Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn lactic phân lập từ các thực phẩm lên men

BO GIAO DUC VA DAO TAO TRUONG DAI HOC SU PHAM TP HO CHi MINH KHOA SINH HOC TRAN THI HONG VAN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN LACTIC PHAN LAP TU CAC THUC PHAM LEN MEN LUAN VAN TOT NGHIEP CHUYEN NGANH VI SINH GVHD : TRAN THANH THUY ! Trai : THÍ VIỄN eee ¬ a ek ị "aam| LƠ7 re, han NIÊN KHĨA 1996 - 2000 LỜI CÁM ON Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Trần Thanh Thủy _ cán giảng dạy môn vi sinh trường đại học Sư Phạm TP_ HCM tình hướng dẫn em suốt thời gian thực để tài tận Xin cảm ơn thầy phịng thí nghiệm vi sinh_ sinh hóa_ sinh thực giúp đỡ tạo điều kiện cho em hồn thành tốt để tài | lí Chân thành cảm ơn bạn lớp giúp đỡ động viên tơi q trình học tập Sinh viên Trần thị Hồng Vân TRAN TH] HONG VAN PHAN I: MG DAU Lên men lacúc loài người biết đến từ lâu Khi mà vốn hiểu hiết sơ khai, người làm điều mà họ khơng ngờ tới ứng dụng q trình lên men lacuc để chế biến bảo quản thưc phẩm cho Ngày nay, giới khắp nơi Ngay từ năm xuất phomat, sữa chua cốc lên men lacuc làm nguồn sản 1908, lên men thức ăn phẩm lên men trình có nước phương Tây người ta biết sản lactic Ở Ấn Độ, người ta sử dụng hạt ngũ ngày Longanisa( Philippines), Muson (Thái Lan ) tôm chua ( Việt Nam ) sản phẩm lên men từ thịt, Kim chi, ăn truyền thống người Hàn Quốc, Takuan Zuke (Nhật ) dưa, cà, hành muối, ăn qucn thuộc người Việt Nam sản phẩm muối chua từ loại rau, củ, Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng, lên mcn lactic tác dụng bảo quản thực phẩm làm tăng giá trị dinh dưỡng, cắm quan sản phẩm, nâng cao sức khỏe cho người dùng Không phải ngẫu nhiên mà Metchnikoff nhà bác học vĩ đại người Nga cho sữa chua có tác dụng trị bệnh đường ruột kéo dài tuổi tho Việt Nam nước nông nghiệp nhiệt đới nên nguồn nông sản giàu vẻ chủng loại dồi đào số lượng, tiền để thuận lợi cho phát triển công nghệ chế biến thực phẩm Thực tế, nhiều sản phẩm lên men cịn sản xuất qui mơ nhỏ, thủ cơng nên chưa đáp ứng nhu cầu ngày cao người dùng chất lượng vệ sinh an tồn thực phẩm Để góp phần cải tiến qui trình cơng nghệ nhằm nâng cao giá trị tồn diện sản phẩm, việc tuyển chọn nghiên cứu chủng mcn giống việc làm cần thiết giai đoạn Bởi lẽ hiệu suất qui trình cơng nghệ khơng kể đến trang thiết bị lên men thi giống vi sinh vật đóng vai trò định, Việc xác định chủng giống phù hợp với qui trình lên men thúc đẩy hiệu lên men cao, chất lượng sản phẩm tốt, rút ngắn thời gian cải thiên chất lượng sản phẩm ban đầu Vì lẻ chúng tơi thực đẻ tài : *Nghiên cứu số đặc điểm sinh học số chủng vi khuẩn lactc phân lập từ thực phẩm lên men” Hy vọng kết thu góp phần nhỏ bé vào mục tiều cơng nghiệp hóa q trình lên men truyền thống LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP + TRẬN THỊ HONG VAN PHAN II: TONG QUAN TAI LIEU Sơ lược vi khuẩn lactic : Vị khuẩn lactc thuộc họ Lactobateriaccae Gồm đạng vi khuẩn hình cầu hình que Tuy hình thái khác chúng thống đặc điểm sinh lý sinh hố Vị khuẩn lactic khơng chuyển động, khơng hình thành bào tử, tuyệt đại đa số gram dương Trong tế bào không chứa xitocrom catalaza, nhiên chúng sinh trưởng có mặt oxy khơng khí nhờ có peroxydaza giúp phân giải H:O› thành Hạ O: người ta gọi nhóm vi sinh vật vi sinh vật ky khí khơng bắt buộc Nhu cầu dinh dưỡng vi khuẩn lactc phức tạp Khơng lồi có khả phát triển môi trường khiết chứa khoáng, glucose, NHy Da s6 chiing can hang loat vitamin: lactoflavin, thiamin, acid pantothenic, acid niconitic, acid folic, biotin va cdc acid amin khac, Vi vay chúng thường nuôi cấy môi trường đinh dưỡng phức tạp chứa lượng tương đối lớn nấm men, nước chiết cà chua, chí máu Một số chủng vi khuẩn lactic sinh trưởng mơi trường chứa máu tạo thành cytochrom, chí tiến hành q trình photphorin hóa chuỗf hơ hấp , Sự sinh trưởng phát triển vi khuẩn lactic phụ thuộc vào nhiều yếu s® Nhiệt độ : ảnh hưởng lớn đến sinh lý tế bào, nói chung vi khuẩn lactc có biên độ nhiệt từ 10 — 30C phân thành hai nhóm nhóm ưa ẩm ta nhiệt , s pH: tùy loài vi khuẩn lactic ma pH cé thé dao động khoảng 4,5 —6,8 ® Chất ức chế : chất kháng sinh nồng độ muối cao ức chế sinh trưởng nhóm vi khuẩn lactc Nồng độ muối cao cho sinh trưởng 6,5% “Độ ẩm : nước yếu tố cần thiết cho hoạt động vi, thiếu nước chúng không tổn LUAN VAN TOT NGHIEP TRAN TH] HONG VAN s® Oxy: vi khuẩn lacuc thuộc lồi ky khí khơng bắt buộc nên có mặt oxy không gây độc cho tế hào, nhiên thiếu oxy sinh trưởng thuận lợi II Đặc diểm trình lên men lactic ; Lên men lactic trình sinh hóa đơn giản, diễn chuyển hóa kị khí đường thành acid lacuc tác động mot cnzim, enzim có tế bào vi khuẩn lacUc , Tuỳ thuộc vào sản phẩm cuối hình thành, người ta chia trình lên men lactic gồm hai kiểu LH Lên men lactic đơng hình : Q trình lên men tạo sản phẩm acid lactc chiếm 90 - YRS, Sơ đồ tổng quát trình lên men đồng hình : CuH¡:O, — 2CH;CHOHCOOH + 75,6 K1 Quá trình thực nhóm khuẩn lên men lauc đồng hình thuộc giống Sưecptococcus Lactobactcrium, Các đại diện thường gap la ‘Streptococcus lactic, Streptococcus cremoris, Streptococcus thermophilus, Lactobacterium bulgaricum,Lactobacterium platarum, Lactobacterium acidophilum, Lactobacterium cascin,, _ Céc vi khuẩn lactc đồng hình tiến hành phân giải glucose theo đường EMP, tạo sản phẩm acid lactic trải qua hàng loạt giai đoạn trung gian với tham gia cnzim tương ứng Trong tế bào nhóm vi khuẩn chứa mcn cẩn thiết cho phân giải kể adolaza Con đường Fructozo l6 diphotphat diễn tới puruvaL Nhờ lactathydrogena⁄a mà pyruvat khử thành acid lactc Khi NAOH; vinh trình đường phân tách hydro glyrerinaldehyt_3 photphat chuyển trở lại thành NAD, Lactatdchydrogenaza xúc tác cho môi khử pyruvat đặc hiệu lập thể LUAN VAN TOT NGHIEP TRAN TH] HONG VAN qua phản ứng mở đầu đường pcntozophotphat oxy hóa Tiếp sau phản ứng photphoketolaza đặc trưng cho vi khuẩn lactic dị hình, phân giải pentoza thành glyccrinalđchyt3 photphat acetyl_ photphat Sự oxy hoá trioza tới axit lactic xảy lên men lactic đồng hình qua phản ứng đường phân Sự phân hủy pentoza từ acetylphotphat tạo thành acid accUc Glucoza Ribulozo — - photphat Xilutozo — - photphat (cy, glycerinadehyt ~ ~ photphat nữ Acetylphotphat AcetyLCoA Lactat =“ Ì Etanol So dé men lactic dj hinh LH Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men : HHI.1;Thơng khí : Trong q trình ni cấy chủng vi sinh vật hiếu khí người ta tiến hành cung cấp lượng lớn khí vơ trùng Lên men công nghiệp thường thường sử dụng thiết bị lên men có hệ thống khuấy đảo sục khí Cịn điểu kiện phịng thí nghiệm, tiến hành ni cấy lắc để cung cấp oxy đầy đủ tùỳ theo nhu cầu chúng Vị khuẩn lactic lồi kị khí khơng bắt buộc việc cung cấp oxy cho q trình lên men khơng cần thiết HH2 Nhiệt độ : Nhiệt độ yếu tố quan trọng, ảnh hưởng lớn đến phát triển vị sinh vật hiệu lên men Quá trình lên men ln có tỏa nhiệt làm cho nhiệt độ thiết bị lên men có xu hướng gia tăng ngưỡng nhiệt độ thích hợp Nhiệt xuất thiết bị lên men liên quan đến LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRAN TH] HONG VAN đồng hóa chất đỉnh dưỡng chủng nuôi cấy Sự gia tăng nhiệt độ xảy trước trình lên men đạt đến pha phát triển ổn định sau uiảm xuống Do phải thường xuyên theo dõi điều chỉnh nhiệt phù hợp với q trình lên men, Thơng thường để điều hịa nhiệt người ta trang hị hệ thống làm nóng làm nguội thiết bị lên men il : Mỗi loài vi sinh vật thích hợp với giá trị pH định mơi trường ni cấy Nhưng q trình lên men chúng tạo sản phẩm trao đổi chất có tính acid hay kiểm khiến cho pH mơi trường khơng cịn thích hgp cho hoạt động nhóm vi sinh vật Do việc chủ động điều chỉnh pH môi trường điều cần thiết thực hiên trình lên men, LII.4.Ảnh hưởng chất ức chế : Hiệu suất trình lên men trước tiên phụ thuộc vào suất hoạt động vi sinh vật, Trong tình lên men việc cung cấp chất dinh dưỡng điều cần thiết, nhiên lượng lớn so với nhu cầu làm ức chế hoạt động nhóm vi sinh vật ức chế lên men IV.Thành phần đặc điểm nhóm vi khuẩn lactic thường gặp lên men thực phẩm : Có nhiều lồi vi khuẩn lactc tham gia vào q trình lên men thực phẩm chủ yếu chúng thuộc chi Streptococcus, Lactobacillus, Peptidococcus ® Streptococcus : Tế bào hình cầu hình trứng, kéo dài thành hình que, thường xếp thành chuỗi ngắn chuỗi dài Ở số lồi, thấy vỗ nhầy điều kiện đặc biệt đó, Khơng di động ngoại trừ vài chủng thuộc nhóm Entercoccus Hydratcacbon rượu đa chức cần thiết cho phát triển nhóm môi trường nhân tạo Các chủng tạo khuẩn lạc có bể mặt nhăn nhỏ thường có khuynh hướng lắng nhanh xuống đáy mơi trường Ngược lại chủng có bể mặt khuẩn lạc phẳng phát triển thường làm đục mơi trường đồng đều, lắng xuống đáy Bê mặt khuẩn lạc loại thay đổi từ nhăn tới phẳng nhây ướt, Lên men hydratcacbon tạo sản phẩm cuối acid lactic LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRAN THỊ HONG VAN Catalaza âm tính, phát triển mơi trường có oxygen Nhu cầu dinh dưỡng phức tạp đòi hỏi phải có nhiều vitamin va acid amin ® Chi Lactobacillus : Tế bào hình quc thẳng cong, thường dạng đơn lẽ tạo thành chuỗi Chúng không di động Gram dương Lên men hydratcacbon tạo sản phẩm cuối acid lacúc số sản phẩm phụ acid lormic, acid acctic, CO: Vi hiếu khí đến ky khí khơng bắt buộc ® Chi Peptidococcus : Tế bào hình cầu thường dạng đơn, đơi, tcưa đơi xếp thành chuỗi ngắn, xếp thành chụm tế bào thấy Vi hiếu khí, phát triển bể mặt môi trường, Lên men hydratcacbon tạo sản phẩm cuối acid lactic, LV.I Các vi khuẩn lên men sữa: Streptococcus lactic : Tế bào hình bầu duc, kich thuée (1 -1,5)x( 0,5 -l ) micromet tổn thành đôi hay chuỗi ngắn Có khả lên men sữa Nhiệt độ thích hựp cho phát triển 1a 30 - 35°C, Lam đông tụ sữa sau dao dong ty 110 - 120°T, 12 Độ acid Lén men glucose, mantose, raffinose, lactose, palactose, dextrin Streptococcus cremoris : Tế bào hình cầu hình trứng gần giống S lactc kích thước nhỏ hơn, kích thước trung bình 0,6 - 0,7 micromet, Thường tìm thấy sữa dạng chuỗi dài gần đơi Gram dương Khơng di động Nhiệt độ thích hợp cho phát triển 20 - 25°C, Lam d6ng tu sifa sau 12 uiờ, Làm cho sữa có độ chưa thấp 110 ~115°T Không phát triển môi trường chứa NaC| 4% Lên mcn loại đường glucosc, manlose, lactosc, galactose Streptococcus thermophilus : Tế bao hình cầu hình trứng Tổn thành đơi hay chuỗi dài, Gram dương, nhiệt độ thích hợp cho phát triển 40 - 45C, phát triển 50”C không phát triển 53°C 20C Không phát triển môi trường chứa NaCl 2% Lên mcn loại đường glucose, Íructose, lactose succlose Ít lên men pentose, ralfinose Khong LUAN VAN TOT NGHIEP TRAN TH] HONG VAN lên men tcưalose, mantose, inulin, glycerin, manitol, sorbitol Nhan biét loài dựa vào đặc tính phát triển nhiệt độ cao nhạy cảm với NaC|, bacill Wdophicus: Tế bào hình que, kích thước (0,6 - 09) x (l5 - ) micromet, Chúng thường đứng riêng rẽ, kết đôi hay tạo thành chuỗi ngắn Khi non gram dương già chuyển gram âm, di động Phát triển tốt nhiệt độ 37 - 40°C Tích tụ % acid lactic môi trường Lên men vác loai duGng glucose, mantosc, saccharose ,lactosc [ beciifus I ous: Tế hào hình que dài, thường xếp thành chuỗi gram dương Nhiệt độ thích hợp cho phát triển 40 —- 48C Trong môi trường lên men tạo 3,5% acid lacuc, độ acid tạo từ 300 -450°T Làm đông tụ sữa từ - giờ, Lên mecn gÌucosc, galactosc ,lactosc, Thường không lên mcn sucrosc, mantos, fructose mdi dude phan lap Lactobacillus casein : Tế bào hình quc kích thước khơng Ién (0,8 - 0,9 )x (2- ) micromet, Nhiét d6 thích hợp cho phát triển 30 — 35 °C Có thể phát triển 22 -55”C Chịu đựng độ acid Lên men tốt loại đường gÌucose, lactosse, mantose, Có thể phân hủy cazein đến acid amin, IV.2 Các vị khuẩn lên men rau : Tế bào hình que , kích thước (0,7 -1, 0) x (3,0 - 8,5 ) micromet Tén dạng đơn lẽ hay kết thành chuỗi ngắn, tế bào cuối chuỗi tròn Gram dương Nhiệt độ thích hợp cho phát triển 30”C không phát triển nhiệt độ 10C 40°C Phát triển môi trường chứa NaC] 5,5% Lên men tích tụ lượng acid lactic mơi trường | ,2% Lên men đồng hình loại đường glucose, Íructose, mantose, galactose, lactose, mannose, Lén men duGng mantose tao acid lactic va acid acetic Lên men yếu loại du@ng sorbitol, manitol,dextrin, glycerol xylose Không lên men tỉnh bét va inulin Leuconostoc mensenteroides: _ Tế bào hình cầu, đường kinh 0,9 - 1,2 micromet, Tổn thành đôi, chuỗi ngắn chuỗi đài Gram dương Nhiệt độ thích hợp cho phát triển 2I- 25 “C Lên men loại đường glucosc,frutosc,galactosc, LUAN VAN TOT NGHIEP TRAN TH] HONG VAN manose, xylose, arabinose,sucrose ,lactose, raffinose, salicin , rhamnosc glycerol Dac diém phân biệt chủng sinh chất nhầy môi trường dịch thể sucrose đường muối cao Lactobacillus Có khả tạo chất thơm, chịu nổng brassicae fermentati: Tế bào hình que, hai đầu trịn Tổn thành đôi, chuỗi ngắn hay chuỗi dài (thường gặp chúng dạng chuỗi) Lên men loại đường tạo thành acid lactic, acid acetic, rudu êtylic CO Lên mcn đường saccharosc mạnh đường lactosc Acid lactic tích tụ mơi trường lên men tới 1,2%, Ngồi chúng cịn có khả tạo chất thơm làm cho xăn phẩm có mùi thơm để chịu V Vai trị vi khuẩn lactic: V Trong cơng nghiệp: V.1.I Công nghiệp sản suất acid lactic: Công nghiệp sản suất acid lacuúc cuối kỷ 19, với vi khuẩn lacuc đối tượng sử dụng để lên men thu nhận acid lactic Loài Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus leichmani, Lactobacillus delbrucki ưu tiên sử dụng Đó lồi vi khuẩn Lactic đồng hình có nhiệt độ tối ưu vào khoảng 45- 48°C, có ưu phòng ngừa lây nhiễm lên men, Nguyên liệu dùng sản suất acid lactic đường, rỉ đường củ cải, dịch thủy phân bột, dịch thủy phân inulin Cũng sử dụng nguyên liệu thơ chứa tính bột phải qua giai đoạn xử lý cnzim thủy phân tinh hội Quá trình lên men thưởng thực điều kiện: s_Nồng độ đường môi trường: 10-15%: " Lượng CaCO; sử dụng: 10% * Mam đại mạch :0,375% * Photphat amon: (),25% Acid lactic dude sit dung nhiều công nghiệp thuộc da, công nghiệp đệt công nghiệp đồ nhựa Nhu cẩu acid lacúc phạm vi toàn giới đạt 30000 tấn/năm, Khoảng 30% nhu cầu đáp ứng nhờ acid lactic racemic sản xuất đường tổng hợp