Phân lập tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn acetic

Trang 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SU PHẠM TP.HỒ CHÍ MINH KHOA SINK HỌC va Lhe LE TH] KIM ANH Đầ tài

Trang 2

NNN N NNN NON ee “ LỜI CẢM ƠN “ s Z

Trong wét nhutng ndm thang hoe tag didi mdi (trường 920 Su

“ Pham TDPHOM, em đã được tiếp thưa rất nhiều trí thức bổ (eÌ va

// thiết thực từ ede thdy, ed Chink diéu dd la eo sd nà động lite dé em

are

Em xin chan thanh géi lal cảm ơn đếm:

@ GOURD - 68 Grin Thanh Thiiy -edn bộ giảng dạu

man ol sink -Teuting dai hee Sut Dham SDHOM, da

luténg ddn tin tink od trayén dgt cho em nhiéu kink

aghi¢m quy bdu trong sudt quá rink nghlén esti

@ “Đan chủ nhiệm khoa sinh - Frting dgi hee See Dhqm

TDHOM da tgo diku kign thugn lgl dé em thuge kiệm đề tai may

® Quy thay, 4, ede anh chj trong phòng thí nghiệm sink

lj -sinkh hod -ol sink 0d ede ban đẳng khoá đã quan

lam, gitig dé em oẺ mọi mặt trong sudt thời gian ota qua

Tran trong

Trang 3

Muc luc

4 P Trang

EBBẦN bh NÓ BẦU ca a2 C02608 scesdd-o 1

PHAN II: TONG QUAN TÀI LIỆU 22222o2cccccvvcvocecccvrzevrrre 2

2:3 Sb bale: eke ont rales ois RS RS 2

2.2 Téng quan vé vi khudin acetic .ccccccccccessesrscsesesesrsencvereserecncecereveerecers 3 2.2.1.Đặc điểm của giống Acetobacter càng tre 4 2.2.2 Đặc điểm của giống Gluconobacter (Acetomona§) 5

2.2.3 Một số đại diện vi khuẩn acetic thường gặp - 6

2.3.Cơ sở khoa học của sự lên men acetic - (c2 7

2.4.Ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường

tốt qá tri lên BÊN C6 XŠ cuoi iiieeieeceaseeeesễieeees 8

đua 1, Anh Bi SH CA QXÝ Giao iesccicseiasa sans ns ebscicncsiinn boosh sveen econ vesauewasoue) 8

D4 2:A mks Rường của nh†iẾt (Ồ Qua hd toa tui Giaacy¿e §

2.4.3.Anh hưởng của các nguồn thức ăn trong môi trường 8

2.4.3.1.Sự acid hoá dịch lên mẹn ‹‹ -.‹5 - 8

2 S22 ian Độ HỆ G6262 1626206 12126202ÿ042000X42614A 8

DADS C hc Mit banks heMibinay isi irs iscisist ss tachcastase 8

2.5.Các quy trình công nghệ lên men acedic 9

2.5.1 Lên men acetic trong công nghiệp Ăn 9

0 1o TU N PHẩĐ CN c2 6x 6¿& 9

25.1.2 Phakins whee WAN ns ie sai 9 sa LÊN ft đần GABA v20 0006421010 02262264044420 21285 9 2.6 Ứng dụng ví khuẩn axetic trong công nghiệp và trong đời sống 10

2.6.1.Trong công nghiệp 0Q QQ HH HH4 4 3 3x2, 10

2.6.2.Trong đời sống .s-.2s°-S S22 St E221 EEE922732222 xe 10 PHAN III: VAT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

NV NT HH Là 442444662446 c46 2t 21g20 666 d2 hú at 82 10s 12

31.1 Nguồn phân Hee sas casein cciaeecosealsioaeeereiasee 12

1,12 MO vn G22 kia can orien eesations 13

3.2.Các phương pháp nghiên cứu đã sử dụng - 15

42-1.Phân lận và chọn Caen asic sess se cciicccsnssinasirdaccesince bccascectienba cdemicatnoneatanlaen 15

3.2.1.1.Phân lập các chủng vi khuẩn acetic . . 15

3.2.1.2 X4c định khả năng sinh acid acetic của các chủng l6

3;2:1.3:/Thuên khiết BI ÔN i6 ERS 16

3.2.2.Mô tả các đặc điểm hình thái của vi khuẩn acetic 16

Trang 4

1:1 nh NI SEN KP a iss ao a ec 0022022202226242 17

3.2.3.2.Khả năng oxy hoá ethanol thành acid acetic 18

12-27 80.18 VI 0 VIÊN 2422222002222 2< 18

Die oe FRONT TERN) CORB INOS 2026261030222 18 3.2.3.5 Kha nang ta0 thamh indole .ccccssensserreeeensrensennsensrenseenens 19

3.2.3.6.Khả năng phân gidi dextrin cece cteceeseseenteeeeeeneeee 19

er ee gg | vo«sesseeeenssveeneenneeseeseeseenee=< 19

3.2.3.8.Khả năng oxy hoá latate hoặc acetate 19 3.2.3.9.Kha năng phát triển trên môi trường glutamate-agar 20

3.2.3.10.Khả năng chuyển hod glycerol thanh dihydroxy acetone 19 3,2.3.11.Kha nang phát triển trên môi trường manitol-agar 20

3.2.3.12.Khả năng phân huy calcium lactate thanh carbonate 20

3.2.3.13.Khả nắng tạo sắc tố nầu c ccscoccsorseee 20 3.2.3.14.Khả năng tổng hợp xenluloza - - 5-5555 5s+ss+sss2 20 3.2.4.Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường

đến quá trình lên men ac€tiC - 5 co ssserxrserrtsrreeree 20

3.2.4.1.Xác định nỗng độ cồn thích hợp cho sự lên men 20 3.2.4.2 Xác định nổng độ pH thích hợp cho sự lên men 20

3.2.4.3.Xác định nhiệt độ thích hợp cho sự lên men 20

PHAN IV: KET QUA BIEN LUAN 21

4.1.Phân lập và chọn giống .-.-. - cnSScsssssrsrrrrrrrrrres 21

4.2.M6 tả các đặc điểm, hình thái của vi khuẩn acetic 25

4.2.1.Đặc điểm hình thái khuẩn lạc . - -5- 5255 5< 5S 25

4.2.2.Đặc điểm hình thái tế bào .- 27 4.3.Khảo sát các đặc điểm sinh lý-sinh hoá của một số chủng ví khuẩn acetic 29 4.3.1.Khả năng oxy hoá ethanol thành acid acetic 29

4.3208 NẺ 0 0H cu Khu 1e «eằỶ-.-=-eee=.ee.e 30

4.3.3 Khảo sát hoạt tính catalase - 222-222 31

4.3.4 Khao sat kha nding tạo indole . -.555 32

4.3.5.Khảo sát khả năng thuỷ phân dextrin và gelatin 32

4.3.6.Khảo sát khả năng oxy hoá acetat€ .- s2 32

4.3.7.Khả năng phát triển của các chủng trên môi trường glutamate-agar 34 4.3.8.Khảo sát khả năng chuyển hoá glycerol thành dihyđroxy acetone 34 4.3.9.Khảo sát khả năng phát triển trên môi trường manitol 35

4.3.10.Khả năng oxy hod calcium lactate đến carbonate 36

4.3.11.Khảo sát khả năng hình thành sắc tố nâu . -5 - 36

Trang 5

4.5.Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men của 2 chủng

AT HN Gv 0 G2400 áÀ 12a 02146 0/2421022202)225165624Á44/00)&¿ 39

4.5.1.Anh hưởng của nồng độ cổn ban đầu đến khả năng

tích luỹ acid ac©liC . se nenneerierrrrsrrsrrrvrrrvrree 39

4.5.2_ÁAnh hưởng của độ pH ban đầu đến khả năng tích luỹ acid acetic của 2 chủng

Ai Về Ủy eneeeeeeesseeeeeseeeeeeeer+ecEeeee-c<S6e2tec0/0442/0242666142/41222342GG1A4244462442222/236 43

4.5.3.Anh hưởng của nhiệt độ đến khả năng

tich luf acid acetic cba 2 chủng A¡, B¿ -.s-« 5< 51

PHAN V: KET LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 2 2222211212000 0177050 52

ST TRE NI vua ket ink chess dene ite eee is cadence oaarevsbibadennts 52

"¬ - - ————————————- 53

Trang 6

PHAN I:

MỞ ĐẦU

idm là một loại thực phẩm lên men cổ truyền đã được con người biết đến từ rất lâu, cách đây hơn 1000 năm trước công nguyên Giấm có nguồn gốc từ bia hay

rượu bị chua nên người Pháp gọi là * Vinaigre " có nghĩa là vang chua Ban đầu, giấm

chỉ được sản xuất ở qui mô gia đình, dùng để chế biến, bảo quản và làm tăng hương vị của thực phẩm Vào thế kỷ XIV - XV giấm bắt đầu được sản xuất trên qui mô công nghiệp ở Pháp Cho đến đẩu thế kỷ XIX, con người mới biết được giấm là sản phẩm lên men của một nhóm vi sinh vật nhất định, có tên gọi là vi khuẩn acetic Vi khuẩn này có tác dụng chuyển hóa một số chất hữu cơ thành acid acetic gây nên hiện tượng * lên men *“ acetic hay lên men giấm Từ giấm bằng phương pháp chưng cất người ta

thu được acid acetic Đây là 1 trong những hoá chất quan trọng trong công nghiệp với

sản lượng 3 triệu tấn/năm hiện đang được sản xuất và tiêu thụ trên toàn thế giới Người ta sử dụng axít này làm nguyên liệu để tổng hợp nhiều loại sản phẩm như : các

cste được dùng làm dung môi hữu cơ, các aldehyt acetic dùng làm tơ lụa, sơn nhân

tạo, chất diệt cỏ, các nguyên liệu dùng để sản xuất aspipin, antitibrin trong công

nghiệp dược Ngoài ra acid acetic còn được dùng trong nghiệp đổ hộp, trong bảo quản các loại rau tươi cho người và gia súc v.v

Trước đây acid acetic được sản xuất chủ yếu bằng con đường tổng hợp hóa học và chưng cất gỗ Ngày nay việc sản xuất các acid này bằng phương pháp vi sinh (lên men nhờ vi sinh vật) chiếm sản lượng đáng kể, nên đã được các nhà khoa học đầu tư nghiên cứu nhiều hơn

Riêng ở Việt nam, nhu cẩu về aciđ acetic ngòai mục đích sử dụng trên, nó còn là một nhu cầu cấp thiết cho sự phát triển của nghành công nghiệp cao su Hiện nay, nhu cầu tổng cộng trên 3000 tấn/năm và nguồn cung cấp chủ yếu là nhập khẩu Trước tình hình này, việc tim kiếm những giải pháp khả thi để sản xuất giấm đạt năng suất cao là việc làm rất thiết thực, đáng được mọi người quan tâm Với mong muốn đi sâu ñm hiểu nghiên cứu vấn để này, chúng tôi quyết định chọn để tài của mình là:“Phân lập-tuyển chọn và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của một số chủng vi khudn acetic.”

Nhiệm vụ đặt ra cho để tài nghiên cứu là :

e Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn acetic có hoạt lực tích lũy acid

cao,

Trang 7

LUAN VAN TOT NGHIEP 1998 - 2002

PHAN II :

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược lịch sử nghiên cứu :

Từ xa xưa, loài người đã biết tới từ “ lên men “ để làm giấm Giấm là một dung dịch chứa khoảng 3% acid acetic Các quá trình chế biến và ứng dụng của giấm,

đã được con người ghi lại trong các tài liệu thời cổ xưa, trong kinh thánh Lúc bấy giờ,

họ hiểu giấm một cách đơn giản là rượu vang hỏng mà thôi Giấm xuất phát từ danh từ Hy lạp “ oxcus “ nghĩa là chua Tiếng Pháp "vinaigre” tức là vang chua [2 ]

Bắt đầu từ thế kỷ XIV —- XV ở Pháp đã hình thành những cơ sở công nghiệp sản xuất ra giấm

Đến đầu thế kỷ XIX, con người mới biết giấm là sản phẩm lên men của một

nhóm vi sinh vật nhất định Ngày nay, người ta gọi chúng là Acetobater hay vi khuẩn acetic Kể từ đây có rất nhiều nhà khoa học quan tâm, nghiên cứu về các vi khuẩn

này

Vào năm 1822 Person, người đầu tiên nghiên cứu về vì khuẩn Acetobacter từ

lớp màng mỏng phát triển trên bể mặt giấm Ông đã chứng minh đó là một loại vi

sinh vật có tên là Mycoderma aceu

Năm 1837 Kiitzing đã khẳng định rõ vai trò của vi sinh vật trong qúa trình lên

men giấm Trong năm này, nhà bác học Hansen (Đan Mạch) đã tách được từ màng giấm hai loài vi khuẩn thuần khiết đặt tên Bacterium acetic va Bacterium

pasteurianum

Năm 1862 - 1868 Pasteur đã khẳng định được bản chất vi sinh vật trong qua

trình lên men acetic và chứng minh sự đúng đấn trong nhận xét của Kiitzing và Hansen Thời gian này, nhờ sự phát minh ra kính hiển vi và một số công cụ đắc lực trong nghiên cứu đã giúp ông quan sát, nghiên cứu màng xuất hiện trên bia và rượu vang để đi đến kết luận :“màng xuất hiện trên bia, rượu vang được tạo thành từ một loại trực khuẩn”, ông cũng gọi là Mycoderma aceti [21]

Đến năm 1878 Beijerinck lần đầu tiên đã tiến hành phân loại vi khuẩn acetic Ông đã phân lập được vi khuẩn này ở dạng thuần khiết

Nam 1926 Heneberg chia vi khuẩn acetic thành 4 nhóm tùy theo mơi trường sinh sống:

e© Nhóm I : vi khuẩn không phát triển trên bia e Nhóm 2: vi khuẩn phát triển bia

e Nhóm 3: vi khuẩn phát triển trong dung dịch rượu vang theo phương pháp

chậm

Trang 8

Năm 1948 Vanghn đã phát hiện sự đi động của nhiều loại vi khuẩn acetic nhờ

có đơn mao ở cực và xếp chúng vào họ Pseudomonadaceae

Ngày nay theo khóa phân loại của Bergeys 1914 và nhiều tác giả khác đã xếp vi khuẩn Acetobacter và Gluconobacter là những vi khuẩn acetic chủ yếu vào họ

riêng Acetobacteriaceae

Năm 1960 Shilwel và Carr nghiên cứu về các đặc điểm nuôi cấy và sinh hoá của vi khuẩn acetic Song song với việc nghiên cứu vi khuẩn này, thì qúa trình lên men acetic không ngừng được cải tiến với mục đích thu được giấm với nồng độ acid

aceuc cao [21]

Hiện nay ứng dụng qúa trình lên men acetic, người ta đã sản xuất ra nhiều loại sản phẩm khác nhau như : giấm ăn thường chứa hàm lượng acid acetic 3%, giấm cô

đặc hoặc tỉnh khiết đã được sử dụng trong các nghành công nghiệp khác

Ở Việt Nam, giấm được sản xuất theo phương pháp lên men truyền thống ở quy mô nhỏ từ các nguồn nguyên liệu khác nhau: nước dừa, chuối, dứa hoặc lên men

công nghiệp từ rượu [20]

2.2 Tổng quan về vi khuẩn acetic :

Vi khuẩn acetic là tác nhân chính của qúa trình lên men acetic Ching thuộc

hai giống Acetobacter và Gluconobacter, đây cũng là hai giống quan trọng nhất của

họ Acetobacteriaceae Về hình dạng, tế bào của chúng có hình que hay elíp, đặc biệt một số có dạng hình cầu, hình chỉ Tùy thuộc vào điều kiện pH môi trường, nhiệt độ nuôi cấy 1 số có hình bán nguyệt Chúng có kích thước trung bình từ 0.6 - 0.8u m Các tế bào đứng tách riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi Một số có khả năng di động nhờ I đến § trên mao ở cực, hay di động bằng chu mao Một số khác không có khả năng này Vi khuẩn acetic là các vi khuẩn hiếu khí bất buộc, gram âm, không hình thành

nội bào tử

Vị khuẩn acetic có khả năng sinh trưởng rất mạnh mẽ từ, một tế bào trong

vòng 12 giờ có điểu kiện dinh dưỡng và thoáng khí đẩy đủ có thể sinh sôi thành 17

triệu tế bào Chúng chỉ phát triển trong điểu kiện hiếu khí, nhiệt độ thích hợp 30- 35°C, pH thích hợp 4-4,2 Chúng thuộc loại cơ thể hóa đưỡng hữu cơ

Các loại vi khuẩn acetic đều có các đặc tính như: oxy hóa ethanol đến acid acetic trong môi trường trung tính hoặc môi trường acid (pH = 4.5) Hầu hết các loài

đểu có catalase (trừ Acetobacter pasterianus Subsb Paradoxus va Acetobacter

peroxydans ), không có oxydase, không có khả năng làm lỏng gelatin, không tạo

indol Vi khuẩn axetic có trong đường , rượu, trái cây, bia, mật ong {16]

Từ trước tới nay, đã có nhiều tài liệu để cập đến vấn để phân loại các loại vi

khuẩn axetic như: Rothenbach (1898), Beijerinck (1948), Hoyer (1899), Hansen

(1911 ), Janke (1931), Vanghn (1948), Nergey (1948-1957), J.Frateur (1950) Dang

Trang 9

Acetobacteriaceae VỀ nguyên tắc, sự phân biệt giữa hai giống Acetobacter và

Gluconobacter rất dễ dàng Acetobacter thì có khả năng oxi hoá acetate hoặc latate đến CO; và HO Chúng đi chuyển bằng chu mao Trong khi đó, Gluconobacter không có khả năng này và nếu di chuyển, chúng di chuyển bằng 1-8 tiêm mao ở cực.[21]

