Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng streptococcus spo5

Trang 1 F Jror BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHAM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA SINH LH NGUYÊN KIẾN HUYÊN Đà tài: NGHIÊN Cứu MỘT SỐ ĐặC ĐIỂM SINH HỌC cd@ CHONG STREPTOCOCCUS.. SP

Trang 1

F Jror BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHAM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA SINH LH

NGUYÊN KIẾN HUYÊN

Đà tài:

NGHIÊN Cứu MỘT SỐ ĐặC ĐIỂM SINH HỌC cd@ CHONG STREPTOCOCCUS SPO5

LUAN VAN TOT NGHIEP

NGANH SINH HOC CHUYEN NGANH VI SINH

CBHD: TS TRAN THANH THUY

Trang 2

Loi cam on

Em xin vô cùng cảm ơn các thay cô trong

khoa đã truyền đạt cho em nhiều kiến thức quý

báu trong những năm học vừa qua

Em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến cô

Trần Thanh Thủy - cán bộ giảng dạy môn Vị sinh vật Trường Đại học Sư phạm Tp Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dẫn cho em trong suốt

quá trình thực hiện để tài

Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô ở

phòng thí nghiệm sinh lý sinh hoá_vi sinh đã

giúp đỡ và tạo điều kiện cho em hoàn thành tốt dé tai nay

Chân thành cảm ơn các anh chị ở phòng

Trang 3

"HỆ VÌ I PHAN I TONG QUAN TÀI LIỆU loa 22c<d9 1.1 VỀ KRNỂN RE iscsi eR 4066 3 [21:1: Lịch sử ngiiÊn CỨNG Gc22020004222 02000826 2Ai0X02Ä0ÄX 3 21:3: ĐI đM CÀ sáo: 0060000 C020122001142114050412010.60áấ 3 UDB HH TH u20 G266 C62620 260⁄2- 2c 2k2 4 I.1.4 Một số yếu tố ảnh huGng dén su phat tri€n cua vi khudn lactic âu58966604494954467016456039X494ÿ95594646y94588/4/96726564ce94934446%55596095340560%/09561668N0955 7

1.1.4.1 Ảnh hưởng của thành phần môi trường 7

1.1.4.2 Anh hung cila nhiét 46 0 ccccccccsscscssessesecsessesseeseesenees 8

1.14.3: Agi teas cia ph aie dã 66 da 8

1.1.4.4 Ảnh hưởng của nỗng độ oxy - s- s55: Ụ

L;1:5, Liên men NĂNG 164v4 ác ác 6x06vässse 9

1.1.5.1 Lên men lactic đồng hình . c5 5< <5 s22 Ụ

1.1:5,2 Lân mơn MGHG đi NHƯ NGcaaveccoseovosecccccoeooeoocoeecesooeccoeee 10

1.2 Ứng dung cia vi khudn lactic TL 12

1.2.1 Trong công nghiệp sản xuất axit lactc .- «<2 12

1.2.2 Trong công nghiệp sila .cccscsssesssssssesssreecsessrecssssssseesssees 12 1.3.3 Trong công RGIƯIÊP HỆ CỀ acc c te 626cc k0 cac 13

I.2.4 Trong công nghiệp chế biến và bảo quản rau quả 14

12.5 TrORG HÔNG NI ND bá 0006002200000 15

\.3 Vai tro va khả năng sử dụng vì khuẩn lactic trong chế phẩm

P.5 A 15

E51 VU ——————snaseaeeseeee«: 15 1.3.2 Co chế kháng khuẩn của vi khuẩn lactic -. - l6 1.3.3 Vai trò của vi khuẩn lactic trong chế phẩm probiotic 17 1.4 Các phương pháp bảo quản vỉ khuẩn Ìactic - - 5s 55- 19

PHAN II VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

duấc VY TÊN 12y(21264i00005210010 265131 266005224ảL4SSL5ã4E 2868508064126 620d4616G18vađ: 21

Trang 4

DNB RR CHẾ u24 2002 ccc aa See eae anaes tana 21

DVB eT aceasta 22

Zi IGE PUIG BRED COU ác tát cuu Ga ác CcGoooocoo 22 ^, PNRMNG PRẾáN NGRÌÊÊN CÊN ác boiooocoooooGoconooooeoc 23 2.2.1 Phan lap Streptococcus sp05 từ chế phẩm Lactomin plus 23

2.2.2 Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá 26

2.2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái của chủng

SEF OOOO COUE: BIOS is saci hid cicevcctassccssabsnseaaspssacenssapnecess 26 2:2:2:2: TRỪ hoạt nh CHIA 22 2c án 6 c0 28

22.2.3 Quan hệ với Hệ ĐỘ vác 6c 28 134.0 QUAYN hệ VỚI BH kdácddkididaccdbscacceuo 28

2.2.2.5 Quan hệ với nỗng độ muối . -‹ 29 2.2.1.6 Khả năng lên men các loại đường 29 2.2.2.7 Xác định hàm lượng axit tổng - 5< 5c5- 29 2.2.1.8 Khả năng axit hoá môi trường trong thời gian ni Ế TY G640 0442 G0G01006689X005000Xi60MWz0x« 30 2.2.3 Xác định hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khoan lỗ tIÊ Hy x2 cv bicxtesuzssexusxv,x 30 2.2.4 Khảo sát khả năng kháng với một số loại kháng sinh đường ruột CUR PM CO CC TT aeeecaiidkiaeioeiieeeeeeeeee.eee 32

2.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của các nhân tố môi trường đến sự sinh

trưởng và phát triển của chủng $/repfococcus sp05 32

2.2.5.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy 33 2.2.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ - - «- se xscvxe2 33

2.2.5.3 Ảnh hưởng của pH ban đầu s55 33

2.2.5.4 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy tĩnh và lắc 33

2.2.6 Kiểm tra số lượng vi sinh vật bằng cách đếm số khuẩn lạc mọc

trên môi TƯỜNG GD cv cacceaiieeeeiiisiseeeioeaieeseneeesec 34

Trang 5

PHAN IIL KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 22222 36

3.1 Kết quả phân lập và làm thuân chủng Streptococcus sp05 36 3.2 Đặc điểm hình thái chủng Streptococeus sp0Š .- 37 3.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 39

3.3.1 TH BA? DẾi GÀ HN cưa áesiisudeadeoeeeasee 39

2.1.2 (20A7 D0 V01 IOS OG snes scercinssvccccnscascsvscassseneneatevcnivestiwaentaassarsee 39

DiS de GHEE LUE FOR TER vis exeserssenvecnensenssarwscepecansonesorsiacesnspumesanatuneseusesiies 39

3.3.4 Quan hệ với nổng dO MUGI cccccceccssesseecessseeseeesseseseeseseeneres 40

3.3.5 Khả năng lên men các loại đường - - ĂĂsx+ s2 4I 33:6: Khả năng sinh exit lNGDC cá 4220660621660 2026 60026 0cc 0066062 42

3.3.7 Biến đổi pH trong quá trình nuôi cấy - - - «5<: 44

3.4 Khả năng đối kháng của chủng Streptococcus sp0§ 45

3.4.1 Khả năng đối kháng với vi khuẩn kiểm định 45

3.4.2 Khả năng kháng kháng sinh -.<- 555552 48

3.5 Ảnh hưởng của các nhân tế môi trường đến sinh trưởng và phát

triển của chủng Strepfococcus spÚŠ .- 555 << sss<S2 50

3.5.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy - s< ss= 50

3.52, Ảnh lưng của Whe Ob c2 66c 220 06626066xcoccxde 52

3.5.3 Ảnh hưởng của pH ban đầu - s3 xesx, 54

3.5.4 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lắc và tĩnh 56

3.6 Bảo quân bằng phương pháp đông khô và kiểm tra khả năng sống

tối II ĐI GUI ru eeiaeredeaeeariioieeeeeaeeeaaeoeeceee 58

3.6.1 Bảo quản bằng phương pháp đông khô 58

3.6.2 Khả năng sống sót của chủng Streptococcus sp05 sau đông khô

Siecle cousin Gia baat A es Na ea ata 59

PHAN IV KET LUAN VA ĐỀ NGHỊ, 60

Trang 6

Luận văn tốt nghiệp CBHD: TS Tran Thanh Thủy

MỞ ĐẦU

Lên men lactic được con người biết đến từ rất lâu Theo thời gian, quá trình này ngày càng được con người sử dụng rộng rãi trong chế biến và

bảo quản thực phẩm Hầu hết các sản phẩm lên men lactic đều giàu dinh

dưỡng, hương vị thơm ngon, có thể bảo quản lâu hơn và đặc biệt là có khả

năng chữa bệnh, kéo dài tuổi thọ (Metchnikoff, 1908) Ngày nay, các sản

phẩm lên men lactic đã có mặt khắp nơi Từ những sản phẩm từ sữa như sữa chua, phomat, kefir (Nga) đến các sản phẩm lên men từ thịt cá như

Longanisa (Philippines), Muson (Thailand), tôm chua, nem chua (Việt

Nam) hay những sản phẩm muối chua từ rau củ quả như kim chi (Triéu

Tiên), dưa cải, cà hành muối chua (Việt Nam)

Hiện nay, việc ứng dụng vi khuẩn lactic không dừng lại ở lĩnh vực

chế biến và bảo quản thực phẩm đơn thuần, mà còn được sử dụng để tạo ra

các chế phẩm probiotic để phòng và trị bệnh, nâng cao sức khoẻ cả vật

nuôi lắn người người dùng

Đối với con người, các chế phẩm probioric từ vi khuẩn lactic giúp

kích thích tiêu hoá, tiêu diệt vỉ sinh vật có hại, trị một số bệnh tiêu chảy,

cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột sau những đợt điều trị kháng sinh dài

ngày Gần đây, một số nghiên cứu còn cho thấy hiệu quả của chế phẩm

này trong việc ngăn ngừa một số bệnh ung thư và hạn chế nhiễm khuẩn trong phẩu thuật

