Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn lactic phân lập từ các thực phẩm lên men

Một số chủng vi khuẩn lactic khi sinh trưởng trên mơi trường chứa máu cĩ thể tạo thành các cytochrom, thậm chí tiến hành cả quá trình photphorin hĩa chuỗf hơ hấp , Sự sinh trưởng phát tr

Trang 1

BO GIAO DUC VA DAO TAO

TRUONG DAI HOC SU PHAM TP HO CHi MINH KHOA SINH HOC

TRAN THI HONG VAN ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN

LACTIC PHAN LAP TU CAC

THUC PHAM LEN MEN LUAN VAN TOT NGHIEP

CHUYEN NGANH VI SINH

Trang 2

LỜI CÁM ON

Em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến cơ Trần Thanh Thủy _ cán bộ giảng dạy bộ mơn vi sinh trường đại học Sư Phạm TP_ HCM đã tận tình hướng dẫn em trong suốt thời gian thực hiện để tài

Xin cảm ơn các thầy cơ phịng thí nghiệm vi sinh_ sinh hĩa_ sinh lí

thực đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho em hồn thành tốt để tài

| Chân thành cảm ơn các bạn cùng lớp đã giúp đỡ và động viên tơi trong quá trình học tập

Sinh viên

Trang 3

TRAN TH] HONG VAN

PHAN I: MG DAU

Lên men lacúc được lồi người biết đến từ rất lâu Khi mà vốn hiểu hiết cịn rất sơ khai, con người đã làm được điều mà chính họ khơng ngờ tới là ứng dụng quá trình lên men lacuc để chế biến và bảo quản thưc phẩm cho chính

mình Ngày nay, trên thế giới các sản phẩm lên men của quá trình này đã cĩ mãi ở khắp mọi nơi Ngay từ năm 1908, 3 các nước phương Tây người ta đã biết sản xuất phomat, sữa chua bằng lên men lactic Ở Ấn Độ, người ta sử dụng hạt ngũ cốc lên men lacuc làm nguồn thức ăn chính trong ngày Longanisa( Philippines),

Muson (Thái Lan ) và tơm chua ( Việt Nam ) là những sản phẩm được lên men từ thịt, Kim chi, mĩn ăn truyền thống của người Hàn Quốc, Takuan Zuke (Nhật ) dưa, cà, hành muối, mĩn ăn qucn thuộc của người Việt Nam đều là những sản phẩm muối chua từ các loại rau, củ, quả

Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng, lên mcn lactic ngồi tác dụng bảo quản thực phẩm cịn làm tăng giá trị dinh dưỡng, cắm quan của sản phẩm, nâng cao sức

khỏe cho người dùng Khơng phải ngẫu nhiên mà Metchnikoff nhà bác học vĩ đại

người Nga đã cho rằng sữa chua cĩ tác dụng trị bệnh đường ruột và kéo dài tuổi tho

Việt Nam là một nước nơng nghiệp nhiệt đới nên nguồn nơng sản rất giàu

vẻ chủng loại và dồi đào về số lượng, là tiền để thuận lợi cho sự phát triển của

cơng nghệ chế biến thực phẩm Thực tế, nhiều sản phẩm lên men cịn sản xuất ở qui mơ nhỏ, thủ cơng nên chưa đáp ứng được nhu cầu ngày càng cao của người dùng về chất lượng và vệ sinh an tồn thực phẩm

Để gĩp phần cải tiến qui trình cơng nghệ nhằm nâng cao giá trị tồn diện

của sản phẩm, việc tuyển chọn và nghiên cứu các chủng mcn giống là việc làm hết sức cần thiết trong giai đoạn hiện nay Bởi lẽ hiệu suất của một qui trình cơng

nghệ nếu khơng kể đến trang thiết bị lên men thi giống vi sinh vật đĩng một vai trị quyết định, Việc xác định chủng giống phù hợp với qui trình lên men sẽ thúc đẩy hiệu quả lên men cao, chất lượng sản phẩm tốt, rút ngắn thời gian và cải

thiên chất lượng sản phẩm ban đầu Vì lẻ đĩ chúng tơi thực hiện đẻ tài : *Nghiên

cứu một số đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn lactc phân lập từ thực

phẩm lên men” Hy vọng kết quả thu được sẽ gĩp phần nhỏ bé của mình vào mục

Trang 4

+

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRẬN THỊ HONG VAN

PHAN II: TONG QUAN TAI LIEU

1 Sơ lược về vi khuẩn lactic :

Vị khuẩn lactc thuộc họ Lactobateriaccae Gồm các đạng vi

khuẩn hình cầu và hình que Tuy hình thái khác nhau nhưng chúng cùng

thống nhất về các đặc điểm sinh lý sinh hố

Vị khuẩn lactic khơng chuyển động, khơng hình thành bào tử, tuyệt đại đa số là gram dương Trong tế bào khơng chứa xitocrom và catalaza, tuy nhiên chúng cĩ thể sinh trưởng được khi cĩ mặt oxy khơng khí

nhờ cĩ peroxydaza giúp phân giải H:O› thành Hạ và O: do đĩ người ta gọi nhĩm vi sinh vật này là những vi sinh vật ky khí khơng bắt buộc

Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactc rất phức tạp Khơng một lồi

nào cĩ khả năng phát triển được trên mơi trường thuần khiết chứa khống,

glucose, NHy Da s6 chiing can hang loat vitamin: lactoflavin, thiamin, acid

pantothenic, acid niconitic, acid folic, biotin va cdc acid amin khac, Vi vay chúng thường được nuơi cấy trên mơi trường đinh dưỡng phức tạp chứa một lượng tương đối lớn nấm men, nước chiết cà chua, thậm chí máu Một số chủng vi khuẩn lactic khi sinh trưởng trên mơi trường chứa máu cĩ thể tạo thành các cytochrom, thậm chí tiến hành cả quá trình photphorin hĩa chuỗf

hơ hấp ,

Sự sinh trưởng phát triển của vi khuẩn lactic phụ thuộc vào nhiều yếu

s® Nhiệt độ : ảnh hưởng rất lớn đến sinh lý tế bào, nĩi chung vi

khuẩn lactc cĩ biên độ nhiệt từ 10 — 30C được phân thành hai

nhĩm là nhĩm ưa ẩm và ta nhiệt ,

s pH: tùy từng lồi vi khuẩn lactic ma pH cé thé dao động trong khoảng 4,5 —6,8

® Chất ức chế : chất kháng sinh và nồng độ muối cao ức chế sự sinh

trưởng của nhĩm vi khuẩn lactc Nồng độ muối cao nhất cho sự sinh trưởng là 6,5%

Trang 5

LUAN VAN TOT NGHIEP TRAN TH] HONG VAN s® Oxy: vi khuẩn lacuc thuộc lồi ky khí khơng bắt buộc nên cĩ mặt

của oxy khơng gây độc cho tế hào, tuy nhiên càng thiếu oxy thì sự

sinh trưởng sẽ thuận lợi

II Đặc diểm của quá trình lên men lactic ;

Lên men lactic là một trong những quá trình sinh hĩa đơn giản, trong đĩ diễn ra sự chuyển hĩa kị khí đường thành acid lacuc dưới tác động của

mot cnzim, enzim nay chỉ cĩ trong tế bào vi khuẩn lacUc ,

Tuỳ thuộc vào sản phẩm cuối cùng được hình thành, người ta chia quá

trình lên men lactic gồm hai kiểu

LH 1 Lên men lactic đơng hình :

Quá trình lên men tạo sản phẩm chính là acid lactc chiếm 90 -

YRS,

Sơ đồ tổng quát của quá trình lên men đồng hình :

CuH¡:O, — 2CH;CHOHCOOH + 75,6 K1

Quá trình được thực hiện bởi nhĩm vì khuẩn lên men lauc đồng hình

thuộc giống Sưecptococcus và Lactobactcrium, Các đại diện thường gap la ‘Streptococcus lactic, Streptococcus cremoris, Streptococcus thermophilus, Lactobacterium bulgaricum,Lactobacterium platarum, Lactobacterium acidophilum, Lactobacterium cascin,,

_ Céc vi khuẩn lactc đồng hình tiến hành phân giải glucose theo con

đường EMP, tạo sản phẩm chính là acid lactic trải qua hàng loạt giai đoạn trung gian với sự tham gia của cnzim tương ứng Trong tế bào của nhĩm vi

khuẩn này chứa các mcn cẩn thiết cho sự phân giải kể cả adolaza Con

đường Fructozo l6 diphotphat được diễn ra tới puruvaL Nhờ lactathydrogena⁄a mà pyruvat được khử thành acid lactc Khi do NAOH; vinh ra trong quá trình đường phân do sự tách hydro của glyrerinaldehyt_3

photphat được chuyển trở lại thành NAD, Lactatdchydrogenaza xúc tác cho

Trang 6

LUAN VAN TOT NGHIEP TRAN TH] HONG VAN

qua các phản ứng mở đầu con đường pcntozophotphat oxy hĩa Tiếp sau đĩ là phản ứng của photphoketolaza đặc trưng cho vi khuẩn lactic dị hình, phân giải pentoza thành glyccrinalđchyt 3 photphat và acetyl_ photphat Sự oxy hố trioza tới axit lactic xảy ra như ở lên men lactic đồng hình qua các phản ứng đường phân Sự phân hủy pentoza từ acetylphotphat sẽ tạo thành acid accUc Glucoza Ribulozo — 5 - photphat Xilutozo — 5 - photphat (cy, glycerinadehyt ~ 3 ~ photphat Acetylphotphat nữ AcetyLCoA Ì Lactat =“ Etanol

So dé lén men lactic dj hinh LH Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men :

HHI.1;Thơng khí :

Trong quá trình nuơi cấy các chủng vi sinh vật hiếu khí người ta tiến

hành cung cấp một lượng lớn các khí vơ trùng Lên men cơng nghiệp

thường thường sử dụng thiết bị lên men cĩ hệ thống khuấy đảo và sục khí Cịn trong điểu kiện phịng thí nghiệm, tiến hành nuơi cấy lắc để cung cấp oxy đầy đủ tùỳ theo nhu cầu của từng chúng

Vị khuẩn lactic là lồi kị khí khơng bắt buộc do đĩ việc cung cấp oxy cho quá trình lên men là khơng cần thiết

HH2 Nhiệt độ :

Trang 7

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRAN TH] HONG VAN

đồng hĩa các chất đỉnh dưỡng của chủng nuơi cấy Sự gia tăng nhiệt độ xảy

ra trước khi quá trình lên men đạt đến pha phát triển ổn định và sau đĩ sẽ

uiảm xuống Do đĩ phải thường xuyên theo dõi và điều chỉnh nhiệt đơ phù hợp với quá trình lên men, Thơng thường để điều hịa nhiệt người ta trang

hị hệ thống làm nĩng và làm nguội ở thiết bị lên men

il :

Mỗi lồi vi sinh vật thích hợp với một giá trị pH nhất định của mơi trường nuơi cấy Nhưng trong quá trình lên men chúng tạo ra các sản phẩm

trao đổi chất cĩ tính acid hay kiểm khiến cho pH của mơi trường khơng cịn

thích hgp cho hoạt động của nhĩm vi sinh vật này nữa Do đĩ việc chủ động

điều chỉnh pH của mơi trường là điều rất cần thiết khi thực hiên quá trình lên men,

LII.4.Ảnh hưởng của các chất ức chế :

Hiệu suất của quá trình lên men trước tiên phụ thuộc vào năng suất hoạt động của vi sinh vật, Trong quá tình lên men việc cung cấp các chất

dinh dưỡng là điều cần thiết, tuy nhiên nếu lượng này lớn hơn so với nhu cầu cĩ thể làm ức chế sự hoạt động của nhĩm vi sinh vật ức chế sự lên

men

IV.Thành phần và đặc điểm của nhĩm vi khuẩn lactic thường gặp trong lên men thực phẩm :

Cĩ nhiều lồi vi khuẩn lactc tham gia vào quá trình lên men thực

phẩm nhưng chủ yếu chúng thuộc các chi Streptococcus, Lactobacillus,

Peptidococcus

® Streptococcus :

Tế bào hình cầu hoặc hình trứng, ít khi kéo dài thành hình que, thường xếp thành chuỗi ngắn hoặc chuỗi dài Ở một số lồi, cĩ thể thấy được vỗ nhầy trong điều kiện đặc biệt nào đĩ, Khơng di động ngoại trừ một vài chủng thuộc nhĩm Entercoccus Hydratcacbon và rượu đa chức cần thiết

cho sự phát triển của nhĩm này trong mơi trường nhân tạo Các chủng tạo

khuẩn lạc cĩ bể mặt nhăn và nhỏ thường cĩ khuynh hướng lắng nhanh

xuống đáy mơi trường Ngược lại chủng cĩ bể mặt khuẩn lạc phẳng khi phát

triển thường làm đục mơi trường đồng đều, chỉ một ít lắng xuống đáy Bê

Trang 8

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRAN THỊ HONG VAN Catalaza âm tính, phát triển được trong mơi trường cĩ oxygen Nhu cầu

dinh dưỡng rất phức tạp địi hỏi phải cĩ nhiều vitamin va acid amin

® Chi Lactobacillus :

Tế bào hình quc thẳng hoặc cong, thường ở dạng đơn lẽ hoặc tạo thành chuỗi Chúng khơng di động Gram dương Lên men hydratcacbon

tạo sản phẩm cuối cùng là acid lacúc hoặc một số sản phẩm phụ như acid

lormic, acid acctic, CO: Vi hiếu khí đến ky khí khơng bắt buộc ® Chi Peptidococcus :

Tế bào hình cầu thường ở dạng đơn, đơi, tcưa đơi khi xếp thành chuỗi ngắn, cĩ thể xếp thành chụm 8 tế bào nhưng hiếm thấy Vi hiếu khí, phát triển kém trên bể mặt mơi trường, Lên men hydratcacbon tạo sản

phẩm cuối cùng là acid lactic,

LV.I Các vi khuẩn lên men sữa:

Streptococcus lactic :

Tế bào hình bầu duc, kich thuée (1 -1,5)x( 0,5 -l ) micromet tổn

tại thành từng đơi hay chuỗi ngắn Cĩ khả năng lên men sữa Nhiệt độ thích

hựp cho sự phát triển 1a 30 - 35°C, Lam đơng tụ sữa sau 12 giờ Độ acid dao dong ty 110 - 120°T, Lén men glucose, mantose, raffinose, lactose,

palactose, dextrin

Streptococcus cremoris :

Tế bào hình cầu hoặc hình trứng gần giống như S lactc nhưng kích thước nhỏ hơn, kích thước trung bình 0,6 - 0,7 micromet, Thường tìm thấy trong sữa dưới dạng chuỗi dài hoặc gần đơi Gram dương Khơng di động

Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là 20 - 25°C, Lam d6ng tu sifa sau 12 uiờ, Làm cho sữa cĩ độ chưa thấp hơn 110 ~115°T Khơng phát triển ở mơi trường chứa NaC| 4% Lên mcn các loại đường glucosc, manlose, lactosc, galactose

Streptococcus thermophilus :

Tế bao hình cầu hoặc hình trứng Tổn tại thành từng đơi hay chuỗi

dài, Gram dương, nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là 40 - 45C, phát

triển được ở 50”C nhưng khơng phát triển ở 53°C và dưới 20C Khơng phát

Trang 9

lên men tcưalose, mantose, inulin, glycerin, manitol, sorbitol Nhan biét

lồi này dựa vào đặc tính phát triển ở nhiệt độ cao và nhạy cảm với NaC|, bacill Wdophicus:

Tế bào hình que, kích thước (0,6 - 09) x (l5 - 6 ) micromet, Chúng thường đứng riêng rẽ, kết đơi hay tạo thành chuỗi ngắn Khi cịn non gram dương về già chuyển gram âm, cĩ thể di động được Phát triển tốt ở nhiệt độ 37 - 40°C Tích tụ 2 % acid lactic trong mơi trường Lên men vác loai duGng glucose, mantosc, saccharose ,lactosc

[ beciifus I ous:

Tế hào hình que dài, thường xếp thành chuỗi gram dương Nhiệt độ

thích hợp cho sự phát triển là 40 —- 48C Trong mơi trường lên men tạo 3,5% acid lacuc, độ acid tạo ra từ 300 -450°T Làm đơng tụ sữa từ 3 - 6 giờ, Lên mecn gÌucosc, galactosc ,lactosc, Thường khơng lên mcn sucrosc,

mantos, fructose khi mdi dude phan lap

Lactobacillus casein :

Tế bào hình quc kích thước khơng Ién (0,8 - 0,9 )x (2- 6 )

micromet, Nhiét d6 thích hợp cho sự phát triển là 30 — 35 °C Cĩ thể phát

triển ở 22 -55”C Chịu đựng được độ acid Lên men tốt các loại đường

gÌucose, lactosse, mantose, Cĩ thể phân hủy cazein đến acid amin,

IV.2 Các vị khuẩn trong lên men rau quả :

Tế bào hình que , kích thước (0,7 -1, 0) x (3,0 - 8,5 ) micromet Tén tại ở dạng đơn lẽ hay kết thành chuỗi ngắn, tế bào ở cuối chuỗi hơi trịn

Gram dương Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là 30”C khơng phát triển được ở nhiệt độ dưới 10C và trên 40°C Phát triển được ở mơi trường chứa NaC] 5,5% Lên men tích tụ lượng acid lactic trong mơi trường là | ,2% Lên men đồng hình các loại đường glucose, Íructose, mantose, galactose, lactose, mannose, Lén men duGng mantose tao acid lactic va acid acetic Lên men yếu các loại du@ng sorbitol, manitol,dextrin, glycerol xylose Khơng lên men tỉnh bét va inulin

Leuconostoc mensenteroides:

Tế bào hình cầu, đường kinh 0,9 - 1,2 micromet, Tổn tại thành đơi,

chuỗi ngắn hoặc chuỗi đài Gram dương Nhiệt độ thích hợp cho sự phát

Trang 10

manose, xylose, arabinose,sucrose ,lactose, raffinose, salicin , rhamnosc và glycerol Dac diém phân biệt của chủng này là sinh chất nhầy trong mơi

trường dịch thể sucrose Cĩ khả năng tạo chất thơm, chịu được nổng đơ

đường và muối cao

Lactobacillus brassicae fermentati:

Tế bào hình que, hai đầu trịn Tổn tại thành từng đơi, chuỗi ngắn hay chuỗi dài (thường gặp chúng ở dạng chuỗi) Lên men các loại đường tạo thành acid lactic, acid acetic, rudu êtylic và CO Lên mcn đường saccharosc mạnh hơn đường lactosc Acid lactic tích tụ trong mơi trường lên men tới 1,2%, Ngồi ra chúng cịn cĩ khả năng tạo chất thơm làm cho xăn phẩm cĩ mùi thơm để chịu

V Vai trị của vi khuẩn lactic:

V 1 Trong cơng nghiệp:

V.1.I Cơng nghiệp sản suất acid lactic:

Cơng nghiệp sản suất acid lacuúc đã được bắt đầu từ cuối thế kỷ 19, với vi khuẩn lacuc là đối tượng được sử dụng để lên men thu nhận acid

lactic Lồi Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus leichmani, Lactobacillus delbrucki ưu tiên được sử dụng Đĩ là những lồi vi khuẩn

Lactic đồng hình cĩ nhiệt độ tối ưu vào khoảng 45- 48°C, cĩ ưu thế trong

phịng ngừa lây nhiễm trong lên men,

Nguyên liệu dùng trong sản suất acid lactic là đường, rỉ đường củ cải, dịch thủy phân bột, dịch thủy phân inulin Cũng cĩ thể sử dụng những

nguyên liệu thơ chứa tính bột nhưng phải qua giai đoạn xử lý bằng cnzim thủy phân tinh hội

Quá trình lên men thưởng được thực hiện ở các điều kiện:

s_Nồng độ đường trong mơi trường: 10-15%: " Lượng CaCO; được sử dụng: 10%

* Mam đại mạch :0,375%

* Photphat amon: (),25%

Acid lactic dude sit dung nhiều trong cơng nghiệp thuộc da, cơng nghiệp đệt và cơng nghiệp đồ nhựa Nhu cẩu về acid lacúc trên phạm vi

Trang 11

LUAN VAN TOT NGHIEP TRAN TH] HONG VAN V.1.2 Cơng nghiệp chế biến và bảo quản thực phẩm:

® Ché bién va bao quản rau quả:

Người ta phối hợp cả qúa trình lên men lactic đồng hình và dị hình vào trong qúa trình chế biến và bảo quản rau quả Trong mơi trường cĩ nồng độ mối, đường thích hợp vi khuẩn lacuc phát triển mạnh sinh ra một lượng lớn acid lactc, làm pH mơi trường ngã về acid ức chế các vi khuẩn

uây thối rau quả Sản phẩm tạo thành sẽ cĩ vị mặn, chua, thơm, kích thích

ăn ngon miệng, dễ tiêu hĩa đồng thời bảo quản được lên men rau quả trong tự nhiên

Trong sản suất cơng nghiệp người ta sử dụng chủng giống thuần khiết Nhân giống trong mơi trường nước ép rau cải sau đĩ cho lên men, cho hiệu quả lên men cao, chất lượng sản phẩm tốt, nâng cao năng suất qui mơ cơng nghiệp

" Lên mcn lactic trong ngành sữa:

Vị khuẩn lactc là nhĩm vi sinh vật quan trọng nhất đối với sữa

Chúng cĩ tác dụng lớn trong việc bảo quản cũng như chế biến các sản phẩm từ sữa (sữa chua, phomat)

Sữa chua là sản phẩm của sự lên men sữa lỏng dưới tác động của nhiều vi khuẩn lactic khác nhau Trong quá trình lên men, gÌucosc trong mơi trường được chuyển hĩa thành acid lactic Lượng acid được tạo ra cao

nên protein sữa tiếp tục được phân giải tạo pepton, acid amin Một số sản phẩm phụ như diacetin, các acid bay hơi khác hoặc este được hình thành Nâng cao giá trị dinh dưỡng của sữa, tạo hương vị thơm ngon kích thích tiêu

hĩa đồng thời bảo quản sữa khỏi bị hư hỏng

Phomat là sản phẩm thu được từ sữa đơng bằng cách loại bỏ dịch đường sữa và làm chín cục vĩn khi cĩ mặt hệ vi sinh vật đặc biệt là vị

khuẩn lactic tham gia đắc lực vào quá trình lên men tạo sản phẩm này

Người ta chế biến và bảo quản các sản phẩm từ sữa bằng phương

pháp tự nhiên hoặc phương pháp cấy giống thuần khiết Sữa đựoc lên men tự nhiên nhờ vào hệ vi sinh vật cĩ sẵn trong tự nhiên (từ khơng khí, từ tay người, từ dụng cụ vắt sữa ) Vị khuẩn sẽ nhanh chĩng phát triển, Đầu tiên

vi khuẩn gây thối phân giải một ít protcin tạo điểu kiện cho nhĩm vi khuẩn lactc phát triển, Khi phát triển, chúng tích lũy dẫn acid lactc ngăn cắn sự

phát triển của nhĩm vị khuẩn cĩ hại và ngăn cắn cả sự phát triển của chúng khi lượng acid lactic được tạo ra khá nhiều

Trang 12

Trong điều kiện sản suất lớn: các giống vi khuẩn thuần khiết cĩ khả

năng lên mcn lacuc mạnh được cấy vào sau khi đã khử trùng mơi trường

Để tạo hương vị thơm ngon cho sữa người ta cấy những vi khuẩn cĩ khả năng tổng hợp diacetin vào

Ngồi việc ứng dụng vi khuẩn lactc trong việc chế biến bảo quản

rau quả và sữa chúng cịn được sử dụng phổ biến cho việc lên men sản suất nem chua, tơm chua chế biến các loại thủy hải sản Một số chủng được

ứng dụng lên men sản suất nước uống, V.2 Trong nơng nghiệp:

Cơ cấu lý hố của đất ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến năng

suất và chất lượng mùa màng Hệ thống đất hữu hiệu nhất đĩ là kết qủa của việc tăng cường thành phần vi sinh vật lên men và vi sinh vật tổng hợp ở

trong đất Nhĩm vi khuẩn lactic trong hệ vi sinh vật lên men đã gĩp phan

vào việc duy trì, cải tạo chất lượng và khả năng sản xuất của đất

Trong đất vi khuẩn lactic sử dụng đường và các nguồn hyđratcacbon

được tạo ra bởi các nhĩm vi sinh vật khác để tiến hành lên men tạo acid

lactic, Lượng acic sinh ra tạo pH thích hợp cho sự hoạt động của nhĩm sinh vật cĩ lợi trong đất đặc biệt là hệ vi sinh vật lên men đường Tăng cường

nhanh sự phân giải các chất hữu cơ Tham gia vào quá trình chuyển hố các chất khĩ phân giải như polisaccharit (nh bột), hemicellulose (xylan),

Vị khuẩn lactic gĩp phần vào việc tiêu diệt các sinh vật gây hại cho

cây trồng Chúng cĩ thể ức chế sự phát triển của nấm Fusaricum_ một loại

nam gay bénh quan trọng trong nơng nghiệp Tham gia vào việc cải thiện mơi trường đất bằng cách lên men tạo ra mùi thơm dễ chịu cho đất

Vị khuẩn lacc được ứng dụng rộng rãi trong việc ủ chua thức ăn dùng trong chăn nuơi gia súc Nhờ ủ chua mà thức ăn cĩ thể giữ được khá

lâu ở trạng thái tươi, khơng những sản phẩm khơng bị hao hụt mà cịn được lang cường hàm lượng dinh dưỡng Bởi lẽ trong quá trình lên men ngồi

lượng acid lacuc được tạo thàng chúng cịn tạo ra một số sản phẩm khác cĩ uiá trị như vitamin, chất thơm, chất kháng sinh (nizin, dilocaxen ) TY đĩ uĩp phần nâng cao hiệu quả trong chăn nuơi

V.3 Trọng y học:

Acid lactic san phẩm của quá trình lên men lactc được sử dụng rộng

Trang 13

Trong thực phẩm, một số chủng được sử dụng ở dạng sống trong

thuốc giúp cho sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột như L.acidophillus

trong * men tiêu hĩa sống” Chúng cĩ thể tiết ra một số chất kháng ngăn cản sự phát triển của nhĩm vi khuẩn gây bệnh đường ruột chẳng hạn Ecoli,

Samonella, Clostridium như tiết ra chất kháng với enterotoxin_ độc tố gây bệnh của những vi khuẩn trên,

Vị khuẩn lacuc chúng cịn tham gia vào hệ thống miễn dịch của cơ thể

hằng cách:

“_ Kích thích sản suất inteferon * Hoat hoa lympho bao B

* Lam thay đổi B-gluconidase Azreductase la các enzim xúc tác qúa trình chuyển hố procarcinogen thành carcinogen vì thế làm chậm và ngăn chặn sự tạo bướu carcinoma ở ruột già

VI Một số phương pháp bảo quan vi khudn lactic:

Cĩ nhiều phương pháp bảo quản giống Tùy vào điều kiện cụ thể mà người ta tiến hành những phương pháp khác nhau

VI.1 Phương pháp cất n trén m

Đây là phương pháp thường được dùng nhất trong phịng thí nghiệm Giống được nuơi cấy trong tủ ấm, chọn những ống giống mọc tốt tiến hành kiểm tra các đặc tính của chúng Sau đĩ bảo quản giống ở nhiệt độ 3-5”C

hoặc thấp hơn Cấy truyền sau | đến 2 tháng

VI.2 Phương pháp bảo quản giống trên mơi trưởng thạch cĩ lớp

dầu khống:

Phương pháp này phổ biến và tiện lợi nhắm khắc phục tình trạng khơ

khống của mơi trường, làm ngăn cách mặt thạch với lớp khơng khí bằng dầu khống( parafin, vazơlin )

Chủng được bảo quản được nuơi cấy cho phát triển tốt trên mơi

trường thạch cĩ chất dinh dưỡng thích hợp Đổ một lớp mỏng parafin đã tiệt trùng và làm nguội lên mặi thạch (dày 1-2 cm) Gắn kín nút bơng bằng

parafin, Giữ giống ở nhiệt độ phịng hoặc 4-7C

Kawono đã thử bảo quản vì khuẩn lacuc trên mơi trường thạch nghiêng trong parafin lỏng Ơng đã thành cơng trong việv giữ 53 trong 62 chủng trong 2 năm, 35 trong 47 chủng trong 4 năm

Trang 14

LUAN VAN TOT NGHIEP TRAN THỊ HỒNG VAN VI.3.Phuwong pháp bảo quản gỉ Ì

Hạt ngũ cốc ( lúa, bobo) được rửa sạch, nấu cho hạt vừa nứt và để ráo nước, Cho chúng vào ống nghiệm phủ bằng một lớp bơng thấm nước, Cấy chủng vi sinh vật lên lớp bơng cho mọc thật dày Giữ mẫu ở nhiệt độ l5-

3ứC,

Hunt và các cộng sự đã thử bảo quậ vi khuẩn L acidophillus trên

hạt gốm các nhà nghiên cứu đã bảo quản giống được trong 10 thang

VỊ 4 PlH(dig pháp lạnh đơng:

Vị sinh vật cần bảo quản được trộn với chất nhũ hố Chất nhũ hố cĩ thể là glyccrin, huyết thanh ngựa hình thường khơng cĩ chất bảo quản,

dung dịch saccharose 10% Cho 1-2% nhũ dịch giống vào mỗi ống Đặt các ống giống vào làm lạnh từ từ đến -2U0”C hoặc thấp hơn nhưng giữ tốc độ

làm lạnh khơng lớn hơn 1-2 phút Cần qui định thời gian cấy truyền

Bằng phương pháp lạnh đơng ở -20°C cĩ thể giữ giống L

acidophillus ít nhất một năm vẫn cịn khả năng sống là 71,86%, vẫn cịn khả năng tăng trưởng tốt trên mơi trường MRS và làm đơng tụ sữa sau 12

wid,

VI áp đơng khơ:

Bảo quản vi khuẩn lacuc tốt nhất là ở nhiệt độ đơng khơ (-80C

hoặc

-120C), tuy nhiên chế độ bảo quản này khĩ được áp dụng rộng rãi bởi

điều kiện trang thiết bị kỹ thuật Thời gian bảo quản đến hàng chục năm Người ta tiến hành nuơi cấy chủng bảo quản đến pha logariL sau đĩ trộn với chất hảo vệ Cấp các dịch huyển phù chứa vi sinh vật vào các ống đơng khơ Đặt các ống giống vào làm lạnh đơng trong chậu tuyết cabonic +

cồn ctylic trong 1-15 phút Đưa các ống giống này vào thiết bị đơng khơ Anthenisse đã dùng phương pháp này để giữ Lactobacillus , cơng hố

uiữ được trong 6 năm Bằng phương pháp này người ta cũng giữ được một xố chủng trong thời gian dài với tỷ lệ sống sĩt là 92% ( Sưcptococcus)

Trang 15

TRAN TH] HONG VAN PHAN III :VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU L Vật liệu: I 1:Nguồn phân lập:

* Yaourt hang Vinamilk va lorcmost “ Nước dưa cải và dưa giá muối chua

Trang 16

1.2.2.Mơi trường định danlt vi khudn lactic: Mơi trường thử khả năng lên men đường:

Mơi trường MRS nhưng thay thế gÌucose bằng các loại đường

khác:Fructose, Lactose ,Galactose,Shacharosc ,Sorbitol,Manitol.Maltosc

Mơi trường khảo sát khả năng sống trong điều kiện nồng độ muối cao, thành phần: Cao thịt 3u Pepton 1Og Glucose 2g K›HPO, lg MgSO, 7H,0 (),%g (NH.,):›SO; Oly FeSO ,), 0,022 Nước cất 000ml Agar 20g

Bổ sung NaCl tạo nỗng độ muối khảo sát là 2%, 4%, 6,5%:

e Mơi trường nhân giống vi khuẩn lactic:

Mơi trường MRS dịch thể : mơi trường MRS nhưng khơng cĩ agar L3 Hĩa chất và dụng cụ: L.3.1 Thuốc thử uphennnent thành phần: Phcnol 5% I0ml FeCl, 5% 2ml Nước cất 25ml

Trang 17

TRAN TH] HONG VAN

«Cách pha:

Dùng đũa thủy tỉnh khuấy tan hết getUan violet trong rượu Tron dung dich (1) va(2) rdi loc trong % Fuchsin kiểm: ® Cơng thức: Fuchsinkiém 03g Rượu ctylic 96” 10 a Phenol ( axitphenit) Sg te Nước cất 95 ml “ Cách pha : trộn dung dịch ( L) và (2) rồi pha lỗng 5 lần % Dung dịch Lugol: Cơng thức : lơtinhthể lg KI 2g Nước cất 300 ml » Cách pha:

Hĩa KI trong 5 ml nước cất cho tan hết rồi cho lốt tỉnh thể

Bổ sung cho đủ 300 ml nước sau khi lốt tan hết

® Cơn 95”

I.3 Các hĩa chất và các dụng cụ thí nghiêm khác: NaOH IN

CH,COOH IN

il Nội dung và phương pháp nghiên cứu:

11.1 Phan lép va chon giống:

LL.I.I.Phân lập:

Mẫu phân lập là cơ chất dạng đặc ,rắn (nem chua):

Thực hiện cân một gram mau nghiễn nhỏ bằng cối sứ vơ trùng rồi

chuyển tồn bộ mẫu vào ơng nghiệm chứa 9 mÌ nươc cất vơ trùng Lắc thật

ky để mẫu được tan đều và ta cĩ độ pha lỗng của dịch huyền phù là I0”

Trang 18

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Dùng pipet vơ trùng hút 1 ml dịch huyền phù này hịa vào ơng nghiệm chứa

9ml nước cất vơ trùng tiếp theo ta cĩ nỗng độ pha lỗng của dịch huyền phù

là 10”, Tiếp tục pha lỗng như vậy cho đến khi đạt được độ pha lỗng cần

thiết và thích hợp để sau khi cấy khuẩn lạc mọc lên khơng quá mau,

Mẫu phân lập là cơ chất dạng lịng hay dạng sệt (tơm chua, yaourt, nược đưa chua, nước trái cây lên men):

Dùng ống hút vơ trùng hút l ml dịch mẫu chuyển sang ống nghiệm

chứa 9 ml nước cất vơ trùng ta cĩ độ pha lỗng 10” Lắc thật kỹ để mẫu tan đều rồi tiếp tục pha lỗng mẫu tương tự như trên cho đến khi đạt được độ

pha lodng edn thiét (10°, 10°, 107 )

11.1.2 Gieo cay trén thach dia:

Chuẩn bị các đĩa pctri chứa sẵn mơi trường phân lập đã vơ trùng

[Dùng pipét vơ trùng lấy 0,1 ml mẫu ở độ pha lỗng thích hợp nhỏ vào hể mặt đĩa,

Ding gue gạt vơ trùng dàn đểu lượng mẫu lên khắp bé mặt mơi trường Mỗi mẫu cấy ba đĩa Cấy xong bao gĩi các đĩa peưri lại, để tủ ấm 30"C trong 2-3 ngày Sau đĩ quan sát trên mơi trường và phân biệt các

khuẩn lạc khác nhau về màu sắc, hình dạng, kích thước, tính chất bể mặt Chọn các khuẩn lạc riêng rẽ cấy sang mơi trường cacbonat_agar

11.1.3 lũng căn cứ vào khả sinh aci e Nguyên tắc

Dựa vào khả năng làm tan CaCO; của acid, người ta xác định khả năng sinh acid của các chủng mới phân lập bằng sự xuất hiện các vịng

phân giải (trong suốt) xung quanh khuẩn lạc khi cấy chúng trên mơi trường cacbonal_agar

* Phuong phap:

Chuẩn bị dia petri cĩ mơi trường cacbonat_agar đã vơ trùng Chọn các khuẩn lạc khác biệt và tách rời nhau nĩi trên để cấy sang mơi trường đã chuẩn bị Nuơi trong tủ ấm ở nhiệt độ 30°C trong 4 ngày Sau đĩ lấy ra

quan sát sự xuất hiện của các vịng phân giải trong suốt xung quanh khuẩn lạc của một số chủng Kích thước vịng phân giải càng lớn chứng tỏ khả

năng sinh acid của các chủng càng nhiều Dùng thước đo đường kính vịng phân giải của các chủng làm căn cứ để sơ tuyển

Trang 19

I 1.4 Thudn khiét giống :

Từ các khuẩn lạc cĩ vịng phân giải CaCO: vừa chọn , dùng quc cấy

trích ly các khuẩn lạc này vào ống nghiệm chứa 3-5 ml nước cất vơ trùng

I ắc thật kỹ để tế bào được tách ra riêng rẺ

Hút 0,1 mÌ dung dịch này nhỏ vào đĩa petri chứa mơi trường MRS đặc ‘Ding que gat vơ trùng dàn đều lượng dịch khắp mặt thạch từ đĩa thứ nhất

sang đĩa thứ ba mà khơng bổ sung thêm dịch giống Nuơi trong tủ ấm ở

nhiệt độ 30”C trong 3 ngày

Chọn các khuẩn lạc được hình thành từ một tế bào riêng rẽ và đồng nhất cấy chuyển sang thạch nghiêng

Tiếp tục kiểm tra sự thuần khiết của khuẩn lạc bằng cách làm tiêu

bản giọt ép ,nhuộm đơn, nhuộm gram để xác định hình dạng, cách sắp xếp

tế hào và sự bắt màu gram

II.1.5, Thử khả năng sinh acid lactic ciia céc ching: 'Vuuyên tắc:

Phcnol cĩ trong thốc thử uphenment khi phản ứng vdi acid lactic sé

làm thuốc thử đổi màu từ xanh dương đậm sang màu vàng Sự đổi màu vàng càng đậm chứng tỏ lượng acid lactic sinh ra càng nhiều

Phương pháp:

_ Các chủng vi khuẩn đã được thuần khiết, dùng que cấy trích ly các chủng này vào ống nghiệm chứa 10 ml mơi trường MRS dịch thể, nuơi cấy

tĩnh ở nhiệt độ 30C trong 3 ngày Sau đĩ đem ly tâm để tách tế bào vi

khuẩn, thu dịch trong rồi thử với thuốc thử uphenmecnt

Chuyển 3 ml dịch trong vào ống nghiệm đã chứa 2 mÌ thuốc thử uphcnment Tiến hành đồng thời hai ống đối chứng :

Đối chứng dương: 3ml acid lactic nguyên chất + 2 ml thuốc thử

Đối chứng âm :3ml mơi trường MRS dịch thể khơng cấy vi khuẩn +2

ml thuốc thử,

Vêu cầu:

Quan sát sự đổi màu của thuốc thử và mức độ đổi màu đối với từng

chủng để chọn ra các chủng vi khuẩn cĩ khả năng lên men lacuc tốt nhất

Trang 20

LUAN VAN TOT NGHIEP TRAN TH] HONG VAN 11.2; Mơ tả các đặc điểm hinh thái của vì khuẩn Lactic :

II.2.1: Đặc điểm lình thái khuẩn lạc trên mơi trường MRS_ agar : Nguyên tắc :

Vị sinh vật khi phát triển trên bể mặt các mơi trường đặc khác nhau

sẽ hình thành các dạng khuẩn lạc đặc trưng cho lồi đĩ Phượng pháp:

Chuẩn bị các đĩa petri chứa mơi trường MRS — agar vơ trùng, Dùng que cấy đầu nhọn, thực hiện cấy ria chủng vị khuẩn phân lập được trên hể mặt mơi trường sao cho tạo được những khuẩn lạc tách rời nhau Nuơi ở

nhiệt độ 30°C trong 3 ngày

Yêu cầu :

Quan sát và mơ tả các đặc điểm của khuẩn lạc :

Hình dạng chung của khuẩn lạc : lớn ( kích thước ), nhỏ(kích thước),

nhỏ li ti , đồng đều

Màu sắc khuẩn lạc

LIL2.2Đặc điểm hình thái tế bào trên mơi trường MRS dịch thể :

Trang 21

LUAN VAN TOT NGHIEP TRAN TH] HONG VAN Tiêu bản giọt treo :

Phương phúp -

“ Dùng mội lamen sạch và một phiến kính đặc biệt cĩ phần lõm hình

trịn ở giữa

“- Bơi vazơlin quanh phần lưm của phiến kính

* Ding que cấy lấy một giọt dịch vị khuẩn đặt vào giữa lamen

* Than trọng úp ngược lamecn lên phần lõm của phiến kính, sao cho giọt dịch vị khuẩn được treo lơ lửng trong phần lõm của phiến kính * Pat tiéu ban lên quan sát dưới kính hiển vi

Yêu cầu:

s- Quan sát hình thái vi khuẩn

“ Xác định sự chuyển động của vi khuẩn (cĩ hay khơng chuyển động)

-_ Nhuộm đơn:

Phương pháp:

Tiến hành làm và cố định vết bơi các chủng vi khuẩn rồi tiến hành

nhuơm thco trình tự sau:

* Bat tiéu ban lén cầu thủy tỉnh

»- Nhỏ vào vết bơi vài giọt Fuchsin, để yên từ 1-2 phút

® Ding hình xịt cho dịng nước chảy nhẹ qua vết bơi đến khi nước chảy ra khơng cịn màu , "_ Lau tiêu bản phía dưới bằng giấy thấm, soi dưới kính hiển vi Yêu cầu : Quan sát hình dạng và cách sắp xếp tế bào vị khuẩn Nhuộm Gram : Nguyên tắc :

Dựa trên klhả năng bat màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tỉnh hình thành nên hai loại phức chất khác nhau:

Trang 22

LUAN VAN TOT NGHIEP TRAN TH] HONG VAN “ Loại phức chất thứ nhất :vẫn giữ nguyên màu sắc của thuốc nhuộm

nên khơng bị rửa trơi khi xử lý bằng cồn Vi sinh vật cĩ phức chất này thuộc loại gram dương

" Loại phức chất thứ hai: khơng giữ được màu thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lý bằng cổn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung

Phương pháp:

Làm tiêu bản và cố định vết bơi, sau đĩ tiến hành nhuộm như sau :

Đặt miếng giấy lọc lên trên vết bơi Nhỏ thuốc nhuộm tím getian

lên trên trong | phút, Nhuộm lugol trong | phút

Nhỏ lên vết bơi rượu êtylic 95” trong 30 giây Rửa nước

Nhuộm bổ sung Fuchsin

Rửa nước, dùng giấy thấm lau khơ phía dưới lam kính, quan sát

dưới kính hiển vi

Yêu câu:Ghi nhận kha năng nhuộm màu của vi khuẩn

Kí hiệu Hình dạng tế ( Sự sắp xếptế | Khả năng | Sự bắt màu

ching bao bao di động Gram

11,3 Phương pháp nghiên cứu các đặc điểm sinh lý , sinh hĩa: 1.3.1, Quan h@ vi Oxygen : Nguyên tắc : Căn cứ vào khả năng sinh trưởng của vi sinh vật trong điều kiện mơi trường cĩ nồng độ xy khác nhau : Vị sinh vật hiếu khí bất buộc chỉ phát triển phía trên hoặc sát lớp bể mặt mơi trường

Vị sinh vật kị khí bất buộc chỉ phát triển ở đáy mơi trường Visinh vật hiếu khí chỉ phát triển ở lớp gần bể mặt mơi trường Vị sinh vật kị khí khơng bắt buộc sẽ phát triển dọc theo độ dày

mơi trường

Trang 23

Phượng pháp:

Chuẩn bị các ống nghiệm thạch đứng chứa 10 ml mơi trường MRS dịch thể Cấy từng chủng vi khuẩn vào ống nghiệm bằng que cấy đầu nhọn theo

kiểu trích sâu Nuơi ở nhiệt độ 30°C trong 3 ngày

Yê

Nhận xét sự sinh trưởng của từng chủng vi khuẩn trong mơi trường, Từ đĩ xác định quan hệ của từng chủng vi khuẩn đối với Oxygen,

11.3.2: im thi | ính :

Ngu yén tdc

Vị khuẩn lacuc là lồi vi hiếu khí hoặc kị khí nên hệ enzim khơng cĩ catalaza là cnzim oxy hĩa HạO: thành H:O và O: để giải độc cho tế bào Do đĩ khi thử bằng HạO: sẽ khơng cĩ khí bay ra Ngược lại đối với những

lồi vi khuẩn hiếu khí trong tế bào cĩ sự hiện diện của enzim catalaza do đĩ sẽ tạo ra khí Os khi thử bằng H:O:

Phương pháp :

Chuẩn bị dung dịch muối sinh lý 0,85% trong ống nghiệm Cấy từng

chủng vi khuẩn lactic vào và nuơi ở nhiệt độ 30°C trong 24 giờ Sau đĩ nhỏ một lượng như nhau H:©O: vào ống nghiệm và ghi nhận kết quả

LI.3.3, Quan hệ với nhiệt độ :

Nguyên tắc :

Mỗi nhĩm vi sinh vật cĩ một giới hạn nhiệt độ thích hợp cho sự sinh

trưởng phát triển Chúng phát triển tốt nhất ở nhiệt độ thích hợp và bị ức

chế khơng phát triển được ở nhiệt độ khơng thích hợp

Phương pháp :

Chuẩn bị các ống nghiệm chứa I0 ml mơi trường MRS dich thé Cay từng chủng vi khuẩn vào các ống nghiệm Nuơi ở các nhiệt độ : 20C, 25 °C, 30”, 35C, 40C, 45°, 50C trong 4 ngày,

a + Vêu củu :

Quan sát mức độ sinh trưởng dựa vào khả năng làm đục, thay đổi

màu mơi trường của từng chủng vì khuẩn ứng với mỗi nhiệt độ Dựa trên vác mức độ sau:

Trang 24

LUAN VAN TOT NGHIEP TRAN THI HONG VAN

- Khơng sinh trưởng ++ Sinh trương khá + Sinh trưởng yếu +++ Sinh trưởng tốt,

11.3.4: Quan hé véi pH:

Nguyên tắc :

Dựa vào khả năng sinh trưởng và phát triển tốt nhất của mỗi loại vi

xinh vật trong điều kiện mơi trường cĩ pH thích hợp

Phương pháp:

Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 10 ml mơi trường MRS dịch thể,

Điều chỉnh mơi trường bằng CH:COOH IN hoặc NaOH IN về các giá trị pH sau:4,0 ; 50 ; 60 ; 70 ; 80 ; 9,2 ; 9/6 ; 10 (chỉnh pH sau khi hấp khử trùng ) Cay từng chủng vi klhuẩn vào các ống nghiệm

chứa mơi trường ứng với từng giá trị pH Nuơi cấy nh ở nhiệt độ 30°C trong 4 ngày

Yêu câu :

_ Quan sắt sự sinh trưởng phát triển của từng chủng vi khuẩn ứng với

mỗi giá trị pH dựa vào mức độ đục của mơi trường H.Ậ.5: Khả năng lên men các loại đường :

Nguyén tắc :

Căn cứ vào khả năng lên men một số loại đường tạo thành acid

lactic của vi khuẩn lacuc Sự cĩ mặt của acid lactic sẽ làm thuốc thử phenol trong mơi trường từ màu đỏ chuyển thành màu vàng

Phương pháp:

Pha chế các mơi trường lên men chứa các nguồn hyđtưratcacbon khác

nhau:glucosc, saccharose, fructose, mantose, sorbitol, manitAol, ualactose Điều chỉnh mơi trường hơi ngả về kiểm dùng chất chỉ thị màu

đỏ phenol Cấy từng chủng vi khuẩn vào mơi trường với những nguồn hyđratcacbon khác nhau, Nuơi cấy tĩnh ở nhiệt độ 30C trong 4 ngày

Vêu cầu :

Quan sát khả năng sinh trưởng phát triển của từng chủng vì khuẩn

ứng với mỗi loại hyđratcacbon dựa trên sự thay đổi màu sắc của mơi

trường Nếu mơi trường chuyển sang màu vàng tức pH mơi trường là acid chứng tỏ cĩ sự lên men của vi khuẩn lacuc,

Trang 25

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRẤN THỊ HỒNG VÂN

11.3.6: Quan hệ với nơng độ muối:

Nguyên tắc:

Khả năng sống trong điều kiện mơi trường cĩ nỗng độ muối cao là những đặc trưng của vi khuaẩ lacuc, những đặc trưng đĩ cĩ ý nghĩa về mặt

nhân loại

Phương pháp -

Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 10 ml mơi trường khảo sát với néng đơ muối là 2%, 4%, 6,5% Cấy từng chủng vi khuẩn vào mơi trừong ứng

với mỗi nồng độ Nuơi cấy tĩnh ở nhiệt độ 30°C trong 4 ngày

Yêu cầu:

Quan sát khả năng sinh trưởng phát triển của từng chủng vi khuẩn dựa trên mức độ làm đục mơi trường

H.4 inl; hai sinh trite anh hué tia nhiét pH đến động thái sinh trưởng của các chủng

LI4.1 Xác định động thái tăng trưởng của các chủng :

Sau khi hoạt hĩa giống, tiến hành nuơi cấy vi khuẩn lacuc vào mơi trường MRS dịch thể

Điều kiên lên men :

"Nhiệt độ: 30°C

" pH 6,0

® Tilé gidng là 5% với số lượng tế bào trén | ml bang nhau

Xác định sự biến động số lượng tế bào tại các thời điểm: 0, 2, 4, 6, 8, ¡0,12 giờ nuơi cấy (triệu tế bào /1 mi ) Từ đĩ xây dựng đồ thị sinh trưởng của mỗi chủng,

Trang 26

“Bắt đầu đếm khi nhỏ giọt dịch từ 3-5 phút để các tế bào cĩ thời gian lắng xuống và nằm trên cùng một mặt phẳng

“= Đếm số tế bào ít nhất trong 5 ơ vuơng lớn

Chú ý:nồng độ dịch huyền phù pha lỗng sao cho mật độ trong mỗi ơ

nhỏ khơng quá 10 tế bào Cách tính :

“_ Tính số lượng trung hình tế bào trong một ơ lớn (a)

“ Mật độ tế bào : N/ml = 0,25 a x I0” tế bào / mi

II.4.2 Anh hưởng của nhiệt độ đến động thái sinlt trưởng :

Tiến hành nuơi cấy các chủng vi khuẩn ở nhiệt độ 20C, 25C, 30C, 35" 40C 45C, 50°C trên mơi trường MRS dịch thể Số lượng tế bào

nuơi cấy ban đầu bằng nhau pH = 6,0 Xác định số lượng tế bào ở các thời điểm 0, 2, 4, 6, 8, 10, giờ Từ đĩ xác định nhiệt độ sinh trưởng phát triển thích hợp của từng chủng

11.4.3 Anh hưởng của pH đến động thái sinh trưởng :

Tiến hành thí nghiệm như trên với mơi trường MRS dịch thể ở nhiệt độ 30°C ở các giá trị pH khác nhau là: 4,0; 5,0; 6,0; 6,5; 7,0 Đếm số

lượng tế bào ở các thời điểm 0, 2, 4, 6, 8, 10 ,12 giờ Từ đĩ xác định pH thích hợp nhất cho sự phát triển của mỗi chủng

Dựa trên cơ sở sự phát triển của vi sinh vật bị ức chế ở nhiệt độ lạnh

Đây là phương pháp được sử dụng khá rộng rãi để bảo quản vi sinh vật Ưu điểm của phương pháp này là dễ bảo quản và thời gian giữ được

lâu

Phương pháp:

ĐỂ bảo vệ vi sinh vật khơng chết ở nhiệt độ lạnh sâu do các tinh thé

nước gây ra, người ta thường trộn vi sinh vật với một trong những chất hảo

ve sau:

Trang 27

* Glycerin 15% * Huyét thanh ngva

= Dung dich saccharose 10% + gelatin 1%, pH = 6.8— 7 Dung dich glucose hoặc lactose 10%,

Sau khi đã trộn đều vi sinh vật với chất bảo vệ, cho vào các ống

nghiém đậy nút lại và làm lạnh từ từ Khi độ lạnh đạt -30C 2€ giữ

tốc độ làm lạmh trong 2 phút

Yêu câu :

Thực hiện bảo quản các chủng đã tuyển chọn để tiếp tục nghiên cứu Chúng tơi tiến hành dùng glyccrin làm chất bảo vệ để giữ giống vì phương pháp này cho kết quả tương đối tốt và phù hợp với trang thiết bị

phịng thí nghiệm

Trang 28

PHAN II: KETQUA - BIENLUAN

1 Phân lập và chọn giống:

I 1L Phân lập giống vị khuẩn lactic:

Tiến hành phân lập theo phương pháp Koch ở độ pha lỗng thích

hợp, đã thu được 13 chủng vi khuẩn tương ứng với từng nguồn phân lập như

`aUH -

Nguồn phân lập : Kí hiệu các chủng được phân lập :

Nước đứa lên men D; Dy ,Dị,D;

Nước cà chua lên mcn C

Nước dưa cải muối chua DC, DC:

Nước dưa giá G

Nem chua Na, Na, Ne

Sifa chua S

Men banh mi (Mori /LaNga) M I2 Sơ chọn giống :

Các chủng đã phân lập, được tiến hành nuơi cấy trên mơi trường

thạch đĩa cacbonat-agar ở nhiệt độ 30”C trong 4 ngày Chúng tơi nhận thấy

rằng, tất cả các chủng đều xuất hiện vịng trong suốt xung quanh mỗi khuẩn lạc Điểu này chứng tỏ trong quá trình sinh trưởng phát triển chúng đã tạo

ra acid Tuy nhiên mức độ sinh acid của mỗi chủng là khác nhau Chủng nào cĩ kích thước vịng trong càng lớn chứng tỏ lượng acid sinh ra càng

nhiều Các kết quả thu nhận, được biểu diễn qua các hình sau :

Trang 29

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRẤN THỊ HỒNG VẬN

Hình I : Khả năng tạo vịng tan trên mơi trường cacbonat agar của các chủng Dị, Dạ, Dạ, Dy

Hình 2 : Khả năng tạo vịng tan trên mơi trường

Trang 30

Hình 3 : Khả năng tạo vịng tan trên mơi trường cacbonat agar của các chủng DC;, DC;, G, C

Hình 4 : Khả năng tạo vịng tan trên mơi trường cachonalt agar của chủng M

Trang 31

+

1.3 Tuyển chọn giống cĩ kha ndng sinh acid lactic :

Khi định tính khả năng sinh acid lactic của các chủng với thuốc thử uphenment Ching tơi nhận thấy rằng, những ống nghiệm cĩ nuơi cấy vi khuẩn khi thử với uphenment đều chuyển sang mầu vàng gần giống với ống

đối chứng là acid lacc nguyên chất , Điều này chứng tỏ các chủng cĩ khả

nang sinh acid lactic

Hình 5 : Kha nang sinh acid lactic của các chủng

Từ các kết quả thu được ở trên, chúng tơi quyết định tuyển chọn đan đầu 3 chủng S, D, và G là những chủng cĩ khả năng sinh acid lactic manh để tiếp tục nghiên cứu

II Mơ tả các đặc điểm hình thái vi khuẩn :

HI.I Đặc điểm hình thái khuẩn lạc trên mơi trường MRS_agar: Khi tiến hành nuơi cấy các chủng vi khuẩn Lactic trên mơi trường

MRS_agar ở nhiệt độ 30”C trong 4 ngày Chúng tơi thu nhận được những đặc điểm về hình dạng, kích thước, màu sắc của khuẩn lạc của các chủng

được tĩmftắt trong bắng 1

Trang 32

` LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRẦN THỊ HỒNG VÂN

Bang 1: Mơ tả các đặc điểm nuơi cây của các chúng vị khuẩn lactic trên mơi trường MRS_agar Kihi¿ua Hình dang Đường kính Màu sắc BC mat Mép chui! (mm) | 3 "> i : a eae eee = he — :

Khuẩn lạc (07-12mm |Màu trắng sữa | BỂ mặt bĩng | Mép ươn

hình trịn đục ,Cấu trúc | ướt và gổ cao

nhỏ đẳng nhất

L, Khuẩn lạc | (),5 -l mm | Màu trắng sữa | BỂ mặt bĩng | Mép trơn và cĩ màu

hình tron, Cấu trúc khơng | ướt và ít gỗ | nhat hơn phẩn trong

nhỏ | đồng nhất cao khuẩn lạc

kin khơng đồng nhất khuẩn lạc

ee

Hình 6 : Hình dạng khuẩn lạc chủng S

Trang 33

LUAN VAN TOT NGHIEP TRAN THI HONG VAN

i

Trang 34

LUAN VAN TOT NGHIEP — TRAN TH] HONG VAN

11.2 Déc diém hinh thai vikhudn trên mơi trường MRS dịch thể :

Tiến hành nhuộm đơn, nhuộm gram, nghiên cứu khả năng di động

Trang 35

Trang 36

II Nghiên cứu các đặc điểm sinh lý _sinh hĩa : LHI.] Quan lệ với Oxygen :

Khi nuơi cấy các chủnh vi khuẩn lactc trên mơi trường thạch đứng

Chúng tơi nhận thấy rằng cả 3 chủng đều phát triển dọc theo vết cấy từ bể

mặt xuống tận đáy mơi trường, các vết cấy này cĩ độ lớn khác nhau như vậy cả 3 chủng vi khuẩn lacúc nghiên cứu đều thuộc loại kị khí khơng bat

huỘc

Hình 12 : Đặc tính phát triển của các chủng

vi khuẩn lactc trên mơi trường thạch đứng HI2 Thí nghỉ hoat tinh cata ;

Trang 37

LUAN VAN TOT NGHIEP TRAN TH] HONG VAN IH.3 Quan hệ với nhiệt độ :

Khả năng sinh trưởng phát triển của các chủng vi khuẩn lacic hki

nuơi cấy ở các nhiệt độ khác nhau được trình bày trong bảng 4 Bang 4:kha năng sinh trưởng phát triển của các chủnh theo nhiệt độ Nhiệt độ ('C) | 20% | 25% | 30% | 35% | 40% | 45% | SỨC Kí hiệu ching FE ++ ++ +++ +++ ++ ++ + | 1), ++ ++ +++ ++~ ++ |G ++ et +++ tHe +++

Ghi chú : - : khơng phát triển ++ : phát triển khá | +: phát triển yếu +++: phát triển tốt

Hầu hết các chủng vi khuẩn lactc trên đều sinh trưởng được ở nhiệt độ từ

20 - 40°C ,Đặc biệt chủng S cĩ thể sống ở nhiệt độ từ 20 - 50C, tuy nhiên ở

nhiệt độ 50°C chúng phát triển yếu Vậy cả 3 chủng vi khuẩn được khảo sát trên

đêu thuộc nhĩm ta nhiệt, chúng đều phát triển tốt ở nhiệt độ ở 30°C - 35°C

HI.4 Quan hệ với pHl:

Khả năng sinh trưởng phát triển của các chủng vi khuẩn khi nuơi cấy ở các pH khác nhau được mơ tả trong bảng S5

Trang 38

LUAN VAN TOT NGHIEP _ TRAN TH] HONG VAN

Hình 13 : Khả năng phát triển ở cácpH khoc nha,

Cua Dị l

Hình !4 : Khả năng phát triển ở các pH khác nhau của chủng G

Trang 39

TRAN TH] HONG VAN LUAN VAN TOT NGHIEP

Cả 3 chủng vi khuẩn khảo sát đều phát triển được trong giới hạn pH

mơi trường từ 5 — 8, Tuy nhiên chủng S cĩ khả năng phát triển được ở biên đơ pH rộng nhất từ 5 — 10, tức cĩ khả năng sống được trong mơi trường kiểm Ngược lại chủng D; chỉ phát triển được ở pH =8 là tối đa Hầu hết các chủng khơng sống được trong mơi trường quá acid (pH = 4 )

ILH.6_ Khả năng lên men các loại đường :

Nuơi cấy từng chủng vi khuẩn lactc trong ống nghiệm chứa mơi

trường lên men với các loại đường khác nhau, chỉ thị màu đĩ là phcnol Theo dõi sự sinh trưởng phát triển của chúng sau 4 ngày nuơi cấy ở nhiệt độ 30C Dựa vào sự thay đổi màu sắc của mơi trường chúng tơi thu nhận kết quả được trình bày trong bảng 6,

Hầu như các chủng khảo sát đều lên men tốt các loại đường làm cho

mơi trường từ màu đỏ chuyển sang màu vàng ( pH acid ), trong khi ống đối chứng vẫn cịn màu đỏ phenol do mơi trường khơng nuơi cấy vi khuẩn

lactic,

Riêng chủng S cĩ khả năng lên mcn tất cả các loại đường khảo sát,

chủng D; và G lên men yếu galactose Chủng D khơng lên men mantosc, chủng G khơng lên mecn Íructose Như vậy giữa các chúng cĩ sự khác nhau

về khả năng sử dụng nguồn cacbon, điểu đĩ phản ánh sự khác nhau về cấu trúc vật liệu di truyền, thơng qua sự tạo thành các enzim khác nhau để đồng hĩa thức an

Định dạng
Số trang	60
Dung lượng	3,82 MB