tiền chất, enzyme

và cofactor (Phan và ctv, 2016).

Quá trình tổng hợp các chất kháng sinh ở xạ khuẩn bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tốnhư pH, nhiệt độ, thành phần môi trường lên men (nguồn cacbon, nguồn nitơ, nguồnphotphat vô cơ, các yếu tố vi lượng) (Thị va ctv, 2021)

2.2 Vi khuẩn Bacillus

Bacillus là trực khuân Gram dương, tế bào hình que thang, kích thước 0,5 - 2,5

um x 1,2 - 10 wm và thường được sắp xếp thành từng cặp hoặc chuỗi, có đầu tròn.Bacillus có phô chịu nhiệt, pH và độ mặn rộng, con đường biến dưỡng bằng hình thứclên men hoặc hô hấp, hầu hết có catalase dương tính Hình thái khuẩn lạc của chi Bacillus

với khuẩn lạc tròn, rìa khuẩn lạc nhăn, bề mặt gồ ghé, nhăn nheo như tạo các mang bam,

màu trang đục đến vàng sáng (Nguyễn Ngọc An va ctv, 2022)

Vi khuẩn Bacillus có thé sản xuất một số hợp chất ức chế sự phát triển của vikhuẩn cạnh tranh Trong số các hợp chất này, các bacteriocin là quan trọng nhất, bêncạnh đó, Bacillus còn sản xuất kháng sinh polypeptide, chang hạn như bacitracin,gramicidin S, polymyxin và tyrotricidin có khả năng chống lại nhiều loài vi khuân Gram

4

dương va Gram âm (Abriouel và ctv, 2011).

Bacillus có thé sử dung các enzyme ngoại bào do quá trình phân giảipolysaccharide, nucleic acid và lipid làm nguồn carbon và chất cho điện tử Các loàithuộc chi Bacillus được biết đến là vi sinh vật có khả năng sản xuất các loại enzyme cólợi trong công nghiệp Enzyme sản xuất bởi các dòng vi khuẩn thuộc chi này chiếmkhoảng 60% tông thị trường enzyme (Naidu, 2011) Các loài Bacillus khác nhau có thésản xuất một số enzyme quan trọng như amylase, cellulase, proteae tannase, pectinase

và betaglucosidase Ngoài ra, Bacillus được sử dụng rộng rãi nhất làm probiotic baogồm B subtilis, B clausii, B cereus, B coagulans và B licheniformis

Các chế phẩm sinh hoc chứa bao tử dang được sử dụng rộng rãi ở người như làchất bổ sung dinh dưỡng, ở động vật như chat kích thích tăng trưởng, các chất cạnh tranhchống vi sinh vật gây bệnh và bổ sung vào các sản phẩm sinh học dé tạo ra các sản pham

khử mùi (Tâm và Thịnh, 2020).

2.2.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis

2.2.1.1 Đặc điểm phân loại

Theo khóa phân loại của Bergey (Kovacs, 2019), vi khuân Bacillus subtilis thuộc:

gian nhân đôi chỉ trong 20 phút (Errington va van der Aa, 2020) Bacillus subtilis con

được gọi là trực khuẩn cỏ hoặc trực khuẩn rơm vi hay được tìm thấy trong cỏ, rơm vađất (Su và ctv, 2020)

Mỗi cá thé Bacillus subtilis có chiều dai 2 — 6 wm, đường kính (chiều ngang) 0,25

— 1 pm, hai đầu tròn, có thé có 8 — 12 lông nhỏ (Errington và van der Aa, 2020) Bacillus

subtilis thường tồn tại đơn lẻ, nhưng cũng tạo thành "quần thé" hình chuỗi ngắn, có khả

năng di động trong môi trường nước nhờ hoạt động của các lông giống như trùng roi

Bao tử hình bau dục nhỏ, kích thước từ 0,8 — 1,8 um, được bao bọc bởi vỏ gồmnhiều lớp màng với các thành phần lipoprotein, peptidoglycan Trong điều kiện không

5

thuận loi, Bacillus subtilis thường tồn tại ở trạng thái bao tử, có lớp vỏ khá day và cứng

chịu đựng được điều kiện môi trường khắc nghiệt, có khả năng chịu được pH thấp, có

khả năng chịu nhiệt (ở 100°C trong 180 phút), chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ, ápsuất, chất sát trùng, có thể sống vài năm đến vài chục năm (Hartig và Jahn, 2012)

2.2.1.3 Đặc điểm nuôi cấy

Môi trường thạch đĩa TSA: khuẩn lạc có dạng hình tròn rìa răng cưa không đều,

có tâm sam mau, phát triển chậm, màu vàng xám, đường kính 3 — 5 mm Sau 1 — 4 ngày

bề mặt nhăn nheo màu hoi sam Môi trường canh TSB: Bacillus subtilis phát triển làm

đục môi trường, tạo màng nhăn, lăng cặn kết lại như vân mây ở đáy.

