Nghiên cứu một số tác dụng sinh học của flavonoit chiết xuất từ lá nhãn dimocarpus longan luor và lá vải litchi chinensis sonn

LIÊN HIỆP CÁC HOI KHOA HOC VA KY THUAT VIỆT NAM VIÊN NGHIÊN CỨU ĐÀO TẠO VÀ TƯ VẤN KHOA HỌC CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU BETA NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA FLAVONOIT CHIET XUAT TW LA NHAN (Ø/0/4#P0S LONGAN LOUR.) VA LA VAI (LITCHI CHINEWSIS SONN.) 7508 15/9/2009 Hà Nội - 2009 MUC LUC Tom tit théng tin vé dé tai Các ký hiệu viết tắt đề tài Mở đầu 1.TÔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây vải thiều 1.2 Cây nhãn cùi 1.3 Nhóm hợp chất Flavonoit DOI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1, Đối tượng thực vật 2.1.2 Đối tượng động vật 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Chiết xuất định lượng Flavonoit tổng số theo phương pháp B.C Talli 2.2.2 Phân tích thành phần Flavonoit sắc ký lớp mỏng, phổ quét quang phổ hấp phụ tử ngoại 2.2.3 Xác định hoạt độ peroxy daza máu theo E C Xavron 21 22 2⁄2.4 Xác định hoạt tính chống oxy hóa in vitro chế phẩm 22 2.2.5 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan chế phẩm Flavonoit chiết xuất 23 2.2.7 Xác định độc tính cấp chế phẩm Flavonoit theo phương 24 25 flavonoit théng qua q trình peroxy hóa lipit tế bào gan chuột theo phương pháp C G Blagodorov cộng từ Vải Nhãn 2.2.6 Nghiên cứu tác dụng kháng khuân chế phẩm Elavonoit pháp 2.2.8 phẩm Nhin 2.2.9 A Wallace Hayes Bào chế, phân tích, kiểm nghiệm xây dựng tiêu chuẩn cho sản chức Agot — G (sản phẩm có sử dụng chế phẩm Elavonoit từ — FN) Khảo sát tác dụng bảo vệ gan sản phẩm Agot - G gây độc 26 26 gan chuột Ethanol 2.2.10 Nghiên cứu ảnh hưởng sản phẩm chức Agot — G lên hoạt độ số enzym tiêu hoá tuyến chó (Amylaza, lipaza, proteaza) 22.11 Xác định độc tính cấp sản phẩm chức Agot — Œ theo 27 31 phương phép cia A Wallace Hayes 2.2.12 Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê sinh học 31 KẾT QUÁ VÀ THẢO LUẬN 3.1 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ HOÁ HỌC CỦA CÁC CHẾ PHẨM FLAVONCIT 32 3.1.1 Chiết xuất định lượng Flavonoit tổng só từ Nhãn Vải 32 3.1.2 Phân tích thành phần Flavonoit tổng số thu sắc ký lớp 34 3.13 Khảo sát test chống oxy hoá chế phẩm EN, EN+, FV, FVr 38 3.2 NGHIÊN CỨU TÁC DỰNG SINH HỌC 3.2.1 Nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá (Antioy danf)của chế phẩm 40 mỏng phổ tử ngoại thơng qua hiệu lực kìm hãm phản ứng oxy hoá inđigocamin enzym peroxydase máu người #lavonoit chiết xuất từ Nhãn Vải 3.3.2 Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn chế phẩm FV EN 3.3.3 Nghiên cứu độc tính cấp chế pham FV va FN 3.3.4 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan chế pham FN va FV 3.3 KIÊN NGHỊ VỀ KHẢ NANG UNG DUNG CAC CHE PHAM FLAVONOIT CHIẾT XUẤT TỪ LÁ NHÃN ŒN) VÀ TỪ LÁ VẢI ŒV) 3.3.1 Nghiên cứu sử dụng chế phẩm EN để hình thành sản phẩm Agot — G 3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng chế phẩm Agot - G lên hoạt động enzym tiêu hố tuyến chó (amylaza, lipaza, proteaza) 3.3.3 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan sản phẩm Agot - Œ chuột gây độc gan Ethanol 3.3.4 Thử độc tính cấp sản phẩm chức Agot - G 3.3.5 Phân tích, kiểm nghiệm xây dựng tiêu chuẩn cho sản phẩm chức 32 40 43 44 46 33 34 35 38 60 62 Agof — G (sản phẩm có sử dụng chế phẩm Flavonoit từ Nhãn — FN) KET LUAN VA KIEN NGHI 'Tài liệu tham khảo 67 71 TOM TAT THONG TIN VE DE TAI Tên đề tài: “Nghiên cứu số tác đựng sinh học cúc hợp chất Tavonot chiết xuất từ lú Nhân (Dimocarpus Longan Lour) wa ta Vai (Litchi Chinensis Sonn)” Cơ quan quản lý để tài: Liên hiệp hội khoa học kỹ thuật Việt Nam Địa chỉ: 53 Nguyễn Du, quận Hai Bà Trưng, Hà Nội 3, Cơ quan thực hiện: Viện Nghiên cứu, Đào tạo Tư vấn khoa học công nghệ Địa chỉ: Số 201 A — B, phố Đội Cắn, quận Ba Đình - Hà Nội Điện thoại: (04)37222233 Fax: (04) 37222277 Chủ nhiệm để tài: TS Đào Thị Kim Nhung Chúc vụ: Phó Viện trưởng Viện Nghiên cứu, Đào tạo Tư vấn khoa học công nghệ Địa chỉ: Số 9, phố Đội Cung, quận Hai Bà Trưng, Hà Nội Điện thoại: (04) 39761106 5.Mục tiêu đề tài Nghiên cứu, hướng tới khai thác ứng dụng hợp chất Flavonoit chiết xuất từ Vải Nhãn làm nguyên liệu dùng lĩnh vực Bảo vệ sức khoẻ cộng đồng Nội dung dé tai: gồm phần Phần1: Chiết xuất, định lượng phân tích thành phần hoá học chất Flavonoit thu nhận từ nguyên liệu Nhãn, Vải tươi khơ Phân tích sàng lọc hoạt tính chống oxy hố chế phẩm Flavonoit thu Phân 2: Nghiên cứu số tác dụng sinh học chế phẩm Flavonoit từ 'Vải Nhãn Nghiên cứu tác dụng chống oxy hố Nghiên cứu vẻ tính an tồn (độc tính cấp) -Nghién cứu hoạt tính kháng khuẩn - Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan Phan3: Kiến nghị khả ứng dụng chế phẩm Flavonoit chiết xuất từ Nhãn Vải Nghiên cứu sử dụng chế phẩm EN để hình thành sản phẩm chức Agot - G -Nghiên cứu số hoạt tính sinh học sản phẩm Agot - G (tác dụng bảo vệ gan, ảnh hưởng lên hoạt động enzym tiêu hố tuyến tuy, thử độc tính cấp) -Phân tích, kiểm nghiệm, xây dựng tiêu chuẩn cho sản phẩm chức Agot- G Thời gian thực hiện: 24 tháng, từ 05/ 2007 đến 05/ 2009 Kinh phí thực - Kinh phí đề tài duyệt: 300.000.000 đ (ba trăm triệu đồng) - Kinh phí thực nhận: 258.000.000 đ Trong đó: Nam thứ nhất: 150.000.000 đ Năm thứ hai: 108.000.000 đ [kinh phí duyệt 120.000.000đ, trừ 10% (12.000.000đ) chi phí tiết kiệm] Danh sách cán tham gia để tài Họ tên Cơ quan công tác vee TS Dao Thị Kim Nhung _ | Viện nghiên cứu, đào tạo tư vấn Ths Đỗ Thi Gim Ths Trần Thị Hiếu TS Hà Việt Sơn CN Trần Nam Thái Ths Trần Quỳnh Hoa Trung tâm nghiên cứu phát triển công nghệ hoá sinh 14 tháng CAC KY HIEU VIET TAT TRONG DE TAI FV: ché phẩm Flavonoit chiết xuất từ Vải khô EV: chế phẩm Flavonoit chiết xuất từ Vải tươi EN: chế phẩm Flavonoit chiết xuất từ Nhãn khô FN;: chế phẩm Elavonoit chiết xuất từ Nhãn tươi TLK: Trọng lượng khô tuyệt đối ASTN: Ánh sáng tự nhiên COOH: Chất chống oxy hoá HD: Hoạt độ ĐOL: Q trình peroxy hố lipit HTCO: Hoạt tính chống oxy hoá DAM: dialdehyl manonyl SKLM: Sắc ký lớp mỏng DMSO: Dimethyl sulphoxide MIC: Néng độ tre ché téi thiéu ( Minimal inhibitory concentration) MTT: - (4,5 — dimethylthiazol — - yl )— 2,5 — diphenyl tetrazolium bromide ICsp: Néng d6 we chế 50% lượng vi sinh vat (Inhibitory concentration 50%) LDsp: Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (Lethal dose 50%) AST: Alanin amino transferase ALT: Aspartate amino transferase ACD: dung dich Axit citrate dextrose MỞ ĐẦU Các hợp chất Flavonoit thiên nhiên có nhiều tác dụng sinh - dược học giá trị, phân bố rộng rãi giới thực vật, độc thể thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học giới Việc nghiên cứu cấu trúc hoá học, đặc điểm lý - hoá - sinh học khả ứng dụng Flavonoit vào lĩnh vực khác đời sống (y được, thực phẩm, mỹ phẩm, sinh học phân tử ) trở thành trường phái mạnh nhiều quốc gia phát triển (Mỹ, Anh, Nga, Hàn Quốc, Trung Quốc ) Người ta tìm thấy hon 4000 chất Flavonoit thực vật hoạt tính sinh học chúng liên quan đến khả phòng ngừa điều trị nhiều bệnh khác người Năm 2006 Viện Nghiên cứu, Đào tạo Tư Khoa học Cơng Nghệ cơng bố cơng trình nghiên cứu vẻ hoạt tính chống oxy hố (antioxydant) Flavonoit 48 trồng mọc hoang dại; Vải Nhãn đối tượng nghiên cứu chọn vào nhóm nguyên liệu có nhiều triển vọng cho việc khai thác ứng dụng Cây Vải (Litchi Chinensis Sonn) Nhãn (Dimocarpus Longan Lour) ộc họ Bỏ Sapindaceae, ăn lâu năm trồng phỏ biến miền Bắc Việt Nam Hàng năm, sau vụ thu hoạch (Vải từ tháng —> 7, Nhãn từ tháng —>10) người trồng thường đón để bắt đầu quy trình chăm bón cho mùa vụ năm sau Khối lượng khổng lồ bỏ trở thành nguồn nguyên liệu phong phú khai thác sử dụng hợp lý Vì vậy, chúng tơi tiếp tục nghiên cứu đối tượng với mong muốn phát số tác dụng sinh học hợp chất Elavonoit chiết xuất từ Nhãn Vải góp phan hướng tới mục đích chăm sóc bảo vệ sức khoẻ cộng đồng Những nội dung đề tài Phân 1: Chiết xuất Flavonoit phân tích hoá học -Chị xuất, định lượng thu chế phẩm Flavonoit tổng số từ Nhãn Vai (gém hai loai tươi khô) -Dùng phương pháp sắc ký quang phổ để so sánh, đánh giá khác biệt cặp Flavonoit tách từ nguyên liệu tươi khô Sơ nhận dạng thành phần Flavonoit chủ yếu (aglycon) chế phẩm Flavonoit thu -Phân tích sàng lọc hoạt tính chống oxy hoá chế phẩm Elavonoit thu Phân 2: Nghiên cứu số tác dụng sinh học chế phẩm Flavonoit từ 'Vải Nhãn Nghiên cứu tác dụng chống oxy hố Nghiên cứu vẻ tính an tồn (độc tính cấp) Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn -Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan Phan3: Kiến nghị khả ứng dụng chế phẩm Flavonoit chiết xuất từ Nhãn Vải Nghiên cứu sử dụng chế phẩm EN để hình thành sản phẩm chức Agot - G -Nghiên cứu số hoạt tính sinh học sản phẩm Agot - G (tác dụng bảo vệ gan, ảnh hưởng lên hoạt động enzym tiêu hố tuyến tuy, thử độc tính cấp) -Phân tích, kiểm nghiệm, xây dựng tiêu chuẩn cho sản phẩm chức Agot- Œ TONG QUAN TAI LIEU 1.1 CÂY VẢI THIỀU Cây Vải thiểu có tên khoa học Litchi chinensis Sonn thudc ho bé hoa Sapindaceae Cay Vai trồng & khấp Việt Nam thấy & Campuchia, lào, Trung Quốc, Thái Lan, phía bắc Ấn Độ Vải ro, cao ri 10 m Cành thường mọc ngang, kép chăn, gồm đến đơi chét hình mác, hay thn dài, hai đầu tù, dai, mặt bóng, mặt mờ Hoa mọc thành chuỳ tận cùng, cành mang hoa phủ đầy lông nâu nhạt Hoa không cánh, đài dính Quả hình cầu, vị khô mỏng, sản sùi chứa hạt to bao bọc áo hạt (cùi vải) trắng, mắm, nhiều nước, thơm chua, ăn Quả vải thường thu hoạch vào tháng -7 dùng ăn tươi bay sấy khơ đóng hộp dùng dân Hạt vải thái mông phơi hay sấy khô dùng làm thuốc với tên lệ hạch Thành phân hoá học vải: áo hạt (tử y) ta thường gọi cùi vải có chất đường (chủ yếu glucoza) 66%; protein 1,5%; chất béo 1,4%; vitamin C (trung bình 40mg 100g dịch áo hạt); ngồi cịn có vitamin A B ( loại viamin thường thấy áo hạt tươi, khó thường đi); axit xitric Công đựng: cùi vài dùng để ăn làm thuốc Áo hạt có vị ngọt, chua, tính bình hay ơn, khơng có độc, có tác dụng ni huyết, làm hết phiền khát, tiêu thũng, chữa bệnh mụn nhọt Hạt vải (lệ hạch) vị thuốc dùng từ lâu đời theo đông y lệ hạch có vị ngọt, chát, tính ơn, khơng có độc, có tác dụng tán hàn, thấp kết khí, thuốc chữa âm nang sưng đau (thốt vị), chữa ia chảy trẻ Ngoài người dùng hoa, vỏ thân rễ Vải sắc lấy nước súc miệng chữa bệnh viêm họng, đau Hạt vải chữa đau dày, ruột non, đau tỉnh hoàn (sắc uống ngày -10g/ngày); vỏ vải chữa đau bụng ngoài; vải dùng trị vết cấn động vật 1.2 CÂY NHÃN CÙI Cay Nhãn cùi có tên khoa học Øimocarpws longan Lour thuộc họ bồ Sapindaceae ăn lâu năm, trồng mọc hoang khắp nơi nước ra: Hưng yên, Phú thọ, Vĩnh phú, Nghệ an Cây nhãn cao -12m, thân gỗ ro, cứng, vỏ xù xì, nhiều cành, nhiều um tùm, quanh năm xanh tốt Lá kép lông chim, mọc so le, gồm -9 chét, dài -9 em, rộng 2-4 em, hình bầu dục dài, mép nhăn Hoa nhỏ mọc thành chùm, màu vàng nhạt Mùa hoa tháng 34 Cây trồng từ — năm có quả, mùa thường từ tháng — 10; to hịn bi, hay (đường kính có tới em), vị ngồi nháp, có áo hạt mọng bao, bọc hạt đen nhánh bên Thành phần hố học : cùi nhãn tươi có thành phần sau %: nước 77%; chất béo 0,13 %; protein 1,47%; hợp chất có chứa ni tơ tan nước 20,55%; ngồi cịn có vitamin A B Cùi nhãn khô chứa nước 0,85%; chất ran nước 79,77%; chất không tan 19,39% ; tro 3,36% Trong phần tan nước có chứa glucose 26,91%, saccharose 0,22; hợp chất có ni rơ 6,309% Hạt nhãn chứa rỉnh bột, saponin, chất béo tanin Lá nhãn có chứa quercetin, quercerrin, tanin Công dụng: theo y học cổ truyền nhãn cho cùi ăn đem chế biến thành long nhãn; cùi nhãn dung chữa trí nhớ suy giảm hay quên, ngủ, than kinh suy nhược, yếu gan, tỷ kém, máu xấu, rong kinh, suy nhược thể; nhãn ngừa sởi, cảm lạnh, sốt rét, viêm một, trị số bệnh da, chữa bệnh vỏ vỏ dùng chữa bỏng, đau (đốt tán thành bột hay nấu cao để dùng); hạt trị đau dày, thoát vị, mụn nhọt, bỏng, chảy máu (dùng uống thậ bơi ngồi) Rễ thường dùng để chữa dưỡng chấp niệu, bạch đới, thống phong Các kết nghiên cứu dự án “Khảo sát số loại cỏ giàu #lavonoit có hoạt tính chống oxy hố - antioxydant cao để định hướng khai thác làm thuốc phòng chữa bệnh” cán Viện Nghiên cứu, Đào tạo Tư vấn khoa học công nghệ thực hiện, nghiệm thu năm 2006 cho thấy Vải Nhãn tích luỹ nhiều hợp chất Polyphenol, hàm lượng hợp chất Flavonoit chiếm tỷ lệ tương đối cao; chế phẩm Flavonoit có hoạt tính chống oxy hố (HTCO) tốt — tiêu chuẩn cần thiết hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh — dược 1.3 NHĨM HỢP CHẤT FLAVONOIT Flavonoit 1a nhóm hợp chất polyphenol, đa dạng vẻ cấu trúc hóa học tác dụng sinh học Chúng có hâu hết phận cây, đặc biệt