2.2.1.Đặc điểm của giống Acetobacter :{ 16]

Hình dạng tế bào: vi khuẩn Acetobacter là những trực khuẩn hình que đến clip,

dạng thẳng hoặc cong, mảnh có kích thước 06 — 0.8 x1 — 4m Ching thường di động hoặc không di động, nếu di động là do chu mao Không hình thành nội bào tử,

tạo màng nhẩy, gram âm ( một vài trường hợp gram âm biến đổi )

Nhiệt độ tối thích : 25 -30°C, pH : 5,4 - 6,8, nổng độ cồn thích hợp : 5% -> 13%

Nguồn carbon thích hợp cho Acetobacter sinh trudng gém cé ethanol, glycerol, D,L ~ Lactate Các acid amin đơn không được dùng làm nguồn nito va carbon duy nhất Nhiều chủng có thể phát triển trong môi trường với ethanol là nguồn carbon duy nhất và ion NH*; được sử dụng làm nguồn nitơ duy nhất Môi trường chứa

1%,2%,5%,10% etanol tương ứng với sự phát triển của 87%, 82%, 58%, 13% các

chủng thuộc Acetobacter Dưới 10% các chủng thuộc Acetobacter hình thành acid từ

meso ~ erythritol, p-manitol, Sorbitol, D-fructose, lactose, dextrin & tỉnh bột

Acetobacter phan giải đường theo con đường hexose-monophosphate va chu trình tricarboxylic acid Chu trinh glycolysis ít hoặc không xảy ra vì Acetobacter

không có enzim phospho fructokinase Mặt khác con đường Entner-Doudoroff chỉ xãy

ra ở giống Acetobacter tổng hợp cellulose, thuộc phân lớp A.aceti subsp.Xylinum (Leisinger 1965, Kersters - Deley 1968 )

Nhu cầu nhân tố phát triển phụ thuộc vào nguồn carbon trong môi trường Trong môi trường có D.manitol làm nguồn carbon, 1 số chủng đòi hỏi p-aminobenzoic acid, niatin, thiamin, pantothenic acid làm nhân tố phát triển ( Gossele 1980 ) Trong

môi trường có D-glucose, các chủng Acetobacter không cẩn nhân tố sinh trưởng

(Ameyama & kondo 1960 ) Đặc biệt các acid amin có tác dụng ức chế sự phát triển

của loài Acetobacter aceti như threonin, glycine, valine, serine, homoserine, cystein, alanine ( O' sullivan báo cáo năm 1974 )

Yamada đã chứng minh Ubiquino của Gluconobacter là Ubiquino10 trong khi giống Acetobacter có Ubiquino 8-9 (ngoại trừ Aliquifaciens và Acetobacter sinh cellulose có Ubiquino 10) Hệ cytochrome trong | ching của giống Acetobacter khong

có đây di cdc cytochrome aj, a2, a4, b, c, c¡, d (smith, 1961; nakaycuma Nakayama &

Deley 1965 ) ỞAcetobaeter chỉ có ai, không có ở Gluconobacter

Trang 10

Acetobacter hiện diện trong hoa, quả, mật ong, rượu nho, rượu táo, bia, giấm, trái cây có đường, đất vườn

Acetobacter gây bệnh hồng táo và thối táo và lê

Thanh phan G+X trong DNA chiếm khoảng 53 -64% mol,

Theo khóa phân loại của Bergey (xuất bản lần thứ 8 ) giống Acetobacter gồm 4 loài:[16]

+ A.Aceti trên gồm 4 loài phụ: aceti, orleanensis, xylium, liquefaciens + A.pasterianus gồm có 5 loài phụ: pasterianus, lovaniensis, estunensis,

astendens, paradoxus + A.peroxydans

+ A.hansenii

2.2.2 Đặc điểm của giống Gluconobacter ( Acetomonas):[ 16]

Tế bào hình elip đến hình que, có kích thước : 0,5-0,8x0,9-4,2 u m, hiện diện đơn độc, cặp, hiếm khi chuỗi

Di động hoặc không di động, nếu đi động tế bào có 3 — 8 tien mao ở cực hiếm

khi có l tiên mao

Nhiệt độ tối thích 25 — 30°C không phát triển ở 37°C, pH tối thích 5,5 — 6,8 hầu

hết các đòng sinh trưởng được ở pH = 3,6

Nguồn carbon thích hợp cho giống Gluconobacter phát triển là D-manitol,

sorbitol, glycerol, D-fuctose, D-glucose, các acid amin đơn không được sử dụng là

nguồn nitơ và nguồn carbon duy nhất Trong môi trường chứa 1%, 2%, 5% etanol tương ứng có 90%, 88%, 42% các chủng phát triển 85% các chủng thuộc Giuconobacter sẽ tạo acid từ n-propanol, n-butanol, glycerol, D_manitol, D-

arabinose nhưng không tạo acid từ L-rhamnose, D-lactose, dextrin và tỉnh bột

Giống Gluconobacter chuyển hóa đường theo con đường Entner-Doudoroff,

không tham gia chu trinh glycolysis va chu trinh tricarboxylic acid

Tất cả các chủng thuộc Gluconobacter đòi hỏi nhân tố phát triển trong môi trường có D-manitol là nguồn carbon Các acid amin cần thiết cho sự phát triển của

Gluconobacter là: panthotheric acid, niacin, thiamine, p-aminobenzovic acid Ngược

lai valine va proline ức chế sự phát triển của 1 số chủng (shanberger 1972, kerwar

1964, O'sullivan 1974)

Giống Gluconobacter không có enzim oxydase, không khử nitrate, không tạo H;S, khơng oxyhố lactate hoặc acetate đến CO; & HO

Vi khuẩn thuộc giống Gluconobacter làm thối táo và lê, làm biến vết thương

chuyển sang màu nâu Ngoài ra, chúng còn gây bệnh làm hồng dứa

Giống Gluconobacter gỗm có l1 loài là G.oxydans được chia làm 5 loài phụ:

oxydans, industrius, suboxydans, melanogenes va sphacricus

Trang 11

LUAN VAN TOT NGHIEP 1998 - 2002 Bảng: So sánh đặc điểm của Acetobacter và Gluconobacter:[ 14] Giống Gluconobacter Acetobacter Đặc điểm Tiên mao Ơ cực hoặc không có |_ Chu mao hoặc không có Phát triển ở pH 4,5 + + Oxi héa: Acetic acid dén CO; - + Lactate đến CO; - + Etanol đến acid acetic d pH + + 4,5 Tham gia trong chu trinh acid + + citric Ubiquinol Q_10 Q_9 Tỉ lệ G+X (%mol) 56 - 64 53 — 64 Số loài I 4

2.2.3 Một đại điện số ví khuẩn axetic thudng gip:[16)

Ngày nay, người ta đã biết tới 60 loài vi khuẩn có khả năng lên men axetic Trong sản xuất, người ta thường sử dụng 1 số loài sau:

+ Acetobacter aceti:

Trực khuẩn ngấn dạng hình que, kích thước 0,4 - 0,8X1,0 - 1,2 um, thường xếp thành 1 chuỗi dài, không di động, gram âm, bất màu vàng với thuốc nhuộm lôt Khuẩn lạc của chúng to, sáng trên gelatin với dịch lên men chứa 10% đường Saccaroza và tạo thành màng nhẩy, nhấn không được nâng lên theo thành bình

Chúng có khả năng phát triển trên môi trường có nổng độ rượu cao (11%) và có khả

năng tích lũy 6% acid acetic , nhiệt độ thích hợp 34C, thường phát triển trên môi

trường bia

* Acetobacter pasteurianum:

Có hình dạng tương ty nhu Acetobacter aceti, nhung bắt màu xanh với thuốc nhuộm lôi, tạo váng khô, nhăn nheo Tế bào xếp rời nhau thành chuỗi, đôi khi bắt

gặp tế bào có dạng hình chùy, phồng lên, di động không thường xuyên Khuẩn lạc

trên môi trường gelatin và dịch lên men nhỏ, tròn, có khả năng tích lũy được 6,2% acid acetic Nhiệt độ thích hợp để phát triển ở 30°C

~* Acetobacter or leaneuse:

Trang 12

thường dùng để chuyển hóa rượu vang thành giấm theo phương pháp của Pháp Nhiệt độ thích hợp cho quá trình phát triển là 25 —30°C

* Acetobacter schutzenbachie:

Tế bào có dạng hình que, kích thước trung bình từ 0,3-0,4*1,0-3,6 p m Té bao

thường đứng riêng rẽ hoặc xếp thành đôi, có thể tạo váng dày và không bền vững ở

trên các môi trường già Chúng có thể tích luỹ trong môi trường tới 11,5% acid acetic

Thường dùng để sản xuất giấm theo phương pháp chìm của Đức

s* Acetobacter suboxydans:

Tế bào hình que, ngắn, đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi ngắn Chúng không có khả năng di động, tạo những váng mỏng, dễ tan, dễ vỡ nó có thể chuyển

hoá glucoza thành acetic gluconic, socbit thành socboza Thường dùng vi khuẩn này

để sản xuất vitamin C

Các chủng chọn lọc của A.suboxydans được nuôi theo phương pháp chìm trong

dịch dinh dưỡng 10-12% ethanol với một ít glucose, có thể chuyển toàn bộ ethanol

thanh acid acetic, néng độ của sản phẩm có thể đạt đến 13% Quá trình lên men xảy

ra ở nhiệt độ thích hợp là 28-307“ trong khoảng 48, với nồng độ cồn 12-13% Yêu

cầu về không khí rất nghiêm nghặt, chỉ cần ngừng từ 10-20 giây là số tế bào vi khuẩn đã có thể chết đến 1/3,

* Acetobacter xylinum:

Trực khudn dang hinh que 2: m, difng riéng rẽ hoặc xếp thành chuỗi, không dy động Các tế bào được tạo bởi chất nhẩy tạo váng nhăn nheo và dày, bắt màu xanh với thuốc nhuộm iốt và H;SO¿, nó có thể tích luỹ 4,5% acid acetic trong môi trường Ngày nay nó được dùng để sản xuất thạch đừa, một món ăn phổ biến ở

Philippin và Việt Nam

2.3.Cơ sở khoa học của sự lên men acetic

Lên men acetic là quá trình oxy hoá rượu etylic thành acid acetic dưới tác dụng của vikhuẩn Acetobacter trong điểu kiện hiếu khí

2CH;CH;OH +O, =—+ 2CH:CHOOH + 2H;O +Q

Bản chất sinh học của quá trình này được xác nhận bởi Kiizing (1838) và Pasteur (1868) Nó gdm 2 giai đoạn:

Trang 13

Để chuyển thành acid acetic, cơ chất là rượu phải được thẩm thấu qua thành tế bào để vào trong tế bào Hệ enzim có mặt bên trong tế bào (nội bào), sẽ chuyển hoá etylic thanh acid acetic Sau d6 acid acetic mới khuếch tán ra môi trường bên ngoài Người ta gọi quá trình này là quá trình oxy hố khơng hồn tồn, vì các sản phẩm tạo ra tương tự như sản phẩm của các quá trình lên men khác

Để quá trình lên men acetic đạt hiệu quả cao chúng ta cẩn tuyển chọn các chủng vi khuẩn acetic đảm bảo các tiêu chuẩn sau:

Có khả năng oxy hoá rượu etylic tốt Tạo ra giấm có nồng độ acid acetic cao

Có khả năng chịu được néng độ cổn và néng độ acid cao

Các tính chất sinh lý, sinh hoá ban đầu được giữ nguyên trong quá trình lên men

s® Có khả năng nuôi cấy trong điều kiện đơn giản, rẻ tiền,

e© Phải thể hiện tính không mẫn cảm với sinh vật tạp nhiễm và thực khuẩn thể Ngoài ra các điều kiện của môi trường: oxy, nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến

quá trình lên men acetic

2.4.Ánh hưởng của một số điều kiện môi trường tới quá trình lên men

acetic :{ 14]

2.4.1.6nh hưởng của oxy

Lên men acetic là quá trình lên men hiếu khí, do vậy rất cần oxy và sự thoáng

khí Quá trình oxy hoá rượu ethanol để tạo thành sản phẩm acid acetic, chỉ xảy ra khi

vị khuẩn tiếp xúc trực tiếp với không khí Trong điểu kiện càng hiếu khí thì quá trình lên men xảy ra càng nhanh Tính trung bình cứ oxy hoá 1 kg rượu khan cẩn 2,3m' không khí Trong điểu kiện yếm khí thì vi khuẩn acetic sẽ sử dụng chất dinh dưỡng để

tăng sinh khối mà không cần thực hiện quá trình oxy hoá cthanol tạo acid acetic

2.4.2.Anh hưởng của nhiệt độ

Đối với vi khuẩn acetic nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men acetic là 25- 35°C nhiệt độ thấp quá hoặc cao quá sẽ làm quá trình lên men chậm lại, do ức chế sự sinh sản của vi khuẩn acetic, do sự bay hơi của rượu và acid acetíc Chúng thuộc loại

vi khuẩn ưa ấm nên sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 25 — 32°C

2.4.3.Ánh hưởng của các nguồn thức ăn trong môi trường

2.4.3.1.Sự acid hoá dịch lên men

Khi sản xuất giấm, người ta thường bổ sung vào cơ chất ban đầu một lượng acid acetic nhất định để acid hố mơi trường nhằm ngăn chặn sự phát triển của sinh vật có hại, bổ sung một lượng giống ban đầu tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình lên

men Độ acid ban đầu giao động từ 2 - 6%, tốt nhất là 2%, pH tốt nhất từ 4 ~ 4,2

2.4.3.2.Nồng độ rượu

Néng độ rượu thích hợp trong môi trường là 6 — 15%, trung bình là 11 - 13% tuỳ theo loại vi khuẩn Nếu không có rượu etylic trong môi trường thì vi khuẩn sẽ oxy

Trang 14

lên men acetic bao giờ cũng phải đảm bảo hàm lượng rượu tối thiểu là 0,3 — 0,5%, nhằm ức chế sự tổng hợp các enzim oxy hoá acid acetic thành CO; và HO

2.4.3.3.Các chất dinh dưỡng { 16]

Để quá trình lên men xảy ra nhanh chóng, đạt hiệu quả cao, ngoài acid acetic, rượu ethanol, ta cẩn bổ sung một số muối khoáng: (NH,);SO,, K;HPO,, KH;PO.,

MgSO,.7TH;O, FeCl;, CaCO; tuỳ nhu cầu từng lồi Bên cạnh đó mơi trường dinh

dưỡng cẩn bổ sung thêm vitamin, cao thịt, nước chiết cà chua, sữa 2.5.Các quy trình công nghệ lên men acetic

2.5.1 Lên men acetic trong công nghiệp :{ I6]

Giấm có thể được sản xuất theo quy mô công nghiệp Ở các nhà máy sản xuất

giấm ,rượu etylic được oxy hóa thành axil acetic theo m6t trong hai phương pháp sau :

2.5.1.1 Phương pháp chậm (còn gọi là phương pháp của Pháp):

Đây là phương pháp được ứng dụng sớm nhất Rượu vang ở nồng độ rượu

khoảng 2-3% Rượu vang thường được lên men trong các thùng gỗ kích thước cao

:0,5m; đường kính 1,5m và chiều dày lớp nguyên liệu đổ vào là 30-40 cm, để ngồi khơng khí trong điểu kiện tĩnh, nuôi ở nhiệt độ thích hợp khoảng 30°C Sau 2-3 ngày trên bể mặt lớp dung dịch sẽ xuất hiện váng giấm và rượu bất đầu chua dần Sau vài tuần khi nổng độ rượu còn khoảng 0,3 - 0,5% thì lấy giấm ra rồi bổ sung rượu để "lên men" khác Giấm thu được có nổng độ acid acêtic khoảng 5-6% và được khử trùng

Pasteur trước khi đưa vào bảo quản

$% Ưu điểm: của phương pháp này: đơn giản, để thực hiện, tận dụng ngay nguồn vi sinh vật từ không khí, thích hợp cho sản xuất gia đình quy mô nhỏ, tận dụng được các loại nước hoa quả và sản phẩm bia, rượu kém chất lượng

+ Nhược điểm: thời gian dài, hiệu suất thấp

2.5.1.2 Phương pháp nhanh (Phương pháp của Đức):

Khâu chuẩn bị thiết bị lên men là công việc tiên quyết của phương pháp này

Đó là thùng gỗ có chiéu cao 2-3m, đường kính 1-2m được rửa sạch Thùng này được

chia làm 3 ngăn Ngăn giữa là ngăn lớn nhất chứa đẩy vỏ bào (loại gỗ không độc và vỏ bào có kích thước khá đều nhau), cấy vi khuẩn acetic vào lớp vỏ này, rồi phun một dung dịch chứa khoảng 6% acid acetic và 3% cthanol ở ngăn trên để cho chảy từ từ xuống Ở đáy thùng có van để dẫn giấm ra Nhờ có diện tích tiếp xúc rộng lớn đối với không khí nên quá trình oxy hóa rượu thành giấm xảy ra rất nhanh Sau thời gian

24-48, lượng giấm tích lũy sẽ đạt 9-12% thể tích (tùy thuộc vào chiểu cao và tốc độ chảy của nguyên liệu)

Ưu điểm của phương pháp này: tiết kiệm được thời gian lại cho hiệu suất cao,

rất phù hợp cho sản xuất công nghiệp Tuy nhiên phương pháp nhanh đòi hỏi nhiều vế

thiết bị lẫn công tác chuẩn bị, đặc biệt là chuẩn bị giống vi khuẩn acetic

Trang 15

đáp ứng yêu cẩu sản xuất Điểu quan trọng là phải đảm bảo việc thông khí cho thiết

bị lén men thường xuyên và liên tục.{ 16]

