Tuyển chọn các dòng vi khuẩn bacillus spp để phòng bệnh thán thư do nấm colletotrichum spp gây hại trên giống ớt sừng trâu thuộc loài capsicum annuum

SỞ NƠNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NƠNG THƠN TP.HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO NGHIỆM THU TUYỂN CHỌN CÁC DÒNG VI KHUẨN BACILLUS SPP ĐỂ PHÒNG BỆNH THÁN THƯ DO NẤM COLLETOTRICHUM SPP GÂY HẠI TRÊN GIỐNG ỚT SỪNG TRÂU THUỘC LOÀI CAPSICUM ANNUUM Mã số: VS01/14-15 Chủ nhiệm đề tài: Cán thực hiện: ThS Nguyễn Tấn Đức ThS Nguyễn Tấn Đức KS Trần Thùy Trang TP Hồ Chí Minh, tháng 03 năm 2016 MỤC LỤC Trang DANH SÁCH BẢNG iii DANH SÁCH HÌNH iv TÓM TẮT v I THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI .vi II ĐẶT VẤN ĐỀ II.1 Lý chọn đề tài II.2 Đối tượng phạm vi nghiên cứu II.3 Ý nghĩa tính khoa học thực tiễn III TỔNG QUAN TÀI LIỆU .2 III.1 Bệnh thán thư ớt III.2 Nấm Colletotricum spp III.3 Vi khuẩn Bacillus spp III.4 Nghiên cứu liên quan IV VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU IV.1 Mẫu vật nghiên cứu IV.2 Phương pháp phân lập nấm Colletotrichum spp từ mẫu bệnh 10 IV.3 Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus spp từ đất 10 IV.4 Phương pháp định danh vi khuẩn thử nghiệm sinh hóa 11 IV.5 Phương pháp định danh sinh học phân tử 13 IV.5.1 Nấm Colletotrichum spp .13 IV.5.2 Vi khuẩn Bacillus spp .14 IV.6 Phương pháp chuẩn bị huyền phù bào tử C acutatum 14 IV.7 Phương pháp chuẩn bị huyền phù tế bào B subtilis 14 IV.8 Phương pháp lây bệnh nhân tạo để xác định độc lực nấm bệnh in vitro 15 IV.9 Phương pháp xác định hiệu đối kháng đĩa petri 16 IV.10 Phương pháp kiểm tra hiệu ức chế nấm bệnh khay 16 IV.11 Phương pháp kiểm tra hiệu ức chế nấm bệnh ớt 17 IV.12 Phương pháp xử lý số liệu 18 IV.13 Thí nghiệm nhà kính 18 i IV.14 Thí nghiệm nhà lưới 19 V KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 V.1 Nội dung 1: Phân lập, định danh nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư 20 V.1.1 Đặc điểm đại thể vi thể 20 V.1.2 Định danh sinh học phân tử 23 V.1.3 Các thí nghiệm kiểm tra đặc điểm gây bệnh 24 V.2 Nội dung 2: Tuyển chọn định danh loài Bacillus spp đối kháng mạnh với nấm Colletotrichum spp điều kiện in vitro 27 V.2.1 Đặc điểm đại thể vi thể 27 V.2.2 Đặc điểm sinh hóa định danh sinh học phân tử .31 V.2.3 Kiểm tra hiệu đối kháng in vitro 33 V.2.4 Thí nghiệm đối kháng khay .36 V.3 Nội dung 3: Khảo sát hiệu đối kháng Bacillus spp in vivo (chậu, vại) 37 V.4 Nội dung 4: Khảo sát hiệu ức chế nấm bệnh Bacillus subtilis CG8 với nấm C acutatum 2.2 điều kiện nhà lưới 38 VI KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39 VII TÀI LIỆU THAM