Bảng 2.1 Các phản ứng sinh hóa của vi khuan Bacillus subtilis

2.2.2.1 Đặc điểm phân loại

Ho: Bacillaceae

Giống: Bacillus

Loài: Bacillus licheniformis

2.2.2.2 Dac diém hinh thai

Bacillus licheniformis là một loại vi khuan thường được tim thấy trong đất Đượctìm thấy trên lông chim, đặc biệt là bộ lông ngực và lưng, và thường thấy nhất ở các loàichim sống trên mặt đất (như chim sẻ) và các loài sống dưới nước (như vịt) (Rey và ctv,

2004).

Bacillus licheniformis là vi khuẩn gram đương , hình thành bào tử , ky khí tùy

nghị, hình que va đơn lẻ, kích thước của vi khuẩn là 0,8 um * (1,5 - 3,5) um Nhiệt độ

tăng trưởng tối ưu là khoảng 50°C, mặc dù có thé tồn tại ở nhiệt độ cao hơn nhiều Nhiệt

độ tối ưu dé tiết enzyme là 37°C Bacillus licheniformis có thê tồn tại ở dang bào tửkhông hoạt động đề chống lại môi trường khắc nghiệt hoặc ở trạng thái sinh dưỡng khiđiều kiện tốt (Veith và ctv, 2004)

2.2.2.3 Đặc điểm nuôi cay

Môi trường thạch đĩa TSA: khuẩn lạc lỗi, duc, mờ, dạng sụn đến rất nhay, trung

tâm khuẩn lạc trang đục, khô và phẳng, đường kính 4mm — 8mm Một số phần của khuẩnlạc sẽ bám dính vào cơ chất chắc hơn các phần khác Môi trường canh TSB: Bacillussubtilis phát trién làm đục môi trường, lắng cặn kết lại như van mây ở đáy

Bang 2.2 Các phản ứng sinh hóa của vi khuân Bacillus licheniformis

2.3 Enzyme protease

Enzyme protease xúc tác quá trình thủy phan protein thành các phan peptide nhỏ

và axit amin, chiếm khoảng 60% giá trị thương mại trên thị trường enzyme thế giới(Naidu, 2011) Protease vi khuẩn chủ yếu là ngoại bao, dé dang sản xuất với số lượnglớn hơn, ôn định nhiệt và hoạt động ở phạm vi pH rộng hơn Do dễ xử lý, 6n định vàchi phí nuôi cay thấp, vi khuẩn là nguồn hấp dẫn dé sản xuất protease Ngày nay,protease trở thành enzyme có vai trò quan trọng hàng đầu trong ngành công nghiệp bởi

những ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, dệt, da, mỹ phẩm, dược

pham và xử lí nước thai (Iqbal và ctv, 2018)

Protease được phân loại bao gồm exopeptidase (aminopeptidase và

carboxypeptidase) va endopeptidase (serine, cysteine, aspartic, metallico, threonine, glutamic endopeptidase va asparagine peptide lyase) dựa trên vi trí của peptide Dựa

trên pH, protease có thé được phân loại thành kiềm, trung tinh và axit Protease kiềm

khá quan trọng trong thị trường công nghiệp toàn cầu vì chúng có khả năng chịu được

các điều kiện pH cao.Trong tất cả các nguồn thu nhận protease, vi khuân được xem lànguồn thu nhận protease lý tưởng so với động vật và thực vật và nam, đặc biệt Bacillus

là một trong những chi quan trong được nuôi cấy dé thu nhận protease vì tốc độ tăngtrưởng nhanh, khả năng tiết enzym ngoại bào vào môi trường cao và an toàn dễ kiếm

soát (Thị và ctv, 2019).