1.5.2 Lên men dân gian:

Lên men acetic rất phổ biến trong dân gian Nguyên liệu được dùng là rượu nha:, dịch dứa, dịch nho Chủng vi sinh vật có sẩn trong tự nhiên.(20}

Ở Việt Nam, người ta thường lên men theo cách sau ;

e Lấy một quả chuối thật chín, bóc vỏ và ép dẹp, cho vào bình Sau đó tưới rượu lên chuối, dùng vải phủ kín Đặt nơi thoáng mát sau 1-2/tuẩn thu được con giấm chính là lớp váng mỏng phía trên mặt chuối.[ 16]

e Lấy rượu trắng 50° pha với nước theo tỉ lệ 1:1 Cho thêm 2 phần nước dừa nguyên chất Cho vào lu lớn hay thùng có bịt vải che bụi và ruổi, để 1 nơi yên tĩnh và thoáng mát Lấy con giấm ở trên mặt chuối thả vào mặt rượu

Đến ngày thứ bảy, lấy một phẩn nước dừa pha vào rượu cho tiếp vào

giấm Như vậy giấm sẽ mau chua và dịu, vì trong nước dừa có phốt phát

và đường Sau 10 ngày, ở nhiệt độ khoảng 30°C, dấm dẫn chua và xuất

hiện váng trên mặt Sau khi lấy giấm ra thì bổ sung một lượng tương đương

nước đừa có pha rượu như trên

se Cho 4 lít rượu gạo15-20°C , 44 lít nước nguội đã điệt khuẩn, 100-150ml

nước dừa, 11 quả chuối tiêu, 4 thìa canh đường vào I chum Diy kin va

bằng vài lớp bao tải, lên men nửa tháng, ở nhiệt độ 30-35”C.[16]

2,6.Ứng dụng vi khuẩn axetic trong công nghiệp và trong đời sống

:[16]

2.6.1.Trong céng nghiép

Qua nghiên cứu con người đã nhận thấy vi khuẩn Acetobacter là một trong những loại vi khuẩn hiếu khí có nhiều ứng dụng trong thực tế

Trong công nghiệp dược phẩm, sử dụng chủng vi khuẩn Acetobacter suboxydans tổng hợp acetic arcocbic (vitamin C), một số khác có khả năng tổng hợp

vitamin B1, B2

Trong công nghiệp thực phẩm, con người đã dùng vi khuẩn Acetobacter xylium vào sản xuất thạch đừa

Các vi khuẩn acetic đã chuyển hoá rượu etylic thành acid acetic, đây là một loại nguyên liệu rất quan trọng trong công nghiệp Người ta đã sử dụng nó để: tổng hợp este, chất diệt cỏ, sản xuất tơ nhân tạo, sơn nhân tạo, làm nguyên liệu để tổng

hợp các dung môi hữu cơ (axetyl, acetaldehyt), sơ chế cao su vv

2.6.2.Trong đời sống

Thường sử dụng vi khuẩn acetic để sản xuất giấm ăn Giấm ăn là một dung địch chứa chủ yếu là acid acetic có nỗng độ từ 3 - 5%

Trang 16

hoá học của các Vitamin B va C được ổn định, khó bị phân huỷ, hạn chế sự sinh sôi nảy nở và hoạt động của vi khuẩn gây hại cho thực phẩm Bên cạnh đó trong giấm còn có nhiều vitamin, chất khoáng, enzim bổ ích

Ngoài ra, người ta còn dùng giấm để diệt vi trùng, làm thuốc giảm đau, tẩy rửa

làm bóng các vật dụng.[{ 18]

Tiêu chuẩn của giấm ăn :{ 16]

Giấm ăn là loại axit thực phẩm Vì vậy nó phải đảm bảo là không chứa chất độc với người và không có những vi sinh vật gây bệnh Một mẫu giấm tốt: trong suốt hoặc hơi đục (nếu nguyên liệu là tính bột ), màu trắng trong (nếu là giấm rượu, glucose) hoặc có màu vàng nhạt đến nâu ( nếu là giấm bia, rượu vang hoặc rỉ đường) Mùi vị chua địu, không có mùi vị lạ, đặc biệt là không có mùi vị kim loại Có thể có

mùi vị của nguyên liệu như rượu, bia, rỉ đường Nếu giấm còn nhiều mùi vị nguyên

liệu thì sự "lên men" giấm chưa đạt yêu cầu, giấm chóng hỏng

e Không có giun lươn

se Độ chua từ 50g-60g acid acetic /1 lít giấm theo tiêu chuẩn nước ngoài hoặc là 30g/lít theo tiêu chuẩn Việt Nam

e Không chứa phẩm màu nào khác ngồi nước giấm © Khơng chứa chất sát trùng

Trang 17

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP 1998 - 2002 PHAN II: VAT LIEU & PHUONG PHAP NGHIEN CUU 3.1.Vật liệu 3.1.1.Nguồn phân lập

Nguồn nguyên liêu để phãn lập vi khuẩn acetic là: bía, giấm thủ công, nước

nho và nước đừa mua ở các chợ khác nhau 6 TPHCM va Dalat 3.1.2.Môi trường nghiên cứu

4 Môi trường dùng để phân lập (MT.1) + Nước thịt (500g/1) Pepton NaCl (NH4)2SO4 KH;PO, K;HPO, CHCOOH Cén + + + + + +.+.° ¡000ml 10g 5g 0,lg 0,1g 0,1g 0,5 0,05% 0,5-1%

Trang 18

3.1.3.Môi trường nghiên cứu quá trình lên men

+ Môi trường nhân giống (MT.4) xế: + + + + + + Glucose 10g Cao nấm men Sg Pepton 3g Ethanol 5ml Acid acetic 0.,3ml Nước chiết khoai tây 100ml Nước cất 900ml + Môi trường lên men của vi khuẩn acetic (MT.§) + + + + + + + Cồn 5% CH;COOH 0.5% Cồn 0,5% MgSO,.7H;O 0,5g/1 NH,SO, 0,1g/1 KH;PO, 0,1g/ K;HPO, 0,1g/

3.1.4.Môi trường nghiên cứu các đặc tính sinh lý-sinh hố Mơi trường thử khả năng oxi hod ethanol (MT.6) + + + + + + + + + + + + Dịch chiết nấm men 3% Agar-agar 2% Bromocrezol Iml(2,2%)

Ruou etylic liml

Trang 19

LUAN VAN TOT NGHIEP 1998 - 2002 CÁCH PHA CHẾ: + NaCl 3g + KH ;PO, l sẽ + K,HPO, 1,52 + Pepton 0,1g + Glucose 0,052 + Nước cất 1000ml

Đem các muối hoà vào 100ml nước cất Gelatin được hoà tan riêng trong 400ml nước cất, bổ sung đường pepton, nước thịt Trộn 2 dung dịch với nhau rồi đun sôi vài phút Hoà tan Agar riêng vào 500ml nước cất khác, rồi trộn chung các thành phan còn lại thành 1000ml môi trường và điều chỉnh pH đến 7,0, sau đó phân phối vào các dụng cụ thuỷ tỉnh rồi khử trùng

Trang 20

+ Agar 20g + Nước cất 1000ml % Môi trường khử khả năng phân huỷ canxi lactate thành carbonate (MT.14) + Canxi lactate 10g + Cao nim men 10g + Agar 20g + Nước cất 1000ml + PH 7 + Môi trường khử khả năng tạo sắc tố (MT.15) + Glucose 30g + Cao nấm men 2g + Pepton 3g + CaCO; 20g + Nước cất 1000ml 3.2.Các phương pháp nghiên cứu đã sử dụng 3.2.1.Phân lập và chọn giống 3.2.1.1.Phân lập các chủng vi khuẩn acetic theo phương pháp của Vinogradski

Bổ sung các nguyên liệu là: bia tươi, nước dừa, địch nho và dấm thủ công vào các bình tam giác có chứa môi trường lên men (MT.5) Để nơi thoáng khí, miệng bình có phủ một lớp vải mỏng để tránh ruổi muỗi Lên men ở nhiệt độ 30-32°C với thời gian 7-I5 ngày Vi khuẩn acetic là loại hiếu khí, vì vậy trên môi trường lỏng bao giờ cũng tạo thành màng, màng đó chính là vi khuẩn acetic Sau 15 ngày chúng tôi thu được các màng giấm từ các nguồn nguyên liệu trên

Tiến hành cân 1 gram m4u, nghién nhỏ bằng cối sứ vô trùng, rồi thực hiện theo phương pháp pha lỗng Pasteur Chuyển tồn bộ mẫu (1g) vào ống nghiệm chứa

9ml nước cất vô trùng ta được dung dịch pha loãng với nồng độ 10Ì lắc đều, dùng

pipét vô trùng rút Iml địch huyển phù này, cho vào ống nghiệm thứ 2 có chứa 9ml

nước cất vô trùng, ta được dung dịch pha loãng có nổng độ 10”, cứ tiếp tục pha loãng

như vậy cho đến khi đạt nồng độ pha loãng cân thiết (10”, 10” )(16]