KHẢO .39 PHỤ LỤC ii DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng Các thí nghiệm sinh hóa dùng định danh Bacillus spp 11 Bảng Trình tự mồi định danh nấm 13 Bảng Phản ứng PCR 13 Bảng Chu trình nhiệt phản ứng PCR 13 Bảng Trình tự mồi định danh vi khuẩn .14 Bảng Phản ứng PCR 14 Bảng Chu trình nhiệt phản ứng PCR 14 Bảng Đặc điểm hình thái hệ sợi bào tử nấm Colletotrichum spp (40x) 21 Bảng 10 Kết định danh nấm Colletotrichum phân lập từ Củ Chi 24 Bảng 11 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả gây bệnh thán thư C acutatum 7.1 ớt điều kiện in vitro .25 Bảng 12 Ảnh hưởng độ ẩm đến khả gây bệnh thán thư C acutatum 7.1 ớt điều kiện in vitro .25 Bảng 13 Khảo sát khả gây bệnh thán thư dòng nấm Colletotrichum sưu tập .26 Bảng 14 Đặc điểm đại thể vi thể chủng vi khuẩn Bacillus spp 28 Bảng 15 Kết kiểm tra đặc điểm sinh hóa chủng Bacillus 32 Bảng 16 Kết định danh sinh học phân tử chủng Bacillus .32 Bảng 17 Khảo sát khả đối kháng chủng vi khuẩn B subtilis với dòng nấm C acutatum 35 Bảng 18 Hiệu ức chế nấm bệnh trường hợp phun dịch vi khuẩn 36 Bảng 19 Hiệu ức chế nấm bệnh nhỏ dịch vi khuẩn lên vết thương 36 Bảng 20 Kết kiểm tra khả đối kháng B subtilis CG8 (dung dịch PBS) điều kiện nhà kính 37 Bảng 21 Diễn tiến tỷ lệ bệnh (TLB) số bệnh (CSB) nghiệm thức đối chứng nghiệm thức phun chế phẩm nhà lưới theo thời gian 38 iii DANH SÁCH HÌNH Trang Hình Cơ chế cơng Colletotrichum spp lên mô thực vật Hình Cơ chế bảo vệ trồng tác nhân gây bệnh nhờ hợp chất cyclic lipopeptide tiết B subtilis Hình Vi khuẩn Bacillus spp bề mặt sau 48 xử lý .7 Hình Thí nghiệm đối kháng Bacillus spp nấm bệnh xồi Hình Tác động enzyme B amyloliquefaciens lên C lagenarium Hình Tác động B subtilis lên phát triển tơ nấm Hình Dung dịch vi khuẩn B subtilis sau lên men .15 Hình Phương pháp chủng bệnh nhân tạo kiểm tra khả gây bệnh thán thư .15 Hình Khảo sát khả đối kháng theo phương pháp đồng nuôi cấy 16 Hình 10 Đo chiều dài vết bệnh .17 Hình 11 Bố trí thí nghiệm nhà kính khảo sát hiệu ức chế nấm 19 Hình 12 Bố trí thí nghiệm nhà lưới khảo sát hiệu ức chế nấm bệnh 19 Hình 13 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc nấm Colletotrichum spp theo thời gian 20 Hình 14 Đặc điểm khuẩn lạc tế bào Bacillus spp thay đổi theo thời gian 27 Hình 15 Kết đối kháng Bacillus spp C acutatum 7.1 .33 Hình 16 Kết đối kháng theo ngày B subtilis CG8 C acutatum 7.1 34 Hình 17 So sánh khuẩn lạc nấm Colletotrichum trường hợp bị không bị đối kháng vi khuẩn 34 Hình 18 Đặc điểm sợi nấm đĩa đối kháng (bên trái) đĩa đối chứng (bên phải) 34 Hình 19 Kết ức chế nấm bệnh sau ngày khay đối chứng (hình bên trái) khay