Vi khuẩn được phân lập trong mẫu nước tiêu mèo và chó đã phát hiện 18,4% mẫu

từ chó và 10,0% từ mèo, hầu hết (>90%) đều chỉ có vi sinh vat Escherichia coli là loài

vi khuân phô biến nhất (lần lượt là 54,7% và 55,6% phân lập ở mèo và chó), tiếp theo

là Proteus mirabilis trong các mẫu chó (22,7%) và Enterococcus spp trong mẫu mèo

(23.2%) (Fonseca và ctv, 2021) Mùi hôi trong nước tiêu thường là do hợp chất hữu cơđược gọi là urea (Rose và ctv, 2015) Sinh khối vi khuẩn là thành phần chính (25-54%chất rắn khô) của phần hữu cơ trong phân Carbohydrate, chất xơ, protein và chất béokhông tiêu hóa chiếm phần còn lại (Rose và ctv, 2015) Phân chủ yếu bao gồm nước,urea, các mudi khoáng và các chất rắn hữu co (Mackie va ctv, 1998) Urea là một chathữu cơ đơn giản được tạo ra từ quá trình phân hủy protein trong cơ thê động vật, trong

đó các axit amin được chuyên hóa thành ammonia, sau đó kết hợp với carbon dioxide

để tạo thành urea, enzyme urease tham gia vào quá trình phân hủy urea thành ammonia

và carbon dioxide Ammonia là một chất khí có mùi khá đặc trưng và không dễ chịu.

8

Khi ammonia tiếp xúc với môi trường 4m ướt hoặc với vi khuẩn, nó có thé tạo ra mùi

hôi khá nặng (Watson, 2000).

Theo Muck và Steenhuis (1981), phần chính của amoniac (NH3) có nguồn gốc từ

sự phân hủy nitơ urê trong nước tiêu bởi các vi khuẩn sản sinh urease như Bacteriodes,Bifidobacteria, Proteus spp và các vi khuẩn khác (Muck và Steenhuis, 1981) Một sốkhác, đặc biệt là E coli, không có hoạt tinh urease nên giải phóng amoniac bang cáchkhử nitơ hữu cơ khác ngoài urê (Vince và ctv, 1973) Ngay khi nước tiểu tiếp xúc vớiphân, urê sẽ được chuyền hóa thành NH: và carbon dioxide bởi enzyme urease của vi

sinh vật có trong phân khi có pH cao (Stevens va ctv, 1989) Do đó, việc giảm mật độ

vi khuẩn sinh enzyme urease như Bacteriodes, Bifidobacteria, Proteus spp., Escherichiacoli sẽ giảm sản xuất enzyme urease từ đó giảm sản xuất amoniac hạn chế được mùi hôi.Theo Abriouel va ctv (2011) khả năng kháng khuẩn của Bacillus spp có được là do khảnăng tiết ra các loại bacteriocin, lipopeptide và các chất ức chế giống bacteriocin khác(Abriouel va ctv, 2011) Bacillus subtilis được chứng minh là sinh ra chất kháng khuẩn

bacteriocin có kha năng kháng Escherichia coli va Proteus spp (Algburi và ctv, 2020;

Xiang va ctv, 2021), từ đó giúp làm giảm mật độ vi khuẩn Escherichia coli va Proteus

spp có trong phân do đó làm giảm phát thai amoniac gây mùi hôi Một khả năng khác

là Bacillus sản xuất một số enzyme ngoại bào bao gồm metallicoprotease và protease,

có thê cải thiện quá trình tiêu hóa nitơ hữu cơ trong phân và do đó làm giảm sản xuấtamoniac (Ye-Jin và ctv, 2014) Độ pH của bùn là một yếu tô quan trọng khác ảnh hưởngđến sự phát thải amoniac (Freney và ctv, 1983) Bacillus đã được báo cáo là có kha nănglàm giảm độ pH của bùn thông qua việc sản xuất axit hữu cơ (Wang và ctv, 2009), từ

đó có thé làm giảm quá trình thủy phân urê và khử amin của các dang nitơ khác, do đó

làm giảm lượng khí thai NH3 gây mùi hôi.