Sau đó phân lâp trên môi trường thạch đĩa (MT.1) với phương pháp như sau:

+ Chuẩn bị các đĩa petri chứa sẵn môi trường phân lập (MT.1) đã vô

trùng

Trang 21

+ Dùng que gạt vô trùng dàn đều lượng mẫu lên khấp bể mặt môi trường Mỗi mẫu cấy 3 đĩa Cấy xong bao gói các đĩa petri lại, để ở

nhiệt độ phòng (30”C) trong 3 ngày [21]

+ Sau 3 ngày quan sắt trên môi trường và phân biệt các khuẩn lạc khác nhau về màu sắc, hình dạng, kích thước, tích chất bể mặt Từ đó chọn ra các khuẩn lạc riêng rẽ cấy sang môi trường cacbonate-agar

(MT.2)

3.2.1.2.Xác định khả năng sinh acid acetic của các ching [21]

* NGUYEN TAC:

Dựa vào khả năng làm tan CaCO; của acid của các chủng mới phân lập được bằng sự xuất hiện các vòng phân giải trong suốt bao quanh khuẩn lạc khi cấy chúng lên môi trường Carbonat-agar (MT.2)

% PHƯƠNG PHÁP:

Chuẩn bị các đĩa petri có môi trường carbonate-agar đã vô trùng Chọn các khuẩn lạc khác biệt và tách rời nhau nói trên để cấy sang môi trường đã chuẩn bị Nuôi chúng ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày, sau đó quan sát sự xuất hiện vòng phân

giải trong suốt bao quanh khuẩn lạc Dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) và

đường kính của khuẩn lạc (d) Khả năng phân giải CaCOa được tính bằng tỉ số D/d Nếu tỉ số này càng lớn, chứng tỏ khả năng sinh acid của chúng càng mạnh

3.2.1.3.Thuần khiết giống [21]

Từ các khuẩn lạc có vòng phân giải CaCO; vừa chọn, dùng que cấy trích ly cdc khuẩn lạc này vào ống nghiệm chứa 3-5ml nước cất vô trùng Lắc thật kỹ để tế

bào được tách ra riêng rẽ

Hút 0,1ml dung địch này nhỏ vào đĩa petri chứa môi trường phân lập

Dùng que gạt vô trùng dàn đều lượng dịch khắp mặt thạch từ đĩa thứ nhất sang đĩa thứ

3 mà không bổ sung thêm địch giống Nuôi ở nhiệt độ phòng 32°C với thời gian 3

ngày Sau đó chọn các khuẩn lạc được hình thành từ một tế bào riêng rẽ và đồng nhất,

cấy chuyển sang thạch nghiêng có chứa môi trường giữ giống vi khuẩn acetic.(MT.3)

Để bảo quản giống, ta để giống trong tủ lạnh (10”C), chu kỳ cấy chuyển

là Itháng/Ilẩn

3.2,2.Mô tả các đặc điểm hình thái của vi khuẩn Acetobacter

3.2.2.1.Đặc điểm hình thái khuẩn lạc trên môi trường phân lập [21]

+ NGUYÊN TẮC:

Vị sinh vật khi phát triển trên bể mặt các môi trường đặc khác nhau, sẽ

hình thành các dạng khuẩn lạc đặc trưng cho loài đó +* PHƯƠNG PHÁP:

- - Chuẩn bị các đĩa petri có chứa môi trường phân lập đã vô trùng

- - Các giống từ thạch nghiêng, đem pha loãng theo phương pháp Pasteur đểtao dung dịch giống phù hợp

Trang 22

- Ding que gat phan phéi giọt dịch đều khấp mặt thạch sao cho tạo được những khuẩn lạc tách rời nhau nuôi ở nhiệt độ 32°C trong 3 ngày

Quan sát và mô tả các đặc điểm của khuẩn lạc: hình dạng, màu sắc, đường kính, đặc tính bể mặt và mép khuẩn lạc

3.2.2.2.Đặc điểm hình thái tế bào trên môi trường nhân giống

Chuẩn bị các ống nghiệm có chứa 10ml môi trường nhân giống (MT4)

Cấy các chuẩn vi khuẩn vào các ống nghiệm Nuôi ở nhiệt độ 32°C trong 16-24”.Tiến hành làm các thí nghiệm sau: ° - LÀM TIÊU BẢN GIOT TREO(21] s* MUC DICH: - _ Quan sát hình thái tế bao vi khuẩn - - Cách sắp xếp tế bào - _ Xác định sự chuyển động của vi khuẩn * NHUỘM GRAM:

Mục đích xác định vi khuẩn này thuộc loại gram gì Nếu sau khi nhuộm kép (nhuộm Gram) mà tế bào bất màu hồng thì đó là vi khuẩn Gram âm Gr, Ngược

lại nếu bắt màu tím thì chính là vi khuẩn Gram dương Gr”

Quan sát các tiêu bản ở vật kính (x40) rồi chuyển sang vật kính (x100) bằng dầu soi 3.2.3 Đặc điểm sinh lý sinh hoá

3.2.3.1.Định lượng acid acetic { I6] NGUYEN TAC:

Định lượng acid acetic bằng theo phương pháp chuẩn độ với NaOH 0,1N có phenolphtalein làm chất chỉ thị màu

* THỤỰC HIỆN:

Cho vào bình tam giác (loại 100ml hoặc 200ml) 10ml dung dịch lên men,

thêm vào đó I đến 2 giọt phenolphtalein, chuẩn độ bằng NaOH 0,IN, tính sé gram

acid acetic trong 1000 ml dung dich lên men

10 (s )

X: số gram acid acetic trong llít dịch lên men

V: số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn 10ml dung dịch lên men

Trang 23

3.2.3.2.Khả năng oxy hoá ethanol thành acid acetic [21]

+ NGUYÊN TẮC:

Các c vi khuẩn acetic đều có khả năng này Nếu là Gluconobacter

sẽ làm cho môi trường biến đổi thành màu vàng, và xung quanh khuẩn lạc có vành

xanh lơ do quá trình oxy hoá các acid Còn chỉ Acetobacter cũng làm môi trường biến

đổi thành màu vàng, nhưng sau đó chuyển lại thành màu lam lục ( do acid bị ơxy hố

tiếp tục)

+ THỰC HIỆN:

Chuẩn bị các đĩa petri có chứa môi trường thử khả năng ơxy hố ethanol

đã vơ trùng Dùng que cấy thước thợ trích ly giống vào một điểm ở giữa đĩa petri Sau 3 ngày quan sát sự biến đổi của môi trường

3.2.3.3 quan hệ với oxygen{22]

+% NGUYÊN TAC:

Căn cứ vào khả năng sinh trưởng của vi sinh vật trong điểu kiện môi trường có nống độ oxy khác nhau:

Vi sinh vật hiếu khí bất buộc chỉ phát triển phía trên hoặc sát lớp bể mặt môi trường

Vi sinh vất kị khí bắt buộc chỉ phát triển ở đáy môi trường

Vị sinh vật hiếu khí chỉ phát triển ở lớp bể mặt môi trường

Vi sinh vật kị khí không bắt buộc sẽ phát triển dọc theo độ dày của môi trường * PHƯƠNG PHÁP:

Chuẩn bị các ống nghiệm thạch đứng chứa 10ml môi trường (MT.1) Cấy

từng chủng vi khuẩn vào ống nghiệm bằng que cấy đầu nhọn theo kiểu trích sâu Nuôi

ở nhiệt độ 32°C trong 3 ngày + YÊU CẤU:

Nhận xét sự sinh trưởng của từng chủng vi khuẩn trong môi trường Từ đó xác định quan hệ của từng chủng vi khuẩn đối với oxygen

3.2.3.4.Hoạt tính Catalase : [22]

+ NGUYÊN TẮC:

Catalase xúc tác sự phân giải H;O; thành O¿ và H;O Nếu vi sinh vật khảo sát có khả năng tạo Catalase thì khi nhỏ H;O; vào dịch nuôi cấy vì sinh vật đó,

HO) sẽ bị phân giải thành O; và HO; gây ra hiện tượng sủi bọt

* YÊU CẦU:

Cẩn thận nhỏ H;O; trực tiếp vào ống môi trường lỏng đã nuôi chủng khảo sát

sau 24" quan sát hiện tượng

3.2.3.5.Kha nang tao thanh indole : (20)

NGUYEN TAC:

Trang 24

Cấy chủng khảo sát vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường tryptophan

Nuôi ở nhiệt độ phòng Sau 48” nhỏ 0,3ml thuốc thử Kowac Quan sát sự xuất hiện

lớp màu đỏ trên bể mặt môi trường từ đó đánh giá khả năng hình thành indole của

chủng khảo sat

3.2.3.6.Khả năng phân giải dextrin:{20]

+ NGUYÊN TẮC:

Dextrin là một polysaccharide có cấu trúc không gian tương đối phức tạp

Khi tác dụng với iốt sẽ bị giữ lại trong cấu trúc mạng không gian và làm môi trường có màu xanh đậm Nếu vi sinh vật có khả năng phân giải dextrin câu trúc này bị phá vỡ, do đó sẽ xuất hiện vòng phân giải trong suốt bao quanh khuẩn lạc

* THỤC HIỆN:

Cấy vi khuẩn vào giữa hộp petri có môi trường thử khả năng phân giải dextrin Nuôi ở nhiệt độ phòng Sau 3 ngày thực hiện phản ứng màu với thuốc thử

od

3.2.3.7.Khả năng phân giải gelatin:{ 16]

Điều chế môi trường gelatin, thạch, thịt, pepton vào các hộp petri, cấy vi

khuẩn và nuôi ở nhiệt độ phòng thí nghiệm Sau 3 ngày xác định khả năng phân giải

gelatin bằng thuốc thử HạC]; (15%HgCI;, 20% ”/¿ HCl) Nếu vi khuẩn có khả năng

phân giải gelatin thì sau khi cho thuốc thử vào chung quanh khuẩn lạc sẽ xuất hiện

vòng trong suốt Chỗ còn gelatin cho kết tủa trắng đục Vòng này càng lớn biểu hiện khả năng phân giải gelatin càng mạnh Đo kích thước vòng phân giải 5-10 phút sau khi

nhuộm bằng thuốc thử HgC)¿

3.2.3.8.Khả năng oxy hoá latate hoặc acetate:{ 16]

Sử dụng môi trường sodiumacetate có chứa bromthy molblue làm chất chỉ thị màu Chỉ thị màu này có pH nhạy cảm trong khoảng 5,6 - 7,4 và biến đổi từ màu vàng sang màu xanh dương Khi acetate bị oxy hoá thì môi trường trở nên kiểm tính

Bằng cách quan sát sự chuyển màu môi trường (vàng hơi xanh chuyển sang xanh

dương) cho phép ta đánh giá được khả năng oxy hoá acetate của chủng vi khuẩn được

phân lập

THUC HIEN:

Cay ching vi khuẩn phân lập được vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường

sodium acetate Sau 7 ngày quan sất sự chuyển màu môi trường

3.2.3.9.Khả năng phát triển trên mơi trường gÌutamate-agar:[16]

Vị khuẩn acetic có đặc tính phát triển trên mơi trường gÌutamate-agar

Cấy chủng khảo sát lên môi trường glutamate-agar Quan sát sự phát triển của vi

khuẩn sau 10-12 ngày ủ ở nhiệt độ phòng

3.2.3.10.Khả năng chuyển hoá glycerol thành dihydroxy acetone:{ 16] Cấy chủng vi khuẩn vào giữa hộp petri có chứa 20ml môi trường cao

nim men-glycerol Sau 48-72", đổ dung dịch Fehling lên mặt thạch Nếu chủng vi sinh

Trang 25

vật chuyển hoá glycerol thành dihydroxyacetone thì khuẩn lạc sẽ xuất hiện màu cam

đỏ (màu của Cu¿ạO),

3.2.3.11.Khả năng phát triển trên môi trường manitol-agar:{ 16]

Cấy các chủng khảo sát lên môi trường manitol-agar, quan sát sự phát triển của vi khuẩn sau 10 ngày ở 30°C

3.2.3.12.Khả năng phân hủy calcium lactate thành carbonate({ I6] Cấy chủng khảo sát vào giữa hộp petri chứa 20ml môi trường calcium- lactate Sau 7 ngày quan sát khả năng phân huỷ calcium lactate của các chủng Nếu

quanh khuẩn lạc xuất hiện cặn tủa CaCO; thì kết luận calcium lactate đã bị phân huỷ

đến carbonate

3.2.3.13.Khả năng tạo sắc tốt 16]

Cấy vi khuẩn lên ống thạch nghiêng chứa môi trường tạo sắc tố.Ủ ở nhiệt độ phòng, sau 12 ngày quan sát khả năng tạo sắc tố của vi khuẩn

3.2.3.14.Khả năng tổng hợp xenluloza[2 I ]

Nhỏ dung dịch lugol (2gIK + 1gl + Nước cất -> 300ml) lên váng vi khuẩn

Sau đó đổ đi thay bằng dung dịch H;SOx 60% Lại đổ đi, nếu có xenluloza sẽ thấy xuất hiện màu lam

3.2.4.Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình lên men

acetie{ I6]

3.2.4.1.Xác định nồng độ cồn thích hợp cho sự lên men

Đầu tiên chuẩn bị các bình tam giác có chứa 100ml môi trường lên men đã vô trùng Bổ sung thêm cổn ở các nổng độ khác nhau là 3%, 5%, 8% và 10% Tiếp theo cấy cùng một lượt tế bào vi khuẩn vào các bình lên men trên (10%) Tiến hành

lên men ở nhiệt độ 32”“, pH ban đầu là 5,5, tốc độ lắc thông khí 150 vòng/phút

Xác định lượng acid acetic sinh ra ở các thời điểm: 0°, 24°, 48", 72", 96", 120°, 144", I68*, 192" Đồng thời xác định nồng độ cồn thích hợp cho quá trình lên men của các

chủng nghiên cứu

3.2.4.2.Xác định néng độ pH thích hợp cho sự lên men

Tiến hành lên men với các điểu kiện như trên nhưng khác nhau với độ pH ban đầu là: 3,4,5,6,7 Điều chỉnh pH có thể bằng CH;COOH hoặc NaOH

Xác định hàm lượng acid acetic sinh ra ở các thời điểm: (0°, 24°, 48", 96",120", 144°, I68°, 192") bằng phương pháp định lượng acid acetic Từ đó xác định pH thích hợp

nhất cho sự lên men acetic

3.2.4.3.Xác định nhiệt độ thích hợp cho sự lên men

Tiến hành lên men ở các nhiệt độ: 25”, 30%, 35,40, độ pH ban đầu

là 5,5 với nồng độ cồn là 5%, để hở ngoài không khi

Trang 26

PHAN IV:

KET QUA - BIEN LUẬN

4.1.Phân lập và chọn giống

Chúng tôi tiến hành phân lập từ các nguồn nguyên liêu khác nhau: bia, nước đừa, dịch nho và giấm thủ công Trước hết, chế tạo các môi trường với thành phẩn và điều kiện thích hợp để đảm bảo cho vi khuẩn acetic phát triển và tạo màng (MT.$) Sau thời gian 7-15 ngày, trên bể mặt tạo thành một lớp màng, màng đó chính là tập hợp các vi khuẩn acetic có trong dịch lên men

Để phân lập được vi khuẩn acetic ta đùng que cấy lấy một lượng (1gram) màng này nghiền nhỏ, hoà nước cất vô trùng rồi pha loãng mẫu theo phương pháp Pasteur chọn nổng độ thích hợp rồi cấy trên môi trường (MT.])

Sau 3 ngày chúng tôi chọn các khuẩn lạc riêng rẽ Sau đó tiếp tục làm thuần và kết quả thu được 16 mẫu khuẩn lạc có hình dạng và kích thước khác nhau, (tạm gọi là 16 chủng vi khuẩn acetic), và được ký hiệu như sau:

Nguồn phân lập Ký hiệu các chủng được phân lập

Giấm thủ công Ái, Aa

Nước dừa lên men Dị, D2, D3 Ds, Ds, Dg

Dich nho lén men NỊ N¿ Nạ

Bia Bì, Bạ, By, Ba, Bs

Bảng 1: Ký hiệu riêng của 16 chủng vi khuẩn được phân lập từ các nguồn nguyên

liệu khác nhau

Để kiểm tra khả năng sinh acid của các chủng mới phân lập trên Chúng tôi nuôi cấy chúng trong môi trường (MT.2) ở nhiệt độ 30-35 /7ngày Các chủng có

khả năng sinh acid mạnh, sẽ tiết acid làm tan CaCO: tạo thành vòng trong suốt bao

Trang 27

Zz Kíhiệu | Đườngkính | Đườngkính | Tỷ số đường

STT | ching Vòng phân | của khuẩn lạc | kính vòng phản

giải D(mm) d(mm) ứng với CaCO; | D/d A; 10 2 5,0 2 By 12 3 4,0 3 Bạ 12,5 3 4,2 4 Bs 13,5 3 4,5 5 Nụ l5 6 2,5 6 Nạ 13 4,5 29 7 N; 12 3,5 3,4 8 D, 11,5 7 1,6 9 D; 15 4,5 3,3 10 Ds 13,5 3,1 4,4 II Ds 13 3 4,3 12 Ds 15,5 3,4 4,6

Bảng 2: khả năng phân giải CaCO; của 12 chủng vi khuẩn acetic Từ kết quả trên cho ta thấy trong 16 chủng được phân lập có đến 12 chủng có khả năngsinh acid để phân giải CaCO; khả năng phân giải CaCO; trên

Trang 29

2‡IP LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP 1998 - 2002

Hình 4: khả năng phân giải CaCO: trên MT.2 của các chủng Nụ, N›,N; Để khẳng định một lần nữa về khả năng sinh acid của các chủng trên Chúng tôi tiếnhành khảo sát sơ bộ khả năng lên men của chúng trong môi trường

Trang 30

Và kết quả được biểu diễn trong biểu đổ sau đây: Ham 5 lượng acid acetic 4 (g1 Al BI B2 BS NI N2 N3 DI D2 D3 D4 D5 Ki hiệu các chủng

Biểu đổ 1: Biểu điễn khả năng tích luỹ acid acetic của 12 chuẩn vi khuẩn acid acetic Từ các kết quả trên ở bảng 2, 3 và biểu đổ 1 chúng tôi quyết định chọn 3 chủng có khả năng sinh acid mạnh nhất có kí hiệu: Á;, B;, D; để tiếp tục nghiên cứu

4.2.Mô tả các đặc điểm, hình thái của vi khuẩn acetic

4.2.1.Đặc điểm hình thái khuẩn lạc trên môi trường (MT.1)

Khi tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn acetic trên môi trường (MT.1) ở nhiệt độ khoảng 32C trong 3 ngày Chúng tôi thu nhận được những đặc điểm và hình

D; Khuẩn lạc 0,2-0,5mm | Mautrén, | Bể mặt Mép trơn

Trang 32

4.2.2.Đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn trên môi trường (MT.4)

Tiến hành nhuộm đơn, nhuộm gram, nghiên cứu khả năng di động của

các chủng vi khuẩn acetic Chúng tôi thu nhận kết quả khi quan sát hình thái tế bào được tóm tắt trong bảng 5: —

Kí hiệu chẳng Hình dạng tế | Cáchsắpxếp ( Khả năngdi | Sự bắt màu

bào tế bào động gram

| Tế bào hình Thường sắp xếp | Khả năng di Màu hồng

Ái que ngắn ở đạng đơn hay | động mạnh gram(-)

đôi

Tế bào hình Thường sắp xếp | Di động mạnh | Màu hồng

Bs que dai ở dạng đơn hay gram(-)

đôi

Tế bào hình Thường sắp xếp | Có di động Màu hồng

Trang 34

4.3.Khảo sát các đặc điểm sinh lý-sinh hoá của một số chủng vi khuẩn

acetic

4.3.1.Khả năng oxy hoá ethanol thanh acid acetic

Sau khi tiến hành thí nghiệm theo phương pháp ở mục 2.3.2, nuôi cấy vi khuẩn acetic ở nhiệt độ 32°C trong 3 ngày Kết quả thu được như sau:

* Chủng D; làm môi trường xuất hiện màu vàng, đồng thời xung quanh khuẩn lạc có màu xanh lơ là do quá trình oxy hoá của acid

% Chủng A;, B; ban đẩu cũng làm môi trường biến đổi thành màu vàng,

nhưng sau đó chuyển môi trường trở lại màu lam lục Nguyên nhân là do

2 chủng này còn có enzim oxy hoá các acid acetic để tạo CO; và H;O Như vậy cả 3 chủng trên đều có khả năng oxy hoá ethanol thành acid acetic Riêng chủng A¡, B„ còn có khả năng tiếp tục oxy hod acid acetic Day la một

trong những đặc tính quan trọng để phan biét 2 chi Gluconobacter va Acetobacter

Trang 35

Hình 11: Khả năng oxy hoá ethanol của 2 chủng B; và D;

4.3.2.Quan hé véi oxygen

Khi nuôi cấy các chủng vi khuẩn acetic trên môi trường thạch đứng (MT.1)

theo phương pháp ở mục 2.3.3, nuôi ở nhiệt độ 32C trong 3 ngày Chúng tôi nhận

Trang 36

Hình 12: Đặc tính phát triển của chủng vi khuẩn acetic trén MT.4 ĐC (-) :Không nuôi cấy vi khuẩn

ĐC (+) :Sự phát triển trong môi trường thạch đứng (MRS) của vi khuẩn kị

khí không bắt buộc —vi khuẩn lactic 4.3.3.Khảo sát hoạt tính catalase

Catalase là một tron những enzim quan trọng của vi khuẩn hiếu khí Tiến hành thí nghiệm, nuôi cấy các chủng vi khuẩn acetic trong môi trường lỏng (MT.4) trong 24” kết quả thí nghiệm cho thấy cả 3 chủng A), Bs, Ds déu

có phản ứng đương tính Nguyên nhân là do sự có mặt của enzim catalase trong thành

phần tế bào ở các chủng trên sẽ oxy hoá H;O; (oxy già) thành H;O và CO; bay ra

Trang 37

+ :phdn tng ++ :phản ứng mạnh

4.3.4.Khảo sát khả năng tạo indole

Tiến hành nuôi cấy các chủng khảo sát vào 5 mÌ mơi trường tryptophan Sau 48” bổ sung thuốc thử kowac vào ống nghiệm Đánh giá khả năng sinh indole của chúng bằng sự xuất hiện màu đỏ trên bề mặt môi trường

Hình 13: Khả năng tạo indole

ĐC() :Môi trường không nuôi cấy vi khuẩn

ĐC(+) :E.coli sính indole tạo lớp màu đỏ trên bể mặt môi trường

Kết quả hình trên cho thấy các chủng A¡, Bs, Ds khéng sinh indole nén không tạo màu Đó là đặc tính chung của các vi khuẩn thuộc họ Acetobacteriaceae

4.3.5.Khảo sát khả năng thuỷ phân dextrin và gelatin

Sau khi tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn acetic ở nhiệt độ 32C, thời gian 32 ngày Kết quả thực nghiệm cho thấy cả các chủng khảo sát đều không có khả nàng thuỷ phân dexưin cũng như không phân giải gelatn là đặc tính của họ Acetobacteriaceae nguyên nhân do chúng không có enzim để phân giải dextrin và

gelatin trong thành phần tế bào

4.3.6.Khảo sát khả năng oxy hoá acetate

Khả năng oxy hoá acetate là một trong những đặc điểm quan trọng nổi

Trang 38

Trong họ nay, chi Acetobacter có khả năng oxy hod acetate làm môi trường có chất

chỉ thị Bromothymol blue chuyển từ màu xanh lục sang thành màu xanh lam Ngược

lại chỉ Gluconobacter không có hoạt tính này

Tiến hành nuôi cấy các chủng cần khảo sát Kết quả thí nghiệm ở hình

L4:

Hình 14: Khả năng oxy hoá Sodium acetate của các chủng Aj, Bs, Ds ĐC: Môi trường không nuôi cấy vi khuẩn

Nhìn chung sau 7 ngày nuôi cấy, các chủng A;, Ba: đều có khả năng oxy hoá sodium acetate đến CO; và H;O và có màu xanh lam Riêng chủng D; không có khả năng này Chủng Ai Bs Ds Két qua + + -

Bảng 7: Khả năng oxy hoá sodium-acetate

Trang 39

4.3.7.Khả năng phát triển của các chủng trên môi trường glutamate-

agar

Kết quả thực nghiệm cho thấy tất cả các chủng khảo sát đều có khả năng phát triển trên môi trường này Dưới đây sẽ minh hoạ điều đó:

Hình 15: Khả năng phát triển của chủng A¡, D; trên môi trường giutamate-agar 4.3.8.Khảo sát khả năng chuyển hod glycerol thanh dihydroxy acetone

Tiến hành cấy các chủng cẩn nghiên cứu vào đĩa petri có chứa môi trường cao nấm men-glycerol Sau 3 ngày đổ dung dịch Fehling lên bể mặt thạch Chúng tôi quan sát và nhận thấy rằng: các chủng A¡, Ba, D; không tạo thành màu cam

đỏ (màu của Cu;O) Chứng tỏ các chủng này đểu không có khảẩ năng chuyển hoá glycerol thanh dihydroxyaceton

4.3.9.Khảo sát khả năng phát triển trên môi trường manitol

Chúng tôi nuôi cấy các chủng A;, Ba, Da trên môi trường manitol ở nhiệt

độ khoảng 32C với thời gian 10 ngày

Kết quả cho thấy các chủng đều có khả năng phát triển mạnh trên môi

Trang 40

Hình 16: Khả năng phát triển trên môi trường mannitol của 3 chủng A;,B;,D; 4.3.10.Khả năng oxy hod calcium lactate đến carbonate

Khả năng oxy hoá calcium lactate của vi khuẩn được đánh giá bằng sự tạo thành CaCO; trên môi trường nuôi cấy Sự tạo thành CaCO: gây ra hiện tượng

làm đục môi trường nuôi cấy Do đó xung quanh khuẩn lạc của vi khuẩn sẽ xuất hiện

can tia CaCO

Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn acetic Sau 7 ngày chúng tôi quan sát và thấy rằng:

Các chủng A;, Bs déu có khả năng oxy hod calcium lactate dén

Định dạng
Số trang	59
Dung lượng	3,67 MB