xử lý vi khuẩn (hình bên phải) nồng độ 108 cfu/ml 36 iv TÓM TẮT Đề tài thực việc phân lập tuyển chọn dòng vi khuẩn B subtilis từ đất có khả đối kháng với nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt, từ khảo sát hiệu ức chế vi khuẩn nấm để đánh giá tính khả thi hướng nghiên cứu tạo chế phẩm B subtilis phòng bệnh thán thư phục vụ cho Chương trình mục tiêu, phát triển rau an tồn địa bàn thành phố giai đoạn 2011 – 2015 theo Quyết định số: 3331/QĐ-UBND ngày 04/07/2011 UBND TP HCM Trên sở này, nhóm thực phân lập định danh 29 chủng Colletotrichum thuộc loài C acutatum có hoạt tính gây bệnh thán thư Chọn chủng có khả gây bệnh thán thư mạnh sưu tập 1.6, 2.4, 3.3, 4.3, 6.1 làm thước đo khả đối kháng Phân lập, định danh tuyển chọn 19 chủng Bacillus spp gồm loài B subtilis, B amyloliquefaciens, B licheniformis Từ kết đối kháng in vitro, chọn dòng CG5, CG6, CG8, CG9 CG10 có khả đối kháng tốt sưu tập Đề tài chọn chủng CG8 để kiểm tra khả ức chế nấm bệnh điều kiện khay, nhà kính nhà lưới Kết cho thấy việc sử dụng chế phẩm vi sinh B subtilis có khả ức chế nấm bệnh ngày đầu, hiệu ức chế nấm bệnh vào thời điểm cao đạt 38.25 ± 9.77 (%) v I THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI I.1 Tên đề tài: Tuyển chọn dòng vi khuẩn Bacillus spp để phòng bệnh thán thư nấm Colletotrichum spp gây hại giống ớt sừng trâu thuộc loài Capsicum annuum (Mã số: VS01/14-15) Dạng đề tài: R&D Chương trình đăng ký: a Tự đề xuất b Đặt hàng nghiên cứu: Chương trình mục tiêu, phát triển rau an toàn địa bàn thành phố giai đoạn 2011 – 2015 theo Quyết định số: 3331/QĐ-UBND ngày 04/07/2011 UBND TP HCM I.2 Cơ quan quản lý: Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM Địa chỉ: 2374 Quốc lộ 1, Phường Trung Mỹ Tây, Quận 12, TP Hồ Chí Minh Điện thoại: 08-38 233 649 I.3 Fax: 08-38 222 567 Đơn vị chủ trì: Phịng Cơng nghệ vi sinh - Trung tâm Cơng nghệ Sinh học TP.HCM I.4 Cơ quan phối hợp chính: Phịng Thực nghiệm trồng – Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM I.5 Chủ nhiệm đề tài: ThS Nguyễn Tấn Đức – Cán kỹ thuật Phịng Cơng nghệ Vi sinh I.6 Cán bộ/Nhóm thực hiện: 1/ ThS Nguyễn Tấn Đức – Cán kỹ thuật phòng CN Vi sinh 2/ KS Trần Thùy Trang – Cán kỹ thuật phòng CN Vi sinh I.7 Thời gian thực hiện: 24 tháng (Từ 03/2014 đến 03/2016 ) I.8 Kinh phí duyệt: 300.000.000 VNĐ I.9 Kinh phí sử dụng: 300.000.000 VNĐ I.10 Mục tiêu đề tài Mục tiêu tổng quát: Tuyển chọn dòng vi khuẩn Bacillus spp nhằm tạo chế phẩm sinh học phòng bệnh thán thư nấm Colletotrichum spp gây hại giống Ớt sừng trâu thuộc lồi Capsicum annuum Mục tiêu cụ thể: Hình thành chủng Colletotrichum spp gây bệnh thán thư ớt Hình thành Bacillus spp đối kháng nấm bệnh thán thư Xác định hiệu đối kháng Bacillus subtilis với C acutatum điều kiện in vitro, nhà kính nhà lưới vi I.11 Các nội dung nghiên cứu thực so với đề cương đăng ký TT Kết cần đạt Nội dung Nội dung 1: Phân lập định danh nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư ớt Nội dung 2: Tuyển chọn định danh loài Bacillus spp đối kháng mạnh với nấm Colletotrichum spp điều kiện in vitro Thời gian Đánh giá Hình thành chủng tháng Colletotrichum spp gây 02 – 07/2014 bệnh thán thư ớt Đạt Hình thành Bacillus spp đối kháng nấm bệnh thán thư tháng 08 – 11/2014 Đạt Xác định nồng độ hỗn hợp chủng Bacillus spp đối kháng với nấm gây bệnh thán thư Đợt 1: tháng 12/2014 – 02/2015 Đợt 2: tháng 07 – 12/2015 Đạt Nội dung 3: Khảo sát hiệu đối kháng Bacillus spp điều kiện in vivo (chậu, vại) Xác định hiệu phòng ngừa bệnh nói chung ớt Nội dung 4: Khảo sát hỗn hợp chủng hiệu đối kháng Bacillus spp theo Bacillus spp điều cách sử dụng khác kiện in vivo (nhà lưới) (tưới vào đất, phun lên lá, kết hợp tưới vào đất phun lên lá) Đợt 1: tháng 06 – 08/2015 Đợt 2: tháng 11/2015 – 03/2016 Đạt I.12 Sản phẩm đề tài TT Tên sản phẩm Bộ chủng nấm C acutatum gây bệnh thán thư phục vụ làm thang đo chủng vi sinh đối kháng Bộ chủng vi khuẩn B subtilis có khả đối kháng với nấm gây bệnh thán thư phục vụ làm chế phẩm vi sinh nông nghiệp Công thức tạo hỗn hợp Bacillus subtilis có khả đối kháng kích thích tăng trưởng trồng Số lượng Chỉ tiêu kinh tế - kỹ thuật Ghi 22 Được sàng lọc đặc điểm hình thái, sinh thái, khả gây bệnh thán thư, định danh sinh học phân tử đến loài Sản phẩm dạng 19 Được sàng lọc đặc điểm hình thái, sinh hóa, khả đối kháng in vitro, định danh sinh học phân tử đến loài Sản phẩm dạng 1 Hỗn hợp dạng lỏng: mật độ vi sinh lớn x 108 cfu/ml Khả đối kháng điều kiện nhà lưới 30% Hiện khảo sát thời gian bảo quản thành phần phụ gia bảo quản phù hợp Sản phẩm dạng vii Bài báo khoa học Báo cáo poster Đào tạo kỹ sư, cử nhân Đại học Sinh viên thực tập 10 Nguyen Tan Duc, Tran Thuy Trang, Le Thi Thuy Nhi, Duong Hoa Xo, Pham Huu Nhuong Selection Bacillus spp strain against Colletotrichum acutatum causing chilli anthracnose disease Tạp chí Khoa học Công nghệ số 5A/2016 Nguyễn Tấn Đức, Trần Thùy Trang, Phạm Hữu Nhượng Tuyển chọn chủng Bacillus spp có khả đối kháng với nấm C acutatum gây bệnh thán thư ớt Báo cáo poster Hội nghị Bảo vệ thực tật toàn quốc 2015 Đại học Nông lâm TP.HCM, 11/2015 -Nguyễn Thị Thúy Hồng – Đại học Nông Lâm TP.HCM (08/2014 – 06/2015) -Nguyễn Thế Bảo – Đại học Mở TP.HCM (08/2014 – 05/2015) -Tô Thị Tố Quỳnh – Đại học Tôn Đức Thắng (04/2015 – 02/2016) Đại học Nông Lâm TP.HCM - Võ Từ Phương Thảo (06/2014 – 08/2014) - Nguyễn Vân Anh (06/2014 – 08/2014) Đại học Công nghệ TP.HCM - Huỳnh Nhi (05/2015 – 07/2015) - Phan Ánh Ngân (08/2015 – 10/2015) Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM - Nguyễn Thị Trường An (09/2015–03/2016) - Nguyễn Thị Thanh Tâm (09/2015–03/2016) - Mạc Thị Mỹ Nữ (10/2015 – 03/2016) - Phạm Thị Diệu (10/2015 – 03/2016) - Lê Thị Phượng (12/2015 – 03/2016) - Trịnh Đăng Tân (12/2015 – 03/2016) Sản phẩm dạng Sản phẩm dạng Sản phẩm dạng Sản phẩm dạng viii II ĐẶT VẤN ĐỀ II.1 Lý chọn đề tài Ớt trồng quan trọng nhiều quốc gia nhiệt đới Diện tích canh tác ớt tồn cầu để cung cấp tươi vào khoảng 1,7 triệu ha, cung cấp cho sản xuất ớt bột khoảng 1,8 triệu Tổng sản lượng đạt khoảng 20 triệu tấn, trung bình thu hoạch 5,7 (FAO, 2003) Các quốc gia sản xuất xuất hàng đầu giới bao gồm Trung Quốc, Ấn Độ, Mexico, Morocco, Pakistan, Thái Lan Thổ Nhĩ Kỳ Bệnh gây hại ớt chủ yếu nấm, vi khuẩn virus gây Xét theo mức độ ảnh hưởng bệnh thán thư Colletotrichum spp nghiêm trọng nhất, kế bệnh héo xanh vi khuẩn Pseudomonas solanacearum, bệnh khảm virus gân (CVMV) bệnh khảm virus dưa chuột (CMV) (Isaac, 1992) Ở quốc gia phát triển bệnh thán thư gây thiệt hại lớn kinh tế cho người trồng ớt, từ 10% đến 80% (Poonpolgul Kumphai, 2007) Bệnh gây hại không giai đoạn trưởng thành cho quả, mà tác động mạnh làm giảm suất giai đoạn giai đoạn bảo quản sau thu hoạch Xét khu vực TP HCM, diện tích trồng rau ăn khoảng 1.123 ha, tập trung Củ Chi, Bình Chánh Hóc Mơn (Sở NN PTNT TP.HCM, 2013) Trong số nhiều bệnh hại gây rau ăn bệnh thán thư xuất nhiều khu vực có xu hướng ngày lan rộng Theo báo cáo chi cục BVTV TP.HCM năm 2013 diện tích canh tác rau bị bệnh thán thư 178,76 ha, chiếm 15% tổng diện tích (Chi cục BVTV TP.HCM, 2013) Các giải pháp hóa học để ngăn ngừa bệnh thán thư có hiệu để lại nhiều ảnh hưởng đến môi trường dễ làm nấm bệnh trở nên lờn thuốc Do ngày việc sử dụng thuốc sinh học phòng ngừa bệnh hại xu hướng lớn nơng nghiệp hữu cơ, lợi ích mơi trường sinh thái Trên sở Trung tâm Công nghệ sinh học TP.HCM đăng ký thực đề tài “Tuyển chọn dòng vi khuẩn Bacillus spp để phòng bệnh thán thư nấm Colletotrichum spp gây hại giống ớt sừng trâu thuộc loài Capsicum annuum” nằm Chương trình mục tiêu, phát triển rau an toàn địa bàn thành phố giai đoạn 2011 – 2015 theo Quyết định số: 3331/QĐUBND ngày 04/07/2011 UBND TP HCM II.2 Đối tượng phạm vi nghiên cứu - Nấm Colletotrichum spp chọn C acutatum dịng mục tiêu nhóm gây bệnh thán thư chủ yếu ớt Lấy mẫu phân lập từ vườn ớt huyện Củ Chi, TP.HCM - Vi khuẩn Bacillus spp chọn B subtilis, B