2.4 Tình hình nghiên cứu ở trong và ngoài nước

2.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Năm 2021, Đoàn Thị Vân và cộng sự đã tạo ra chế phẩm vi sinh Biopro từ vikhuan Bacillus lichenoformis TT01 có kha năng ức chế và tiêu diệt vi khuan gây hai

có trong phan chim cut (Escherichia coli va Salmonella typhi).

Năm 2012, Tran Thi Hồng Nghi va ctv đã nghiên cứu ứng dung enzyme proease

từ vi khuan Bacillus subtilis dé thủy phân phụ phẩm từ cá tra

Năm 2021, Tặng Thị Chính và ctv đã nghiên cứu sử dụng chế phẩm vi sinh ưa

9

nhiệt Sagi bio được sản xuất từ chủng vi khuan Bacillus và xạ khuẩn Streptomyces ưanhiệt xử lí chất thai ran trong chăn nuôi bò có tác dung ức chế vi khuẩn gây bệnh như

Escherichia coli và Salmonella typhi.

Năm 2013, Nguyễn Văn hiếu va ctv đã nghiên cứu chủng xa khuẩn HLD 3.16 cókhả năng kháng đối với Escherichia coli và Salmonella typhi

2.4.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Năm 2020, Algburi va ctv đã nghiên cứu chứng minh Bacillus subtilis sinh ra chấtkháng khuẩn bacteriocin có khả năng khang Escherichia coli và Proteus spp

Năm 2020, Changning Li va ctv đã nghiên cứu tác động của chất khử mùi vi sinhvật MIX có chứa vi khuẩn Bacillus đối với quá trình lên men phân lợn và cơ chế khử

mùi cơ bản.

Năm 2014, Ye-Jin va ctv đã nghiên cứu đánh giá của Bacillus amyloliquefaciensnhư một chất phụ gia phân bón để kiểm soát khí thải có mùi từ phân heo, đã phát hiệnBacillus sản xuất một số enzyme ngoại bào bao gồm metallicoprotease va protease, cóthể cải thiện quá trình tiêu hóa nitơ hữu cơ trong phân và đo đó làm giảm sản xuất

amoniac

10

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 07/08/2023 đến 30/11/2023 tại phòng thí nghiệm

Vi sinh BIO 311 và BIO 305, Khoa Khoa học Sinh học tại Truong Đại học Nông Lâm

Thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Vật liệu

3.2.1.1 Mẫu thí nghiệm

Các chủng vi khuẩn Bacillus spp.: Bacillus subtilis 1.3, Bacillus subtilis 1.1,

Bacillus licheniformis 4.1, Bacillus licheniformis 4.2, Bacillus licheniformis 4.3 được

cung cấp bởi phòng Vi sinh thực phâm - Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học va Môitrường tại Trường Đại học Nông Lâm Thành phó Hồ Chi Minh

Các chủng xạ khuẩn: Streptomyces costaricanus, Streptomyces coelicolor đượccung cấp bởi phòng Nam ăn và dược liệu - Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học vàMôi trường tại Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

Các chủng vi khuẩn kiểm nghiệm: Escherichia coli ATCC 25922, SamonellaTyphymurium ATCC 14028 được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Vi sinh BIO 311-

Khoa Khoa học Sinh học tại Trường Dai học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.2.1.2 Thiết bị và dụng cụ

Các trang thiết bị gồm: tủ cấy vi sinh đôi SW-CJ-2F (Trung quốc), nồi hấp tiệttrùng LS-50LJ (JIBIMED - Trung Quốc), cân điện tử VIBRA SJ (VIBRA - JAPAN), tủlắc 6n định nhiệt độ Daihan IS-10 (Daihan - Hàn Quốc), Máy ly tâm thường Hettich -EBA 20S (Hettich - Đức), May Khuấy Từ Gia Nhiệt Model UC152 (STUART - Anh)

Dụng cụ gồm: đĩa petri, ống nghiệm, que cấy trải, que cấy vòng, các loạimicropipette, đầu tuýp, bình erlenmeyer, đèn cồn, ống falcon, ống eppendoft, ông đong,bút ghi mẫu, giây lọc và một số dụng cụ trong phòng thí nghiệm

3.2.1.3 Môi trường và hóa chất

Môi trường được sử dung dé tăng sinh xạ khuẩn gồm có:

Môi trường SCA: tinh bột 10 g/L, casein 0,3 g/L, KNO3 2 g/L, NaC]; g/L, KaHPO¿ 2 g/L, MgSO4.7H20 0,05 g/L, CaCOa 0,02 g/L, FeSO4.7H20 0,01 g/L, thạch agar 20 g/L,

pH = 7,0.