Đối với vật nuôi, probiotic từ vi khuẩn lactic không chỉ có tác dụng

trong điều trị các chứng tiêu chảy ở heo con, ở gà và một số gia súc khác mà còn kích thích vật nuôi hay ăn chóng lớn, tận dụng nguồn thức ăn, nâng

cao chất lượng sản phẩm góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi.| 2]

Nước ta là nước có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, rất thích hợp cho sự

phát triển của vi sinh vật gây bệnh, đặc biệt là các vi sinh vật gây bệnh

Trang 7

Luận văn tốt nghiệp CBHD: TS Tran Thanh Thảy

đường tiêu hoá Thực tế, việc điều trị các bệnh này chủ yếu bằng kháng

sinh Nếu sử dụng kháng sinh dài ngày và không đúng cách sẽ gây hiện

tượng loạn khuẩn đường ruột và nhờn thuốc Xu hướng hiện nay người ta quan tâm nhiều hơn đến khả năng sử dụng các chế phẩm probiotic chữa các bệnh này nhờ khả năng kháng khuẩn cao, ít chịu tác dụng của chất

kháng sinh và giúp ngăn ngừa bệnh tật Do đó, việc nghiên cứu các chủng

ví khuẩn lactic có hoạt tính sinh học cao làm cơ sở cho việc sử dụng chúng

tao chế phẩm probiotic là một việc làm rất có ý nghĩa đối với sức khoẻ con người cũng như vật nuôi trong điều kiện hiện nay Chính điều này đã khiến chúng tôi chọn để tài cho mình là : “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học

của chủng Streptococcws sp 05”

+ Mục đích để tài: Nghiên cứu các đặc điểm sinh hoc và khả năng

sit dung ching Streptococcus spO5 cho viéc tao ch€ phẩm probiotic phục

vu chan nuôi

Nhiệm vụ của đề tài:

! Phân lập chủng Srreptoeoccus sp05 từ chế phẩm Lactomin plus 2 Nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chủng Streptococcus

sp05

3 Nghiên cứu khả năng để kháng của ching S/repfococeus sp05

4 Tìm hiểu một số điều kiện tối ưu cho sự sinh trưởng và phát tri€én cla ching Streptococcus sp05

5 Bảo quản bằng phương pháp đông khô và kiểm tra khả năng

sống sót của chủng Sfreptococcus sp05 sau bảo quan

Trang 8

Luận văn tốt nghiệp CBHD: TS Trần Thanh Thủy

PHẦN I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 VI KHUAN LACTIC:

1.1.1 LICH SU NGHIEN CUU:

Con người từ lâu đã sử dụng vi sinh vật lên men lactic để bảo

quản và chế biến các loại thức ăn Nhưng mãi đến năm 1780, nha bac học Thụy Điển Scheele lần đầu tiên tách được axit lactic từ sữa bò lên men chua Năm 1857, Louis Pasteur lan đầu tiên chứng minh được việc làm chua sữa là kết quả hoạt động của nhóm vi sinh vật đặt biệt gọi là vi khuẩn

lactic va dat tén la Bacterium lactic (nay gọi là Streptococcus lactic ).Từ đó

đến nay các nhà khoa học đã phân lập được nhiều vi khuẩn lactic khác

nhau và ngày càng được ứng dụng nhiều trên quy mô lớn, đặc biệt là những

chủng có hoạt tính sinh học cao thuộc chi Lactobacillus [5]

1.1.2 ĐẶC ĐIỂM CHUNG :

- Vị khuẩn lactic là tên gọi của những vi khuẩn thu nhận năng

lượng nhờ phân giải hydratcacbon và sinh ra axit lactic Chúng được xếp

chung vào họ Lactobacteriaceac.|S]

Mặc dù nhóm vi khuẩn này không đồng nhất vẻ hình thái (gồm

cả các vi khuẩn dạng que ngắn, que dài lẫn các vi khuẩn hình cầu) Nhưng

về mặt sinh lý chúng lại tương đối đồng nhất ở một số đặc điểm sau: o_ Đều là những vi khuẩn gram dương

Trang 9

Luận văn tốt nghiệp CBHD: TS Trdn Thanh Thủy © Lén men bat buéc, khéng chifa cdc cytochrome, men catalaza,

men oxytaza

o Séng tit ki khi tới vi hiếu khí, là loại cơ thể độc nhất có khả

năng lên men hiếu khí cũng như kị khí [Š],|23]

- Nhu cầu về dính dưỡng của vi khuẩn lactic rất phức tạp, không một đại diện nào thuộc nhóm này có thể phát triển được trên mơi

trường muối khống thuần khiết chứa glucose và NHạ Da số chúng cần

hàng lọat vitamin (BI, B2, B6, PP), các axit amin, các bazơ nucleic

(purines, pyrimidines ), axit béo Vì vậy, chúng đòi hỏi môi trường nuôi cấy

giàu chất dinh dưỡng , chứa đựng tương đối lớn cao thịt, cao nấm nem,

protein, dịch cà chua và các muối khoáng khác ( Mg””, Mn'”, Fe”" )

Sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic còn phụ thuộc

vào nhiều yếu tố khác như : nhiệt độ, độ pH, nồng độ oxy, các chất ức chế trong môi trường Š],[7 |

1.1.3 PHÂN LOẠI CÁC NHÓM VI KHUẨN LACTIC

Theo những nghiên cứu phân loại gần đây [22]{34](35], vi khuẩn lactic bao gém cdc chi: Aerococcus, Alloiococcus, Carnobacter,

Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus,

Tetragenococcus, Streptococcus, Vagococcus va Bifidobacterium cũng được

xem là thành viên của nhóm này Hiện nay, vi khuẩn lactic rất được quan

tâm trong công nghiệp thực phẩm cũng như sản xuất các chế phẩm

probiotic, dac biét la cac chi Lactobacillus, Streptococcus, Bifidobacterium

va Lactococcus, [5},{7]

* Lactobacillus Té bao hình que ngắn hoặc

dài, thường dạng chuỗi Nhiệt độ tối ưu 30-40°C

Bao gồm cả nhóm lên men đồng hình và lên men dị È

hình Một số đại diện điển hình là:

- L acidophilus : tế bào hình que ngắn :

có kích thước (0,6-0,9)x(1,5-6) um Phát triển inh 1.1 L aeidephis |3l]

Trang 10

tối ưu ở 37- 40C và pH tối thích từ 5,2- 5,8 Có khả năng lên men nhiều loại đường khác nhau Một số chủng tạo thanh bacteriocin dang acidophilin, acidophin có hoat tính ức chế các vi khuẩn gây bệnh Thường

được sử dụng trong các chế phẩm trị tiêu chảy.[7]{22]

- L_ plantarum: Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng là 30°C, lượng axit tích tụ tới 1,3%, Chủng nay được ứng dụng nhiều trong việc bảo quản rau

quả và lên men rau quả dùng trong chăn nuôi.[7]

% BIdobacterium: là những trực khuẩn kị

khí, lên men lactic dị hình, sản phẩm chính là axit

lactic và axit axetic (tỷ lệ 3:2) cùng l lượng nhỏ axit

[ormic, ethanol, axit xucxinic nhưng khác biệt với

các vi khuẩn lên men lactic dị hình khác là chúng `

không sinh CO; Chúng là những cơ thể ưa Hình 1.2 BỰïidobacterium{31]

ấm, nhiệt độ sinh trưởng 31-41°C [4]

Đại diện thường dude biét dén Ia B bifidum B bifidum phat tién

tốt nhất ở nhiệt độ 37°C va pH 4,8-5,2 Có khả năng lên men kém, chỉ có khả năng phân giải được các nguồn hydrat cacbon như lactose, gÌucose,

fructose, M6t s6 chủng tao thanh bacteriocin ở dạng bựïdocin Thường sử

dụng trong các chế phẩm probiotic cùng với L.acidophilus va S faecalis tri

tiêu chảy ở trẻ em.[22]

“+ Leuconostoc: tế bào hình oval, xếp thành đôi hay chuỗi ngắn hoặc chuỗi dài, nhu cầu dinh dưỡng rất phức tạp Lên men lactic dị

hình, ngoài axit lactic cOn tao ra axit axetic,

cthanol, CO;, có khả năng tạo hương thơm cho

bơ, sữa chua do có chất acetyl carbinol hay

acetonin, Một số đại diện tiêu biểu của giống

nay là: Hinh1.3 Leuc mesenteroides [29 |

- Leuc mesenteroides: nhiét độ

phát triển thích hợp là 20 -30"C, thường gặp trong sản phẩm sữa, rau củ lên

Trang 11

men Một số chủng sinh bacteriocin dạng menterocin chống lại Listena

monocytogenes

- Leuc oenos: Nhiét 46 phát triển thích hợp 1a 18 - 24°C Lén men

malolactic, rất quan trọng trong sản xuất rượu vang Trong sản xuất phomat chúng đóng vai trò sinh CO; hình thành lỗ

s* Sfrepfococcus:

Giống Sreptococcus có dạng hình cầu thường tổn tại thành từng

cặp hay dạng chuỗi, đường kính từ 0,5-1 m Tế bào không di động, gram

dương không sinh bào tử Chúng lên men từ kị khí đến vi hiếu khí, có thể tăng trưởng ở nhiệt độ từ 20-40°C , một số có thể chịu được 60°C trong 30

phút, nhưng nhiệt độ tối thích của nhóm này là khoảng 37°C pH tối thích

cho sự phát triển là khoảng từ 6-7 Nhưng chúng cũng có thể sống ở pH nhỏ

hơn 5 Một số đại diện điển hình là: [22]

- $ lactic: Phát triển tốt ở 30°C- 35°C, làm đông tụ sữa ở điều

kiện này sau 10-12 giờ Trong môi trường nó tích tụ được 0,8- 1% axit

lactic S /œefic là đối tượng được nghiên cứu quan tâm nhiều trong những

năm gần đây trong lĩnh vực bảo quản thực phẩm Ching nay có khả năng sinh bacteriocin dang nisin, dùng trong việc bảo quản các sản phẩm sữa tươi, sản phẩm đổ hộp, bia, pho mat và các sản phẩm khác từ thịt, cá, rau quả Hiện nay mis¿n đã được sử dụng phổ biến ở hơn 50 quốc gia [7]

- §, thermophilus: tế bào hình cầu có đường kính 0,7-lum, thường xếp thành chuỗi Không thể sống dưới 15°C nhưng có thể sống ở 60°C trong 30 phút Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của chủng này

la 45°C Ching này thường được sử dụng trong các sản phẩm sữa lên men

Một số chủng sinh bacteriocin dạng thermophilin.[22|

- § faecalis : có dạng hình cầu, có đường kính nhỏ hơn | pm, thường ở dạng cặp hoặc 4 tế bào Phát triển tốt ở nhiệt độ từ 20"°C đến 45"C Nhiệt độ tối thích cho sự tăng trưởng là 37°C Nó có thể phát triển

trong điều kiện vi hiếu khí đến kị khí, có 10% CO) La loại vi khuẩn lên

men lactic đồng hình, sản xuất ra lượng axit khoảng 90-95% Trong điều

Trang 12

Luận văn tốt nghiệp CRHD: TS Trần Thanh Thủy

kiện pH trung tính § faecalis còn tạo ra một số chất có khả năng kháng khuẩn rất tốt như ethanol, axit axetic, diacety],

H:O:› và CO; Một số chủng sinh kháng sinh

va bacteriocin dang cytolysin, streptococcin va

nisin |22

Ching nay được cho là có hiệu quả

trong việc làm giảm tác dụng của một số loại kháng sinh như Aureomycin,

Gentamicin, Erythromycin, Trimethoprim, Oxytetracyclin, Bacitracin,

Lincomycin, ASP-250, Furacin, Carbodox (mecadox), Virginiamycin va cé

tác động vdi ngay ca Ampicillin, Tetracycline, Spectinomycin, Novabiacin, va Gentacin,|25|,[26],[23]

Hién nay ngudi ta thudng sf dung ching S faecalis cing véi L

acidophillus va Bifidobacterium trong ché phém probiotic trị bệnh tiêu chẩy

và chấm đứt tình trạng loạn khuẩn trong đường ruột ở người Í| l |

1.14 MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN CUA

VI KHUẨN LACTIC

1.1.4.1 Thành phần môi trường

Vi khuẩn lactic có nhu cầu dinh dưỡng rất phức tạp Mỗi thành phần

của môi trường cũng có ảnh hưởng nhất định đối với sự sinh trưởng và phát

triển của chúng

- Hydrat cacbon là nguồn cung cấp năng lượng chính Mỗi chủng vi

khuẩn có khả năng phân giải các loại đường khác nhau và khả năng lên

men cũng phụ thuộc vào hàm lượng đường ban đầu

- Sự có mặt của vitamin, axit amin, xitrat, axit béo làm tăng tốc độ

sinh trưởng của vi khuẩn lactic

- Các ion khoáng như Mg”*, Mn”” đóng vai trò quan trọng trong trao

đổi chất và năng lượng của ví khuẩn lactic Và có tác động tích cực đối với

khả năng tổng hợp axit lactic va bacteriocin [9], [13]

Trang 13

Luận vấn tốt nghiệp CHHD: TS Trần Thanh Thủy

1.1.4.2 Anh hưởng của nhiệt độ:

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động của vi khuẩn lactic

Điều này càng có ý nghĩa hơn khi sử dụng chúng trong công nghiệp Khoảng nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn lactic khá rộng

Nhìn chung đa số chúng có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 15°C -

45°C Nhiệt độ cao thường tiêu diệt vi khuẩn lactic do tác dụng làm biến

tính enzyme, mất nước, ôxi hóa các thành phần tế bào Nhiệt độ thấp thường ức chế tăng trưởng của vi khuẩn lactic do đó làm giảm lượng sinh khối tạo ra Các loài có nhiệt độ phát triển từ trong khoảng 40°C- 45°C được gọi là vi khuẩn ưa nhiệt Các loài có nhiệt độ phát triển tối ưu trong khoảng 20°C- 40°C được gọi là vi khuẩn ưa ấm Các chủng vi khuẩn lactic được sử dụng làm chế phẩm probiotic thường có nhiệt độ thích hợp dao

động trong khoảng 35 - 40C [13]{14]

L.1.4.3 Ảnh hưởng của pH ban đầu:

Hoạt động của vỉ khuẩn lactic chịu tác động mạnh của pH Mỗi loài vi khuẩn lactic có một giá trị pH mà ở đó nó sinh trưởng tốt nhất, Các vi

khuẩn lactic có pH tối ưu cho sy phat trién 1a 5.5-6.2 (Lactobacillus), 5.5-

6.2(Pediococcus), 6.3-6.5 ( Lewconostoc) Giá trị pH cuối cùng mà mỗi

giống chịu được là khác nhau Chẳng hạn Lactobacillus có thể chịu được pH 3.2-3.5, Pediococcus có thể chịu được pH 3.5-4.4, Leuconostoc c6 thé

chịu được pH Š

Trong quá trình lên men lactic, axit lactic sinh ra đầu tiên có tác dụng

ức chế các loại vi sinh vật khác Sau đó khi lượng axit lactic tích lũy đủ lớn

thì chính vi khuẩn lactic cũng bị ức chế Vì vậy việc xác định pH ban đầu

để nuôi vi cấy khuẩn lactic sao cho thu được sinh khối cao nhất là rất quan

trong.[13],[ 17]

Trang 14

1.1.4.4 Ảnh hưởng của nông độ oxy :

Vi khuẩn lactic là lồi ki khí khơng bắt buộc, chúng có thể phát triển

trong điều kiện có oxy là do có peroxydaza phân giải H;O; thành HạO và

O; Nhưng điều kiện kị khí thì thích hợp với sự sinh trưởng và phát triển của

chúng hơn

Tuy nhiên, thành phần môi trường cũng có ảnh hưởng đến nhu câu oxy cia vi khuan lactic Ching han Streptococcus faecium, Pediococcus sp, Lactobacillus plantarum c6 thé déng héa dude glyxerin trong diéu kién

hiếu khí Một vài giống Leuconostoc có thể cần sự có mặt của oxy trong

giai đoạn đầu để đồng hóa hexoza như Lacfobacilus brevis, L.buchneri

Sự ảnh hưởng của oxy đôi khi còn phụ thuộc vào điều kiện nhiệt độ

Một vài chủng L brevis, L buchneri phát triển tốt ở 30°C trong điều kiện

ky khí và hiếu khí, trong khi ở 37°C nó chỉ phát triển trong điều kiện hiếu

khí { 13,{ L7]

1.1.5 LEN MEN LACTIC

Lén men lactic 1a quá trình chuyển hoá ky khí đường với sự tích luỹ

axit lactic trong môi trường Tuỳ thuộc vào sản phẩm sinh ra trong quá trình

này mà người ta chia quá trình lên men lactic thành hai kiểu.[9] 1.1.5.1 Lên men lactic đồng hình:

Lên men lactic đồng hình là quá trình lên men lactic mà lượng axit

lactic được hình thành chiếm 90-98%.[9]

Vi khuẩn lactic

C,H.;O, + 2ADP + 2Py —» 2CH;-CHOH-COOH + 2ATP

glucose lên men đồng hình axit lactic

Các vi khuẩn lactic lên men đồng hình phân giải đường theo con

đường EMP (Emblen - Meyerhof - Parnat) và cho sản phẩm chủ yếu là

axit lactic (90 -98%) Chỉ một phần nhỏ pyruvat được decacbonxyl hoá và

Trang 15

chuyển hoá thành axit axetic, etanol, axetoin và CO Mức tạo thành các

sản phẩm phụ này phụ thuộc vào sự có mặt của O;

Mặt dù chỉ tạo thành 2 ATP khi phân giải một phân tử đường

glucose thành hai phân tử axit lactic (hiệu suất năng lượng kém), nhưng vi

khuẩn lactic đồng hình lại có ý nghĩa lớn trong công nghệ thực phẩm vì : để

đảm bảo đủ năng lượng cho hoạt động sống , đồng thời cung cấp năng

lượng cho sinh trưởng phát triển, chúng phải phân giải một lượng lớn đường tạo thành một lượng lớn axit lactic, một sản phẩm có vai trò quan trọng

trong công nghệ thực phẩm | 14]

Một số vi khuẩn lactic lên men đổng hình thường gặp là:

Lactococcus latic, Streptococcus faecalis, S salivarius, Š pyogenes, S

cremoris, S thermophilus, Pediococcus cerevisiea va m6t s6 vi khuan lactic

hinh que nhu: Lactobacillus lactis, L acidophilus, L bulgaricus, L

delbruckii, L casei, L plantarum, Sporolactobacillus inulinus.{5]{14}

1.1.5.2 Lén men lactic dj hinh:

Lên men lactic dị hình là quá trình lên men mà ngoài axít lactic còn

có hàng loạt các sản phẩm khác chiếm tỉ lệ khá cao như axit xucxinic, rượu

ctanol, axit axetic và CO; [9]

Vị khuẩn lactic

C„H,:O, CH;CHOHCOOH + COOH(CH;);COOH +

Glucose a lactic a succinic

CH,;,CH,OH + CH,COOH + CO, + Kcal

etanol a acetic

Vi khuẩn lactic dị hình do thiếu hai enzym chủ yếu của con đường

EMP là aldolase và triozophotphat-isomerase nên giai đoạn đầu của quá

trình phân giải glucose xảy ra theo con đường PP ( Pentose phosphat) Quá trình chuyển hoá triozophosphat thành axit lactic xảy ra giống như trong lên men đồng hình | 14]

Trang 16

Đại diện của nhóm vi khuẩn lên men dị hình là: Lenconostoc mensenteroides, L cremoris và một số vi khuẩn lactic hình que như:

Lactobacillus brevis, L fermentum, Bifidobacterium bifudum

a.Lên men đồng hình b.Lén men dị hình Glucose (IIMg ATP lờ, Pv Gì 6P (2 ADP CO; (%) NADPH; Fructose 6 P 6 P - Gluconat DP + Pv NADP (3\ ATP (6) NADPH; Fructose 1.6 di P Ribulose 5 P (4) (7) { 1(1P Glixeraldehut) ST Thì 3 P Glixcraldehit Axeul P +CO, NADH; +2H" NAD* 1.3 di P ghxerat Axit xuexinic Axit axetic (9) | @ADP + Pv ATP P giixerat Chá thích: đội (1) Phospho—glucose—kinase +p An: ( (2) Phospho~glucose-izomerase 1) (3) Phospho-fructosr—kinase Fre (4) Adolase 2P enol piruvat (5) Glucose 6 P—dehidrogenase (1211 ADP + Pv (6) 6P dehidrogenase 2H’ ,*»ATP (7) Phosphoribo~izomerase Piruvat và phospho—xetopento—epimerase | NADP" (8) Glixeradehid-3phosphat-dehidrogenase

(13) S9 NADPH; (9) Phospho — glixerat — kinase

Axit lactic (10) Phosphoglixero — mutase

(11) Enolase (12) Piruvatkinase

(13) Lactat dehidrogenase

Hình 1.5: Sơ đồ chuyển hoá Gilucose thành axit lactic bằng con đường lên men

lactic đồng hình (a) và lên men lactic đị hình (b) [ L4

Trang 17

1.2 UNG DUNG CUA VI KHUAN LACTIC

1.2.1 TRONG CONG NGHIEP SAN XUAT AXIT LACTIC:

Axit lactic là nguyên liệu rất cần thiết của nhiều ngành công nghiệp Nó được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thuộc da (làm mềm và nở da), trong công nghiệp đệt (làm thuốc nhuộm), trong ¡in ấn và chế tạo chất dẻo,

sơn ( đóng vai trò như một dung môi) Trong công nghiệp thực phẩm, axit

lactic đóng vai trò như một chất gia vị đối với các loại đồ uống nhẹ, tỉnh

dầu, cao, dịch quả, mứt, sirô, rượu vang Ngoài ra, muối lactat với các

nguyên tố vi lượng được dùng làm dược phẩm nhằm bổ sung cho cơ thể như

luctat canxi bổ sung canxi cho bệnh nhân thiếu canxi, lactat sắt bổ sung sắt cho bệnh nhân thiếu máu do thiếu sắt Hiện nay, nhu cầu về axit lactic trên phạm vi toàn thế giới đạt 30.000 tấn/năm Nhưng chỉ khoảng 30% nhu cầu này được đáp ứng nhờ axit lactic raxemic sản xuất bằng con đường tổng

hợp [ I |,4]

Có thể coi công nghệ lên men để sản xuất axit lactic hình thành từ

năm 1881 Người ta thường sử dụng các chủng vi khuẩn lên men đồng hình

để sản xuất axit lactic VD: Lactobacilus delbruckii, L leichmanii Nguyén

liệu thường dùng là rỉ đường, đường, dịch thuỷ phân cám ngơ Ngồi ra,

cũng có thể sản xuất axit lactic từ nước sữa bằng cách cấy L bulgaricus và

Streptococcus lactis, chúng sẽ biến lactoza trong sữa thành axit lactic (4]

1.2.2 TRONG CÔNG NGHIỆP SỮA:

Để bảo quản dài hạn kết hợp với chế biến sữa thành những sản phẩm dùng trong thực phẩm người ta đã chế biến sữa thành các sản phẩm

như sữa lên men, bơ, phomat Ở quy trình sản xuất các sản phẩm này, vi

khuẩn lactic đóng vai trò quan trọng

s* Sữa chua:

Sữa chua chứa 2-3% axit lactic được tạo ra do kết quả lên men đường lactose của vi khuẩn lactic Sự có mặt của axit lactic làm tăng khả năng

Trang 18

tiêu hóa, đặc biệt là sự chuyển hóa các thức ăn giàu P, Ca Trong quá trình lên men protein của sữa tạo thành pepton, các amino axit Đồng thời quá

trình lên men phụ còn tạo ra diacetyl và acetonyl là các chất thơm có tác động kích thích tiêu hóa [4], [ I1]

Ngoài thành phần dinh dưỡng, sữa chua còn chứa một lượng lớn vi

khuẩn lactic Do vậy, khi ăn sữa chua giúp cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột và tránh được các bệnh về đường ruột như tiêu chảy, tả, thương

han.{ 12]

Trên quy mô công nghiệp người ta thường sử dụng các chủng thuần

khiết để lên men sữa tươi như : Lacftococcws lactic, Lactobacillus

bulgaricus, L acidophilus, Streptococcus cremoris [4], [ L 1] “+ Phomat:

Phomat là một loại thực phẩm lên men được chế biến từ sữa có giá

trị dinh dưỡng cao, dễ tiêu hoá, bảo quản được lâu Trong phomat chứa

20% protein (dưới dạng pepton, amino axit 30% lipid, các muối khoáng,

vitamin (A, BI, B2, C ) Phomat có mùi thơm ngon, kích thích tiêu hóa,

làm tăng khả năng đồng hóa thức ăn cho cơ thể

Để làm phomat, người ta sử dụng enzyme và vi khuẩn lactic để đông

kết sữa sau đó tách huyết thanh sữa rồi cho lên men với nồng độ muối loãng Quá trình chín phomat mà có thể do những tập đoàn vi sinh vật khác nhau tham gia Ngoài vi khuẩn lactic còn có vi khuẩn propionic, vi khuẩn

sinh sắc tố đỏ và nấm mốc [4], [11]

1.2.3 CÔNG NGHIỆP THỊT CÁ:

Việc sử dụng vi khuẩn lactic trong công nghiệp chế biến và bảo quản

thịt, cá những năm gần đây đã đem lại hiệu quả đáng kể như rút gắn thời

gian lên men nhưng chất lượng vẫn bảo đảm, đem lại hương vị đặc trưng, góp phần loại bỏ vi sinh vật gây bệnh cũng như làm hỏng thịt

Ngoài vi khuẩn lactic, trong công nghiệp thịt, cá người ta còn sử dụng

các giống vi sinh vật có khả năng trao đổi nhiều loại cacbon, có khả năng

Trang 19

Luận văn tất nghiệp CBHD: TS Trần Thanh Thủy

sinh axit tốt, có thể phát triển trên môi trường yếm khí, chịu nhiệt độ khác

nhau, chịu được muối và nitric Những giống thường được sử dụng là:

Lactobacillus, Pediococcus, Micrococcus |13)

Bảng 1.1 Một số thực phẩm lên men lactic | 13]

_Từ sữa eA" = — "Y

Kefir Sữa L bulgaricus Toàn thế giới | S lactis Yoghurt Sữa đông L bulgaricus Toan thé gidi S thermophilus .Phomát Sữa đông Leuconostoc sp Châu Âu, Mỹ S thermophilus Thit es BS oe mere ok

Thịt bò băm | Thịt bò S lactis Toan thé gidi Xúc xích khô | Thịt bò, thịt Pediococcus cerevisiae Toàn thế giới Từthợcvạt Ô 7 7777 SN, aes Dưa cải Bắp cải Leuconostoc mensenteroides | Toàn thế giới Lactobacillus plantarum Kim chi Bắp cải và các | Vỉ khuẩn lactic Triều Tiên loại rau khác

1.2.4 TRONG CHE BIEN VA BAO QUAN RAU QUA:

Người ta phối hợp cả quá trình lên men lactic đồng hình và dị hình

vào trong quá trình chế biến và bảo quản rau quả Trong môi trường có

nồng độ muối, đường thích hợp vi khuẩn lactic phát triển mạnh sinh ra một lượng lớn axit lactic, làm pH môi trường ngã về axit ức chế các vi khuẩn

gây thối rau qua Sản phẩm tạo thành sẽ có vị mặn, chua, thơm, kích thích

in ngon miệng, dễ tiêu hóa đồng thời bảo quản được rau quả lên men trong

tự nhiên.|4|

Trong sản xuất công nghiệp người ta sử dụng chủng chống thuần

khiết Nhân giống trong môi trường nước ép rau cải sau đó cho lên men,

Trang 20

Luận văn tốt nghiệp CBHD: TS Trén Thanh Thủy

hiệu quả lên men cao, chất lượng sản phẩm tốt, nâng cao năng suất qui mô

công nghiệp.{ I8|

12.5 TRONG NÔNG NGHIỆP:

Trong đất, vi khuẩn lactic sử dụng đường và các nguồn hydratcabon được tạo ra bởi các nhóm vi sinh vật khác để tiến hành lên men tạo thành

acid lactic Lượng axit sinh ra tạo pH thích hợp cho sự hoạt động của nhóm

sinh vật có lợi trong đất đặc biệt là hệ sinh vật lên men đường, tăng cường

nhanh sự phân giải các chất hữu cơ Chúng tham gia tích cực vào quá trình

chuyển hóa các chất khó phân giải như polisaccharit (nh bột),

hemicellulose (xylan)

Vi khuẩn lactic góp phần vào việc tiêu điệt các sinh vật gây hại cho

cây trồng Chúng có thể ức chế sự phát triển của nấm Fsaricwm- một loại

nấm gây bệnh quan trọng trong nông nghiệp Tham gia vào việc cải thiện môi trường đất bằng cách lên men tạo ra mùi thơm dễ chịu cho đất.{ I8]

Vi khuẩn lactic được ứng dụng rộng rãi trong việc ủ chua thức ăn dùng trong chăn nuôi gia súc Nhờ ủ chua mà thức ăn có thể giữ được khá lâu ở trạng thái tươi, không những sản phẩm không bị hao hụt mà còn được

tăng cường hàm lượng dinh dưỡng Bởi lẽ trong quá trình lên men ngoài

lượng axit lactic được tạo thành chúng còn tạo ra một số sản phẩm khác có

giá trị như vitamin, chất thơm, chất kháng sinh (nizin, đilocaxen ) Từ đó

góp phần nâng cao hiệu quả trong chăn nuôi.[2],{4],[5]

1.3 VAI TRO VA KHẢ NĂNG SỬ DUNG VI KHUAN LACTIC TRONG CHE PHAM PROBIOTIC

1.3.1 KHAI QUAT VE PROBIOTIC:

Probiotic la tit cé6 nguồn gốc từ Ai Cập có nghĩa là sự sống Năm

074, Paket đã sử dụng từ này để mô tả các vi sinh vật đóng vai trò quan

trọng trong việc cân bằng vi sinh vật đường ruột Năm 1979, Fuller xác

định lại: *robiotic là một loại thức ăn có chứa vi sinh vật sống có tác dụng

Trang 21

Luận vấn tốt nghiệp CBHD: TS Tran Thanh Thủy

có lợi đối với động vật bằng cách cải thiện sự cân bằng của hệ sinh vật

đường ruột” Hiện nay probiotic của vi khuẩn lactic không chỉ sử dụng cho

con người mà còn sử dụng ở vật nuôi.|2]

Các vi khuẩn lactic được chọn sản xuất chế phẩm probiotic thường phải có các đặc điểm sau :

- Phổ kháng khuẩn rộng, ức chế được nhiều vi khuẩn gây bệnh cả vi khuẩn GŒ' lẫn G'

- Kháng với chất kháng sinh để có thể tổn tại trong đường ruột có

chất kháng sinh

- Chịu được nhiệt độ gắn với nhiệt độ của cơ thể người và động vật

- Sinh trưởng và phát triển tốt trên pH trung tính, pH trung tính là pH

có lợi cho việc tạo thành các chất kháng khuẩn

- Tạo sinh khối nhanh trong môi trường [ 17]

1.3.2 CO CHE KHANG KHUAN CUA VI KHUAN LACTIC:

Khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic là một tiêu chuẩn quan trọng để sử dụng chúng trong các chế phẩm probiotic Sở đĩ vi khuẩn có khả năng này vì trong quá trình sinh trưởng và phát triển chúng tạo ra một

số chất có khả năng ức chế các vi sinh vật gây bệnh như axit lactic, axit

axelc, ethanol, CO;, điacetyl, HạO; đặc biệt là bacferiocin [22],[7]

vi khuẩn lactic Axit lactic được cho là có khả năng kháng khuẩn khá tốt

nhờ khả năng làm axit hoá môi trường làm cho pH môi trường xuống dưới

4,5 pH thấp ảnh hưởng đến sự trao đổi chất, làm chậm sự tăng trưởng của các vi khuẩn khác dẫn đến tiêu diệt các vi khuẩn khác Axit lactic còn kìm

hãm sự hoạt động của FoF ATPase củng ảnh hưởng đến trao đổi chất

thuốc sát trùng Nó có khả năng kìm hãm cả những vi khuẩn G' như Pseudomonas lẫn vì khuẩn G° như Staphylococcus aureus

Trang 22

Luận văn tốt nghiệp CBHD: TS Tran Thanh Thủy © Diacetyl tc ché manh d46i véi vi khudn G va nấm mốc, đặc biét la d6i vai M turbeculosis

tế bào vi khuẩn

gây hỏng thực phẩm lên men cũng như không lên men Bacteriocin do vi

khuẩn lactic sinh ra là các phân tử protein mang điện tích dương, kích thước

nhỏ gồm 30 - 60 axit amin, có điểm điện cao và có khả năng ức chế các vi

khuẩn G” có quan hệ họ hang véi ching sinh bacteriocin, mét sé

bacteriocin c6 phổ kháng khuẩn rộng, có khả năng ức chế cả vi khuẩn G*

lẫn G Bacteriocin có mặt ở tấc cả các nhóm của vỉ khuẩn lactic , đặc biệt

là hai nhém Lactobacillus va Streptococcus.[ 14],|17],[27]

:

1.4.3 VAI TRO CUA VI KHUAN LACTIC TRONG CHE PHẨM PROBIOTIC:

~ Ở người:

Probiotic từ vi khuẩn lactic có tác dụng cân bằng hệ vi sinh vật

đường ruột, tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh, kích thích sự thực bào bởi các tế

bào bạch cầu ở biểu mô làm tăng cường hệ thống miễn dịch Làm thoái

hóa các khối u, giảm sự tạo thành các tác nhân gây ung thư thông qua việc

làm giảm các enzym f-glucuronidase, nitroreductase, azoreductase \a

những tác nhân hoạt hoá chất tiền ung thư thành chất gây ung thư.[7]

Ngoài ra probiofic còn có tác dụng giảm áp lực máu, giảm cholesterol huyết thanh, làm giảm chứng táo bón, tổng hợp axit amin, giảm hiện tượng di ứng.|27|

Trong phẩu thuật ở các bệnh viện nguy cơ bị nhiễm trùng do vi

khuẩn tụ cầu §aphylococcws aureus có thể xảy ra, làm hủy hoại mô Hậu

quả có thể gây nhiều chứng viêm nhiễm khác trên cơ thể người như viêm

Trang 23

Luận văn tốt nghiệp CBHD: TS Trần Thanh Thay

đa, viêm các mô xương, các mô mềm có thé de doa đến tính mạng Những hiện tượng viêm nhiễm này có thể được xử lý với việc sử dụng

Lactobacillus fermentum trong các ca phẩu thuật, cũng như các dạng thuốc khử trùng trong phẩu thuật.|26] Bang 1.2 Một số sản phẩm probiofie [28)(29)(30)(32]

Sản phẩm Nhà sản Ching vi Tác dụng Deng san

xuất xuất xứ khuẩn phẩm

Nestle, Chau | S thermophilus | Kích thchhệ | Thuốc bột

Auva My | L bulgaricus mién dich

L acidophilus

Cernitin | B breve Bình thường hoá | Thuốc

America, Mỹ | S thermophilus | ` hệ vi khuẩn viên

S feacium đường ruột nhộng

Bio 12 chủng ví Kích thích miễn | Thuốc Essential, | khudn lactic dich , tang viên

Nhật Bản cường sức khoẽ | nhộng

Vitaviva, | L acidophilus | Bình thường hoá | Thuốc Chau Au |S lactis hệ vi khuẩn viên

B bifidum đường ruột nhộng

Ở Việt Nam, chế phẩm probioric với sự phối hợp 3 chủng vi khuẩn

lactic la Streptococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium bifidum va các vi khuẩn khác có khả năng ngăn chặn các triệu chứng loạn khuẩn gây ra các bệnh về đường ruột như tiêu chảy thương hàn,

ta [12][28]

% Ở vật nuôi:

Sử dung probiotic trong chăn nuôi gia súc và gia cẩm mang lại hiệu

quả kinh tế cho người sản xuất Phần lớn các chế phẩm probiotic có sự có

Trang 24

mặt của vi khuẩn lactic không chỉ có tác dụng trong điều trị bệnh mà còn

nâng cao chất lượng sản phẩm và tận dụng tốt thức ăn

Một số nghiên cứu gần đây cho thấy thêm các chế phẩm

Lactobacterin, Bifidobacterium, Bifikol vao thifc 4n cho heo con không

những phòng ngừa các chứng tiêu chảy mà còn giúp tăng trong trung bình

khoảng 10 — 20% Cdn đối với gà broiler khi nhan thém Streptococcus

faecium ti thife An và nước uống thì trong lượng cơ thể cao hơn so với những con gà khác chỉ nhận những chất kháng vi khuẩn Một nghiên cứu khác của Mohan cho thấy trọng lượng của gà có thể tăng từ 5 — 9% khi gà được bổ sung 100mg/kg thức ăn các chế phẩm hỗn hợp L acidophilus, L

casei, B bifidum, Aspergillus oryzae Hiện nay ở Mỹ để tăng hiệu quả trong

chăn nuôi người ta bổ sung vào thức ăn của vật nuôi các chế phẩm vi

khuẩn lactic như Bacid, Dofus [2]

Ở Việt Nam, chế phẩm Biolactyl (L acidophilus) có hiệu quả trong

việc phòng trị tiêu chảy ở heo con và heo mẹ hiện đang được sử dụng rộng

rai Ché phdm Lactobac C (Lactobacillus, Enterococcus) phodng tri tiéu chay

cho nhiều vật nuôi như heo, bò, gà, vịt đồng thời còn kích thích vật nuôi

hay ăn chóng lớn giúp nâng cao hiệu quả kinh tế cho người chăn nuôi.[36]

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN VI KHUẨN LACTIC

Vi khuẩn lactic có thể được bảo quản bằng nhiều phương pháp

khác nhau:

% Hảo quản giống trên thạch nghiêng:

Phương pháp này đơn giản và được sử dụng khá phổ biến Ở phương pháp này các ống giống thạch nghiêng sẽ được bảo quản ở tủ lạnh ở nhiệt độ 4 - 6°C và được cấy chuyền định kì mỗi tháng một lần.{ I !|

Hảo quản giống trong dung dịch 40% glyxerin:

Các chủng ví sinh vật được nuôi cấy trong môi trường MRS dịch thể

ở 30°C Sau 18 giờ nuôi cấy, đem ly tâm dịch nuôi cấy tách lấy sinh khối

Trang 25

Luận văn tốt nghiệp CBHD: TS Trần Thanh Thủy Hoà tan sinh khối trong Iml dung dich 40% glyxerin da v6 trùng và giữ ở

-20°C trong các ống eppendorff vô trùng Phương pháp này cho phép bảo

quản chủng giống trong khoảng thời gian từ 3 — 10 năm.[7] + Bảo quản giống bằng phương pháp lạnh đông:

Phương pháp này dựa trên nguyên tắc ức chế sự phát triển của vi sinh vật bằng cách đưa chúng vào điều kiện lạnh sâu ở -25" đến -75C Trong phương pháp này để đảm bảo vi sinh vật không bị chết khi lạnh sâu,

sinh khối được trộn với các chất bảo quản như glyxerin 15%, huyết thanh

ngựa, dung dịch glucose hoặc lactose 10% Và việc làm lạnh cần tiến

hành từ từ đến -20°C thì tiếp tục làm lạnh với tốc độ I-2"C/phút Thời gian

bảo quản giống tuỳ thuộc vào nhiệt độ lạnh sâu [11]

+ Bảo quản giống bằng phương pháp đông khô:

Về nguyên tắc, cách giữ giống này giống với phương pháp lạnh đông, tức vi sinh vật sẽ được đưa vào nhiệt độ thấp ở t”= -60°C đến -70°C một cách từ từ với sự có mặt của chất bảo vệ như glutamat, sữa gầy

Điều khác biệt với phương pháp lạnh đông là: Dé đảm bảo an toàn

hơn cho sự sống của tế bào giống, người ta làm thăng hoa phan nước có

trong tế bào và môi trường có chất bảo vệ trong thiết bị đông khô ở điều kiện áp suất 1.10'mmHg Hỗn hợp giống và dung dịch bảo vệ được chứa trong các ống thủy tỉnh có ø = 10mm hay ø =l5mm được hàn kín để bảo đảm độ khô và chân không cần thiết

Phương pháp này được coi là phương pháp tối ưu, cho hiệu suất bảo quản cao nhất và thời gian bảo quản có thể lên đến hàng chục năm Bằng

phương pháp này người ta đã giữ được ching Streptococcus trong thời gian đài với tỉ lệ sống sót là 92%.,[ I I ].[9]

Trang 26

Luận văn tốt nghiệp CHHD: TS Trân Thanh Thủy

PHAN II

VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VAT LIEU

2.1.1 NGUYEN LIEU VA CAC CHUNG VI SINH VAT

- Nguồn phân lập : Chế phẩm Lactomin plus

- Các chủng vi sinh vật kiểm định có trong bộ lưu trữ của phòng thí

nghiệm vi sinh: Streptococcus sp, Bacillus subtilis, Enterococcus faecium,

E coli, B pimitilis, Salmonella typhimurium, S choleraesuis, Sarcina lutea, Serratia sp, Klebsiella, Shigella flexneri

- Các khdng sinh chuén : Kanamycin, Ceftazidime, Neomycin,

Nalidixic axit, Gentamycin, Ampicyllin, Tetracilne, Chloramphenicol 2.1.2 HOA CHAT % Thuốc thit uphenment: Phenol 5% : 10 ml FeCl, 5% :2ml Nước cất : 25 ml % Thuốc nhuộm Gram: + Tím gentian (tím kết tỉnh) Công thức :

| Gentian Violet : lg (3 Phenol đã tỉnh chế lại : 5g (1) © Rudu Etylic : 10ml Nước cất : 100ml

Cách pha chế: Dùng đũa thuỷ tỉnh khuấy cho gentian violet tan trong

rượu Trộn hai dung dịch (1) và (2) rồi lọc trong

+ Dung dịch lugol: { lốt tinh thé : Ig

KI : 2E

Nước cất : 300ml

Cách pha chế: Hoà KI trong 5ml nước cất cho tan hết rồi cho lốt tỉnh thể vào Bổ sung cho đủ 300ml nước cất sau khi lốt tan hết

Trang 27

Luận văn tốt nghiệp CBHD: TS Trần Thanh Thủy + Euchsin kiểm: m { Rượu Etylic 90” : 10ml, Fuchsin kiểm : 03g (2) { Phenol (axit phénic) : 5g Nước cất : 95ml Trộn hai dung dịch (1) và (2) rồi pha loãng 5 lần 2.1.3 THIẾT BỊ :

Tủ sấy MEMMERT (Đức), nổi khử trùng áp lực HUXLEY (Đài

Loan), tủ giữ mẫu VESTEROST REETECH, máy li tâm HETTICH (Đức),

máy đo pH WTW (Đức), kính hiển vi OLYMPUS (Nhật Bản), pipetman

NICHIGO (Nhật Bản), cân điện tử SATURIUS (Đức), máy quang phổ

SHIMADZU (Nhật Bản), kính hiển vi chụp hình OLYMPUS (Nhật Bản), kính hiển vi soi nổi OLYMPUS (Nhật Bản), máy đông khô VIRTIS (Hoa

Kỳ), tủ cấy vô trùng, ống nghiệm, pêtri, bình tam giác, que gạt.(Việt

Nam), má y liâm lạnh HETTICH (Đức)

2.1.4 MÔI TRƯỜNG NGHIÊN CỨU :

% Môi trường 1: Môi trường cacbonat agar

Dùng để phân lập vi khuẩn lactic, thành phần:

Glucose : 20g CaCO; :10¢g

Cao nấm men :5g Agar : 20 g Nước cất : 1000 ml

s% Môi trường 2: Môi trường MRS agar:

Dùng để nuôi cấy, giữ giống và nghiên cứu các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, thành phần:

Pepton : lÚg Natri acetat : 5g Amonium citrat : 2g Cao thịt : Og

Cao nấmmen : l0g Glucose : 10g

MgSO.7HO : 0.2g Tween 80 : Iml

Trang 28

Luận văn tốt nghiệp CHHD: TS Trần Thanh Thủy

MnSO,4HO : 0.1g Agar : 20g

K HPO, : 2g Nước cất : 1000ml

4 Môi trường 3: Môi trường MRS dịch thể

Dùng để nuôi cấy và nghiên cứu các đặc điểm sinh lí sinh hoá Thành

phần giéng MRS agar nhưng không có agar

s» Môi trường 4: môi trường nước cà chua

Nước cà chua : 400ml Glucoza : 10g

DungdịchA :5ml Cao nấm men : 10g

Dung dich B :5 ml

Dung dịch A: K;HPO;: 2.5g; KH;PO:: 2.5g; HạO: 250ml

Dung dịch B: MnSO,.7H;O: 10g; NaCL: 5g; FeSO¿.7H;O: 5g

Dùng 0.5kg cà chua thái nhỏ đun sôi với 0.5 lít nước trong 60 phút, lọc

lấy nước trong

% Môi trường 5: Môi trường nước chiết giá đậu:

Pepton : 5g Cao thit :8.5g

Trang 29

s Môi trường 8:

Glucose : 30g Pepton : 8g

Cao nấm men : 8g (NHySO, : lg K;HPO, : 4g Nuéccét : 1000mI

KH;PO, : L.Sg

s% Môi trường 9: Môi trường MPA

Dùng để nuôi cấy một số VSV kiểm định

Cao thịt r3g NaCl : Sg

Pepton : 10g Thach ‘15g

Nước cất : 1000ml 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 PHAN LAP Streptococcus sp05 TU’ CHE PHAM LACTOMIN PLUS

+ Phương pháp pha loãng mẩu:

- Cân 200ug Lactomin pÌus cho vào ống nghiệm chứa 9ml MRS dịch

thể, hoạt hoá trong 24 giờ ở 30°C

- Lấy Iml giống đã hoạt hoá cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất, lắc đều ta được độ pha loãng 10", Lấy 1 ml trong ống nghiệm này cho vào

ống nghiệm chứa 9 ml nước cất, lắc đều ta được độ pha loãng 10” Tiếp tục pha loãng như trên đến khi đạt được độ pha loãng cần thiết

% Gieo cấy trên thạch đĩa:

Chuẩn bị một số đĩa petri có chứa môi trường MRS agar vô trùng Ding pipet v6 tring hit 0,1 ml mẫu ở độ pha loãng cần thiết nhỏ vào giữa thạch, dùng que gạt vô trùng dàn đều trên khắp mặt thạch Mỗi độ pha

loãng cấy 3 đĩa Sau đó, úp ngược đĩa petri, bao gói các đĩa lại và nuôi ở

nhiệt độ 30C Sau 2 — 3 ngày có thể quan sát các dạng khuẩn lạc khác

Trang 30

nhau về hình dạng, kích thước, màu sắc và tính chất bể mặt Chọn khuẩn lạc riêng rẽ cấy sang môi trường cacbonat agar

“+ Kiểm tra khả năng sinh axit:

e Nguyên tắc: CaCO: sẽ bị tan khi tác dụng với axit Vì vậy, có thể

định tính khả năng sinh axit của chủng vi sinh vật dựa vào vòng trong suốt

xung quanh khuẩn lạc khi cấy chúng trên môi trường cacbonat agar,

e Phương pháp: Chuẩn bị các đĩa petri có chứa môi trường cacbonat

agar vô trùng Dùng que cấy đều nhọn trích ly các khuẩn lạc riêng rẽ khác

nhau trên MRS agar cấy sang môi trường cacbonat agar nuôi ở 30°C Sau 4

ngày thấy xuất hiện vòng trong suốt quanh khuẩn lạc Điều này chứng tỏ vi khuẩn trên có sinh axit

+ Kiểm tra khả năng sinh axit lactic:

e Nguyên tắc: Axit lactic khi tác dụng với phênol có trong thuốc thử uphenmen sẽ làm thuốc thử có màu xanh dương chuyển sang màu vàng

e Phương pháp: Dùng que cấy trích ly các chủng vi khuẩn có vong

phân trong suốt trên môi trường cacbonat agar cấy vào ống nghiệm chứa 10

mi môi trường MRS dịch thể, nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ 30°C trong 3 ngày Sau đó đem ly tâm 4000 vòng/phút để tách tế bào vi khuẩn, thu dịch trong

Tiến hành đồng thời 2 ống đối chứng và ống thí nghiệm:

- Ống thí nghiệm: 3 ml dịch nuôi cấy + 2 ml thuốc thử

- Ống đối chứng âm (ĐC) : 3 ml axit lactic nguyên chất + 2 ml thuốc

thử (có màu vàng trong suốt)

- Ong đối chứng dương (ĐC2): 3 ml môi trường MRS dịch thể không

cấy vi khuẩn + 2 ml thuốc thử (có màu xanh)

e Yêu cầu: Quan sát sự đổi màu thuốc thử, kiểm tra khả năng sinh

axit lactic

% Thuần khiết giống: Từ dạng khuẩn lạc có khả năng sinh axit

lactic, dùng que cấy lấy khuẩn lạc này hồ vào nước cất vơ trùng rồi nhỏ một giọt dịch lên đĩa petri có sấn môi trường MRS agar Dùng que gạt vô

Trang 31

trùng dàn đều trên mặt thạch đĩa thứ nhất, rồi thứ 2, thứ 3, Nuôi ở 30°C

trong 3 ngày Chọn những khuẩn lạc riêng rẽ cấy chuyển sang môi trường thạch nghiêng Tiếp tục kiểm tra độ thuần khiết bằng cách quan sát tiêu

bản giọt ép, nhuộm đơn, nhuộm Gram trên kính hiển vi với độ phóng đại

x 100

2.2.2.NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH LÝ, SINH HOÁ

2.2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái của chủng Streptococcus sp05 % Quan sát hình thái và đo kích thước khuẩn lạc:

e Nguyên tắc: Trên các môi trường tiêu chuẩn hình thành các dạng

khuẩn lạc đặc trưng cho loài

e Phương pháp: Chuẩn bị các đĩa petri chứa môi trường MRS agar

Dùng que cấy lấy một ít vi khuẩn hoà vào nước cất vô trùng và pha loãng với nỗng độ cần thiết

Dùng pipet vô trùng lấy 0,1ml dịch vi khuẩn nhỏ lên bể mặt môi trường MRS agar Dùng que gạt dàn đều dịch vi khuẩn trên mặt thạch

(thạch 1 lớp)

Tiến hành tương tự như trên nhưng sau đó đổ lên mặt thạch một lớp mỏng môi trường MRS agar đã tiệt trùng và để nguội đến 40°C (thạch 2

lớp) Sau đó để trong tủ ấm 30°C trong 2-3 ngày

e Yêu cầu: Quan sát hình thái khuẩn lạc, phân biệt sự khác nhau về

màu sắc, hình dạng , kích thước, tính chất bể mặt khuẩn lạc trên môi trường _MRS agar một lớp và hai lớp Hình dạng | Đường kính ` Màu sắc Bê mặt Mép

% Quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản sống:

e Phương pháp: Nuôi chủng vì khuẩn lactic trong MRS dịch thể ở 30°C trong 18 giờ Dùng que cấy lấy I giọt dịch vi khuẩn đặt vào lam kính

Trang 32

Đặt lamen lên giọt dịch thật nhẹ nhàng tránh tạo thành bọt khí Đưa tiêu

bản lên quan sát dưới kính hiển vi ở độ bội giác x40

e Yêu cầu: Quan sát hình thái vi khuẩn, sự sắp xếp tế bào, xác định

sự chuyển động của vi khuẩn (có hay không chuyển động)

% Quan sát hình thái tế bào trên tiêu ban nhuém Gram:

e Nguyên tắc: Dựa vào khả năng bắt màu của tế bào chất và màng

tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và lốt hình thành nên 2 loại phức chất

khác nhau:

- Loại phức chất thứ nhất: Vẫn giữ nghiên màu sắc của thuốc nhuộm nên không bị rửa trôi khi xử lý bằng cổn Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại Gram (+)

- Loại phức chất thứ hai: Không giữ được màu thuốc nhuộm nên mất

màu khi xử lý bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung

e Phương pháp: Nuôi cấy vi khuẩn lactic trong MRS dich thể ở

30"C trong 18 giờ Lấy một giọt dịch làm vết bôi và cố định vế bôi, sau đó

tiến hành nhuộm như sau:

- Đặt miếng giấy lên trên vết bôi

- Nhỏ thuốc nhuộm tím gentian lên trên giấy thấm trong một phút

- Nhuộm lugol trong một phút

- Tẩy bằng cồn trong 30 giây

- Rửa nước

- Nhuộm bổ sung Fuchsin từ 10-30 giây

- Rửa nước

- Làm khô và soi tiêu bản với vật kính dầu x 100

e Yêu cầu: Ghi nhận khả năng bắt màu Gram của vi khuẩn Kết quả

Trang 33

2.2.2.2 Thử hoạt tính catalase :

e Nguyên tắc: Vi khuẩn lactic là loài vi hiếu khí hoặc kị khí không

bất buộc nên hệ enzym không có catalaza là enzym oxi hoá H;O; thành HO và O; để giải độc cho tế bào Do đó khi thử bằng H;O; sẽ không có khí

O; bay ra Ngược lại đối với những loài vi khuẩn hiếu khí trong tế bào có

sự hiện diện của enzym catalaza do đó sẽ tạo ra khí O; khi thử bằng HO;

e Phương pháp: Nuôi chủng nghiên cứu trong MRS dịch thể ở 30°C trong 18 giờ Li tâm 3000 vòng/1phút để tách sinh khối tế bào từ dịch nuôi

cấy Sau đó nhỏ 1 giọt H;O; 3% lên sinh khối Quan sát và ghi nhận kết

quả

2.2.2.3 Quan hệ với nhiệt độ:

e Nguyên tắc: mỗi nhóm vi sinh vật có giới hạn nhiệt độ thích hợp

cho sự sinh trưởng và phát triển Chúng phát triển tốt nhất ở nhiệt độ thích

hợp và bị ức chế ở nhiệt độ không thích hợp

e Phương pháp: Chuẩn bị các nghiệm chứa 10 ml môi trường MRS dịch thể Cấy chủng vi khuẩn vào ống nghiệm và nuôi ở các nhiệt độ :

I5"C, 20°C, 25°C, 30°C, 35°C, 40°C, 45°C trong 4 ngày

e Yêu cầu: Quan sát mức độ sinh trưởng và phát triển dựa vào khả năng làm đục và làm thay đổi màu của môi trường của chủng vi khuẩn

nghiên cứu ở mỗi nhiệt độ

2.2.2.4 Quan hệ với pH:

e Nguyên tắc: Dựa vào khả năng sinh trưởng và phát triển tốt nhất

của mỗi loại vi sinh vật trong điều kiện môi trường có pH thích hợp

e Phương pháp: Chuẩn bị các ống nghiệm chứa I0ml môi trường MRS dịch thể Điều chỉnh pH môi trường bằng NaOH 1N hoặc HCI IN về

các giá trị: 3,5 ; 4,0; 4,5; 5,5; 6,0; 6,5; 7,5; 9,0; 9,5 (Chỉnh pH sau khi hấp

khử trùng) Cấy từng chủng vi khuẩn vào các ống nghiệm chứa môi trường

tương ứng với từng giá trị pH Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ 30"C trong 4 ngày

Trang 34

Luận văn tốt nghiệp CBHD: TS Trần Thanh Thủy eYêu cầu: Quan sát sự sinh trưởng phát triển của chủng vi khuẩn

lactic ứng với mỗi giá trị pH dựa vào độ đục của môi trường

2.2.2.5 Quan hệ với nồng độ muối:

e Nguyên tắc: Khả năng sống trong điều kiện môi trường có nông độ

muối cao là đặc trưng của vi khuẩn lactic

e Tiến hành: Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 10 ml môi trường MRS

có bổ sung NaCl 2%, 4%, 6%, 7% Cay ching vi khuan nghiên cứu vào các ống nghiệm nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ 30°C trong 4 ngày

e Yêu cầu: Dựa vào mức độ đục của môi trường đánh giá khả năng

phát triển của chủng vi khuẩn nghiên cứu trên các môi trường có nồng độ muối khác nhau

2.2.2.6 Khả năng lên men các loại đường

e Vguyên tắc: Căn cứ vào khả năng lên men và số loại đường tạo

thành axit lactic Sự có mặt của axit lactic sẽ làm thuốc thử phenol trong

môi trường màu đỏ chuyển sang màu vàng

e Phương pháp: Pha chế các môi trường lên men chứa các nguồn

hydrat carbon khác nhau: glucose, saccharose, mantose, lactose, sorbital,

dextrin, galactose Điều chỉnh môi trường hơi ngả về kiểm, dùng chất chỉ thị màu đỏ phenol Cấy chủng vi khuẩn lactic vào môi trường ứng với những nguồn hydrat carbon khác nhau Nuôi cấy tĩnh ở 30°C trong 4 ngày

e Yêu cầu: Quan sát khả năng sinh trưởng phát triển của chủng vi khuẩn, ứng với mỗi loại hydrat carbon dựa trên sự thay đổi màu sắc của

môi trường Nếu môi trường chuyển sang màu vàng, chứng tỏ có sự lên

men của vi khuẩn lactic

2.2.2.7 Xác định hàm lượng axit tổng

e Nguyên tắc: Xác định hàm lượng axít trong dịch nuôi cấy bằng

dung dịch kiểm chuẩn nhờ có sự thay đổi màu của thuốc thử

phenolphtalein

Trang 35

Luận văn tốt nghiệp CBHD: TS Tran Thanh Thủy e Phương pháp: Nuôi chủng vi khuẩn lactic trong môi trường MRS

dịch thể ở 37°C Thu dịch nuôi cấy tại các thời điểm Oh, 6h, 12h, 18h, 24h,

30h, 36h, 42h, 48h và đem chuẩn độ bằng NaOH 0,1N nhờ sự thay đổi màu

của thuốc thử phenolphtalein

e Cách tính: Độ axit được tính:

*T = số mi NaOH * 10

% Axit lactic = "T* 0,009

2.2.2.8 Khả năng axit hoá môi trường trong thời gian nuôi cấy

e Vguyên tắc: Khả năng sinh axit của chủng nghiên cứu khi nuôi cấy

trong môi trường xác định bằng sự giảm pH của dịch nuôi cấy so với pH

ban đầu của môi trường Độ pH được xác định bằng máy đo pH

e Phương pháp: Ching vi khuẩn lactic được nuôi cấy tĩnh trong môi

trường MRS dịch thể ở 37°C thu dịch nuôi cấy và đo pH tại các thời điểm

(0h, 6h, 12h, 18h, 24h, 30h, 36h, 42h, 48h dịch nuôi cấy được lấy ra để đo

độ pH

2.2.3 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG SINH BẰNG PHƯƠNG

PHÁP KHOAN LỖ THẠCH

Nguyên tắc: dựa vào sự khuếch tán của chất ức chế trong dịch nuôi

cấy vào môi trường thạch, chổ nào có chất ức chế khuếch tán nơi đó vi sinh

vật kiểm định không mọc được và tạo thành vòng vô khuẩn

Phương pháp khoan lỗ thạch cho phép xác định hoạt tính kháng sinh

của chủng nghiên cứu ở những thời điểm nuôi cấy xác định; vì thế, có thể so sánh hoạt tính của các chủng khác nhau cũng như của một chủng ở cùng một thời điểm nuôi cấy Bên cạnh đó, có thể dễ dàng điều chỉnh pH của dịch li tâm đem khử hoạt tính về pH trung tính , nên có thể dùng các vi

khuẩn không có khả năng chịu axit làm vi khuẩn kiểm định

Trang 36

Luận văn tốt nghiệp CBHD: TS Tran Thanh Thủy Hoạt tính kháng sinh được đánh giá bằng hiệu số D - d (mm) D là

đường kính vòng ức chế, d là đường kính lỗ khoan (d = 9mm) Hiệu số này

càng lớn, hoạt tính kháng sinh của chủng càng mạnh

Phương pháp biểu diễn theo sơ đổ sau:

* Chuẩn bị vi khuẩn lactic Ching vi khuẩn lactic | Nuôi trong MRS dịch thể (ở 30”C trong 18 giờ) * Chuẩn bị vi khuẩn kiểm định Các chủng vi khuẩn kiểm định |

Nuôi trong môi trường

MPA dich thé trong 18 gid : |

Trộn dịch nuôi cấy vi khuẩn kiểm định

vào MPA thạch chưa đông ở 40°C Đổ

Trang 37

Luận văn tốt nghiệp CHHD: TS Trần Thanh Thảy

22.4 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG VỚI MỘT SỐ LOẠI KHÁNG SINH ĐƯỜNG RUỘT CỦA Streptococcus sp05

e Nguyên tắc: Trên môi trường thạch, các chất kháng sinh có khả năng khuếch tán, ức chế các vi sinh vật và tạo ra xung quanh chất kháng

sinh vong vô khuẩn Những vi sinh vật nào có khả năng kháng với chất

kháng sinh thì có thể mọc thành khuẩn lạc

se Phương pháp:

- Hoạt hoá chủng Srepfococcus sp05 trong 24 giờ Rồi lấy một giọt dịch nuôi cấy nhỏ lên mặt thạch Dùng que gạt vô trùng dàn đều dịch khắp mặt đĩa

- Dùng gắp vô trùng lấy 3 mẩu giấy tẩm chất kháng sinh dán lên mặt

thạch Nuôi ở nhiệt độ 30°C trong 2 — 3 ngày Kiểm tra khả năng mọc của

ching Streptococcus sp05 xung quanh đĩa giấy kháng sinh chuẩn

2.2.5 NGHIEN CUU ANH HUGNG CUA CAC NHAN T6 MOI

TRƯỜNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIEN CUA CHUNG

Sfreptococcus sp0S

Nguyên tắc của máy đo mật độ quang : Vì sinh vật trong môi trường

nuôi cấy có thể vừa hấp thu hoặc phân tán ánh sáng làm cho ánh sáng

truyền suốt bị giảm Như vậy, số lượng ánh sáng được hấp thu hoặc phân tán có quan hệ tỉ lệ thuận với số lượng vi sinh vật trong dịch nuôi cấy

Phương pháp tiến hành:

- Hoạt héa ching Streptococcus spOS bing MRS dich thé ở 30°C

trong 24 giờ

- Lấy 3ml giống hoạt hóa cho vào bình tam giác chứa 150 ml dung

dịch môi trường nuôi cấy vô trùng Điều chỉnh mật độ quang ở bước sóng

61nm (OD,¿› )về giá trị 0.1

- Phân phối dịch đã chuẩn ODạs ra nuôi cấy ở các ống nghiệm 50ml

Nuôi cấy ở những điều kiện khảo sát

Trang 38

- Tiến hành thu mẩu và xác định mật độ quang 6 budc séng 610nm

(OD,„u) tại các thời điểm 0h, 6h, 12h, 18h, 24h, 30h, 36h, 42h, 48h

Mỗi thời điểm đo ít nhất 3 mẫu và lấy kết quả trung bình

2.2.5.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy:

- Tiến hành nuôi cấy chủng S/reptococcs.sp05 trong các môi trường dịch thể khảo sát ở 30°C với giá trị OD,,gban đầu bằng nhau

- Thu mẫu và đo OD,¡ạ từ các thời điểm 0h, 6h, 12h, 18h, 24h, 30h,

36h, 42h, 48h

- Từ đó xác định môi trường tối ưu cho việc nhân sinh khối

2.2.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ:

-Tiến hành nuôi cấy chủng Sreptococcus sp05 ở các nhiệt độ 25C, 30C, 35C, 40C, 45"C trên môi trường MRS dịch thể với giá trị OD,,sban

đầu bằng nhau và bang 0.1

- Thu mẫu và đo OD,uutại các thời điểm Oh, 6h, 12h, 18h, 24h, 30h,

36h, 42h, 48h

- Từ đó xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình nhân sinh khối

2.2.5.3 Ảnh hưởng của pH ban đầu:

- Môi trường MRS dịch thể được điều chỉnh pH ban đầu ở các giá trị

5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5

- Bổ sung ching Streptococcus sp05 a dude hoat héa sao cho gid tri

OD,» ban đầu bang 0.1

- Tiến hành thu mẫu và đo ODgip tai cdc thdi diém Oh, 6h, 12h, 18h,

24h, 30h, 36h, 42h, 48h

- Từ đó xác định giá trị pH ban đầu tối ưu cho sự nhân sinh khối

2.2.5.4 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy fĩnh và lắc:

- Nuôi cấy chủng $reptococcus sp05 ở hai điều kiện tĩnh và lắc (150

vòng/ phút) trên môi trường MRS dịch thể, giá trị OD,¡; ban đầu bằng 0.1

Trang 39

- Thu mẫu và đo OD,¡stại các thời điểm Oh, 6h, 12h, 18h, 24h, 30h, 36h, 42h, 48h

- Từ đó xác định điều kiện nuôi cấy tĩnh hay lắc 150 vòng/phút là tốt

hơn cho sự nhân sinh khối của chủng Streptococcus sp05

2.2.6 KIỂM TRA SỐ LƯỢNG VI SINH VẬT BẰNG CÁCH ĐẾM SỐ

KHUẨN LẠC MỌC TRÊN MÔI TRƯỜNG THẠCH

e Nguyên tắc : Trên môi trường đặc mỗi vi sinh vật hoặc bào tử đứng

riêng lẻ sẽ phát triển thành một khuẫn lạc Đếm số lượng khuẩn lạc có thể tính ra số lượng vi sinh vật trong mỗi đơn vị thể tích dịch nghiên cứu

® Phương pháp :

- Pha loãng dịch huyền phù ở các néng độ pha loãng khác nhau :10,

10°, 10°, 10"

- Dùng pipet vô trùng nhỏ 2 giọt dịch huyền phù vào mỗi đĩa thạch

- Dùng que gạt thủy tỉnh vô trùng dàn đều dịch khắp mặt thạch để

tách riêng từng tế bào

- Mỗi mẩu cấy 3 nổng độ liên tiếp Mỗi nổng độ cấy 3 đĩa Lấy kết

quả trung bình

- Nuôi ở nhiệt độ 30°C trong 3 ngày

- Đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên mỗi đĩa

s Cách tính :

Số lượng tế bào vi sinh vat trong 1 gam mau: Số tb / g mau = M.a.10*.N

M : Số khuẩn lạc trung bình trong một đĩa petri

Trang 40

Luận văn tất nghiệp CBHD: TS Trần Thanh Thủy

2.2.7 BẢO QUẢN VI SINH VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG KHÔ

e Nguyên tắc : Phương pháp đông khô là phương pháp làm thăng hoa

phần nước có trong môi trường nhũ hóa vi sinh vật ở điều kiện áp suất

thấp Đảm bảo tỉ lệ sống sót của vi sinh vật rất cao, các đặc tính di truyền

của vi sinh vật không vi sinh vật không bị biến đổi

e Phương pháp: Nuôi cấy chủng S!reptococcus sp05 trên môi trường

dịch thể cho tới pha log (18 giờ ) Cấy đếm trên môi trường MRS agar để xác định mật độ tế bào/ml Ly tâm để thu sinh khối cho vào ống bảo quản bằng thủy tinh đã chứa sẩn 2ml môi trường bảo quản, lắc đều Đậy kín lại,

để trong tủ lạnh ở -20” C, trong 30 phút Sau đó lấy ra cho vào thiết bị đông

khô khoảng 2 giờ, rồi đóng kín lại và bảo quản ở nhiệt độ 4 - 6°C hay nhiệt

độ phòng Sau đông khô hoạt hóa giống bằng môi trường MRS dịch thể ở

37°C trong 24 giờ Sau đó cấy đếm trên môi trường MRS agar Từ đó xác

định kha nang s6ng s6t cla ching Streptococcus sp05 sau bao quan

Định dạng
Số trang	70
Dung lượng	4,5 MB