Nghiên cứu một số tác dụng sinh học của flavonoit chiết xuất từ lá nhãn dimocarpus longan luor và lá vải litchi chinensis sonn

3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của chế phẩm Agot - G lên hoạt động của các enzym tiêu hoá tuyến tuy chó amylaza, lipaza, proteaza 3.3.3 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của sản phẩm Agot - Œ t

Trang 1

LIÊN HIỆP CÁC HOI KHOA HOC VA KY THUAT VIỆT NAM VIÊN NGHIÊN CỨU ĐÀO TẠO VÀ TƯ VẤN KHOA HỌC CÔNG NGHỆ

BÁO CÁO NGHIỆM THU

BETA

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA

FLAVONOIT CHIET XUAT TW LA NHAN (Ø/0/4#P0S LONGAN LOUR.) VA LA VAI (LITCHI CHINEWSIS SONN.)

7508 15/9/2009

Trang 2

MUC LUC Tom tit théng tin vé dé tai

Các ký hiệu viết tắt trong đề tài

Mở đầu

1.TÔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cây vải thiều

1.2 Cây nhãn cùi

1.3 Nhóm hợp chất Flavonoit

2 DOI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1, Đối tượng thực vật 2.1.2 Đối tượng động vật

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Chiết xuất và định lượng Flavonoit tổng số theo phương pháp của

B.C Talli

2.2.2 Phân tích thành phần Flavonoit bằng sắc ký lớp mỏng, phổ quét và

quang phổ hấp phụ tử ngoại

2.2.3 Xác định hoạt độ peroxy daza trong máu theo E C Xavron

2⁄2.4 Xác định hoạt tính chống oxy hóa in vitro của các chế phẩm

flavonoit théng qua quá trình peroxy hóa lipit tế bào gan chuột theo phương pháp của C G Blagodorov và cộng sự

2.2.5 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của chế phẩm Flavonoit chiết xuất

từ lá Vải và lá Nhãn

2.2.6 Nghiên cứu tác dụng kháng khuân của các chế phẩm Elavonoit

2.2.7 Xác định độc tính cấp của các chế phẩm Flavonoit theo phương

pháp của A Wallace Hayes

2.2.8 Bào chế, phân tích, kiểm nghiệm và xây dựng tiêu chuẩn cho sản phẩm chức năng Agot — G (sản phẩm có sử dụng chế phẩm Elavonoit từ lá Nhin — FN)

2.2.9 Khảo sát tác dụng bảo vệ gan của sản phẩm Agot - G khi gây độc

gan chuột bằng Ethanol

2.2.10 Nghiên cứu ảnh hưởng của sản phẩm chức năng Agot — G lên hoạt độ của một số enzym tiêu hoá tuyến tuy chó (Amylaza, lipaza, proteaza)

Trang 3

phương phép cia A Wallace Hayes

2.2.12 Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê sinh học

3 KẾT QUÁ VÀ THẢO LUẬN

3.1 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ HOÁ HỌC CỦA CÁC CHẾ PHẨM FLAVONCIT

3.1.1 Chiết xuất và định lượng Flavonoit tổng só từ lá Nhãn và lá Vải

3.1.2 Phân tích thành phần Flavonoit tổng số thu được bằng sắc ký lớp

mỏng và phổ tử ngoại

3.13 Khảo sát test chống oxy hoá của các chế phẩm EN, EN+, FV, FVr

thông qua hiệu lực kìm hãm phản ứng oxy hoá inđigocamin của enzym

peroxydase máu người

3.2 NGHIÊN CỨU TÁC DỰNG SINH HỌC

3.2.1 Nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá (Antioy danf)của các chế phẩm

#lavonoit chiết xuất từ lá Nhãn và lá Vải

3.3.2 Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của chế phẩm FV và EN 3.3.3 Nghiên cứu độc tính cấp của chế pham FV va FN

3.3.4 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của chế pham FN va FV

3.3 KIÊN NGHỊ VỀ KHẢ NANG UNG DUNG CAC CHE PHAM FLAVONOIT

CHIẾT XUẤT TỪ LÁ NHÃN ŒN) VÀ TỪ LÁ VẢI ŒV)

3.3.1 Nghiên cứu sử dụng chế phẩm EN để hình thành sản phẩm Agot — G

3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của chế phẩm Agot - G lên hoạt động của các enzym tiêu hoá tuyến tuy chó (amylaza, lipaza, proteaza)

3.3.3 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của sản phẩm Agot - Œ trên

chuột gây độc gan bằng Ethanol

3.3.4 Thử độc tính cấp của sản phẩm chức năng Agot - G

3.3.5 Phân tích, kiểm nghiệm và xây dựng tiêu chuẩn cho sản phẩm chức

năng Agof — G (sản phẩm có sử dụng chế phẩm Flavonoit từ lá Nhãn —

FN)

4 KET LUAN VA KIEN NGHI

Trang 4

TOM TAT THONG TIN VE DE TAI

1 Tên đề tài: “Nghiên cứu một số tác đựng sinh học của cúc hợp chất

Tavonot chiết xuất từ lú Nhân (Dimocarpus Longan Lour) wa ta Vai (Litchi Chinensis Sonn)”

2 Cơ quan quản lý để tài: Liên hiệp các hội khoa học và kỹ thuật Việt Nam

Địa chỉ: 53 Nguyễn Du, quận Hai Bà Trưng, Hà Nội

3, Cơ quan thực hiện: Viện Nghiên cứu, Đào tạo và Tư vấn khoa học công nghệ

Địa chỉ: Số 201 A — B, phố Đội Cắn, quận Ba Đình - Hà Nội

Điện thoại: (04)37222233

Fax: (04) 37222277

4 Chủ nhiệm để tài: TS Đào Thị Kim Nhung

Chúc vụ: Phó Viện trưởng Viện Nghiên cứu, Đào tạo và Tư vấn khoa học công nghệ

Địa chỉ: Số 9, phố Đội Cung, quận Hai Bà Trưng, Hà Nội

Điện thoại: (04) 39761106 5.Mục tiêu của đề tài

Nghiên cứu, hướng tới khai thác và ứng dụng các hợp chất Flavonoit chiết

xuất từ lá Vải và lá Nhãn làm nguyên liệu mới dùng trong lĩnh vực Bảo vệ sức

khoẻ cộng đồng

6 Nội dung chính của dé tai: gồm 3 phần

Phần 1: Chiết xuất, định lượng và phân tích thành phần hoá học của các chất Flavonoit thu nhận được từ các nguyên liệu là lá Nhãn, lá Vải tươi và khô

Phân tích sàng lọc hoạt tính chống oxy hoá của các chế phẩm Flavonoit thu

được

Phân 2: Nghiên cứu một số tác dụng sinh học của chế phẩm Flavonoit từ lá 'Vải và lá Nhãn

Nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá

Nghiên cứu vẻ tính an toàn (độc tính cấp)

Trang 5

-Nghién cứu hoạt tính kháng khuẩn

- Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan

Phan 3: Kiến nghị về khả năng ứng dụng các chế phẩm Flavonoit chiết xuất từ lá Nhãn và lá Vải

Nghiên cứu sử dụng chế phẩm EN để hình thành sản phẩm chức năng Agot - G

-Nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của sản phẩm Agot - G (tác dụng bảo vệ

gan, ảnh hưởng lên hoạt động các enzym tiêu hoá của tuyến tuy, thử độc tính

cấp)

-Phân tích, kiểm nghiệm, xây dựng tiêu chuẩn cho sản phẩm chức năng Agot- G 7 Thời gian thực hiện: 24 tháng, từ 05/ 2007 đến 05/ 2009 8 Kinh phí thực hiện - Kinh phí của đề tài được duyệt: 300.000.000 đ (ba trăm triệu đồng) - Kinh phí thực nhận: 258.000.000 đ Trong đó: Nam thứ nhất: 150.000.000 đ

Năm thứ hai: 108.000.000 đ [kinh phí được duyệt là 120.000.000đ, trừ 10% (12.000.000đ) chi phí tiết kiệm]

9 Danh sách cán bộ tham gia để tài Họ và tên Cơ quan công tác vee TS Dao Thị Kim Nhung _ | Viện nghiên cứu, đào tạo và tư vấn Ths Đỗ Thi Gim Ths Trần Thị Hiếu TS Hà Việt Sơn CN Trần Nam Thái

Ths Trần Quỳnh Hoa Trung tâm nghiên cứu và phát triển 14 tháng

Trang 6

CAC KY HIEU VIET TAT TRONG DE TAI

FV: ché phẩm Flavonoit chiết xuất từ lá Vải khô

EV: chế phẩm Flavonoit chiết xuất từ lá Vải tươi

EN: chế phẩm Flavonoit chiết xuất từ lá Nhãn khô

FN;: chế phẩm Elavonoit chiết xuất từ lá Nhãn tươi TLK: Trọng lượng khô tuyệt đối

ASTN: Ánh sáng tự nhiên

COOH: Chất chống oxy hoá

HD: Hoạt độ

ĐOL: Quá trình peroxy hoá lipit

HTCO: Hoạt tính chống oxy hoá

DAM: dialdehyl manonyl

SKLM: Sắc ký lớp mỏng

DMSO: Dimethyl sulphoxide

MIC: Néng độ tre ché téi thiéu ( Minimal inhibitory concentration)

MTT: 3 - (4,5 — dimethylthiazol — 2 - yl )— 2,5 — diphenyl tetrazolium bromide

ICsp: Néng d6 we chế 50% lượng vi sinh vat (Inhibitory concentration 50%)

LDsp: Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (Lethal dose 50%)

AST: Alanin amino transferase ALT: Aspartate amino transferase ACD: dung dich Axit citrate dextrose

Trang 7

MỞ ĐẦU

Các hợp chất Flavonoit thiên nhiên có nhiều tác dụng sinh - dược học giá

trị, được phân bố rộng rãi trong thế giới thực vật, ít độc đối với cơ thể đang thu

hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới Việc nghiên cứu về cấu

trúc hoá học, các đặc điểm lý - hoá - sinh học và khả năng ứng dụng của

Flavonoit vào các lĩnh vực khác nhau của đời sống (y được, thực phẩm, mỹ

phẩm, sinh học phân tử ) đã trở thành một trường phái mạnh ở nhiều quốc gia phát triển (Mỹ, Anh, Nga, Hàn Quốc, Trung Quốc ) Người ta đã tìm thấy hon

4000 chất Flavonoit thực vật cùng hoạt tính sinh học của chúng liên quan đến

khả năng phòng ngừa và điều trị nhiều bệnh khác nhau ở người

Năm 2006 Viện Nghiên cứu, Đào tạo và Tư vẫn Khoa học Công Nghệ

đã công bố công trình nghiên cứu vẻ hoạt tính chống oxy hoá (antioxydant) của

Flavonoit ở 48 cây trồng và cây mọc hoang dại; trong đó lá Vải và lá Nhãn là

những đối tượng nghiên cứu được chọn vào nhóm nguyên liệu có nhiều triển

vọng cho việc khai thác và ứng dụng

Cây Vải (Litchi Chinensis Sonn) và cây Nhãn (Dimocarpus Longan Lour)