11

Môi trường Gause I: tinh bột 20 g/L, KNO: 1 g/L, NaCl 0,5 g/L, K2HPOs 0,5 g/L,

MgSOa.7HaO 0,5 g/L, FeSO4.7H20 0,01 g/L, thạch agar 20 g/L, pH = 7,2 - 7.4.

Môi trường ISP4: tinh bột 10 g/L, NaCl 1 g/L, K2HPOs« 1 g/L, CaCO: 2 g/L, MgSOs.7H20 1 g/L, (NHa)2SOs4 2 g/L, thạch agar 20 g/L, pH = 7,2 - 7,4.

Môi trường dùng dé tăng sinh va cấy truyền Bacillus spp., Escherichia coli vàSamonella typhymurium gồm có:

Môi trường TSA: pancreatic digest of casein 15 g/L, enzymatic digest of soya bean 5 g/L, sodium chloride 5 g/L, thạch agar 20 g/L, pH = 7,1 — 7,5.

Môi trường NA: Peptone 5 g/L, Sodium chloride 5 g/L, HM peptone B# 1,5 g/L, Yeast extract 1,5 g/L, thach agar 20 g/L, pH = 7,2 — 7,6.

Môi trường dùng cho phương pháp kháng khuẩn gồm:

Môi trường MHA: acid digest of casein 17,5 g/L, beef extract 2 g/L, starch 1,5 g/L, sodium chloride 5 g/L, thach agar 20 g/L, pH = 7,1 - 7,5.

Khang sinh Ampicillin va Tetracyclin được sử dung làm đối chứng dương va nướccất được sử dụng làm đối chứng âm trong thử nghiệm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.2.1 Phương pháp khảo sát hoạt tinh kháng khuẩn của vi khuẩn Bacillus spp

Năm chủng vi khuẩn được sử dung dé kiêm tra khả năng khang Escherichia coliATCC 25922 và Samonella Typhymurium ATCC 14028 bao gồm: Bacillus subtilis 1.3,

Bacillus subtilis 1.1, Bacillus licheniformis 4.1, Bacillus licheniformis 4.2, Bacillus

licheniformis 4.3 Khảo sát được tiễn hành trên môi trường MHA

Chuan bị dich tăng sinh vi khuẩn: các chủng vi khuẩn kiểm nghiệm được trữ đôngtrong glycerol 20% được tiễn hành hoạt hóa trong môi trường TSB và ủ ở nhiệt độ 37°Ctrong 24 gid Ria vi khuẩn kiểm nghiệm trên môi trường TSA dé làm thuần chuẩn bịcho những thí nghiệm sau Tiến hành tăng sinh vi khuân kiểm nghiệm trong môi trườngTSB ở 30°C trong 24 giờ và được điều chỉnh sao cho mật số đạt 108 CFU/ mL bang cách

sử dung máy đo quang phổ ở bước sóng 625 nm Dé môi trường thích hợp khảo sát hoạttính kháng sinh MHA vào các đĩa petri Hút 100 uL địch vi khuẩn kiểm nghiệm mật số

108 CFU/ mL tiến hành cấy trải lên môi trường MHA

Chuan bị dich vi khuẩn Bacillus spp khảo sát hoạt tính khang sinh: các chủng vikhuẩn Bacillus spp được trữ trong thạch nghiêng sẽ được tiến hành hoạt hóa trong môitrường TSB và ủ ở nhiệt độ 37°C trong 24 giờ Ria các chủng vi khuan Bacillus spp trên

12

môi trường TSA để làm thuần chuẩn bị cho những thí nghiệm sau Tiến hành tăng sinhcác chủng vi khuẩn Bacillus spp trong môi trường TSB ở 30°C, lắc 180 vòng/ phút trong

24 giờ Hoạt tính kháng sinh của vi khuẩn được xác định dựa trên phương pháp đục lỗ

thạch mô tả ở mục 3.2.2.2.