amyloliquefaciens, B licheniformis chủng mục tiêu nhóm vi khuẩn thường dùng tạo chế phẩm vi sinh đối kháng nấm bệnh Phân lập từ mẫu đất khu vực canh tác ớt lâu năm - Ớt dùng thử nghiệm thuộc giống ớt sừng trâu trái ớt lớn, dễ bị bệnh thán thư nên dễ theo dõi, đo đạc đường kính vết bệnh giống ớt khác Ngày Ngày Ngày Ngày 12 Hình 16 Kết đối kháng theo ngày B subtilis CG8 C acutatum 7.1 Mặt nấm bệnh đĩa bị đối kháng vi khuẩn đĩa đối chứng Ta thấy mép khuẩn lạc nấm bị chất tiết từ vi khuẩn làm đổi màu đen sẫm Trong đó, chủng vi khuẩn khơng đối kháng với nấm bệnh mép ngồi nấm bệnh không bị đổi màu khuẩn lạc phát triển bình thường phía Hình 17 So sánh khuẩn lạc nấm Colletotrichum trường hợp bị không bị đối kháng vi khuẩn Sợi nấm đĩa đối kháng bị phình to thân, bào tử nhiều so với đĩa đối chứng Hình 18 Đặc điểm sợi nấm vùng rìa đĩa đối kháng (bên trái) đĩa đối chứng (bên phải) độ phóng đại 40x 34 Từ chủng vi khuẩn sàng lọc với chủng nấm 7.1 trên, tiếp tục thực thí nghiệm đối kháng với chủng nấm gây độc lực mạnh sưu tập Thí nghiệm bố trí theo kiểu CRD, chủng lặp lại đĩa Kết cho thấy chủng CG8 CG9 có khả đối kháng mạnh hẳn chủng cịn lại Do chúng tơi chọn chủng CG8 đem vào thí nghiệm thử khả ức chế nấm bệnh khay nhà kính, nhà lưới Bảng 16 Khảo sát khả đối kháng chủng vi khuẩn B subtilis với dòng nấm C acutatum Hiệu ức chế nấm bệnh (%) Vi khuẩn CG5 CG6 CG8 CG9 CG10 Nấm ngày 1.6 2.4 3.3 4.3 6.1 15,11j 24,46cdefghi 21,03ghij 18,88ij 20,27hij 42.24ij 41.25j 41.33j 41.27j 45.32hi 61.23i 60.90i 60.34i 60.26i 64.14h 68.03gh 67.76h 66.48h 66.37h 70.92def 72.28lm 71.67m 71.63m 72.40lm 74.55kij 1.6 2.4 3.3 4.3 6.1 33,08ab 28,92bcdef 27,54bcdefgh 23,28efghi 31,04bcd 50.73bcd 47.45efgh 52.37ab 47.33efgh 52.79ab 67.43bcde 66.23cdefg 69.23ab 64.22gh 69.02ab 73.38abc 74.10ab 73.77abc 70.37ef 74.49a 77.88abcde 76.50cdefgh 78.40ab 74.72hkij 78.01abcd 1.6 2.4 3.3 4.3 6.1 28,20bcdefg 29,40bcdef 29,48bcdef 28,76bcdef 38,51a 48,86cdef 44,83hi 49.87bcdef 47.78cdefgh 55.09a 66.83cdef 64.29gh 66.63cdef 64.11h 69.74a 72.35bdc 70.33ef 61.24i 69.69fg 74.87a 76.55cdefgh 76.32defghi 76.67bcdefg 75.49fhkgij 78.74a 1.6 2.4 3.3 4.3 6.1 29,24bcdef 31,28abc 22,07fghij 33,78ab 33,86ab 50.43bcde 47.22fgh 47.56defgh 53.07ab 54.36a 67.95abcd 66.12deghf 65.98deghf 68.21abc 69.75a 73.81ab 72.03cde 71.25def 73.67abc 75.06a 78.08abcd 76.14efghij 76.39defghi 78.28abc 79.93a 1.6 2.4 3.3 4.3 6.1 22,42fghij 23,80dèghi 28,84bcdef 25,02cdefghi 29,97bcde 0,03 16,66 49.02cdef 47.50efgh 50.16bcdef 50.78bc 48.27cdegh 0,0006 4,05 65.36fgh 65.65efgh 67.24bcdef 65.70efgh 66.01deghf 0,0007 1,89 71.55de 70.45ef 71.58de 70.83def 71.46de