Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái sinh lý sinh hóa của chủng nấm men saccharomyces sp2

Trang 1

KHOA SINH HỌC an

NGO MY YEN Dé tai:

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM HINH

THÁI, SINH LY, SINH HOA CUA CHUNG NAM MEN SACCHAROMYCES SP2

LUAN VAN TOT NGHIEP

NGÀNH: SINH HỌC CHUYEN NGANH: VI SINH

CBHD: TS TRAN THANH THUY

Trang 2

pm ml

Lei cam On

Luin odn tất nghiện duge hoan thanh, em xin chan thanh cam on:

® C7/iến si Tran Shank Thiiy - ein bd gidng day b¢ min

Vi Sink, khoa Sink hge, tnting Del hoe đư phạm ƠID.206/A, Ì , <6 da tan tink hudng dan, gitip dé od truyén dgt kink nghi¢m

=

|

oee

đại kọe

sinh , triting (Đại học Su pham SDP.WEM da tgo điêu kiện

giúp em hoan thank dé tai

nghiệm trong théi gian cing hee oà thye hign dé tai

Sink oién

on | a

Trang 3

Trang

KT SH uaaeeddaeenraaaaaanaaatearaueeegrseaeeoaagaeosre I

Phẩy ƒ: TỔNG QUẦN TALES ssid 3

1.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ NẤM MEN o - đ

1.2 MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA NẤM MEN 3

1.2.1 Đặc điểm hình thái, kích thước của nấm men 3

1.2.2 Cấu tạo của tế bào nấm rmen à< í sexcecsxrrserrerree „4 1.2.3 Thành phần hóa học của nấm men -5-s-5s5sse- wath 134 Phên Đại tank cies cise nine ọ 1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của NTP-——~_ vi 1.3 VAI TRÒ CỦA NẤM MEN TRONG ĐỜI SỐNG VÀ TRONG NÊN BÌNH TẾ Gái ae ca 13 1.3.1 Vai trò của nấm men trong công nghiệp thực phẩm 13

1.3.1.1 Sinh khối protetn đơn bào s ecerercve 13 1.3.1.2 Nấm men làm nd G8 ttt cccccceesecseescceeeseeessncensvesessnessneeeneenns 13 1.3.1.3 N&m men trong sản xuất rượu, bia L4 1.3.1.4 Nấm men trong sản xuất rượu vang - AS 1.3.2 Vai trò của nấm men trong chăn nuôi Ă 16 1.3.2.1 Bổ sung vào thành phần thưé ăn cho gia súc 16

1.3.2.2 Nấm men được sử dụng làm men gia súc 16

1.3.3 Vai trò của nấm men trong công nghệ di truyền 17

1.3.4 Vai trò của nấm men trong công nghệ dược phẩm 18

1.3.4.1 Vai trò của nấm men trong sản xuất vitamin Öò°Ö ⁄8 1.3.4.2 Nấm men được sử dụng làm cấm bổ - 19

1.3.4.3 Vai trò nấm men trong sản xuất chế phẩm probiotic 20

Phần II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

Trang 4

đồ 1 NHI HỒN ieccccccicictooiCiidoGbiodikbadioikicsaeg 23

4 7 Hếu th isi i a 23

ri, in Ô 23 31⁄4 Chis ah AME HH Gaeeeiieedaiieiỷeiiee ee 24 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỮU s5 S2 sen “587

2.2.1 Kiểm tra độ thuần khiết của giống « 27 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu các đặc điểm hình thái, đo kích

Cale OF ĐÀN 4106220 00G2G((GG002X6004/0002AAx-% 28

2.2.2.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc 5s 28

2.2.2.2 Quan sát hình thái tế bào nấm men 28

3.223 Đo kh thi Ñ bàês S2 29

2.2.3 Các phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa

ĐI NĂNG DGGH cac ky csniesseeeeeeeseeeoeonoeeesdeocsdiekorkiugintilAg0i6600L01 30 2.2.3.1 Quan sát hình thức nảy chồi ở tế bào nấm men 30 2.2.3.2 Quan sát khuẩn ty của nấm men - - „ 30

2.2.3.3 Quan sát nang bào từ của nấm men 31 2.2.3.4 Xác định khé ndng sit dung nitrat lam nguén nito

ies Wal Ah WU cies dasn a Senciineaanaiaaaa sine 2.2.3.5 Xác định khả năng phân giải urê của nấm men 33

2.2.3.6 Xác định khả năng lên men các loại đường 3.3

2.2.4 Chọn môi trường tối tu cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm men bằng phương pháp đếm số lượng tế bào bằng

khung đếm Thoma-(oridÊv -«« se serneterterrdstxaddsixrerkesee 34

2.2.5 Khảo sát sự ảnh hường của các yếu tố môi trường đến khả năng

tạo sinh khối của tế bào bằng phương pháp cân sinh khối tươi dS

Trang 5

men bằng phương pháp dùng đĩa kháng sinh chuẩn 36

2.2.7 Bảo quản nấm men bằng phương pháp đông khô 36 2.2.8 Xác định khả năng sống sót sau đông khô 37

Phần III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 32-s rECEttrrecErrrrcre 39

3.1 Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng

nấm men SqcChaFOITLVC€S.SD2 « coososessnen eo con nọ nơ nong non me 39 3.7.1 Các đặc điểm XỀNh thÁÍ.sss-s—- 2 G222 222 6= „39

3.1.2 Quan sát khuẩn ty nấm rtei co ccccessocvoeesrxree 40 3.1.3 Quan sát nang bào tử HẤTm !m€H «ằ se seo 41 3.1.4 Khả năng sử dụng nirat làm nguồn nìtơ duy nhất 4I

3.1.5 Khả năng phân giải urê 5 SÍ HH HH He reo 42 3.1.6 Khả năng lên men các loại đường, -. - 43 3.2 Chọn môi trường tối tu thu sitth KRG ccccssessessserssesvnessnceseessceeneenees -Ö-45 3.3 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến khả năng

tạo sinh khối của tế bào o «cv tạ 32211.2E1 0EE11 ecrrrre „50

3.3.1 Ảnh ưng của RNN sua keo kebiiiadeeeee=e==< $0

3.3.2 Ảnh hưởng của cường độ thơng khí <S- -Ư53 3.3.3 Ảnh hưởng của độ pH S -ecsrccrrrrrrrrreerrrirrrrrrsrre 55

3.4 Khảo sát khả năng kháng các kháng sinh của chủng nấm men

SGPCRGPGRRYDGSLENTCG426555 6 G6 kuHh SG GGGGGGS20GS63206623 cà ae

3.5 Bao quản nấm men bằng phương pháp đông khô 59

Btls FE BET TAN YÃBÊNGHỈxx«e=m==esse==mal 61

3 TR Baba scence cc cette 61

đ 2 ĐỂ NGÃ Q2 A0 uc A5222 0040 80002 ydak 61

Trang 6

CBHD: TS.Trần Thanh Thủy Luận văn tốt nghiệp

ĐẶT VAN DE

Nấm men là đại diện điển hình cho sinh vật nhân chuẩn Đã từ lâu, nấm men được biết đến như một công cụ không thể thiếu được trong

công nghiệp sản xuất cồn, các loại nước có rượu như: bia, vang, sâm

banh và các loại bánh mì.v.v Đến thế kỉ 19 nhà thực vật học Meyen

công bố công trình nghiên cứu phân loại đầu tiên về nấm men, trong đó ông mô tả và đặt tên giống là Saccharomyces và loài là cerevisiae Đến thế kỉ 20 nhờ những nghiên cứu sâu về cấu trúc phân tử các nhà khoa học đã tìm ra được nhiều đặc điểm mới về cấu tạo, thành phần hóa học,

đặc điểm sinh lý, di truyền của nấm men Các nhà khoa học đã có những nhìn nhận mới khi đánh giá nấm men trên nhiều phương diện, đặc biệt

nấm men ngày càng có nhiều ứng dụng mới vào hàng loạt những quy trình công nghệ tiên tiến

Từ những năm 60 của thế kỷ 20 nấm men thực sự trở thành đối

tượng quan trọng thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học bởi những đặc

tính hết sức quý báu hơn hẳn các sinh vật khác đó là: có khả năng lên men rượu rất mạnh, khả năng sinh trưởng và phát triển nhanh, vòng đời ngắn, có thể tạo sinh khối lớn Chúng có thể sử dụng nhiều nguồn phế liệu đơn giản rẻ tiển của nhiều ngành công nghiệp Hơn thế nữa, nấm men còn chứa hầu hết tất cả các chất cẩn thiết cho sự sống Trong đó,