3.2.2.2 Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của xạ khuẩn

Hai chủng xạ khuẩn được sử dung dé kiểm tra khả năng kháng Escherichia coliATCC 25922, Samonella Typhymurium ATCC 14028 bao gồm Streptomycescostaricanus, Streptomyces coelicolor Khảo sat được tiễn hành trên môi trường MHA

Chuẩn bị dịch xạ khuẩn khảo sát hoạt tính kháng khuẩn: các chủng xạ khuẩn đượctrữ trong thạch nghiêng sẽ được tiến hành hoạt hóa trong môi trường Gause I lỏng và ủ

ở nhiệt độ 37°C trong 7 ngày Ria các chủng xạ khuẩn trên môi trường Gause I thạch délàm thuần chuẩn bị cho những thí nghiệm sau Tiến hành tăng sinh các chủng xạ khuântrong các môi trường SCA lỏng, Gause I lỏng, ISP4 lỏng ở 37°C, lắc 180 vòng/ phút

trong 7 ngày.

Phương pháp đục lỗ thạch: dau tip có đường kính 8 mm được dùng dé đục lỗ trên

bề mặt đĩa thạch MHA Hút 50 pl đối chứng đương ampicillin, 50 pl đối chứng âm nướccất, 50 ul dịch vi khuan Bacillus spp va 100 ul dịch xa khuan da tang sinh cho vao 16

da duoc duc trén bé mat dia thach MHA da cay vi khuan kiém nghiệm Vì khuẩn kiểmnghiệm nuôi ở 37°C, riêng đĩa có chứa dich tăng sinh các chủng xạ khuẩn cần ủ trước ở

tủ mát 10°C dé dịch tăng sinh khuếch tán trong môi trường thạch trước sau đó đem ủ ở

37°C cho vi khuẩn kiểm nghiệm phát triển Đọc kết quả sau 1 ngày, các nghiệm thứcđược lặp lại ba lần Hoạt tính kháng khuẩn được xác định dựa vào kích thước vòng

Kháng mạnh: kích thước vòng kháng > 10 mm.

3.2.2.3 Phương pháp khảo sát khả năng phân giải protein của Bacillus spp.

Môi trường NA chứa 0,1% casein được sử dung nhằm khảo sát khả năng phângiải protein của năm chủng Bacillus spp trong nghiên cứu này Các nước thực hiện gồm

có:

Chuẩn bị thuốc nhuộm amido black 0,1%: Pha dung dịch acetic acid 10% làmdung môi cho thuốc nhuộm và dung dịch rửa sau nhuộm Bồ sung 0,1 g amido blackvào 100 ml dung dịch acetic acid 10%, khuấy đều cho tan hết, lọc qua giấy lọc và bảo

quản tránh ánh sáng (Thị Bích Ngọc và Ngọc Ly, 2014).

Phương pháp cấy điểm: Các chủng Bacillus spp được cung cấp sẽ được nuôi caytăng sinh trong môi trường NB và cấy ria trên đĩa thạch chứa môi trường NA Sau đó,dùng que cấy lay các khuẩn lạc riêng rẽ đưa vào đĩa thạch NA - casein, mỗi đĩa cấy 1điểm U trong 48 giờ ở 37°C Sau khi ủ tiến hành nhuộm các đĩa thạch bang amido black

0,13% trong 30 phút, rửa nhuộm và quan sát vòng phân giải casein Cac chủng có vòng phân giải casein lớn là chủng có kha năng sinh protease cao.

Vòng phân giải protein được tính bằng mm theo công thức:

Kích thước vòng phân giải = D - d (tính bằng mm)

Trong đó: D (mm) đường kính vòng phân giải

d (mm) đường kính khuẩn lạc

Đánh giá vòng kháng được chia làm 4 mức độ theo (Thủy và ctv, 2018).

Không phân giải: D = 0

Phân giải yếu: kích thước vòng phân giải < 10 mm

Phân giải trung bình: 10 mm < kích thước vòng phân giải < 20 mm

Phân giải mạnh: kích thước vòng phân giải > 20 mm.

3.2.2.4 Phương pháp khảo sát hoạt độ enzyme protease của Bacillus spp.

Môi trường TSB chứa 1% casein được sử dụng trong thí nghiệm này Trong năm chung Bacillus spp.: Bacillus subtilis 1.3, Bacillus subtilis 1.1, Bacillus licheniformis 4.1, Bacillus licheniformis 4.2 va Bacillus licheniformis 4.3, chung có vòng phan giải

protein lớn nhất thu ở thí nghiệm 3.2.2.3 sẽ được chon dé kiểm tra hoạt độ enzyme

protease.