ộc họ Bỏ hòn Sapindaceae, là những cây ăn quả lâu năm trồng phỏ biến

cùng thì

ở miền Bắc Việt Nam Hàng năm, sau mỗi vụ thu hoạch quả (Vải từ tháng 5 —>

7, Nhãn từ tháng 8 —>10) người trồng cây thường đón lá để bắt đầu quy trình chăm bón cây cho mùa vụ năm sau Khối lượng khổng lồ lá bỏ đi có thể trở thành nguồn nguyên liệu rất phong phú nếu được khai thác và sử dụng hợp lý Vì vậy, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu trên đối tượng này với mong muốn phát

hiện một số tác dụng sinh học của các hợp chất Elavonoit chiết xuất từ lá Nhãn

và lá Vải góp phan hướng tới mục đích chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ cộng đồng

Những nội dung chính của đề tài

Trang 8

-Dùng các phương pháp sắc ký và quang phổ để so sánh, đánh giá sự khác biệt

giữa các cặp Flavonoit tách ra từ nguyên liệu tươi và khô Sơ bộ nhận dạng thành phần Flavonoit chủ yếu (aglycon) của các chế phẩm Flavonoit thu được

-Phân tích sàng lọc hoạt tính chống oxy hoá của các chế phẩm Elavonoit thu

được

Phân 2: Nghiên cứu một số tác dụng sinh học của chế phẩm Flavonoit từ lá 'Vải và lá Nhãn

Nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá

Nghiên cứu vẻ tính an toàn (độc tính cấp) Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn

-Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan

Phan 3: Kiến nghị về khả năng ứng dụng các chế phẩm Flavonoit chiết xuất từ lá Nhãn và lá Vải

Nghiên cứu sử dụng chế phẩm EN để hình thành sản phẩm chức năng Agot - G

-Nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của sản phẩm Agot - G (tác dụng bảo vệ

gan, ảnh hưởng lên hoạt động các enzym tiêu hoá của tuyến tuy, thử độc tính

cấp)

Trang 9

1 TONG QUAN TAI LIEU

1.1 CÂY VẢI THIỀU

Cây Vải thiểu có tên khoa học là Litchi chinensis Sonn thudc ho bé hoa

Sapindaceae Cay Vai được trồng & khấp Việt Nam và còn thấy & Campuchia, lào, Trung Quốc, Thái Lan, phía bắc Ấn Độ Vải là một cây ro, có thể cao ri 10 m Cành thường mọc ngang, lá kép chăn, gồm 3 đến 4 đôi lá chét hình mác, hay

thuôn dài, hai đầu tù, dai, mặt trên bóng, mặt dưới mờ Hoa mọc thành chuỳ tận

cùng, trên cành mang hoa phủ đầy lông nâu nhạt Hoa không cánh, 5 lá đài dính nhau Quả hình cầu, vò quả khô và mỏng, sản sùi chứa một hạt to bao bọc bởi

một áo hạt (cùi vải) trắng, mắm, nhiều nước, thơm ngọt và chua, ăn được Quả

vải thường thu hoạch vào tháng 5 -7 dùng ăn tươi bay sấy khô hoặc đóng hộp dùng dân Hạt vải thái mông phơi hay sấy khô dùng làm thuốc với tên lệ chỉ hạch

Thành phân hoá học của cây vải: trong áo hạt (tử y) ta thường gọi là cùi

vải có chất đường (chủ yếu là glucoza) 66%; protein 1,5%; chất béo 1,4%; vitamin C (trung bình 40mg trong 100g dịch áo hạt); ngoài ra còn có các vitamin

A và B ( loại viamin này thường chỉ thấy trong áo hạt tươi, khó thì thường mất

đi); axit xitric

Công đựng: cùi vài được dùng để ăn và làm thuốc Áo hạt có vị ngọt, chua, tính bình hay ôn, không có độc, có tác dụng nuôi huyết, làm hết phiền khát, tiêu thũng, chữa những bệnh mụn nhọt Hạt vải (lệ chỉ hạch) cũng là một vị thuốc

được dùng từ lâu đời và theo đông y thì lệ chỉ hạch có vị ngọt, chát, tính ôn,

không có độc, có tác dụng tán hàn, thấp kết khí, là thuốc chữa âm nang sưng đau

(thoát vị), chữa ia chảy ở trẻ con Ngoài ra người ra còn dùng hoa, vỏ thân và rễ

của cây Vải sắc lấy nước súc miệng chữa bệnh viêm họng, đau răng Hạt vải chữa đau dạ dày, ruột non, đau tỉnh hoàn (sắc uống ngày 6 -10g/ngày); vỏ quả vải chữa đau bụng đi ngoài; lá vải dùng trị các vết cấn của động vật

1.2 CÂY NHÃN CÙI

Cay Nhãn cùi có tên khoa học là Øimocarpws longan Lour thuộc họ bồ

hòn Sapindaceae là cây ăn quả lâu năm, được trồng và mọc hoang ở khắp nơi

Trang 10

thân gỗ ro, cứng, vỏ xù xì, nhiều cành, nhiều lá um tùm, quanh năm xanh tốt Lá

kép lông chim, mọc so le, gồm 5 -9 lá chét, dài 7 -9 em, rộng 2-4 em, hình bầu dục dài, mép nhăn Hoa nhỏ mọc thành chùm, màu vàng nhạt Mùa hoa tháng 3-

4 Cây trồng từ 4 — 5 năm thì có quả, mùa quả thường từ tháng 7 — 10; quả to

bằng hòn bi, hay hơn (đường kính có khi tới 3 em), vò ngoài hơi nháp, trong có

áo hạt mọng bao, bọc một hạt đen nhánh bên trong

Thành phần hoá học : cùi nhãn tươi có các thành phần sau %: nước 77%;

chất béo 0,13 %; protein 1,47%; hợp chất có chứa ni tơ tan trong nước 20,55%; ngoài ra còn có các vitamin A và B Cùi nhãn khô chứa nước 0,85%; chất ran trong nước 79,77%; chất không tan 19,39% ; tro 3,36% Trong phần tan trong

nước có chứa glucose 26,91%, saccharose 0,22; hợp chất có ni rơ 6,309% Hạt

nhãn chứa rỉnh bột, saponin, chất béo và tanin Lá nhãn có chứa quercetin, quercerrin, tanin

Công dụng: theo y học cổ truyền quả nhãn cho cùi ăn hoặc đem chế biến thành long nhãn; cùi nhãn dung chữa trí nhớ suy giảm hay quên, mất ngủ, than

kinh suy nhược, yếu gan, tỷ kém, máu xấu, rong kinh, suy nhược cơ thể; lá nhãn

ngừa sởi, cảm lạnh, sốt rét, viêm một, trị một số bệnh ngoài da, chữa bệnh về

thậ

để dùng); hạt quả trị đau dạ dày, thoát vị, mụn nhọt, bỏng, chảy máu (dùng uống

vỏ cây và vỏ quả dùng chữa bỏng, đau răng (đốt tán thành bột hay nấu cao

hoặc bôi ngoài) Rễ thường dùng để chữa dưỡng chấp niệu, bạch đới, thống phong

Các kết quả nghiên cứu của dự án “Khảo sát một số loại cây cỏ giàu

#lavonoit có hoạt tính chống oxy hoá - antioxydant cao để định hướng khai thác

làm thuốc phòng chữa bệnh” do các cán bộ của Viện Nghiên cứu, Đào tạo và Tư vấn khoa học công nghệ thực hiện, nghiệm thu năm 2006 đã cho thấy trong lá

Vải và lá Nhãn tích luỹ khá nhiều các hợp chất Polyphenol, trong đó hàm lượng các hợp chất Flavonoit chiếm một tỷ lệ tương đối cao; các chế phẩm Flavonoit này có hoạt tính chống oxy hoá (HTCO) rất tốt — là tiêu chuẩn cần thiết đối với một hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh — dược

1.3 NHÓM HỢP CHẤT FLAVONOIT

Trang 11

tế bào rhực vật quang hợp Các Flavonoit không được tổng hợp ở người và động vật; chúng được tìm thấy ở động vật là do động vật ăn thực vật mà có

-Elavonoit được cấu tạo bởi khung cacbon Cạ-C;-C;, gồm 2 vòng Benzen

(vòng A và B) và một vòng pyron (vòng C); trong đó vòng A kết hợp với vòng C

Tạo rhành khung Chroman

oH Oo

Khung eacbon của Elavonoit

-Trong thực vật Elavonoit tồn tai ở 2 dạng: dạng tự do (gọi là aglycon) va dang

liên kết với đường (glycozit) Các glyeozit khi bị thủy phân bằng axit hoặc enzym sẽ giải phóng ra đường và aglycon Tùy theo mức độ oxy hóa của mạch 3 cacbon, sự có mặt hay không của nối đôi giữa C„ - C; và nhóm cacbonyl ở C„ mà phân loại các aglyeon của Flavonoit thành các nhóm phụ sau:

+Flavon, Flavonol, Flavanon, Elavanonol, Catechin, Leucoanrhoxyanidin,

Anthoxyanidia, Chaleon, Auron

+Ngoài ra còn có các dẫn xuất

1zoflavonoit (vòng B nối với vòng C ở vị trí C,) Neoflavonoit (vòng B nối với vòng C ở vị trí C„

Biflavonoit (2 phan tit Flavonoit liên kết với nhau)

-Mỗi vòng A, B, C của phân tử Flavonoit đêu có mức độ hydroxyl hóa, methoxyÏ hóa khác nhau; vì vậy hoạt tính sinh hóa của các Flavonoit và các chất chuyển hóa của chúng phụ thuộc vào cấu trúc hóa học và sự định hướng của các phần tử khác nhau trên phân tử Cấu trúc của các Elavonoit là nền tẳng của nhiều giả thuyết về tác động sinh lý của chúng

13.1 Tinh chat hod hoc

Tlavonoit đa dạng về cấu trúc hoá học, vì vậy khả năng phản ứng hoá học của chúng rất lớn Hoá tính của flavonoit phụ thuộc vào nhiều yếu tố: các nhóm hydroxyl, ahém cacbonyl, adi doi C, - C,, su eó mặt và vị trí các nhóm thế trong

Trang 12

Kha năng tham gia nhiều phản ứng đặc hiệu đã tạo nên hoạt tính sinh học đa dạng của lớp chất này

Tlavonoit là một polyphenol, do đó chúng có đủ các tính chất hoá học của

phenol, ngoài ra, chúng còn có thêm một số tính chất do cấu rạo đặc thù rạo nên

* Phản img cila nhém hydroxyl (OH) -Phản ứng oxy hoá -Phản ứng với kiểm -Khả năng tạo các liên kết hydro -Phản ứng este hoá *Các phần ứng của vòng thơm -Phản ứng thế

-Phản ứng diazo và azo hoá “Phân ứng của nhóm cacbonyl

-Phản ứng Shinoda (phản ứng shinoda đặc trưng cho các nhóm flavonoit có nhóm caebonyl ở vị trí C„)

-Phản ứng tạo phức với kim loại

Các flavonoit có nhóm cacbonyl ở vị trí C, và nhóm hydroxyl & vi ti C, hoặc C„ đều dễ tạo phức với kim loại

Flavonoit c6 hai nhóm hydroxyl ở vị trí Cạ và C„ cũng tạo phức với kim loại

Tính hoạt động hóa học cao của các Flavonoil biểu hiện ở ái lực khi kết

hợp với các Polymer sink hoc, céc ion kim loại nặng cũng nhục khả năng xúc tác

cho sự vận chuyển điện tử và bẫy các gốc tự do (Antioxydant) Những Fiavonoit có hoạt tính sinh học được gọi ta Bioflavonoit

Tưới đây là một số dẫn liệu vẻ tác dụng sinh - dược học tiêu biểu của

Elavonoit đã được công bố trên các kênh thông tin quốc tế (sách chuyên ngành,

tạp chí, hội nghị 1.3.2 Hoạt tính

h học của Flavonoit

(1) Tác dung chéng oxy héa (antioxydant)

Trang 13

dây chuyên sinh ra bởi các gốc tự do hoạt động Hoạt tính này thể hiện mạnh hay

yếu phụ thuộc vào đặc điểm cấu tao hóa học của từng chất Flavonoir cụ thể

Bình thường các gốc superoxyt (O?) được sinh ra trong quá trình hô hấp

tế bào chuyển thành nước (HO) theo phản ứng của các enzym superoxyL

dismuraza (SOD), catalaza hoặc glutathion peroxydaza Từ anion gốc superoxyt

(O¿”) được sinh ra ban đầu sẽ sản sinh ra hàng loạt gốc: '!O;, 'OH, và các gốc tự do khác Các gốc này được gọi là các dạng oxy hoạt động: chúng ít bên và có khả năng phẫn ứng rất lớn, là thủ phạm gây bệnh tật Phản ứng của gốc tự do là nguyên nhân sinh ra quá trình peroxy hóa các chất hữu cơ Các gốc ‘OH và oxy đơn bội !O„ thường là tác nhân khơi mào phản ứng Tiếp đó các gốc thứ cấp phản ứng với các phân tử mới khác ờ gần tạo ra phản ứng dây chuyển , cứ thế nhân mãi lên, không dừng lại và kéo dài cho tới khi tiêu tốn hết cơ chất (không có enzym tham gia) ứng với thời kỳ này, các cơ quan tổ chức bị phá hoại nghiêm trọng, gây nên những biến đổi bệnh lý như ung thư, hoại tử, rối loạn chuyến hóa Đến giai đoạn dập tắt mạch, các gốc phản ứng với nhau tạo ra những sản

phẩm bền, trung tính

Thidy: RB, +R RR,

Hau quả là xảy ra quá trình polyme hóa Thí dụ, ở người già, các tổ chức bị xơ chai, không mềm mại, bởi vì phản ứng gốc tự do đã làm cho các gốc liên

hợp lại với nhau Như vậy, sự tăng số lượng các gốc tự do hoạt động trong tế bào

làm cho các phân tử sinh học bị biến đổi, những prorein bất thường xuất hiện

trong cơ thể, đó là nguyên nhân phát sinh nhiều bệnh nguy hiểm và sự già của cơ

thể

Ngoài các gốc tự do sinh ra trong quá trình sinh lý bình thường, cơ thể còn

bị ảnh hưởng của các dạng oxy hoạt động phát sinh bởi các yếu tố từ bên ngoài

như tia phóng xạ, tia cực tím, bức xạ mặt trời, thuốc trừ sâu diệt cỏ, các chất

niro hữu cơ, các phảm nhuộm, các chất độc hướng gan như CCI,, hydrocacbon

đa vòng, các chat mau azo, cdc stress

Các gốc tự do độc hại lại liên quan đến nhiều bệnh hiểm nghèo như bệnh

tim mach, ung thuc, thân kinh, thoái hoá, lão hoá, rối loạn chuyển hoá cơ bản

Trang 14

NHUNG TRANG THAI BENH LY CHINH LIEN

QUAN DEN GOC TU DO Tim Não Nhỏi máu Sốc Tiêu cục nghẽn mạch Parkinson Xơ cứng cột bên teo cơ Alzheimer Bệnh cơ tìm Phối Khóp ội chứng suy hô hấp ở Tho người trưởng thành Ruét

Than 'Viêm tuy,

Ghép thận #—( Stress oxy ——»| Loet

Suy thân mãn hoá gốc tự do Bệnh Crohn Thiếu máu cục bộ Xơ nang tuy, Đa phủ tạng Vien tây Ngộ độc Bội tích sắt Ung thư Hồng cầu Mạch Due thuy tinh thể AIDS: - Bệnh võng mạc

Lao hoa Thiếu máu Vữaxơ - Thoái hoá điểm vàng

'Nghiện rượu Sốt rét Tăng huyết áp

Đái tháo đường

Để chống lại tác hại gây ra bởi các gốc tự do đó, mỗi cơ thể sống có những hệ thống chống oxy hóa nội sinh, ngoài ra còn có những chất antioxydant

khác được đưa vào cơ thể theo dạng thức ăn, thức uống Ngày nay, nhiều nhà

hóa - sinh học cho rằng Flavonoit là chất anioxydanr lý tường đối với con người

Do bản chất cấu rạo polyphenol nén Flavonoit ở trong tế bào thực vật hoặc

trong cơ thể động vật và người chịu tác động của các biến đổi oxy hóa- khử, bị oxy hóa từng bước và tổn tại ờ các dạng hydroquinon, semiquinon, quinon Những Elavonoit có các nhóm hydroxyl sắp xếp ở vị trí ortho dé dàng bị oxy hóa

Trang 15

dưới tác dụng của các enzym polyphenoloxydaza và peroxydaza có trong tế bào

động, thực vật; phản ứng như sau:

1 O, + Flavonoit (khử) — PVP2#/#22— rlavonoir (bị oxy hóa) + H,O

(Hydroquinoa) (Semiquinon hoặc Quinoa)

2 HO, + Flavonoit (Khir) "2" > Ftavonoit (dang bi oxy héa) + HO

(Hydroquinon) (Semiquinon hoặc Quinoa)

Semiquinon hoặc quinon là những gốc tự do bên vững, có thể nhận điện tử và hydro từ những chất cho khác nhau để trở lại dạng hydroquinon Các chất này

có khả năng phản ứng với các gốc tự do hoạt động để triệt tiêu chúng

Như vậy, khi đưa Flavonoir vào cơ thể sẽ sinh ra gốc tự do bền vững hơn các gốc tự do được hình thành trong quá trình bệnh lý (viêm nhiễm, ung thư, lão hóa ), chúng có khả năng tòa các điện tử trên mạch vòng của nhân thơm và

hệ thống nối đôi liên hợp, làm triệt tiêu các gốc tự do hoạt động Các gốc tự do tạo nên bởi Flavonoir phản ứng với các gốc tự do hoạt động và trung hòa chúng

nên không tham gia vào dây chuyển phản ứng oxy hóa tiếp theo Vì vậy Flavonoit duge goi là "Những tác nhân thu đọn và hủy diệt" các gốc tự do độc hại

Ngoài cơ chế trên, Flavonoit còn kìm hãm sự phát sinh các gốc tự do hoạt

động do có khả năng tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp như Fe”, Cu để chúng không thể xúc tác cho phản ứng Fenron sinh ra các gốc hoạt động như

“OH, 'O,

Khi phân tích mối liên hệ giữa cấu trúc Flavonoit và hoạt tính chống oxy hóa, người ta thấy rằng các phân tử Flavonoit với nhiều nhóm hydroxyl ở vòng A và B, có nối đôi ở vị trí C; = C¿, có nhóm hydroxyl tự do ở vị ríC; và nhóm bán

xeto ở vị trí C thường thể hiện đặc tính chống oxy hóa mạnh

(2) Tác đụng đối vái enom

Các Flavonoit có khả năng tác động đến hoạt động của nhiều hệ enzym

động vật trong các điều kiện in vi#ø và in vo Khả năng tương tác với protein

là một trong những tính chất quan trọng nhất của các hợp chất phenol, quyết

định hoạt tính sinh học của chúng Phản ứng xảy ra giữa nhóm oxyphenolie và oxycaebonyl của các nhóm peptit để rạo thành liên kết hydro

Trang 16

(3) Tác đụng kháng sinh, chống viêm nhiễm

Tác dụng chống viêm nhiễm và kháng khuẩn của Flavonoit đã được nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới chứng minh Một số tác giả nghiên cứu tác dụng của 24 anthoxyanin, leueoanthoxyanin và axit phenolie lên Saimonella (vi khuẩn

thương hàn) và thấy có tác dụng kìm hãm rõ rệt Hầu hết các chất này đều có khả

năng kìm hãm sự hô hấp hay phân chia của vi khuẩn khi có mặt glueoza Tác dụng kháng virut của Flavonoit cũng đã được khẳng định; Chang-Qï Hu và cộng sự đã nghiên cứu khả năng ức chế virut HIV ở các tế bào H9 của 35 Flavonoit

chiết xuất từ thực vật và tổng hợp - đã thấy rằng các hợp chất có nối đôi ở vị trí

C=C, va cé nhóm OH ở Cạ và C, thể hiện hoạt tính cao hơn

Cơ chế rác dụng kháng sinh của Flavonoir còn rất ít được nghiên cứu, các tác giả đưa ra một số giả thuyết sau:

- Flavonoit tic ché enzym transpeptidaza làm cho mucopeptit - yéu tố đảm bảo

cho thành tế bào vi khuẩn vững chắc không rổng hợp được

- Gắn lên màng bào tương của vi khuẩn, làm thay đổi rính thấm chọn lọc của

màng nguyên sinh chất Vì vậy làm một số chất cần thiết cho đời sống vi khuẩn

như nueleotit, pyrimidin, purin lọt qua màng bào tương ra ngoài

-Tác động lên quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn theo 2 kiểu: phong bế mạch peptit của vi khuẩn bằng cách phong bế enzym transferaza chuyến axit

amin từ ARN vào mạch làm mạch không kéo dài thêm được hoặc Tạo ra protein

bất thường vô dụng với đời sống của vi khuẩn làm chúng không sử dụng được - ứ chế tổng hợp axit nueleie

- Flavonoit có thể tác động vào ADN khuôn, ức chế tổng hợp ARN của vi khuẩn

(4) Tác dụng đốt với các bệnh từm mạch

Tác động bảo vệ của các Flavonoit đối với ỉm mạch có thể do khả năng

của chúng trong việc ngăn ngừa sự oxy hóa các lipoprorein ty trọng thấp, phòng

ngừa sơ vữa động mạch, chặn sự kết tụ huyết khối, điều hòa nhịp tỉm, ngăn ngừa bệnh mạch vành và nhỏi máu cơ tỉm, điều hòa huyết áp

Trang 17

Các Flavonoit có tác dụng làm bền thành mạch tương đương với hoạt tinh

vitamin P Nam 1936, Szeot Gyorgy va cong su da tìm thấy một số dấu hiệu của

bệnh chảy máu và viramin C đơn thuần không cầm được, nhưng lại được chữa

khỏi bằng nước chanh Szent Gyorgy đã tách chiết chất này và đặt tên là ciin

Đó là một hỗn hợp các dẫn xuất Flavonoit; chúng không tác dụng lên bệnh

Scocbur nhưng có tác dụng trên thành mạch Về sau, chất citrin này được đặt tên

la Vitamin P (Vitamin de Permiabilite) Lavollay, Neumann, Porrot đã chứng

minh: catechin có tác dụng mạnh hơn viramin C rong việc giữ bền thành mạch

Tiếp sau đó, các tác giả phát hiện rằng vitamin P là tập hợp của nhiều loại sắc tố thực vật gốc Flavonoit Đại diện điển hình là eateehin và leucoanthoxyan, rồi đến Flavonol (rutin, quercetin), flavanon (hesperidin) và một số chalcon Những

Flavonoit trén có tác dụng làm tăng sức bền và tính đàn hồi của thành mao mạch,

chủ yếu là do khả năng điều hòa, làm giảm tính thấm mao mạch, ngăn cản không cho protein của máu thẩm dịch qua các mô khác; có tác dụng dự phòng vỡ

mmao mạch, gây xuất huyết, gay phi thing

(5) Tác đụng bảo vệ gan

Tính chất chống oxy hoá của Flavonoit đóng vai trò rất quan trọng trong

sự ngăn chặn quá trình huỷ hoại cấu trúc và chức năng của gan trong nhiều trang

thái bệnh lý, làm tăng nhanh quá trình tái sinh và phục hỏi chức năng của tế bào gan Flavonoit đống vai trò chủ yếu trong những liệu pháp phức tạp để điều trị

viêm gan cấp và mạn rính, sơ gan

Trong y văn, có rất nhiều tài liệu nghiên cứu hoạt tính bảo vệ gan của một

Flavolignan [a cilibinin (cilimarin) trong những mô hình bệnh lý thực nghỉ

Chất này ngăn cản sự peroxi hoá lipir màng rế bào gan, ngăn cản sự tạo thành quá thừa các axir béo và cholesteron, tăng cường quá trình sửa chữa các sai lệch,

loại mừ rác dụng ức chế của galactosamin trong sự tổng hợp protein của

mierosom và glyeoprotein của gan, và đẩy nhanh quá trình acetyl hoá chất này

'Trong trường hợp viêm gan ở chuột tao nên bởi CCI,, cilibinin ngăn cản sự tích

luỹ trong gan các hợp chất dien liên hợp — maloyl dialdehyd va cdc base Schifs, làm hoạt hoá hệ thống oxy hoá tự nhiên của gan và ổn định màng các vi thể

Trong viêm gan chuột do CCI,, chế phẩm convaflavin (flavonoit toàn phần của cây huệ chuông Convalfaria majalis L), chế phẩm caleflon (hỗn hợp các polyphenol cia cay xu xi Calendula øfficinalis L) tò ra có tác dụng tốt Cơ chế

Trang 18

tác dụng của các chế pham dé Ia sur diéu hoa sinh tag bop glycogen, diéu hoa chuyển hoá lipit và điều hoà hoạt độ các enzyme của gan

Khi nghiên cứu so sánh tác dụng bảo vệ gan của các chế phẩm Flavonoit: liquiriton, ascortin, quercetin va cả bột hoa cây dam but gidm (Hibiscus sabdarifla L) mà thành phần chủ yếu là các glycoside eyanidin và đelfinidin và các Flavonoit: quereetin, hibisein, myrieiin, gossipein, gossipetrin, sapdarerin, hibiseein Trên mô hình viêm gan chuột do CCl,, người ta thấy có sự khác nhau hàm lượng các lipid

trong máu, sự đọng lipit ờ tổ chức gan và sự huỷ hoại tế bào ở gan Về chỉ riêu hạ

rõ rột giữa tác dụng của các chế phẩm đó qua các chi tie

hấp hoạt độ aminotransferase và hàm lượng lipit trong huyết tương và trong gan

thì từng chế phẩm nói trên đều không thua kém cilimarin Điều đó nói lên là với mục đích điều trị, điều trị hợp lý là không dùng riêng từng Flavonoit mà là dùng

hỗn hợp nhiều Flavonoit một lúc

(6) Tác đụng đốt với ung thu

Các nghiên cứu trên động vật thực nghiệm và các số liệu dịch tễ đã chỉ ra

rằng các nhân t6 thức ăn đóng một vai trò quan trọng đối với sức khỏe động vật

và con người liên quan tới sự phát triển của một số bệnh kể cả ung thư Quả và

rau tuoi giàu vitamin A, C, E, B - caroten, Flavonoit và các thành phân khác đã

được nghiên cứu như các nhân tố ngăn ngừa ung thư Nhiều mô hình tế bào nuôi cấy và động vật thực nghiệm đã chỉ ra rằng hoạt tính chống ung thư mạnh của

một số polyphenol gián tiếp thông qua một số cơ chế khác nhau Khi đưa ra một

số chất Elavonoir vào vật chủ mang khối u thì người ta thấy chúng có tác dụng

liệu nhưng hầu như không độc hại (với liêu lượng xác định) Các chất này có tác dụng kim ham các enzym oxy hóa khử, kìm hăm quá

như những tác nhân hóa trị

trình glyeolyse và hô hấp, kìm hãm quá trình giảm phân, hạn chế sự phá vỡ cân

bằng của các quá trình trao đổi chất bình thường trong tế bào

L.B Kukushkina và cộng sự đã thử nghiệm dùng chất ionol và propylgalat

điều trị cho chuột gây ung thư báng nước và ung thư gan bằng chủng tế bào ung thư 22a Phương pháp điều trị bằng cách cho uống và tiêm trực tiếp thuốc vào

khoang bụng Kết quả được đánh giá thông qua theo dõi lâm sàng và phương

pháp đánh dấu L- C aminoaxit để theo dõi quá trình rổng hợp prorein Dung

địch Serrer và Darell được dùng để nghiên cứu ARN từ những tế bào u báng Kết

Trang 19

quả chứng minh khả năng kìm hãm sự phát triển của khối u phụ thuộc nồng độ

thuốc Sự phụ thuộc ấy liên quan chặt chẽ với hiệu lực kìm hãm tổng hợp protein

va ARN 6 té bao u

Các công trình nghiên cứu của Racker và cộng sự cho biết các tế bào ác

tính gây bởi virut (kiểu Rous sareoma virus) có liên quan đến tác dụng của các

kinaza Khi ủ các tế bào ung thư nuôi cấy với Flavonoit, các tế bào ác tinh trở lại thành các tế bào bình thường do Flavonoir đã làm thay đổi hoạt tính của các

kinaza

Với nỗ lực nhằm nghiên cứu khả năng chống ung thư của các hợp chất

Flavonoit, gần dây nhiều tác giả trên thế giới đã tiếp tục thử nghiệm tác dụng i¡ vitro va in vo của Flavonoit lên các dòng tế bào ung thư khác nhau, Dyung-Zun Aha và Gyn-Yong Song đã nghiên cứu tác dụng của 46 flavon tổng hợp lên các

dòng tế bào ung thư khác nhau và rút ra nhận xét các hợp chất 2'-benzyloxy-5

metoxyflavon, 2-benzoloxy - 5,7-dimetoxyflavon, 2'-beazyloxy - 5,78 - trimeroxyflavon, 2'-benzyloxy - 5 — hydroxyflavon thể hiện tính gây độc tế bào đối với dòng tế bào LI 210 và HL- 60 Tác dụng chống khối u gây bởi dòng tế bào ung thu S -180 trên chuột đối với 52-dihydroxy - 6, 7, 8, 6 -

1errameroxyflavon chiết xuất từ Scwfeliaria baicaliensis đã được chứng minh bời

B Ahnn và cộng sự

(7) Tác dụng đối với chuyển hóa và trên lâm sàng

Các Flavonoit được hấp thụ theo đường dạ dày - ruột ở người và động vật,

và được bài tiết nguyên dạng hoặc dưới dạng chất chuyển hóa của chúng qua nước tiểu và phân Một vài Flavonoit dạng glyeozit bị deglyeosyl hóa bởi các enzym trong các loại mô của người trong khi các chất còn lại không bị biến đổi Tốc độ và phạm vi deglycosyl hóa phụ thuộc vào cấu trúc Flavonoit và vị trí, bản chất của gốc đường bị thay thế Phép do khả năng chống oxy hóa của huyết

tương và nước tiểu sau khi tiêu hóa Chè xanh đã cho thấy sự hấp thụ các chất

oxy hóa trong chè xanh diễn ra nhanh, các chất chống oxy hóa đi vào vòng tuần hoàn ngay sau khi uống vào làm cho lượng chất chống oxy hóa trong huyết

tương tăng lên đáng kể Benzie va cs (1999) đã cho thấy rằng sự tăng hàm lượng

Elavonoit chè xanh trong huyết tương có thể làm giảm sự thiệt hại do oxy hóa

gay ra và vì thế làm giảm nguy cơ mắc ung thư

Trang 20

Các Flavonoit có tác động sâu sắc lên chức năng của các tế bào miễn dịch

và tế bào viêm Trongeác nghiên cứu trên động vật hai este methyl EGCG tách

chiết từ Chè ôlong gây kìm hãm đáng kể lên các phản ứng dị ứng trên chuột Gaby (1998) đã chỉ ra rằng quercetin có thể có giá trị trong điều trị hen suyễn và

tốt cho các bệnh nhân tiểu đường va ahiém HIV (human immunodeficiency

virus) Elavonoit baicalin rong các nghiên cứu gần đây cho thấy có hoạt tính

chống viêm và chống HTV - 1 theo cơ chế gây cản trở sự tương tác giữa các

protein vỏ của HIV-1 với các receptor và ngăn chặn HIV-1 tấn công vào các tế

bào đích

(8) Một số ứng đụng của biaFlavonoit trong y học

- Bảo vệ thành mạch, phòng chống nguy cơ chảy máu - Chống đị ứng

- Chống viêm loét, kháng khuẩn

- Điều trị các bệnh gan, mật

- Phòng và chữa một số bệnh liên quan đến chuyển hoá

- Bệnh tìm mạch: huyết áp, cholesterol và triglyxerol trong máu cao, điều hoà nhịp tìm, điều hồ chuyển hố canxi

- Một số bệnh liên quan đến nội tiết và điều hoà cân bằng sinh học của cơ

thể

- Hỗ trợ cơ thể khi dùng nhiều kháng sinh hoặc sống trong môi trường có

nhiêu bức xạ ion

- Miễn dịch: kích thích Iympho bào sản xuất interferon, chống virut xâm

nhập vào cơ thể và kìm hãm sự nhân lên của virur

- Giảm đau do tác dụng chống co thắt, giãn cơ trơn Làm giảm các đám

xuất huyết nhỏ trong bệnh đái đường

- Một số Flavonoit có tác dụng chống khối u lành và ác tính

- Làm tăng rạo máu do làm tăng tổng hợp axit folic của vi khuẩn đường

ruột, tăng số lượng hồng cầu và tỷ lệ hemoglobin

- Loại trừ rối loạn thần kinh cơ do thiếu viramin C

Với cơ sở sinh học trên, nhiều chát Flavonoit được sử dụng như những

chế phẩm thuốc đặc trị cho một số bệnh và được thế giới công nhận là một

trong những hợp chất tự nhiên có tác dụng làm châm sự hoá già của cơ thể

và chống đột biến tế bào

1.4 MỘT SỐ CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VỀ ELAVONOIT

Việt Nam có thảm thực vật nhiệt đới phong phú vẻ chủng loại, có điều

kiện sinh thái thuận lợi (nhiều ánh nắng) cho quá trình sinh tổng hợp các chat

Flavonoit Đấy là nguồn tài nguyên vô cùng lớn lao cần được nghiên cứu khai

Trang 21

thác để phục vụ đân sinh và phát triển kinh tế - xã hội Ở nước ta việc nghiên cứu vẻ các hợp chất Bioflavonoit còn rất ít; chỉ những năm gần đây mới xuất hiện một số công trình nghiên cứu của trường Đại học Dược Hà Nội, Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên, Viện Dược liệu, Viện

Y học Cổ truyền, Viện Nghiên cứu Đào tao và Tư vấn KHCN (thuộc Liên hiệp hội)

Tuy nhiên, các nghiên cứu còn lẻ tẻ chưa có hệ thống: Các nhà nghiên cứu và sản xuất chưa quan tâm đúng mức đến giá trị và tắm quan trọng của việc nghiên cứu khai thác nhóm chất này từ thiên nhiên để phục vụ tích cực cho đời sống cộng đỏng (có thể sử: dụng Flavonoit trong nhiều lính vực như y - dược, thực phẩm, mỹ phẩm, hóa công nghiệp)

-Công trình nghiên cứu của Vũ Quỳnh Trang, Trần Thị Long và Nguyễn Quốc Khang (Đại học Khoa học Tự Nhiên) đã chiết xuất thu các chế phẩm Polyphenol, Flavonoit, Alkaloit của lá cam canh vùng đồng bằng và vùng ỏi Tiến hành khảo sát tác dụng kháng khuẩn của các chế phẩm này trên 7 chủng vì sinh vật kiểm nghiệm các kết quả thu được bước đầu cho thấy: các chế phẩm đều thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tốt, và thể hiện hoạt tính mạnh nhất đối với Shipelia fieameri, yếu nhất đối với Escherichia Cali (Báo cáo hội nghị khoa học Hoá Sinh Y Dược năm 2006)

-Công trình nghiên cứu của Hà Thị Thanh Bình, Nguyễn Quốc Khang (2002) đã khảo

sat tac dụng hạn chế sự phát triển ung thư cơ đùi chuột bởi dòng tế bào ung thư S-180

của chế phẩm Flavouoit từ lá chè Tân Cương (Tạp chí Dược học, số 8, tr 23-24/30)

Tác nhân gây bệnh là chủng tế bào ung thư Sarcoma - I80 Kết quả cho thấy có sự hạn chế phát triển u đùi, hạn chế di căn ung thư tới gan và phổi rõ rằng

-Các nghiên cứu (2006) của Trần Thị Thanh Hương (Viện 69 — Bộ tư lệnh Lăng) và Nguyễn Thị Hà, Tạ Thành Văn (Bộ môn Hóa — Héa Sinh ĐH Y HN) cho thấy: bột

chiết polyphenol và Flavonoit (EGCG) chè xanh có tác dụng ức chế sự phát triển tế bào của dòng tế bào ung thư phổi LU-I và đồng tế bào ung thư gan Hep — G2, tác dụng tố

nhất trên dồng LŨ — l với giá trị IC50 là 3,84 uM của EGCG chè xanh Bước đầu phát

hiện sự tăng hoạt độ của enzym caspase — 3 trêu dòng tế bào LU -L được bổ sung

GCG chè xanh vào môi trường nuôi cấy

Trang 22

2 ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊ

2.1 DOI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối trợng thực vật

Đối tượng thực vat ding để nghiên cứu trong đề tài:

- Cây Nhãn cùi (2ữnocarpus Longan Luor): bộ phận sử dụng là lá bánh tẻ Thu hái vào tháng 8- 10, tại Hải Dương

- Cây Vải thiều (Litchi Chinensis Sonn): b6 phan str dung 1a 14 baénh té Thu hai

vào tháng 5 — 7, tại Lục Ngạn - Bắc Giang

Mẫu được thu hái vào các thời điểm thích hợp với từng loại cây, sau đó

được sấy khô ở 60C và tán nhỏ mẫu thu bột nguyên liệu và bảo quản trong lọ

đựng mẫu kín

2.1.2 Đối tượng động vật

a Máu người: máu tươi toàn phần của người khoẻ mạnh được chống đông bằng

ADC do khoa huyết học của bệnh viện Việt - Đức cung cấp Dùng cả 4 nhóm

máu A, B, AB, O b Động vật

- Chuột nhắt trắng Swiss: do Viện Vệ sinh dịch tế cung cấp, 6 tuần tuổi, trọng

lượng từ 20 — 22 gam, trạng thái sinh lý bình thường

- Cúc chủng Vĩ khuẩn tiểm định: do Viện Vệ sinh dịch tễ cung cấp

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Trang 23

2.2.1 Chiết xuất và định lượng Flavonoit tổng số theo phương pháp của B.C Talli [20]

a, Qui trinh chiét (B.C Talli)

Tach chiét Flavonoit téng số theo qui trình của B.C Talli, các bước trong qui trình được mô tả chỉ tiết dưới đây Bột nguyên liệu + Chiết bằng clorofooe (loai tap) ws, Bột nguyên liệu sấy khô Dịch chiết clorofooe Chiết bằng Ethanol

90” trên máy siêu Âm ¥

Dich chiét Ethanol Cô cạn ở áp suất giảm Cao Ethanol Chiết bằng nước cắt núng (chinh pH = 3- 4) Hoạt chất trong địch chiết nước Chiết bằng Btlylaxetat ¥ Dich chiét Ethylaxetat | Cô cạn kiệt, áp suất giằm trên mây cất quay TA ay 4a Diing Ethanol 96° —

gre a den PONE ERD ae hod tan Chế phẩm Flavoncit hồ

bột vơ định hàn | toàn phần | cenghien lễ nghiên cứu) i

Hinh 1: Quitrinh B.C Talli

b Dink tong Flavonoit tong sé

Trang 24

Cân chính xác 10g bột nguyên liệu, chiết bằng clorofooc trên máy siêu

âm; chiết trong 3 giờ để loại hết nhựa, chất béo, caroten và clorofooc Lấy phan

bột nguyên liệu ra, sấy cho bay hết clorofooc rồi tiếp tục chiết bằng Ethanol 96" trên máy siêu âm đến khi dịch chiết không còn cho phản ứng Shinoda Dịch chiết Ethanol được xác định thể tích chính xác và bảo quản trong bình thuỷ tỉnh

màu nâu có nút nhám kín

Lấy 50 ml dịch chiết Ethanol 96” đem cô cạn ở điều kiện áp suất thấp trên

máy cất quay chân không, sau đó chiết lại bằng nước cất nóng Dịch chiết nước sau khi đã lọc và chỉnh pH = 3 - 4 được cho vào phếu chiết, dùng Ethylaxetat chiết nhiều lần, sau đó đuổi kiệt dung môi trên máy cất quay chân không tới trọng lượng không đổi Cân xác định trọng lượng Flavonoit tổng số

Hàm lượng Flavonoit chứatrong mẫu phân tích được tính theo cơng thức:

X®% = [M;ạ—M¡)x V⁄ x10]/ 100 Trong dé:

XV: thể tích dịch chiết Ethanol từ 10 g bột nguyên liệu

v: thể tích dịch chiết Ethanol lấy ra để định lượng (50 ml) M¡: trọng lượng khi cân cặn Flavonoit cả bì M¡: trọng lượng bì Để định lượng, thí nghiệm được lặp lại 5 lần (n = 5), các kết quả được xử lý thống kê 2.2.2 Phân tích thành phần Flavonoit bằng sắc ký lớp mỏng, phổ quét và quang phổ hấp phụ tử ngoại [ 6,13] a Sắc ký lúp mông

- Bản mỏng Silicagel F 254 của Merk

- Chạy sắc ký một chiều từ đưới lên với hệ dung môi triển khai TEAF

(Toluen: Ethylaxetat: Axeton: Axit Focmic = 5: 2: 2:1)

- Quan sát sắc ký đỗ ở các điều kiện khác nhau như: ở ánh sáng tự nhiên;

phun các thuốc thử đặc tring (FeCl, NaOH, KOH, AICI; Willson, Diazo, Vanillin, NH OH ), quan sát đưới đèn từ ngoại ở bước sóng 254 và 365 nm b Đo phố quét trén may Shimaze CS — 9001 PC ~ Chrornafogram (đo ở bước sống 270 nm)

Trang 25

2.2.3 Xác định hoạt độ peroxydaza trong máu theo E C Xavron [ 20]

-Dựa trên nguyên tắc: xác định tốc độ của phản ứng oxy hoá cơ chất indigocarmin bdi HO; trong mdi trường axit yêu khi có sự tham gia của enzym peroxydaza Hoạt tính enzym peroxydaza được tính bằng thời gian phản ứng

oxy hóa indigocarmin Thời gian càng nhanh hoạt tính enzym càng cao và

ngược lại Hoạt tính enzym peroxydaza ở mẫu đối chứng (không có mẫu thử) là 100%, khi có mẫn thử hoạt tính enzym sẽ thay đổi Nồng độ mẫu thử (trong thí nghiệm này là chế phẩm Flavonoit) càng cao thì thời gian phản ứng càng kéo

dài, nghĩa là hoạt độ enzym bị giảm.Thí nghiệm được tiến hành trên cả 4 nhóm

máu O, A, B, AB với cdc néng dé flavonoit thay đổi khác nhan

- Nguyên liệu thí nghiệm:

Bốn nhóm máu (A, B, AB, O) người khoẻ mạnh, do khoa huyết học và truyền máu - bệnh viện Việt Đức cung cấp

Mẫu thử là các chế phẩm Elavonoit chiết xuất từ lá Vải và lá Nhãn

2.2.4 Xác định hoạt tính chống oxy hóain vitro của các chế phẩm flavonoit

thông qua quá trình peroxy hóa lipit tế bào gan chuột theo phương pháp của C G Blagodorov và cộng sự [ 7, 10]

- Nguyên tức: Bằng các thí nghiệm in vitro hoặc in vivo để đánh giá khả năng chống oxy hoá của một chất nào đó thông qua quá trình peroxy hoá lipit tế bào gan chuột dựa trên nguyên tắc: các gốc tự do của oxy sinh ra trong gan chuột là những tác nhân chính gây ra phản ứng peroxy hóa các chất hữu cơ (chủ yếu là các axit béo chưa no ở màng tế bào) Một trong những sản phẩm của quá trình này là dialdehyt malonyl (DAM) Chất này phản ứng với axit thiobarbiturie tạo ra phức có màu hồng bền ở À=532 nm Đo cường độ màu của phức (OD) có thể biết lượng DAM sinh ra nhiều hay ít Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) là tỷ lệ % lượng DAM giảm đi ở mẫu thử so với mẫu đối

chứng Thí nghiệm được tiến hành với các nồng độ Flavonoit khác nhau

-Nguyên liệu động vật: Gan tươi của chuột nhất trắng chủng Swiss khoẻ mạnh,

nặng 22 + 2 g

Trang 26

-Hod chdt: Dém Tris, FeSO, axit ascorbic, TCA, axit thiobacbituric

-Tién hanh: Mé ldy gan chuét nhat Can chinh x4c 100mg gan chuột làm

homogennat trong cối sứ ở điều kiện 4" C v6i 5 ml dém Tris 0,04 M, pH = 7,4

va 10 ml H,0 Ly tam 6 600 vong / phut trong 10 phat Sau d6 lay 3 ml dich ly

tâm cho vao hén hop gém: 0,4 ml FeSO, 107 M; 0,4 ml dung dich axit ascorbic

10? M Ủ hỗn hợp ở 37 C trong 1 giờ, lấy hỗn hợp ủ ra Thêm 2 ml dung dich axit thiobacbituric 0,25% Đun sôi cách thuỷ khoảng 15 phút, để nguội Đo màu ở bước sóng 532 nm

Lượng DAM được tính theo công thức:

C=D/e.I Trong đó:

€: số mol DAM D: mật độ quang học

1: chiều đây cuvet e: hệ số tắt mol = 1,56.10 M em”

2.2.5 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của các chế phẩm Flavonoit chiết

xuất từ lá Nhan va 14 Vai (in vivo) [3]

Nguyên tắc: Gây ton thương gan chuột thực nghiệm bằng cách tiêm ip

CCL với liều 4ml/kg_ San đó cho chuột nhất trắng uống mẫu thử theo các liều dự

định Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của các chế phẩm cần thử qua việc khảo sát khả năng ức chế quá trình peroxy hoá lipid (POL) và đồng thời thăm dò tác dụng điều hoà chức năng gan thông qua sự thay đổi hoạt tính các enzym AST, ALT trong huyết thanh chuột

A42 hình thí nghiệm: thí nghiệm được tiến hành trên chuột và được chia thành 3 lô - Lô 1: lô đối chứng sinh học (ĐCSH): chuột được nuôi và chăm sóc bình thường không dùng chế phẩm - Lô 2: chuột được tiêm 0,1 ml dung địch CCl, 10% trong dau ving, cham sóc bình thường

- Lô 3: chuột vừa được tiêm 0,1 ml dung dich CCL, 10% trong dầu ving

vừa được cho uống mẫu thử

Trang 27

Sau 72 gi

thương thực thể của gan và xác định DAM theo phương pháp C.G.Blagodorov tat cả các chuột thí nghiệm đều bị giết lấy gan để quan sát tồn

Lấy máu, tách huyết thanh để định lượng enzym theo phương pháp của

Reitruan va Eran KÍI trên máy phân tích sinh hóa tự động Asmes SEAC CH ~

100, hoá chất xét nghiệm được hãng Span Diagnostic Ltd cung cấp

2.2.6 Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của các chế phẩm Flavonoit chiết xuất từ lá Vải và lá Nhãn [2,12,18]

Các thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp: Èhuyách tán trên môi trường đặc và phương pháp pha loãng đa nâng độ

a.Phương pháp khuốch tán trên môi trường đặc

*NEuyên tắc: Dựa trên đường kính vòng vô khuẩn, có thể đánh giá khả năng kháng khuẩn của các mẫu nghiên cứu

* Mau th

các chế phẩm 1a: 1,2 mg/ml

hế phẩm Flavonoit chiết xuất từ lá Vải và lá Nhãn, néng độ thử của

* Môi trường nuôi cấy:

- Môi trường canh thang thường: 5g cao thịt + 10g pepfon bột + 5g muối tỉnh khiết (NaCl) + 1000 ml nước cất Đun nóng, khuấy đều cho tan hết các chất

Điều chỉnh pH = 7,4 - 7,6 rồi lọc Chuyển vào ống nghiệm $16, mỗi ống 5ml,

hấp khử trùng 110C trong 30 phút

- Môi trường Mueler Hinton: 5g cao thịt + 10 g pepton bột + 5g muối tinh khiết

+18 — 20g thạch sợi + 1000ml nước cất Đun sôi cho các chất hoà tan hoàn toàn Điều chinh pH = 7,4 — 7,6 Dung trong bình cầu, mỗi bình cần 250ml, hấp khử

trùng 110” C trong 30 phút

Trang 28

+ Vi khudn Gram (+): Staphylococcus aureus (Sa) ATCC 13709; Bacillus subtilis (Bs) ATCC 6633; Lactobasillus fermentum N4 Enterococus faecium

Besa

+ Nắm Candida albicans (Ca) ATCC 10231 b Phicong phap pha loãng đu nồng độ

-Nồng độ chế phẩm FV và FN được pha loãng như sau: chế phẩm ban đầu được pha trong DMSO có nông độ là 40 mg/ml sẽ được pha loãng thành các nồng độ

khác nhau: 256 pe/ ml; 156 ug/ mù; 64 ng/mÙ; 16 ug/ mù; 4hg/l; Iuz4nl ae thir

hoạt tính với các chủng vi sinh vật kiểm định ở trên

- Tiến hành: chuẩn bị dung dịch vi sinh vật hoặc nắm với nẻng độ 5 10, lấy 10

pl dung dich mau tht theo các nồng độ đã được pha loãng thêm 200 HÍ dung

dịch vi sinh vật hoặc nấm

-Ủ ở 37! € sau 24 giờ đọc giá trị MIC bang mat thường san khi bổ sung 50 pl MTT (1mg/ml) vào các giếng thử, giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử tháo nhất khơng chuyển hố MTT thành MTT formazan cho màu

tím đậm IC 50 được tính toán dựa trên số liệu đọc độ đục tế bào bằng máy

'Tecan (Genios) và phần mềm tính giá trị IC 50 Raw dafa program

2.2.7 Xác định độc tính cấp theo phương pháp của A Wallace Hayes [ 5, 17, 21]

- Dựa theo nguyên tắc và phương pháp thử độc tính cấp của Wallace Hayes

- Đối tượng động vật là chuột nhất trắng chủng Swiss, trọng lượng 20 + 2 g Chuột được nhịn ăn 15 giờ trước khi thí nghiệm, uống nước theo nhu cầu Kiểm tra cân nặng trước khi thử nghiệm Chuột đạt các yêu cầu về cân nặng được đưa

vào thử nghiệm

- Mẫu thử là các chế phẩm Flavonoit chiết xuất từ lá Vải và lá Nhãn Mẫu thử được pha thành các dung dịch có nồng độ tăng dần rồi cho chuột uống

- Đưa mẫu thử dưới dạng hỗn dịch theo đường uống Lấy thể tích mẫu thử theo qui định đưa thẳng vào dạ dày chuột bằng kim cong đầu tù Dựa trên kết qua

thăm dò trong thử nghiệm sơ bộ, tiến hành thử nghiệm chính thức trên 40 chuột,

chia thành 4 nhóm gồm ¿ nøðÓm chứng dùng nước cất và 3 nhóm thik theo mite

liều đã dự tính

Trang 29

* Đối với ché pham FV: néng 46 dung dich thir (dd FV) 1a 21,15 mg ché phẩm F⁄/ 1,5 mử rước cất, mức liều thi khoi dau 1a: 282 mg hoat chất / kg

chuột thí nghiệm

* Đối với chế phẩm FN: nồng độ dung dịch thử (dd EN) là 20,12 re chế phẩm ITV/ 1,5 mử nước cất, mức liều thử khởi đầu là: 268 mg hoat chất / kg

chuột thí nghiệm

- Lịch theo doi: theo doi biểu hiện của chuột sau khi uống trong 24 giờ đầu và

theo dõi hoạt động của động vật thí nghiệm trong thời gian 7 ngày sau khi uống

2.2.8 Bào chế, phân tích, kiểm nghiện và xây dựng tiêu chuẩn cho sản phẩm chức năng Agot - G (sản phẩm có sử dụng chế phẩm Flavonoit từ lá

Nhãn —FN)

œ Bào chế sản phẩm Agof— Œ và Agof— G¡

5 Phân tích và kiểm nghiệm sân phẩm chức năng Agot— G theo các chỉ tiêu

sau:

- Chỉ tiêu cảm quan theo TCVN

- Hàm lượng kim loại nặng (As, Pb, Cd, As) theo TCVN

- Chỉ tiêu dịnh dưỡng (hàm lượng gluxit, protein, chất xơ, tro tổng số) theo

TCVN

- Chỉ tiêu vi sinh vật (tổng số vi sinh vật hiếu khi, coliforms, E Coli, St Aureus,

B cereus, tong s6 nam men - méc, Cl perfringenst) theo TCVN - Hoá chét khéng mong muén theo TCVN

c Xây đựng tiêu chuan co sé cho san phẩm chức năng Agot— G (đựa trên kết quả phân tích và kiểm nghiệm các chỉ tiêu kỂ trên)

2.2.9 Khảo sát tác dung bảo vệ gan của sản phẩm Agot - G khi gây độc gan

chuột bằng Ethanol (theo phương pháp đánh giá gián tiếp dựa vào tác dụng của thuốc bị chuyển hoá) [ 3]

Nguyên tắc của phương pháp: Cho chuột nhắt trắng uống Ethanol 96” với liều

hàng ngày 4 ml/kg (rước khi uống pha loãng Ethanol 96” với nước cất) liền trong 45 ngày, gan sẽ bị tổn thương Khi gan bị tốn thương sẽ làm cho chuyển hoá thuốc giảm nên tác dụng của thuốc sẽ kéo dài

AMÔ hình thí nghiệm: dùng các lô chuột như sau

Trang 30

* Lô 1 - đối chứng (-): chuột nuôi bình thường, không cho uéng Ethanol 96"

* Lô 2 - đối chứng (+): cho uống Ethanol 96” trong 45 ngày

* Lô 3A - cho uống Ethanol 96” đến ngày thứ 30 thì cho uống thêm các hoạt chất cần thử tác dụng bảo vệ gan theo liều đã định (trong thí nghiệm này chất thử là sản phẩm Agot - G) cho đến ngày thứ 45 thì ngừng thí nghiệm

* Lô 3B - cho uống Ethanol 96” đến ngày thứ 30 thì cho uống thêm các hoạt chất cần thử tác dụng bảo vệ gan theo liều đã định (trong thí nghiệm này chất thử là sản phẩm Agot - G¡) cho đến ngày thứ 45 thì ngừng thí nghiệm

Dùng thuốc ngủ Hexobarbital natri tiêm dưới da cho chuột ở lô 2, lô 3A, lô 3B với liều 75mg/kg Theo đối thời gian (giây) ngủ của chuột ở các lô thí nghiệm Chuột ở các lô thí nghiệm ngủ càng lâu so với chuột ở lô đối chứng (-)

chứng tỏ mức độ tổn thương gan càng lớn Nếu mẫu thử có tác dụng bảo vệ gan

tốt thì thời gian ngủ của chuột ở lô thí nghiệm sẽ tiến gần đến độ dài thời gian của giác ngủ ở lô chuột đối chứng (-)

2.2.10 Nghiên cứu ảnh hưởng của sản phẩm chức năng Agot - G lên hoạt động của một số enzym tiêu hoá tuyến tuy chó [8,14]

œ Xác định hoạt động cia enzym Amylaza tuyén tay ché theo phiwong phap cia Folin— Wu

+ Dựa trên nguyên tắc: xác định lượng tỉnh bột còn lại không bị thuỷ phân sau phản ứng enzym Hoạt độ của enzym được xác định theo lượng tỉnh bột bị thuỷ phân bởi enzym trong thời gian 30 phút

+ Tiền hành thi nghiệm:

- Mỗ chó lấy tuyến tuy, loại bỏ các cơ và mỡ xung quanh tuyến tuy

Nghiền dịch đồng thể tuyến tuy trong điều kiện lạnh và trong đệm Photphat 0,1

M; pH =7,2 Ly tâm thu dịch tuy trong để làm thí nghiệm

- Thí nghiệm được tiến hành với các lô bình thí nghiệm: dink adi chứng, bình kiểm tra, bình thì nghiệm Lần lượt cho vào các bình thí nghiệm các hoá chat sau: 1 ml tinh b6t 2% + 1,4 [ml đệm photphat + chất thử với các nông độ

thay đổi (chất thử trong thí nghiệm này sản phẩm Agot - G)] + 1 ml dịch tuy Téng thể tích phản ứng V = 3,4 ml

Để các bình thí nghiệm đó trong tủ ấm ở điều kiện 37” trong 30 phút

Trang 31

Ngimg phan tng bang 0,4 ml HCl 0,1 N Ly tam lay dich trong để làm phan tng mau Lấy 0,02 ml dich ly tam + 4 ml nước cất + 0,05 ml dung dịch Tot

0,1N và thêm nước cất đến đủ thể tích 5 ml So màn OD 6 2.= 660 nm, dya vao đường chuẩn tỉnh bột để xác định hàm lượng tỉnh bột còn lại, ghi kết quả thí nghiệm +Xây dựng độ thị chuẩn tỉnh bột: Bảng ¡: Đồ thị chuẩn tỉnh bột STT | Lượng tỉnh bột ứng) ©D, 2= 660 nm 1 2 0,102 2 4 0,153 3 6 0,214 4 8 0,268 5 10 0339 6 12 0411 0.459? "4 03 03 08 sa ons on 0s 6 0 2 4 68 8 1 2 44 matinh bot

Dé thi 7: DO thi chuẩn tỉnh bột

+Phương trình huần tình của đồ thị chuẩn tinh bét: Y = 0,0321 X + 0,0308

Trong 46: ¥ lamét 49 quang hoc (OD); X lamg tinh bét

b Xác định hoạt động của eugym lypaga myễn ñạy chó theo phương pháp Tietz

Nguyên tắc: phương pháp này dựa trên cơ sở chuẩn độ các axit béo tạo ra

bằng dung dịch kiểm Hoạt độ của enzym lypaza được xác định theo hàm lượng axit béo được giải phóng ra từ lipit trong thời gian 1 giờ

Trang 32

Chuẩn bị dịch enzym tie tuyén tuy chó: lẫy tuyến tuy của chó vừa mỗ, loại

bỏ màng bám quanh, thấm khô bằng giấy lọc, nghiền thành dịch đồng thể với

đệm Axetat natri pH = 6,8 theo tỷ lệ 1g tuyến tuy / 10 ml dung dich đệm

Tiến hành: dùng bình tam giác 100 ml, cho vào từng bình thí nghiệm các

thanh phan sau: 7 ml dich chiết tuy + 1 (đệm Axetatnatri + chất thử) + 2 ml đầu g thé tich của phản ứng V = 10ml Cho vào tủ ấm 37” trong 60 phút Sau đó lấy ra làm ngừng phản ứng enzym bằng cách đun bình phản ứng

đận nành

trong nồi cách thuỷ sôi 5 phút Song song với các bình phản ứng làm bình kiểm tra (làm ngừng hoạt động của enzym ngay từ đầu) Sau đó cho vài giọt phenolphtalein và chuẩn độ axit béo giải phóng ra bằng KOH 0,05 N đến khi

xuất hiện màn hồng bển Tinh lượng KOH đã chuẩn độ dé xác định hoạt động

của enzym Lipaza

c Xác định hoạt động của enzym proteaza tuyến tuy theo phương pháp

Anson cai tién

Nguyên tắc: enzym proteaza có trong dịch đồng thể của tuyến tuy sẽ thuỷ

phân cơ chất protein (ở đây protein là cazein) để giải phóng ra axit amin trong

đó có tyrozin Xác định hoạt độ phân giải protein của proteaza tuyến tuy dựa trên cơ sở định lượng sản phẩm được tạo thành (tyrozin) bằng phản ứng màu với

thuốc thir Folin — Ciocaltean Dựa vào đỗ thị chuẩn tyrozin sẽ tính được hàm

lượng tyrozin được tạo ra sau phản ứng

Chuẩn bị dịch enzym từ huần họy chó: lấy tuyến tuy của chó vừa mỗ, loại bỏ

màng bám quanh, thắm khô bằng giấy lọc, nghiễn thành địch đồng thể với đệm Dung dịch đệm Axetatnatri 1M, pH = 8,0 theo tỷ lệ 1g tuyến tuy / 10 ml dung dịch đệm

Hod chat:

(1) Dung dịch đệm Axetatnatri 1M, pH = 8,0

(2) Dung địch cơ chất cazein: cân 2 g cazein tỉnh khiết, cho vào bình định

mức 100 mÌ hồ tan trong 20 m] NaOH 0,1N; khuấy và đun trên nổi cách thuỷ cho tan hết, đùng nước cất din dén 100 ml khi dùng pha loãng 10 lần

(3) Dung dich Tricloaxetic 8% (TCA)

(4) Dung địch chuẩn tyrozin: dùng tyrozin tỉnh khiết pha thành dung dịch 0,019 trong Na;CO; 6%

Trang 33

(5) Thuốc thử Folin - Ciocalteau

Bé tri thi nghiém nh sau:

Bang 2: Bồ trí thí nghiệm xác định hoạt độ của proteaza trong tuyến tuy, chó Gn vitro), V = 4 ml

TT] Thínghiệm [Dich déngthe | dd | dd mau thir pém Ghi chú

_ tuyến tuy (ml) | cazein Axetatnatri (ml)

1 | Béichtng 1 0,5 1,0 0 2,5 Cho ngay 2 ml TCA 2 | Đốichứng 2 0,5 1,0 0 2,5 Ủ ở 37” trong 60 phút 3 | Thínghiệm 1 0,5 1,0 0,2 2,3 U 37" trong 60 phut 4 | Thínghiệm 2 0,5 1,0 0,3 2,2 Ủ ở37 trong 60 phút 3 | Thínghiệm 3 0,5 1,0 0,4 2,1 U 37" trong 60 phut 6 | Thinghiém 4 0,5 1,0 0,5 2,0 Ủ ở37 trong 60 phút 7 | Thínghiệm 5 0,5 1,0 0,6 1,9 U 637" trong 60 phut Ong đối chứng 1: sau khi cho đủ thành phần phản ứng, thêm ngay 2 ml TCA đề làm ngừng phản ứng từ đầu

Ống đối chứng 2 và các ống thí nghiệm 1,2,3,4,5: sau khi cho đủ thành phần

phản ứng, đem ủ ở tủ ấm 37C trong 60 phút, san đó thêm vào mỗi ống 2 ml TCA, lắc đều để lắng ở nhiệt độ phòng trong thời gian 30 phút San đó ly tâm,

lấy 0,1 ml dich ly tam + 4 ml NaOH 0,5N + 1 ml CuSO, + 0,5 ml thuéc thử

Folin — Ciocalteau + 1,4 ml nước cất 8o màu ở bước song 660 mn Dựa vào

đường chuẩn tyrozin dé tinh được hàm lượng tyrozin gai phóng ra sau phản ứng

Trang 34

oD 0.45 04 0.35 03 0.25 02 015 01 0.05 0 0.01 0.02 0.03 0.04 mg tyrozin Dé th; 2: Đỗ thị chuẩn tyrozin

+Phương trình tuyén tinh của đồ thị chuẩn Tyrozin: Y = 13,914 X - 0,012

Trong đó: Y làmật độ quang học (OD}; X làmg tyrozin

2.2.11 Xác định độc tính cấp của sản phẩm chức năng Agot - G theo

phương phap cita A Wallace Hayes

Trang 35

3 KET QUA NGHIEN CUU 3.1 CAC NGHIEN CUU VE HOA HOC

~ Chiết xuất và dink long Flavonoit tong sé tie ld Nhan va ii Vai (teoi và

khô)

~ Phân tích các chế phẩm Flavonoit bằng sắc ký lúp mông và pha tie ngogi

3.1.1 Chiết xuất và định lượng Flavonoit tổng số từ lá Nhãn và lá Vải

- Từ các mẫu nguyên liệu là lá bánh tẻ của cây Vải và cây Nhãn, chúng tôi

hành xử lý theo các chế san:

(1) Lá tươi, được rửa sạch, để ráo nước, thấm khô, cân xác định trong

lượng tươi Nghién nhỏ thành dạng nhuyễn đồng thé rồi chuyển vào bình nút

nhám màu nâu và cố định mẫu ngay bằng cén 96"

(2) Lá tươi đã được xác định trọng lượng được sấy 6 60°C cho đến khi

khô giòn Xay thành bột, thu bột nguyên liệu và bảo quản trong lọ nút nhám và

giữ trong bình hút 4m

-Xác định trọng lượng khô tuyệt đối của nguyên liệu: Cân chính xác 100g mẫu

nguyên liệu, sấy khô kiệt ở 100'C, cân xác định đến khi trọng lượng không đổi (thí nghiệm được lặp lại 5 lần) Trọng lượng khô tuyệt đối của lá Nhãn = 49,5

% (năm 2007) Trọng lượng khô tuyệt đối của lá Vải = 50% (năm 2007)

-Tiến hành phá mẫu và chiết mẫu trên máy siêu âm Power Sonic 410, chiết xuất và định lượng Flavonoit tổng số theo quy trình B.C.Talli Các kết quả được trình bày ở bảng 4 Bảng 4: Trọng lượng khô tuyệt đối và hàm lượng Flavonoit tổng số của lá Vải và lá Nhãn

Mẫu % Trọng lượng | Hàm lượng lượng ETavonoit tống số (%)

Trang 36

Kết quả & bdng 4 cho thấy:

*Hàm lượng Flavonoit của mẫu nguyên liệu thu ở mùa vụ năm 2007 và 2008 gan như tương đương nhan

*Hàm lượng Flavonoit tổng số của lá Nhãn và lá Vải đều chiếm một tỷ lệ

tương đối cao Điều này cho thấy đây là những nguyên liệu giầu Flavonoit có thể hướng tới khai thác ứng dụng vào thực tiễn

*Hàm lượng Flavonoit của lá Nhãn tươi là: 1,89 % (năm 2007) va 1,792% (năm 2008); khi quy đổi ra theo hàm lượng khô là 3,818 % và 3,620 % Hàm lượng Flavonoit của lá Vải tươi là: 2,703 % (năm 2007) và 2,739% (năm 2008); quy đổi ra theo hàm lượng khô là 5,406 % và 5,478 %

Bằng 5: So sánh hàm lượng Flavonoit tổng số (%) của lá Nhãn và lá Vải chiết xuất từ nguyên liệu khô và từ nguyên liệu tươi quy đổi theo trọng lượng khô

_ Ham lượng Flavonoit tông số (%6)

Mẫu (n = 5) Chiết xuất từ lá khô | Chiết xuất từ lá tươi quy

dỗi theo trọng lượng khô Năm 2007 3187 3,818 LáNhãn am 2008 3201 3,620 _ |Năm2007 4,402 5,406 LáVải Hm 2008 4318 5,478

So sánh với hàm lượng Flavonoit thực tế thu được của mẫu khô cho

thấy: trong quá trình làm khô mẫu (lá), hàm lượng Flavonoit ở mẫu nguyên

liệu khô có bị mất đi so với nguyên liệu tươi; song việc thu gom bảo quản một

khối lượng nguyên liệu tươi là rất khó thực thi nên ta buộc phải sử dụng

nguyên liệu khô nếu thành phan và hoạt tính sinh học của các hoạt chất không

lận cho cúc công việc nghiên cứu tiếp theo chúng tôi ký liệu các

rHẪw tu được nưc sưu:

EU: chỗ phẩm Flavonoit chiất xuất từ lá Vải khô

Er: chế phẩm Flavonoit chiết xuất từ lá Vải tươi

EN: ché phẩm Flavonolt chiết xuất từ lá Nhấn khô

Trang 37

Từ các chế phẩm Flavonoit thu dwgc chúng tôi tiễn hành kiểm ứra cdc phân ứng định tính đặc trưng của nhóm chất Ifavonoit kết quả được trình bay ở bằng 6

Bang 6: Cac phan ứng định nh của các chế phẩm Flavonoit thu được

Tên mẫu | P/u NaOH 10% | P/uFeCl;5% Ï P/uShinoda | P/ Diazo

FV Vangnau4t+ | Xanhdend+ | Đỏnâu4t | Vang cam 4+

FV; Vangnau4t+ | Xanhden3+ | Đỏnâu4t | Vang cam 3+

FN Vang nau 4+ | Xanh đen 4+ Đỏ 4+ Đỏ cam 4+

FNy Vàng nâu 4+ | Xanh den 3+ Đỏ 3+ Đỏ cam 3+

Các kết quả thu được ở bảng 6 cho thấy các phản ứng định tính đặc trưng của nhóm chất Elavonoit rất điển hình: phản ứng FeCl; cho màu xanh

đen đặc trưng đã cho thấy sự có mặt của những Elavonoit có cấu tạo

orthodiphenol; phản ứng Shinoda có màu đỏ đậm đặc chỉ ra sự có mặt các chất

Flavonoit mang nhém cacbonyl (+C = 0) 6 vi tri Cy Đặc điểm cấu tạo hoá học nay là một trong những yếu tố cơ bản cần có đối với một Bioflavonoit (các chất

Flavonoit có hoạt tính sinh học) $.L mỏng và phổ tử ngoại Phân tích thành phần Flavonoit tổng số thu được bằng sắc ký lớp

* Việc phân tích thành phần Elavonoit tổng số bằng sắc ký lớp mỏng và phỏ tử

ngoại được tiến hành đồng thời trên bến chế phẩm Flavonoit thu được: EN,

EN¡, EV, FVị Để phân tích thành phần Flavonoit trên bản mỏng chúng tôi sử

dụng nhiều phương pháp phối hợp:

- §ắc ký lớp mỏng một chiều, chạy từ dưới lên với hệ dung môi triển

khai TEAF (Toluen: Etylaxetat: Axeton: Axit Focmic = 5: 2: 2:1); phun các

thuốc thử đặc hiệu của nhóm chat Flavonoit: FeCl;, NaOH, KOH, AICI;

Trang 38

* Các kết quả thu được trình bày ở bảng 7, 8, ảnh 1, 2 3, 4 và hình 2a, 2b,3,4a,

4b,5 Từ các kết quảthu được cho thấy:

+Trên ảnh sắc ký đồ (ảnh 1,2,3,4) thu được cho thấy:

phẩm FN và EN; hoàn toàn giống nhan, đều xuất hiện 11 vết, với giá trị Rf của

các vết tương đương nhan; tương tự như thế sắc ký đồ của chế phẩm EV và ắc ký đỗ của chế

EVr cũng hoàn toàn giống nhau, 10 vết với giá trị Rf của các vết tương đương nhau Căn cứ trên sắc ký đỏ có thể nhận xét: quá trình xử lý từ mẫu tươi

thành mẫu khô hầu như không ảnh hưởng đến thành phan định tính của các chế

phẩm Flavonoit

Sắc ký đồ được quan sát ở các điều kiên khác nhau [cột (5) đến cột (16)

của bảng 7 và 8]: ở ánh sáng thường, dưới đền tử ngoại A = 365 nm, phun ede

thuốc thử đặc trưng để sơ bộ nhận dạng Flavonoit, các kết quả thu được cho

biết các vết tách ra trên sắc ký đổ đều là những chất Flavonoit

+ Cũng từ bản sắc ký lớp mỏng đó chúng tôi tiến hành đo phổ quét ở bước sóng 270 nm, để có thể xác định tương đối tỷ lệ % của mỗi vết so với

mẫu tổng số [cột (3) của bảng 7 và 8] Kết quả ở hình 3 và 5 cho thấy đây là những đỉnh hấp thụ trong cúng với các vết tách ra trên sắc ký đỏ biệt, ở

chế phẩm FN vết số 2 và số 8 có đỉnh hấp phụ tương đối lớn cho thấy 2 vết này chiếm một tỷ lệ tương đối cao (vứt số 2 chiếm 24.9139 và vất số 8 chiếm 35,893%y, còn ở chế phẩm EV vết số 3 và số 5 có đỉnh hấp phụ tương đối lớn cho thấy đây là những vết chiếm tỷ lệ khá cao (vất số 3 chiếm 45,944 % và vất số 5 chiếm 20.5.1799)

+Tiếp đó chúng tôi tiến hành chạy sắc ký điều chế để tách các vết và đo phổ tử ngoại, kết quả ở cột (4) của bảng 7 và 8 cho thấy đã xác định được phổ tử ngoại đặc trưng của từng vết

- Ở chế phẩm EN vết số 1,2,3,4,6,7,9 có phổ tử ngoai nằm trong giải II

(hấp phụ cực đại ở bước sóng 220 -280 nm) còn vết số 8 có phổ tử ngoại

trong giải I (hấp phụ cực đại ở bước sóng > 290 nm) Ở chế phẩm EV vết số

2,3,4,8,9 có phổ tử ngoai nằm trong giải II (có giải hấp phụ cực đại ở bước

sóng 220 -280 nm) còn vết số 5,6,7 có phổ tử ngoại nằm trong giải I (có giải

hấp phụ cực đại ở bước sóng > 290 nm Như vậy, hầu hết các chất tách ra trên

sắc ký đổ đều được hấp phụ trong giải hấp thụ đặc trưng của Flavonoit (trừ

những vết có tỷ lệ nhỏ quá không tiến hành đo phổ tử ngoại được)

Trang 39

- Ghi chit:

fies Seat Q: chat chudn Quercetin

A: chat chuan Axil Gallic

EN: ché pham Flavonoit chiét

xuất tử lá Nhãn khỏ

INr: chế phẩm Flavonoit

chiết xuất từ lá Nhãn tươi

EV: chế phẩm Flavonoit chiết

xuất từ lá Vải khô

Vị: chế phâm Flavonoit

chiết xuất từ lá Vải tươi

*

9 FN ENr FV FV; A

Ảnh 1: Sic ky dé cia ché phim Flavonoit tir 4 Nhan va lé Vai

(tươi và khô) khi quan sát ở điều kiện ánh sáng thường Ghi chúc Q: chất chuẩn Quercetin; A: chất chuẩn Axit Gallic EN: chế phẩm Flavonoit chiết xuất từ lá Nhãn khô ENr: chế phẩm Flavonoit chiết xuất từ lá Nhãn tươi EV: chế phẩm Flavonoit chiết xuất từ lá Vải khô Vy: chế phẩm Flavonoit chiết xuất từ lá Vải tươi Q FN FNry FV FVr A

Ảnh 2: Sắc ký đồ của chế phẩm Flavonoit chiết xuất từ lá Nhãn và lá

Vài (tơi và khô) khi phun thuốc thử FeCl; 5%

Trang 40

Xanh đen | Năuá+ Nau Nau Nau Vàng cam - Da son

34 4 4t

den 2+ 3+ +

Định dạng
Số trang	107
Dung lượng	16,49 MB