đáng chú ý nhất là protein và vitamin với thành phần, hàm lượng phong

phú và có giá trị sinh học cao Từ nấm men, người ta còn có thể tạo ra

hàng loạt các chất có hoạt tính sinh học như: vitamin, enzim, acid amin, hoocmon sinh trưởng dùng cho người và động vật

Trang 7

cho nhân chuẩn, để nghiên cứu chức năng protein động vật, chức năng

một số gen ở thực vật

Trong vòng 20 năm trở lại đây, nấm men đã tạo ra một cuộc cách

mạng trong nghiên cứu sinh học phân tử giai đoạn hiện đại

Vậy từ quá khứ đến hiện tại và tương lai, nấm men luôn được chọn

là đối tượng điển hình xuất sắc trong nghiên cứu lý thuyết và những ứng dụng thực tiễn Để góp phần vào việc tìm hiểu, ứng dụng nấm men phục vụ đời sống, chúng tôi đã chọn cho mình để tài “ nghiên cứu một số đặc đểm hình thái sinh lý, sinh hoá của chủng nấm men

Saccharomyces.sp2” Hy vong rằng những kết quả nghiên cứu bước đầu

về chủng nấm men này sẽ là cơ sở cho những ứng dụng thiết thực trong chăn nuôi gia súc hiện nay và giúp tôi có cách nhìn mới hơn, day đủ hơn về giá trị toàn diện của nấm men

Mục đích của đề tài:

Nghiên cứu, tìm hiểu một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa làm cơ sở để chế tạo một chế phẩm probiotic và tìm ra môi trường tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của ching ném men Saccharomyces sp2

Nhiệm vụ của đề tài:

1 Tiến hành nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng nấm men Saccharomyces sp2

2 Tìm ra môi trường tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của

ching nam men Saccharomyces sp2

3 Nghiên cứu một số điều kiện tối ưu cho việc thu sinh khối của chủng nấm men Saccharomyces sp2

4 Tìm hiểu khả năng để kháng một số kháng sinh đường ruột 5 Bảo quản chủng nấm men trên bằng phương pháp đông khô

Trang 8

Phần I:

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.KHÁI QUÁT CHUNG VỀ NẤM MEN :

Từ lâu người ta đã biết tác dụng của nắm men về mặt sinh lý học

nhưng chỉ khoảng non 1 nửa thế kỉ trở lại đây, người ta mới bắt đầu tìm

hiểu về cơ chế tác dụng của nắm men và sử dụng chúng trong sản xuất và đời sống

Trước khi phân lập được, để hiểu tính chất và tác dụng của nắm

men, loài người đã biết dùng nắm men để làm rượu Nhưng mãi đến

cuối thế kỷ 19, ở châu Âu mới bắt đầu dùng các loại nấm men có khả

năng phân giải và sử dụng những phế liệu của công nghiệp, những phụ

phẩm của nông nghiệp Từ đầu thế kỷ 20, nắm men được dùng trong các

lĩnh vực: tạo sinh khối, sản xuất men gia súc, trong công nghiệp thực

phẩm Những ứng dụng này đã phát triển rất nhanh vì trong thành

phẩn nấm men gồm đẩy đủ các chất dinh dưỡng cẩn thiết cho cơ thể:

acid amin không thay thế được, các vitamin, các chất khoáng, các

nguyên t6 vi lượng Do đó, nấm men là một loại thức ăn bổ sung nguồn protid, góp phần giải quyết tình trạng thiếu protid trong khẩu phan

của người và gia súc

1.2.MOT SO BAC TINH SINH HOC CUA NAM MEN :

1.2.1 Đặc điểm hình thái, kích thước của nấm men:

Nấm men là loại vi sinh vật có cấu tạo đơn bào, không di động và

sinh sản chủ yếu bằng phương thức nảy chổi

Nấm men có dạng hình tròn, hình trứng như Saccharomyces

Trang 9

Saccharomyces apiculatus, đôi khi có hinh chai nhu Saccharomyces

ludwigii hoặc hình ống dai như Pichia Trong cùng một loài hình dạng tế bào cũng có thể thay đổi tùy thuộc vào điều kiện môi trường, điểu kiện nuôi cấy và tuổi của tế bào [15]

Nấm men có kích thước từ 3-5um thậm chí 25um Trong đó chiều

rộng tế bào thường là 3 -5um và chiểu dài là 5 —10um hoặc hơn nữa

Kích thước này cũng thay đổi tùy loài, giống và điểu kiện hoặc môi trường sống

Trên môi trường thạch Hansen khuẩn lạc nấm men thường có màu

trắng, nâu, đỏ hồng, cam, kem Kích thước khuẩn lạc to khoảng vài mm, bể mặt trơn nhắn, bóng ướt hay xù xì, khô Giữa khuẩn lạc nhô lên đều, phẳng hay lõm xuống [10]

1.2.2 Cấu tạo của tế bào nấm men :

Nấm men là cơ thể đơn bào nhưng cũng mang đẩy đủ tích chất của một cơ thể sống, chúng có cấu tạo gồm: thành tế bào, nguyên sinh chất,

nhân tế bào và một số bào quan khác

1.2.2.1 Thành tế bào:

Đây là lớp ngoài cùng của tế bào nấm men, chiếm khoảng 90% khối lượng khô của thành tế bào là hai hợp chất glucan và mannan, 10%

còn lại chủ yếu là protein và lipit Protein của thành tế bào nấm men (6 ~7%) thường liên kết vững chắc với phần glucid và tạo thành các phức chất giàu lưu huỳnh Trên thành tế bào nấm men có nhiều lỗ nhỏ, chất dinh dưỡng từ môi trường thấm vào bên trong tế bào và các sản phẩm

trao đổi chất từ tế bào thải ra ngoài qua các lỗ nhỏ có chọn lọc

Trang 10

CBHD: TS.Trẩn Thanh Thủy Luận văn tốt nghiệp

Thành tế bào có tác dụng bảo vệ hình dạng của tế bào nấm men,

duy trì áp suất thẩm thấu bên trong tế bào và góp phẩn điểu hòa quá trình trao đổi chất

1.2.2.2 Mang nguyên sinh:

Bên trong lớp thành tế bào là màng nguyên sinh chất, màng này có

cấu trúc tương tự như màng ở các vi sinh vật, động vật, thực vật Màng

nguyên sinh cấu tạo gồm phospholipit và protein, phospholipit chiếm 30- 40% trọng lượng màng tế bào còn các phân tử protein nằm xen kẽ trong lớp phospholipit kép Màng nguyên sinh chất ở nhiều nấm men có chiều

dày khoảng 75-80nm

Chức năng của màng nguyên sinh chất là chủ động điều khiển việc hấp thu các chất dinh dưỡng vào tế bào Ngoài ra, trên màng cũng có các

loại enzim thực hiện tổng hợp nên các cấu trúc của thành tế bào

1.2.2.3 Nguyên sinh chất:

Nguyên sinh chất của tế bào nấm men là một hệ thống ống keo cấu

tạo bởi protein, lipit, polysaccarit, muối khoáng và nước Nguyên sinh chất có độ nhớt khá cao (gấp 800 lần so với độ nhớt của nước), tùy thuộc

vào độ tuổi của tế bào: tế bào còn non có độ nhớt thấp hơn và nguyên sinh chất có cấu tạo đồng nhất hơn so với tế bào trưởng thành Khi tế bào càng già cấu tạo hạt càng xuất hiện nhiều đồng thời xuất hiện không bào, các thể vùi và nhiều cơ quan tử

#Ribôxôm: nấm men có hai loại ribôxôm đó là ribôxôm 80s tổn tại trong tế bào chất và ribôxôm 70s (gồm hai tiểu thể 40s và 30s) chứa

trong ty thể Ribôxôm chứa 40-60% ARN và phẩn còn lại là protein

Trong tế bào chất một phần ribôxôm (80s) tổn tại tự do, phần khác gấn

Trang 11

Chức năng của ribôxôm là nơi tổng hợp protein cho tế bào

#T7y thể: có cấu tạo đa hình (sợi, hạt, phân nhánh), có nhiều trong

tế bào với kích thước, hình dạng, số lượng, vị trí khác nhau trong những điều kiện sinh trưởng khác nhau Ty thể được bao bọc bởi hai lớp màng

cấu tạo bởi protein, lipit và trên có vô số các hạt nhỏ gọi là hạt cơ bản

(oxixom) Đặc biệt trong ty thể có chứa ADN, ribôxôm 70s, các ARN và

một số enzim

Chức năng của ty thể là thực hiện các phản ứng oxi hóa, chuyển

điện tử phục vụ cho việc tổng hợp ATP, tham gia giải phóng năng lượng

cung cấp cho tế bào sử dụng, tổng hợp protein, phospholipit, acid béo và

một số enzim [15]

+Khéng bào: trong mỗi tế bào nấm men có một không bào khá lớn hoặc nhiều không bào nhỏ Không bào chứa đẩy dịch tế bào gồm các chất hữu cơ ở trạng thái keo (protein, lipit glucid, enzym) và các chất

điện phân ở dạng hòa tan (Na, K, Ca, Mg, Cl, SO,, PO,)

Không bào có chức năng điểu hòa áp suất thẩm thấu trong tế bào,

là nơi xảy ra các quá trình oxi hóa khử và là nơi tích lũy nhiều chất dinh

dưỡng dự trữ khác nhau

Chất dự trữ: glycogen là hạt hydratcacbon dự trữ khi môi trường

thừa đường, voluun là hạt protein đự trữ, hạt lipit dự trữ

1.2.2.4 Nhân tế bào :

Mỗi tế bào nấm men có một nhân hình tròn hoặc hình bầu dục, bao

ngoài nhân là màng nhân Trong màng nhân là chất dịch nhân, hình dạng

và kích thước của nhân có thể thay đổi tùy thuộc tuổi và trạng thái sinh

lý của tế bào, trong các tế bào đang hoạt động mạnh nhân có kích thước

Trang 12

khá lớn Nhân của nấm men cấu tạo bởi protein, ADN, ARN và nhiều

enzym khác nhau

Nhân quyết định tính di truyền và tham gia điểu khiển tất cả mọi hoạt động sống của tế bào nấm men

1.2.3.Thành phần hóa học của nấm men:

Protit: 44-54%, glucid: 25-35%, lipit: 1,5-5%, các chất chiết suất suất vô đạm 22-40%, các chất khoáng 6-12%, các vitamin nhóm B,

vitamin H, vitamin D; Thanh phan hóa học của nấm men rất khác nhau

và tùy thuộc vào giống, vào nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất chúng Kết quả nghiên cứu của B.Bauer cho thấy trong nấm men khô có những chất dinh dưỡng sau :

Bảng 1.1: Thành phần dinh dưỡng của một số loài nấm men (%) [20]

Các chất Men Bia | Men Men gia Mentrén ' Men trên

dinh dưỡng Rượu |súc dung dich | dịch thủy

kiểm sunfit | phân gỗ Protit 53 48 49 41 46 Lipit 4 2 5,5 1,5 1,5 Khoáng 1 8 7 12 7 đương lượng Tỉnh bột 72 73 80 44 70

Trong thành phần khoáng của nấm men K: 23-29%, Ca: 1-7%, còn

lại là những nguyên tố vi lượng (Fe, Mg, Na, S, Cu, Mn ,Co) Những công trình nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy giá trị dinh dưỡng của

nấm men khá khác nhau Dưới đây xin giới thiệu thành phân acid amin

Trang 13

Bảng 1.2: Thành phần acid amin của một số nòi nấm men (%) [20]

Men lúa Men Mengia | Men trên | Men trên

Acid amin bánh mì súc | địch kiểm | dịch thủy sunfit phân gỗ Alanin 4,80 442 5,78 8,09 6,64 Arginin 2,60 1,43 2,33 1,40 1,40 A.asparaginic 5,60 5,60 3,97 1,20 1,27 Xistein 0,74 0,61 0,54 0,36 0,36 Acid glutamic 10,60 8,50 6,74 5,32 5,32 Histidin 1,76 1,39 1,19 0,42 0,40 Glicin 3,15 2,76 2,10 2,10 Lizin 3,53 3,30 3,11 1,52 2,52 Metionin 1,05 1,12 0,60 0,60 0,65 Phenylalanin 2,29 2,23 2,01 2,44 2,56 Prolin 2,08 1,82 1,59 1,90 4,16 Treonin 3,26 2,49 2,50 4,28 4,20 Tryptophan 0,82 0,74 0,68 0,75 0,70 Tirozin 2,09 2,23 2,77 1,70 Xérin 1,89 2,21 2,20 2,20 Valin 3,23 3,21 3,30 5,06 Leuxin 3,83 3,29 3,80 3,40 1zoleuxin 2,76 2,45 3,70 1,30

Số lượng acid amin có trong nấm men tương đối phong phú (18/20

loại acid amin) điều đáng chú ý là sự có mặt của các acid amin không thay thé: xistein, lizin, methionin, treonin, tryptophan

Trang 14

CBHD: TS.Trần Thanh Thủy Luận văn tốt nghiệp Về trữ lượng acid amin không thay thế, nấm men rất gần với protit

động vật Về giá trị dinh dưỡng nấm men không thua kém bột cá, bột

thịt, bột thịt - xương

Ngoài protit, lipit, glucid nấm men còn chứa rất nhiều loại vitamin

nhóm đặc biệt là vitamin B [20] 1.2.4 Phân loại nấm men:

Từ trước đến nay có nhiều khóa phân loại nấm men của nhiều tác

giả khác nhau Trong đó, khóa phân loại thường hay dùng nhất cho đến nay là của Lodder Ông đã tổng kết lại một cách khá hoàn chỉnh vấn để

phân loại nấm men, theo Lodder, 1971

Nấm men được chia thành 39 giống:

I Nấm men hình thành nang (túi): gồm 22 giống là Citeromyces,

Debariomyces, Coccidiascus, Dekkera, Endomycopsis, Hanseniaspora, Hansenula, Kluyveromyces, Lipomyces, Lodderomyces, Metschuikowia, Nadsonia, Nematospora, Pachysolen, Pichia, Saccharomyces,

Saccharomycopsic, Schizosaccharomyces, Schwanniomyces, Wickerhamia va Wingea

2 Các giống nấm men giả thuộc b6 Ustilaginales gm 2 gidng 1A

Leucosporidium và Rhodosporidium

3 Các giống nấm men giả thuộc họ Sporobolomycetaceae gồm 3

giống là 8ullera, Sporidiobolus và Sporobolomyces

4 Các giống nấm men không sinh bào tử, không thuộc họ Sporobolomycetaceae gém 12 giống là Brellanomyces, Candida,

Trang 15

Tất cả nấm men là vi sinh vật dị dưỡng, chúng phát triển trên

nhiều hợp chất hữu cơ và một vài chất khoáng Nấm men trao đổi chất theo phương thức kị khí không bắt buộc, trong điều kiện có không khí chúng chuyển hóa đường để cung cấp năng lượng cho cơ thể, trong điều kiện không có oxi thì xảy ra hiện tượng lên men để chuyển đường thành rượu và các sản phẩm khác [22] Phần lớn nấm men dùng trong công

nghiệp thuộc lớp Ascømyceres, đa số thuộc chỉ $accharomyces, chỉ này gồm 41 loài và có những đặc điểm sau: tế bào có hình cầu, hình elip,

hình ống, hình kéo dài Chúng sinh sản vô tính theo cách nẩy chổi có thể nẩy chổi đa cực hoặc đơn cực, có khuẩn ty, không tạo váng, có hoặc không có khuẩn ty giả, có 1-4 bào tử túi hình cẩu, hình cầu dài- elip Khuẩn lạc có dạng bột nhão, hơi bóng, tất cả các loài đều có khả năng

lên men mạnh [2] Chúng có khả năng phân giải kị khí các loại đường

khác nhau, có thể sử dụng nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ nhưng khơng có

khả năng đồng hố nitrat [4]

Nấm men thuộc giéng Saccharomyces c6 nhiéu ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm như: Saccharomyces elipsoideus trong sản xuất rượu vang, $accharomyces oviformis trong sản xuất cồn,

Saccharomyces caribergensis và Saccharomyces cerevisiae trong sẵn xuất

bia, Saccharomyces cerevisiae làm nở bột mì Ngoài ra còn có loài

Saccharomyces boulardii hiện nay đang được nghiên cứu rộng rãi và có nhiều ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm, công nghệ di

truyền và đặc biệt trong công nghệ dược phẩm

$accharomyces boulardii là một loài nấm men có nguồn gốc phân

lập từ trái vải ở Indochina vào năm 1920 Ti nam 1962, nó được sử dụng

rộng rãi ở một số nước Châu Âu để điều trị bệnh tiêu chảy cho người Ở

Trang 16

Mỹ, người ta dùng nó làm thuốc để chữa trị cho những bệnh nhân bị tổn

thương hệ vi sinh vật đường ruột do sử dụng kháng sinh trong một thời gian dài Đây là chủng nấm men không gây bệnh, có hoạt tính sinh học

cao, trung hòa được các độc tế đường ruột do cơ thể nhiễm khuẩn Vibrio cholera, E.coli không bến nhiệt Chủng này có khả năng hạn chế sự

phát triển căn bệnh tiêu chảy do sử dụng kháng sinh bừa bãi [21]

Nấm men Saccharomyces boulardii ngăn chặn độc tế của vi khuẩn

Gram dương Cotridium difficile bằng cách tiết protease phân giải độc tố

của vi khuẩn nói trên Hiện nay, trên thị trường Châu Âu đã xuất hiện

thuốc mang nhãn hiệu “Saccharomyces boulardii ” có tác dụng điều tri

bệnh tiêu chảy [24]

1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của nấm # Nhiệt độ: nấm men có thể phát triển trong điều kiện nhiệt độ từ 20-40°C, và mỗi chủng nấm men thích ứng với một nhiệt độ khác nhau nhưng nói chung nhiệt độ tối thích cho sự phát triển của nấm men khoảng 28-30°C Nấm men chỉ có thể chịu nhiệt độ thấp nhất là 4 - 10C Nhiệt độ càng cao cũng làm ức chế sự sinh trưởng và phát triển

của nấm men, tuy nhiên một số loại nấm men nhu Saccharomyces

boulardii lại phat triển ở điều kiện nhiệt độ từ 35-37°C vi vậy chúng có

thể tổn tại được trong cơ thể người [21] Dựa vào đặc điểm này, các nhà

khoa học đã sử dụng chúng bổ sung vào hệ vi sinh vật đường ruột nhằm

góp phần cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột

+ pH: néng độ ion HỶ của môi trường có ảnh hưởng đến hoạt động

Trang 17

keo ở thành tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu của chất dinh

dưỡng Do đó, mỗi chủng nấm men thích hợp với một độ pH thích hợp

Mặt khác, mức độ hấp thu chất dinh dưỡng vào tế bào, hoạt động

của hệ thống enzim tham gia vào sự tổng hợp protein, tạo vitamin của

nấm men đều tuỳ thuộc vào độ pH của môi trường [ 16]

# Thông khí: trong quá trình nuôi nấm men, cần thiết giữ cho dịch

men liên tục bão hoà oxi hoà tan Ngừng cung cấp oxi trong 15 giây sẽ

gây nên tác dụng "âm” trên hoạt động sống của nấm men Oxi khí quyển chuyển vào tế bào nấm men qua 2 giai đoạn:

_ Hoà tan oxi đến dạng lỏng

_ Hấp thu oxi hoà tan vào tế bào

Lượng oxi rất cần thiết cho giai đoạn tăng sinh khối nấm men { 12]

* Thành phần dinh dưỡng: thành phần dinh dưỡng của môi trường ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm men

Hàm lượng đường: nỗng độ đường ảnh hưởng trực tiếp đến tế bào nấm men Nồng độ đường thích hợp nhất cho sự sinh trưởng — phát triển

của nấm men 10-20% Khi nồng độ đường đạt 35-40% sự sinh trưởng -

phát triển của nấm men gần như đình chỉ

Hàm lượng đạm: nitrogen tham gia trong các thành phần cấu trúc

nên tế bào vi sinh vật, giúp tế bào hoàn thiện được mọi chức năng của

hoạt động sống Do vậy trong quá trình sinh trưởng, nấm men cần đựoc

cung cấp nguồn nitrogen để tạo thành nhóm amin (-NH;), nhóm imin

(-NH-) trong các phân tử acid amin, các nucleotit purin và pirimidin,

trong nhiều vitamin và một số hợp chất khác

Muối khoáng và vitamin: muối khoáng là nguồn nguyên liệu cần

thiết để nấm men xây dựng cấu trúc tế bào, hoạt hoá các enzim, là tác

Trang 18

nhân gây ra các phản ứng sinh hóa Các nguyên tố khoáng chủ yếu là: S,

P, Mẹ, Fe, Ca, Zn, Na, K, Cl, SO,Ÿ giúp ổn định sự sinh trưởng và phát

triển của nấm men Vitamin có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của nấm men, đặc biệt là các vitamin nhóm B (BI, B2, B6),

Biotin, PP [ 10}

1.3 VAI TRO CUA NAM MEN TRONG ĐỜI SONG VA

TRONG NEN KINH TE:

13.1 Vai trò của nấm men trong công nghiệp thực phẩm: 1.3.1.1 Sinh khối protein đơn bào:

Trong các nguồn protein sản xuất bằng con đường vi sinh vật, nấm

men là loại được nghiên cứu sớm nhất và đến nay đã được áp dụng rộng

rãi ở nhiều nước Con người đã sử dụng nấm men và các sản phẩm của

hoạt động sống của chúng từ hàng ngàn năm nay Trong tế bào nấm men

hầu như chứa tất cả các chất cần thiết cho sự sống Về mặt dinh dưỡng,

nấm men rất giàu protein, vitamin, đặc biệt là vitamin nhóm B

Sinh khối nấm men chứa khoảng 75 80% nước, 20 -25% vật chất

khô trong đó Carbon 45 50%, Nitơ 7 ~10% (tương ứng 40 -60%

protein), Hydro 5-7%, Oxi 25 ~30%, các nguyên tố vô cơ: 5 —10%

Phospho và K chiếm 95 —97% tổng lượng tro, số còn lại là Ca, Mg, AI, S,

Cl, Fe ngoai ra còn một lượng nhỏ Mn, Zn, Mo, Bo, Co

Nấm men được sử dụng để sản xuất protein đơn bào quan trọng nhất là nim men Candida utilis, Candida tropical va Saccharomyces

cerevisiae [3]

1.3.1.2 Nấm men làm nở bột mì :

Trang 19

cerevisiae Trong công nghiệp, người ta tuyển chọn những chủng nấm

men có một số đặc tính sau đây: có khả năng nở bột tốt làm khối bột

nhào nhẹ và xốp, dễ hòa với nước, có đặc tính sinh hóa ổn định và độ

bén vững tốt (không bị tự phân dễ dàng) [12] Có khả năng sinh sản

nhanh và cho năng suất cao trong quá trình lên men Hiện nay ở Việt

Nam, chúng ta đã tuyển chọn được một số nấm men bánh mì đáp ứng

với các chỉ tiều trên cho năng suất sinh khối khá cao, thích hợp để sản xuất trên môi trường rỉ đường mía Men bánh mì có thể phát triển tốt

trong môi trường có nguồn carbon là glucose, mantose, saccarose, nhưng trong công nghiệp thường dùng rỉ đường mía hoặc rỉ đường củ cải để sản

xuất sinh khối nấm men

1.3.1.3 Nấm men trong sản xuất rượu, bia :

Theo phương pháp cổ điển, rượu được lên men từ các dịch đường nhờ các nòi nấm men trong điều kiện kị khí Nguyên liệu dùng trong sản

xuất rượu là các loại ngũ cốc: sắn, khoai tây, rỉ đường, các loại nước quả

và gỗ Ngoài sản phẩm chính là cồn etylic trong quá trình lên men còn

tạo thành khí CO¿, glycerin, một vài loại cồn bậc cao, aldehyt, các acid hữu cơ và sinh khối nấm men tích tụ đồng thời với sự hình thành các sản

phẩm [13]

Trong sản xuất rượu, người ta thường dùng các loài nấm men thuộc

giống Saccharomyces cerevisiae

Bia là một thứ đổ uống có độ rượu nhẹ và có tính giải khất cao, được toàn thể loài người ưa chuộng Có nhiều nước sản xuất và tiêu thụ

bia ở mức 140 —160 líƯnăm cho một đâu người, ở nước ta mức độ này

khoảng 5 —8 lit

Trang 20

Thành phần của bia gồm có §0 -90% nước, 1,5 -7% cổn, 3-10% chất hòa tan, 0,3-0,4% CO¿; Chất hòa tan chủ yếu là hydratcacbon

(dextrin, maltoza, glucoza, và pentoza), các protein và sản phẩm thủy phân của nó (albumoza, pepton, các acid amin), các chất khoáng, các

vitamin và các chất đắng, chất thơm của hoa houblon

Trong sản xuất bia thường dùng các loài men chìm thuộc giống

Saccharomyces carlbergensis C6 khi cũng dùng loại men nổi thuộc giống saccharomyces cerevisiae Men chìm dùng để sản xuất các loại bia

sắng màu còn men nổi chỉ dùng sản xuất các loại bia thẫm màu

1.3.1.4 Nấm men trong sản xuất rượu vang:

Khác với rượu trắng và các loại rượu pha chế, rượu vang là loại đồ

uống lên men trực tiếp từ nước quả Khi quá trình lên men kết thúc, người ta không chưng cất mà để lắng tự nhiên, gạn lọc và hoàn thành sản phẩm Rượu vang vốn có nguồn gốc từ quả nho, nên có tên gọi là

“vin “ hoặc “wine”, ngày nay người ta mở rộng ý nghĩa của rượu vang là

rượu không chưng cất từ các loại nước quả Sản xuất rượu vang dựa trên

cơ sở các quá trình hóa sinh xảy ra trong quá trình lên men các loại nước

quả dưới tác dụng của enzim nấm men

Nấm men tham gia lên men rượu vang: theo dõi quá trình lên men ở nhiều nơi một cách tự nhiên thấy rằng một vài ngày đầu các men đại

hình thoi đầu nhỏ hoặc hình chùy (Kloeckera) chiếm ưu thế (70-80%

trong tổng số nấm men) Sau đó, các nấm men hình elip hoặc ovan

(Saccharomyces ellipsoideus) nhanh chóng phát triển gây lên men mạnh,

lượng đường tiêu hao nhanh và tích tụ cồn etylic Khi độ cồn tương đối

Trang 21

phát triển và hoạt động, khi ấy nấm men chịu cén Saccharomyces oviformis tiếp tục lên men cho đến khi kết thúc

1.3.2 Vai trò của nấm men trong chăn nuôi:

1.3.2.1 Bổ sung vào thành phần thưé ăn cho gia súc:

Nấm men gia súc lần đầu tiên dược sản xuất ở Đức vào khoảng những năm 80 của thế kỉ trước Năm 1968, Liên Xô là nước đầu tiên xây dựng nhà máy sản xuất nấm men từ parafin dầu mỏ Sau đó Anh, Pháp, Nhật tiến rất nhanh trong lĩnh vực sử dụng nguồn nguyên liệu dồi dào

và rẻ tiền này vào mục đích thu nhận protein của nấm men và đã đưa

sản lượng nấm men trên thế giới ngày càng tăng, riêng 4 nước: Anh,

Pháp, Nhật, Italia trung bình hàng năm trên thế giới từ 1976-1980 lượng

nấm men đã sản xuất là 750.000 tấn

Các giống nấm men thường được dùng làm thực phẩm cho người và thức ăn gia súc là: Endomyces vernalis, Hansenula jadimi, Saccharomyces cerevisiae, Candida arbores, Candida tropicalis, Mycotorula lipolitica, Mycotorula japonica, Torulopsin puicherima, Torulopsis utilis var

thermophilis, Monilia candida, Oidium lactis Trong 46 giéng Candida,

Saccharomyces va Torulopsis duigc ding nhiều hơn cả vì chúng có khả

năng chuyển hóa cao, tạo nhiều sinh khối và sinh khối có nhiều chất

dinh dưỡng có giá trị [20]

1.3.2.2 Nấm men được sử dụng làm men gia súc:

Thuật ngữ: “men gia súc” được nêu lên trong các nghiên cứu từ rất sớm của Max Delbruck và các cộng sự của ông Ngoài việc sử dụng rỉ

đường, dịch kiểm sunfit, n-ankan để làm nguồn cacbon nuôi cấy men gia

súc, người ta còn sử dụng cả etanol, tính bột, sữa phụ phẩm, metanol và

xenluloza

Trang 22

Các chủng nấm men được sử dụng thường thuộc các loài sau đây: Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Candida utilis, Candida arborea, Endomycopsis fibuligera, Hansenula anomala, Saccharomyces

fragilis, Pichia lidnerii (20)

1.3.3 Vai trò của nấm men trong công nghệ di truyền [11]:

Nấm men được sử dụng làm vector chuyển tải gen trong công nghệ

di truyền

_ Chuyển ADN tái tổ hợp vào tế bào nấm men: ADN rất dễ đưa vào tế bào nấm men, muốn vậy phải phá vỡ thành tế bào nấm men bằng

phương pháp enzim khi đó người ta thu được spheroplast Spheroplast sẽ được trộn chung với ADN, CaCl;, polyetylenglycol Loại rượu này sẽ tạo

điểu kiện cho ADN vào tế bào Sau đó spheroplast sẽ được nuôi trong môi trường thạch, Trong môi trường này tế bào sẽ hồi phục lại thành tế

bào

_ Nạp gen của tế bào nấm men vào £.coli: người ta cho biết rằng

30% gen của tế bào nấm men có thể thực hiện chức năng của mình trong tế bào E.coli ADN của nấm men có thể tạo dòng ở plastmit và các

plasmit này sẽ được chuyển sang vi khuẩn Khi người ta thu nhận được

spheroplast từ nấm men và ta tiến hành nhận ADN từ một chủng E.coii

đột biến ta sẽ thu được một plasmit hỗn hợp chứa thông tin di truyền của E.coli đột biến và của cả nấm men Plastmit này có thể được chuyển

sang tế bào E.cøii và cũng có thể chuyển sang tế bào nấm men

_ Plasmit của nấm men và sự xâm nhập ADN: Plasmit của tế bào

Trang 23

bằng phương pháp trao đổi chéo với nhiễm sắc thể của tế bào nấm men

(một đoạn ADN cho và nhiễm sắc thể của tế bào nấm men)

Nếu ADN ở dạng vòng thì hiện tượng trao đổi chéo rất ít xảy ra

(tần số 1/triệu) ngay cả khi kích thước của chúng chỉ 10 kb Trong trường

hợp plasmit chui vào được spheroplast mà nó tách ra từng đoạn thì tần số

trao đổi chéo với tế bào chủ sẽ tăng gấp 100 lần Như vậy muốn thâm nhập được vào nhiễm sắc thể của nấm men ADN (plastmit) của cơ thể

cho phải được cất đoạn Việc chuyển thông tin di truyền từ tế bào cho

vào tế bào nấm men là quá trình tái tổ hợp đồng nhất

1.3.4 Vai trò của nấm men trong công nghệ dược phẩm: 1.3.4.1 Vai trò của nấm men trong sẵn xudt vitamin:

Hiện nay, vitamin được tổng hợp bằng hai con đường cơ bản: tổng

hợp hóa học và tổng hợp sinh học Các vitamin được sản xuất bằng tổng hợp hóa học chiếm wu thé trong các loại vitamin có trên thị trường Số

lượng vitamin được sản xuất bằng công nghệ sinh học không nhiều,người ta phát hiện ra khả năng sinh tổng hợp vitamin ở vi sinh vật từ năm 1930 Trước đó người ta đã tìm ra nguồn sinh khối nấm men chứa nhiều

vitamin Hopkins (1906), Schaumann (1910), Funk (1912) đã tìm ra rất nhiều loài vi sinh vật có vitamin.(bảng 1.3)

Hiện nay việc sử dụng sinh khối vì sinh vật nói chung và nấm men

nói riêng như một nguồn vitamin hay việc chiết tách chúng vẫn đang

thường xuyên nghiên cứu và sử dụng

Trang 24

Bảng 1.3 : Số lượng vitamin trong một số vi sinh vật: [11] Vitamin Torula ufilis (| Nấm men bánh | Nấm men (mg/g ) mi (mg/g ) bia (mg/g) Acid aminobenzoic 65 175 100 Acid folic 30 80 30 Acid pantotenic 180 350 200 Biotin 3 0,6 1,10 Colin 4300 5000 Isositol 3500 5000 3000 Nicotinamit 600 700 1000 Riboflavin 70 80 80 Thiamin 50 40 180 1.3.4.2 Nấm men được sử dụng làm cốm bổ [23]:

Hiện nay người ta đã sản xuất ra sinh khối nấm men có bổ sung ion crom, sinh khối này có thể được sử dụng trong khẩu phần ăn của những người tiểu đường Các nhà khoa học đã nuôi cấy nấm men

Saccharomyces cerevisiae trên môi trường có chứa rỉ đường, amonium và cromsunfat Những thí nghiệm đã chứng tỏ rằng sự hợp nhất của ion

crom trong điều kiện yếm khí điễn ra nhanh hơn trong điều kiện hiếu khí

đặc biệt với một lượng cromsunfat lớn Mặt khác trong quá trình lên men

rượu, ở giai đoạn đầu là giai đoạn vi hiếu khí (8 giờ) và sau đó trong giai

đoạn yếm khí sự hợp nhất của ion crom trong tế bào nấm men xuất hiện

ở pha đầu tiên nhanh hơn Cũng trong điểu kiện đó sự hợp nhất của ion

crom trong sinh khối nấm men là 20 mcg Chúng ta tin tưởng rằng sẽ có một lượng sinh khối được sử dụng để chữa trị cho những bệnh nhân tiểu

Trang 25

đường nhằm điều hòa lượng đường huyết dưới mức glucose cho phép

Nghiên cứu của khoa độc vật học ở châu Âu đã khẳng định rằng trong

sinh khối nấm men được sản xuất không có yếu tố nào gây độc cả 1.3.4.3 Vai trò nấm men trong sản xuất chế phẩm probiotic:

Probiotic là từ có nguồn gốc từ Ai Cập có nghĩa là sự sống Lilley

và Suillwell đã sử dụng đầu tiên để mô tả các chất tiết ra bởi vi sinh vật

có tác dụng kích thích sự tăng trưởng của vi sinh vật khác, Đến năm

1974, Parker xác định : “probiotic là những sinh vật đóng vai trò quan

trọng trong việc cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột” Năm 1989 Fuller

xác định lại: “probiotic là một loại thức ăn có chứa vi sinh vật sống có tác dụng có lợi đối với động vật chủ bằng cách cải thiện sự cân bằng của

hệ vi sinh vật đường ruột ”

Một vài đặc điểm quan trọng của các vi sinh vật probiotic bao gồm: -Khả năng gắn vào tế bào

- Loại bỏ hay hạn chế sự gắn của các tác nhân gây hại - Tổn tại lâu đài và sinh san nhanh

- Tạo ra các acid, H;O; và các bacteriocin chống lại sự phát

triển của các tác nhân gây bệnh

- Phải an tồn khơng lan truyền rộng, không gây ung thư và

không gây bệnh [ 19]

Hiện nay người ta đang nghiên cứu tìm kiếm các chế phẩm vi sinh hay nguồn gốc thảo mộc để bổ sung thức ãn chăn nuôi nhằm chống các bệnh đường tiêu hoá thay vì sử dụng kháng sinh Các chế phẩm vi sinh vật được nghiên cứu ở nhiều nước có nguồn gốc là các chủng nấm men

Saccharomyces và vi khuẩn lactobacillus cũng như Bacillus subtilis Các chế phẩm vi sinh vật có tác dụng điều hòa hoạt động hệ vi sinh vật

Trang 26

CBHD: TS.Trần Thanh Thủy Luận văn tốt nghiệp đường ruột, một số chủng nấm Saccharomyces cerevisiae có thể gắn kết

một số hoá chất hữu cơ, thậm chí cả £.coli trên bể mặt của chúng Do tác dụng hỗ trợ như vậy, các chế phẩm vi sinh vật giúp cho cơ thể phát triển chống được tác hại của một số các chất độc, chủ yếu là các chất độc

nấm mốc chúng hạn chế bệnh đường ruột do E.coli va Salmonella và giúp cơ thể tăng cường sức để kháng và tăng trọng lượng, giảm chỉ phí

cho một đơn vị thức ăn [6] Chủng dùng để sản xuất chế phẩm nấm men

sinh học là chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae chủng HV có đặc tính chịu nhiệt và acid, có khả năng hình thành nha bào và t6n tai trong

môi trường khô trong nhiều tháng Chế phẩm có tác dụng làm tăng trọng và giảm tỷ lệ tiêu chảy, giảm tác động có hại của aflatoxin B1 đối với cơ thể trong giới hạn từ 100 -200 ppb trong khẩu phẩn thức ăn Có thể sản

xuất số lượng lớn dạng bột trộn thức ăn chăn nuôi phòng chống bệnh

đường tiêu hoá và tác dụng xấu của độc tố nói chung Những nghiên cứu

trên được thử nghiệm trên gà và đạt được những kết quả khả quan Lô

gà được ăn 1% chế phẩm Saccharomyces cerevisiae có trọng lượng 490

gam sau 2l ngày nuôi dưỡng trong khi đó lô gà cho ăn thức ăn bình

thường có trọng lượng 400 gam cũng trong thời gian trên Nếu trong thức ăn có chứa từ 100-200ppb bổ sung chế phẩm nấm men có tác dụng cải

thiện rõ rệt, làm giảm ảnh hưởng xấu của Aflatoxin BI đối với sự phát

triển của gà (đặc biệt ở hàm lượng 100ppb) Hiện nay đã sản xuất chế

phẩm Saccharomyces cerevisiae sOng dang bét: ching ding để sản xuất

là HV Tuy nhiên chỉ mới ứng dụng chế phẩm này trong chăn nuôi hộ gia

đình [5] Ché phdm Saccharomyces cerevisiae cing c6 tac dung với lợn con đang bú mẹ và lợn sau cai sữa Khi bổ sung 1% chế phẩm

Trang 27

Đối với lợn con đang bú mẹ: giảm tỷ lệ tiêu chảy (lô thí

nghiệm:30-45%, lô đối chứng: 40-63 %) Tăng khối lượng lợn sau cai sữa 0,5 kg/ con so với lô đối chứng [6]

Chế phẩm nấm men được dùng để làm thuốc trị loạn khuẩn đường

ruột đặc biệt là chủng Saccharomyces bouiardii Vì chúng có khả năng kháng kháng sinh rất mạnh (ngoại trừ kháng sinh kháng nấm) Chủng

này có thể sống được trong đường ruột rnà không bị tiêu diệt bởi kháng sinh nên chúng góp phần cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột đối với

những bệnh nhân sử dụng khấng sinh lâu đài [7|] Mặt khác

Saccharomyces boularđii còn có khả năng tiết ra protease tiêu giải độc tố của Clostridiwm difficite, vi khuẩn gây viêm ruột kết màng giả cũng như trung hòa được nội độc tố E.coli và Vibrio cholerae nên có thể dùng trong dự phòng tiêu chảy cấp tính

Trang 28

CBHD: TS.Trần Thanh Thủy Luận văn tốt nghiệp Phần II:

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.VẬT LIỆU:

2.1.1 Nguyên liệu : chủng nấm men Saccharomyces.sp2 từ bộ sưu

tập giống của phòng thí nghiệm Vi sinh -Khoa Sinh Trường Đại học Sư

phạm TPHCM, các đĩa giấy kháng sinh chuẩn được cung cấp bởi công ty

vật tư thí nghiệm Nam Khoa 2.1.2 Hóa chất :

Agar (Việt Nam), cao nấm men (Mỹ), glucose (Trung Quốc),

saccarose (Trung Quốc), lactose (Trung Quốc), d - galactose (Trung

Quốc), maltose (Trung Quốc), KH;PO, (Trung Quốc), MgSO, 7 H;O

(Trung Quốc), pepton (Trung Quốc), cao malt (Mỹ), cồn tuyệt đối (Việt

Nam), cao thịt (Trung Quốc), NaCl (Trung Quốc), urê (Việt Nam), phenol đỏ (Việt Nam), tỉnh bột tan (Việt Nam), gelatin (Trung Quốc)

2.1.3 Thiết bị :

Máy đo pH (WTW - Đức)

Nồi hấp áp lực (Huxley - Đài Loan) Tủ cấy vô trùng (LB1234- Việt Nam)

Tủ sấy (Memmert - Đức)

Máy lắc (Gehard - Đức)

Máy lắc điều nhiệt (Gehard - Đức)

Máy li tâm lạnh (Rotina-Đức) Máy li tâm thường (Hettich-Đức) Máy đông khô (Vitis-Mỹ)

Trang 29

Tủ đông -20°C (Sanyo - Nhật Bản)

Kính hiển vi chụp hình (Olympus - Nhật Bản) Kính hiển vi soi nổi (Olympus - Nhật Bản) Kính hiển vỉ quang học (Olympus - Nhật Bản)

Cân phân tích (sarturius- Đức) 2.1.4 Các loại môi trường:

Môi trường 1 : Môi trường cao malt ( Môi trường hoạt hóa ) : Cao malt 30g Pepton 3g

Nước cất 1000ml

Hấp khử trùng ở 1,5 atm trong 15 phút

Môi trường 2 : Môi trường Hansen agar và dịch thể:

Trang 30

Môi trường 4 : Môi trường SBH:

Pepton 10g

Dich chiét men bia 150 g

Glucose 20 g

Nước cất 000ml

Cách làm dịch chiết men bia: cân 20g men khô hòa vào 1 lít nước

sau đó đun lên để sôi trong 5 phút đem gạn lọc lấy nước trong rồi khử trùng bằng phương pháp Tyldal Môi trường 5: Môi trường YPD: Cao nấm men 10g Pepton 20g Glucose 20g Agar 20g Nước cất I000ml Hấp khử trùng ở 1,5 atm trong 15 phút Môi trường 6 : Glucose 20g KH;PO, lg MgSO, 7 HạO 0,58 Agar 16g Nước cất 000ml

Hấp khử trùng ở I,5 atm trong 15 phút

Môi trường 7: Môi trường thử khả năng phân giải urê:

Glucose 20g

KH;PO, lg

Trang 31

Urê 8g Agar 20g Nước cất 1000ml

Cách pha môi trường: pha môi trường trên lấy 900 ml nước cất rồi bổ sung 0,012g phenol đỏ làm chất chỉ thị màu, hấp vô trùng latm/30phút (dung dich A) Hoà 8g urê với 100 ml nước cất vô trùng (dung dịch B)

Trộn đều dung dịch A và B rồi phân phối vào các đĩa pêtri Môi trường 8: Môi trường nước chiết giá đậu:

Nước chiết giá đậu

Loại đường cần nghiên cứu 20g

Trang 32

Glutamat natri 1%

=> Sữa gầy 20% 20%

Nước cất tới 50ml

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:

2.2.1 Kiểm tra độ thuần khiết của giống [10] : - Bước 1 : hoạt hóa giống :

Chuẩn bị các bình tam giác 250 ml chứa 100 ml môi trường 1 vô trùng Cấy giống vào các bình trên và nuôi trên máy lắc ở chế độ130

vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng

- Bước 2: gieo cấy trên thạch đĩa:

Pha loãng: lấy l ml môi trường hoạt hóa hòa vào 9 ml nước cất vô

trùng ta được độ pha loãng 10 lần Tiếp tục pha loãng đến độ pha loãng

thích hợp khoảng 10 —10'

Cấy trên thạch dia: ding pipet hút và nhỏ | giọt (khoảng 0,05ml)

dịch pha loãng trên vào giữa đĩa pêtri chứa môi trường 2 (agar), sau đó

dùng que gạt phân phối dịch mẫu trải đều khắp mặt thạch Tiếp tục sử

dụng que gạt này gạt mẫu cho đều khắp mặt thạch đĩa pêtri thứ 2 rồi đĩa

pêtri thứ 3 Cấy xong thì bao gói các thạch đĩa và nuôi ở 28 — 30” C trong 3 ngày, quan sát các khuẩn lạc mọc trên thạch đĩa

-Bước 3: kiểm tra tính thuần chủng:

Trong điều kiện vô trùng, lấy một khuẩn lạc riêng lẻ đã phân lập được hòa vào 10 ml nước cất vô trùng và lắc đều ta được dung dich nấm

men có độ pha loãng 10 lần Nhỏ một giọt dịch vào đĩa pêtri chứa môi

trường 2 dùng que gạt dàn đều để tách rời các tế bào Sau đó, tiếp tục sử

Trang 33

và chọn khuẩn lạc riêng rẽ Kiểm tra độ thuần khiết bằng cách làm tiêu

bản nhuộm xanh metylen 0,1% dưới kính hiển vi Nếu chúng đồng nhất

về hình thái và khác nhau chút ít về kích thước thì chọn cấy vào thạch

nghiêng để sử dụng Nếu không phải tiến hành lại từ đầu cho đến khi

nhận được các đĩa thạch chứa các khuẩn lạc thuần chủng

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu các đặc điểm hình thái, đo kích thước tế bào

2.2.2.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc [1]:

Nuôi cấy nấm men trên môi trường 2 (ở thạch đĩa) ở nhiệt độ 28-

30°C trong 3 ngày Sau đó lấy ra quan sát và mô tả đặc điểm

*® Hình dạng, kích thước * Màu sắc khuẩn lạc

* Bê mặt khuẩn lạc

* Mép của khuẩn lạc

2.2.2.2 Quan sát hình thái tế bào nấm men [l]:

Việc xác định hình thái và kích thước tế bào nấm men tiến hành khi

tế bào còn trẻ, đó là thời kì hình thái của chúng tương đối ổn định nhất

Các chủng nghiên cứu được cấy chuyền từ thạch nghiêng sang ống nghiệm chứa 10ml môi trường Hansen dịch thể, để vào tủ ấm 2- 3 ngày ở 28-30°C sau đó lấy ra làm tiêu bản rồi quan sát hình thái tế bào

Các đặc điểm cần xác định là :

se Hình dạng tế bào

“=_ Số lượng tế bào nảy chi

* Số lượng tế bào chết (đùng phòng đếm Thoma —Goriaêv)

Trang 34

Muốn phân biệt tế bào sống chết ta tiến hành làm tiêu bản giọt ép bằng thuốc nhuộm xanh mêtylen 0,01% Tế bào sống không bắt màu

hoặc bất mau xanh nhạt, tế bào chết bắt màu xanh đậm hơn

Muốn quan sát tế bào nấm men một cách tỷ mỉ hơn có thể dùng một số thuốc nhuộm để nhuộm các tế bào nấm men Dùng que cấy lấy 1

giọt dung dịch nuôi cấy nấm men đưa lên phiến kính sạch, đàn mỏng

giọt dung dịch trên phiến kính, làm khô và cố định vết bôi bằng ngọn lửa đèn cổn Nhuộm màu bằng Fuchsin kiểm hoặc xanh mêtylen, để 1 phút

sau đó dùng nước cất rửa sạch tiêu bản, để tiêu bản khô tự nhiên hay

dùng giấy lọc thấm cẩn thận, quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi quang

học ở vật kính x100 bằng dầu soi kính

2.2.2.3 Đo kích thước tế bào [9]: *Các dụng cụ đo:

Thước đo vật kính là một phiến kính tốt ở giữa có 1 vạch khắc đài I mm, chia thành 100 khoảng mỗi khoảng dài 10um

Thước đo thị kính là một bản thủy tinh hình tròn, ở trung tâm có

một vạch dài 5mm chia ra làm 50 khoảng cách đều nhau

* Cach do:

Nuôi nấm men trên môi trường Hansen dịch thể, sau 48 giờ dem làm tiêu bản giọt ép để đo

Đặt thước đo vật kính lên bàn kính (chỗ để tiêu bản), điều chỉnh

sao cho vạch chia nằm giữa quang trường Lắp thước đo thị kính vào,

quay thước đo thị kính sao cho các vạch chia của nó nằm song song các

Trang 35

với một vạch của thước đo thị kính và tính giá trị mỗi khoảng chia bằng

ụm

Ví dụ: trong 4 vạch của thước đo vật kính (40um) chứa 13 vạch của

thước đo thị kính, mỗi vạch của thước đo thị kính ở độ phóng đại tương

ting 40/13=3,08 pm

Bỏ thước đo vật kính ra, thay bằng tiêu bản vi sinh vật, điều chỉnh

thước đo thị kính trùng hướng tiêu bản muốn đo Kích thước tế bào bằng

số khoảng chia của thước đo thị kính nhân với hệ số đo

Yêu câu: mỗi tế bào được đo chiều dài và chiều rộng Mỗi mẫu đo

số tế bào không ít hơn 20, sau đó lấy trị số trung bình và chỉ đo các tế

bào đã trưởng thành

2.2.3 Các phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của

nấm men [1]

2.2.3.1 Quan sát hình thức nảy chồi ở tế bào nấm men:

Nảy chổi là một chỉ tiêu trong phân loại nấm men, đa số nấm men đều sinh sản vô tính bằng hình thức nảy chổi Nuôi cấy nấm men trong

môi trường Hansen dịch thể (MT 2) ở 25-30°C trong 1-2 ngày có thể

quan sát được quá trình nảy chổi của nấm men Khi quan sát quá trình

này dưới kính hiển vi cần phân biệt được chổi hình thành là chổi một cực

hay đa cực, số lượng chổi con hình thành trên mỗi tế bào mẹ, chổi con phát triển có tách khỏi tế bào mẹ hay không

2.2.3.2 Quan sát khuẩn ty của nấm men:

Một số nấm men phát triển trong những môi trường già hay điều kiện thiếu oxi có thể hình thành những tế bào dài, xếp nối tiếp nhau được gọi là giả khuẩn ty Cũng có một số nấm men khi phát triển trong diéu kiện bình thường cũng tạo khuẩn ty Khuẩn ty giả chưa hình thành

Trang 36

CBHD: TS.Trần Thanh Thủy Luận văn tốt nghiệp sợi rõ rệt mà chỉ là nhiều tế bào nối với nhau thành chuỗi dài Sự tạo

thành khuẩn ty là một đặc điểm quan trọng trong phân loại nấm men Để kiểm tra sự tạo thành khuẩn ty, nuôi cấy nấm men trên môi

trường 9 Môi trường được đổ vào hộp pêtri sao cho càng mỏng càng tốt

Dùng que cấy, cấy nấm men thành ba đường song song Dùng panh lấy lá kính mỏng (thường xuyên ngâm trong cồn) đốt nhẹ cho hết cồn, để

nguội một chút rồi đặt nhẹ nhàng lên vết cấy Phải cấy để 3 đường cấy song song có chiều ngang nằm gọn trong lá kính mỏng, hai đầu dài hơn

một chút Sau khi đậy lá kính một cách nhẹ nhàng và cẩn thận, đậy hộp

pêtri lại và nuôi trong tủ ấm ở 25-30°C trong 3-5 ngày Lấy ra và quan sát các vết cấy dưới kính hiển vi Bằng phương pháp này dễ dàng quan

sát thấy sự tạo thành khuẩn ty ở một số loài nấm men 2.2.3.3 Quan sát nang bào tử của nấm men:

* Nguyên tắc: nấm men sinh sản hữu tính bằng bào tử túi hay còn

gọi là bào tử nang Tế bào chứa bào tử nang gọi là nang Thường quan

sát thấy nang bào tử của nấm men trong các môi trường già

*Phương pháp: nuôi nấm men 2 ngày trong môi trường 2 Cấy ria

ở mật độ cao lên các ống thạch nghiêng chứa môi trường 10, ủ ấm ở

28°C trong 10-15 ngày rồi làm tiêu bản soi tươi (không cần nhuộm) để

quan sát nang bào tử,

* Yêu cầu:

-Phân biệt các dang nang: nang tiếp hợp do sự dung hợp của nhân tế bào mẹ và chổi hay nang tiếp hợp do sự dung hợp của 2 tế bào riêng biệt Nang nằm riêng biệt bên ngoài tế bào

- Xác định số lượng bào tử trong mỗi nang

Trang 37

- Mô tả hình dạng bào tử: hình cầu, hình thận, hình nón, hình sao

thổ, hình kim xoắn, hình sao, hình thoi

2.2.3.4 Xác định khả năng sử dụng nitrat làm nguồn nitơ của nấm men:

* Nguyén tdc: M6t s6 nim men cé kha nang sif dung nitrat lam

nguồn nitơ và khif nitrat thanh nitrit hodc NH3, có khi thành N;

Khả năng khử NO; thành NO;' là một trong các chỉ tiêu phân loại

nấm men Để xác định sự tạo thành NO; dùng thuốc thử Griss I và Griss II

* Đặi thí nghiệm:

_ Lô đối chứng 1: Các ống nghiệm chứa môi trường cơ sở (MT6) _Lô đối chứng 2: Các ống nghiệm chứa môi trường cơ sở có bổ

sung thêm pepton 1%

_Lô thí nghiệm: Các ống nghiệm chứa môi trường cơ sở có bổ sung thêm nguồn nitơ dưới dạng KNO;

Môi trường được thanh trùng ở 1 atm trong 30 phút Mỗi chủng nấm

men cấy vào 3 loại môi trường trên Nuôi cấy nấm men trong tủ ấm từ 5-

7 ngày Cứ sau một thời gian nhất định lấy một ít dịch nuôi cấy thử xem

có hoạt tính hay không

*Kiểm tra hoạt tính:

Lấy 1-2 giọt dịch nuôi cấy cho vào bản sứ lõm Nhỏ một giọt thuốc

thử Griss I và một giọt thuốc thử Griss II Nếu có mặt nitrit dịch nuôi cấy

có màu đỏ

Cách pha thuốc thừ Criss ï và Criss H1:

Crisl: Acid Sunfuniic 0,5g Acid Acetic 150ml

Trang 38

Crissll: Naphtylamin 0,5 Acid Acetic 150ml

Nước cất 50ml

Hòa Naphtylamin vào nước rồi mới bổ sung acid Acetic

2.2.3.5 Xác định khả năng phân giải urê của nấm men:

* Nguyên tắc:

Phân giải urê cũng là một chỉ tiêu trong phân loại nấm men Một số

nấm men có khả năng tạo thành enzim ureaza do đó có thể phân giải urê

tạo thành NH; làm kiểm hóa môi trường

* Phương pháp:

Để xác định khả năng tạo enzim ureaza, cho vào môi trường 7 chất

chỉ thị màu là phenol đỏ Cấy nấm men, nuôi ở tủ ấm 3-5 ngày, nếu thấy vết cấy chuyển màu đỏ hồng, chứng tỏ nấm men có khả năng phân giải

uré

Phản ứng xảy ra như sau:

O=C-(NH;; + 2H;O > (NH,),CO, > 2NH;+H,CO; NH; phan tfng vdi ch4t chi thị phenol đỏ làm vết cấy chuyển màu đỏ

2.2.3.6 Xác định khả năng lên men các loại đường:

Khả năng lên men các loại đường là một chỉ tiêu quan trọng trong

phân loại nấm men

* Nguyên tắc: Dựa vào sự thay đổi màu sắc, độ đục của môi trường và lượng CO; tạo thành trong dịch lên men

* Phương pháp:

-Dùng MT 8 với các loại đường: glucose, d- øgalactose, lactose,

Trang 39

-Chuẩn bị các bình lên men Einhorn - Smith vô trùng Sau khi khử

trùng môi trường cho 9ml môi trường vào mỗi bình rồi bổ sung 1ml giống đã hoạt hóa vào mỗi bình sao cho đầy ống chia độ (không để xuất hiện

bọt khí) Khảo sát khả năng lên men của nấm men sau § giờ ở 28 ~30°C

Nếu nấm men có khả năng lên men đường chứa trong môi trường sẽ sinh ra khí CO; đẩy môi trường xuống:

- - Môi trường chuyển màu rõ, lượng CO; nhiều: lên men mạnh - Môi trường chuyển màu không rõ,lượng CO; ít: lên men yếu

- Môi trường không chuyển màu, không tạo CO;: không lên men

2.2.4 Chọn môi trường tốt ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm men bằng phương pháp đếm số lượng tế bào bằng khung đếm

Thoma-Goriaêy ( I8]:

Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 9ml các môi trường 2, 3, 4, 5 vô

trùng

Giống được hoạt hóa trong 24 giờ trên máy lắc với chế độ 130 vòng/phút sau đó điểu chỉnh lượng giống vào các môi trường trên bằng

nhau (xấp xỉ 0,3 triệu tế bào/ml), nuôi cấy 28-30°C trong 24 giờ Kiểm

tra số lượng tế bào bằng khung đếm Thoma-Goriaêv tại các thời điểm: 0,

3,6, 9, 12, 15, 18 ,21, 24 gid

Phương pháp:

* Nguyên tắc: dựa vào thể tích của khung đếm để tính số tế bào có trong 1ml dịch nuôi cấy

Khung đếm là một phiến kính dày ở giữa có một chỗ löm phẳng, tại

đây có kẻ một I lưới gồm 400 hình vuông, có diện tích tổng cộng Imm' vậy diện tích ! ô nhỏ =1/400 mmỶ và một ô vuông lớn =1/25mmỶ

Trang 40

CBHD: TS.Trần Thanh Thủy Luận văn tốt nghiệp *Cách đếm: se Pha loãng dịch huyển phù nấm men đến nổng độ thích hợp “Nhỏ dịch huyền phù nấm men vào cạnh lamelle (đã đặt trên phòng đếm), chú ý không để bọt khí =_ Quan sắt ở vật kính x40

s® _ Đếm số lượng tế bào ở 5 ô lớn với 5 vị trí khác nhau

Chú ý: sau khi nhỏ giọt vào khung đếm để 3-5 phút để các tế bào lắng xuống và cùng nằm trên một mặt phẳng mới bắt đầu xác định số

lượng

Cách tính: = a,

N: S6 t€ bao/ml

a: Số tế bào trung bình trong 1 ô nhỏ

n: Độ pha loãng huyền phù h: chiểu sâu của khung đếm

s: diện tích ô nhỏ

2.2.5 Khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tế môi trường đến khả

năng tạo sinh khối của tế bào bằng phương pháp cân sinh khối tươi 2.2.5.1 Ảnh hưởng của pH:

Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 9ml mồi trường 3 vô trùng

Dùng NaOH 0,1 N hoặc acid citric, điểu chỉnh pH môi trường đạt

các giá trị 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5

Giống được hoạt hóa sau 24 giờ trên máy lắc với chế độ 130

Định dạng
Số trang	70
Dung lượng	4,19 MB