Phuong phap do hoat d6 enzyme protease:

Dựng đường chuẩn tyrosin: từ dung dich tyrosin chuẩn 1 uM/I, xây dựng đường

14

chuẩn với dung dịch tyrosin có nồng độ từ 0,2 - 1,0 uMI.

Bảng 3.1 Quy trình dựng đường chuẩn tyrosine

: : Ặ Ong nghiệm Dung dịch hóa chât 1 2 3 4 5 6

Dung dịch tyrosine chuẩn (ml) 02 O04 O66 O,8 1,0 0

Luong tyrosine tương ứng (uM/1) 02 O04 06 08 1,0 0 Dung dịch HCI 0,2N (ml) 48 46 44 42 40 5,0 Dung dich NaOH 0,5N (ml) 10 10 10 10 10 10

Thuốc thử Folin (ml) 3 3 3 3 3 3

Lac manh, sau 10 phút do OD ở bước sóng 660 nmOng số 6 là ống kiểm chứng (KC), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TN) Vẽđường chuẩn tyrosine thé hiện mối tương quan tương quan giữa lượng tyrosine (uM) và

AOD (AOD = ODrn — ODkc ).

Chuan bi mẫu: các chủng vi khuẩn Bacillus spp được hoạt hóa trong môi trườngTSB lỏng ở 37°C, lắc 180 vòng/ phút, trong 24 giờ Chuyển 1 ml dich tăng sinh vào 100

ml bình môi trường TSB lỏng chứa 1% casein với tỷ lệ tiếp giống 1%, nuôi cấy ở 37°C,lắc 180 vòng/ phút, trong 72 giờ Ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch nổi

Tiến hành: lay 4 ống nghiệm sạch, tiến hành làm 2 ống thử thật (TT), 2 ống thử

không (TK).

Bảng 3.2 Quy trình đo hoạt độ enzyme protease

: , k Ong nghiém

Dung điợi hộ: ghất Thử thật Thử không

Dung dich casein 1% (ml) 2,5 25

Dung dich TCA 5% (ml) 0 5

Dung dich enzyme mau (ml) 0,5 0,5

Lac đều va giữ ở 35,5°C trong 20 phút

Dung dich TCA 5% (ml) 5 0

Đề yên 30 phút, loc lay dich bên dướiLay 4 ống nghiệm mới khác, cho vào mỗi ống tương ứng kí hiệu mã hóa 2,5 mldịch lọc của ống thử thật và ống thử không sau khi ủ và lọc ở bước trên

Tiếp tục thêm vào mỗi ống 5 ml NaOH 0,5 N và 1,5 ml thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau

10 phút do OD ở bước sóng 660 nm AOD = ODrr — ODr, sau đó dựa vào đồ thị chuẩn

suy ra được pM tyrosine.

Tính kết quả: định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lượng enzyme tốithiểu trong điều kiện thí nghiệm (35,5°C : pH 7,6) thủy phân casein trong 1 phút tạothành sản phâm hòa tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho độ hấp thu OD ở

15

bước sóng 660nm tương ứng với 1 1M tyrosine trong đường chuẩn (Pham và ctv, 2019).

uM tyrosine x Vx L

txmxvw

Hd Enzyme protease (UI/ml) =

Với:

Hd Protease : hoạt độ enzyme protease ( UI/ml)

V : tông thé tích hỗn hop trong ống thử thật hoặc ông thử không (ml)

v : thể tích dich lọc đem phân tích (ml)

t: thời gian thủy phân (phút)

m : lượng mẫu enzyme đem đi xác định hoạt tính (ml)

L: độ pha loãng enzyme

uM tyrosine: lượng uM tyrosine trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn

3.2.2.5 Phương pháp khảo sát sự tương thích của vi khuẩn Bacillus spp và xạkhuẩn

Vi khuẩn kiểm định được sử dụng dé kiểm tra sự tương thích là chung vi khuẩnBacillus spp có vòng phân giải lớn nhất và hoạt độ của enzyme protease cao nhất đượcchọn từ thí nghiệm 3.2.2.3 và 3.2.2.4 và xạ khuẩn có hoạt tinh kháng khuẩn cao nhấtđược chọn từ thí nghiệm 3.2.2.2 Khảo sát được tiễn hành trên môi trường MHA

Phương pháp cấy vuông góc: dùng que cấy vòng lấy khuẩn lạc xạ khuẩn cấy mộtđường thang xạ khuẩn trên bề mặt đĩa thạch, tiến hành đồng thời hai phương pháp: cấycùng lúc xạ khuẩn và cấy vuôn góc vi khuẩn cùng lúc, ủ ở 37°C và đọc kết quả trong24h; cấy đường thang xạ khuẩn trước, ủ đĩa ở 37°C trong 3 gay dé xạ khuẩn phát triểntrên bề mặt thạch trước Sau 3 ngày nuôi cấy, xạ khuẩn đã phát triển thành một đườngthang trên bề mặt đĩa, tiền hành dùng que cấy vòng lay khuẩn lạc của hai chủng vi khuẩnBacillus spp lần lượt cây từ ngoài vào trong đến khi chạm vào đường cấy xạ khuẩn,vuông góc với đường cay xạ khuẩn góc 90°, ủ ở 37°C trong 24 giờ (Ngân và ctv, 2021)

Kết quả ghi nhận định tính vi khuan Bacillus spp và xạ khuẩn không ảnh hưởnglẫn nhau khi điểm giao nhau của các đường cấy vi khuẩn và xạ khuan đều phát triểnbình thường chứng tỏ không có sự ức chế lẫn nhau

Kết quả ghi nhận định tính vi khuẩn Bacillus spp và xạ khuẩn ảnh hưởng lẫn nhaukhi điểm giao nhau đường cay xạ khuẩn hoặc vi khuẩn mờ đi không có khuẩn phát triển,

làm ức chê sự phát triên của nhau.

16

3.2.2.6 Phương pháp khảo sát khả năng kháng khuẩn khi phối trộn vi khuẩnBacillus spp và xạ khuẩn

Thí nghiệm này được thực hiện nhằm khảo sát khả năng kháng khuẩn của hỗn hợp

vi khuân và xạ khuẩn sau khi phối trộn Các chứng vi khuẩn Bacillus spp có vòng phângiải lớn nhất và hoạt độ của enzyme protease cao nhất được chon từ thi nghiệm 3.2.2.3

và 3.2.2.4 va xạ khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất được chon từ thí nghiệm3.2.2.2 Khảo sát được tiến hành trên môi trường TSB đối với vi khuẩn và môi trườngSCA đối với xạ khuẩn

Chuan bi dịch vi khuẩn khảo sát phối trộn Bacillus spp.: Tiến hành tăng sinh cácchủng vi khuẩn Bacillus spp trong môi trường TSB lỏng ở 30°C, lắc 180 vòng/ phúttrong 24 giờ Sau đó tiến hành phối trộn Bacillus subtilis 1.3 và Bacillus licheniformis4.1 với tỉ lệ 1:1 dé chuẩn bị cho thí nghiệm sau

Chuẩn bị dịch xạ khuẩn khảo sát phối trộn: Tiến hành tăng sinh các chủng xạ

khuan trong các môi trường SCA lỏng, ủ ở 37°C, lắc 180 vòng/ phút trong 7 ngày Thudịch nỗi chuẩn bị cho thí nghiệm sau

Bảng 3.3 Bồ trí nghiệm thức tỉ lệ phối trộn Bacillus spp và xạ khuẩn

Nghiệm thức Bacillus spp Xa khuân

BX (1:1) 50% 50%

BX (1:3) 25% 75%

BX (3:1) 75% 25%

Phương pháp đục lỗ thạch: đầu tip có đường kính 8 mm được dùng dé đục lỗ trên

bề mặt đĩa thạch MHA Hút 50 wl đối chứng dương ampicillin, đối chứng âm nước cất,

dịch nghiệm thức phối trộn vi khuẩn Bacillus spp và dịch xạ khuẩn cho vào lỗ đã được

đục trên bề mặt đĩa thạch MHA đã cấy vi khuân kiểm nghiệm Vi khuẩn kiểm nghiệmnuôi ở 37°C Đọc kết quả sau | ngày, các nghiệm thức được lặp lai ba lần Hoạt tính

kháng sinh được xác định dựa vào kích thước vòng kháng.

Vòng kìm hãm vi sinh vật được tính bằng mm theo công thức: