Luận văn thạc sĩ phân lập và đánh giá một số tác dụng sinh học của polysaccharide từ lá cây thanh táo (justicia gendarussa burm f)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HOÀNG DUY TĂNG PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA POLYSACCHARIDE TỪ LÁ CÂY THANH TÁO (Justicia gendarussa Burm f.) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN – 2022 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HOÀNG DUY TĂNG PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA POLYSACCHARIDE TỪ LÁ CÂY THANH TÁO (Justicia gendarussa Burm f.) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: 1.TS Vũ Thị Lan Trường Đại học Khoa học, ĐHTN 2.TS Võ Hồi Bắc Viện Cơng nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam Thái Nguyên - 2022 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi thực dưới sự hướng dẫn TS Vũ Thị Lan TS Võ Hồi Bắc Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Thái Nguyên, ngày tháng năm 2022 Tác giả Hoàng Duy Tăng ii LỜI CẢM ƠN Lời xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Thị Lan, Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên TS Võ Hồi Bắc, Phịng Sinh hóa thực vật, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ suốt thời gian thực hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Khoa học-Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ sinh học, phịng Sinh hóa thực vật, Viện cộng nghệ sinh học thầy cô giáo, cán Khoa Công nghệ sinh học, đặc biệt sự quan tâm, giúp đỡ anh chị kỹ thuật viên phòng thí nghiệm khoa tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình làm luận văn thạc sĩ Tơi xin cảm ơn gia đình bạn bè ln bên cạnh ủng hộ, khuyến khích, động viên tạo động lực để tơi hồn thành luận văn Trong q trình làm luận văn khơng tránh khỏi sai sót, tơi mong nhận sự đóng góp q báu từ phía thầy bạn bè để tơi hồn thành luận văn Thái Nguyên, ngày tháng năm 2022 Tác giả Hoàng Duy Tăng iii MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Polysaccharide 1.1.1 Oligosaccharide 1.1.2 Polysaccharide 1.2 Vai trò sinh học tác dụng polysaccharide thực vật 1.2.1.Vai trò sinh học ý nghĩa kinh tế 1.2.2 Tác dụng chữa bệnh số polysaccharide thực vật 1.3 Nghiên cứu giới Việt Nam Thanh táo (Justicia gendarussa Burm f.) 1.3.1 Mô tả thực vật 1.3.2 Nghiên cứu giới Thanh táo (Justicia gendarussa Burm f.) 10 1.3.3 Nghiên cứu Việt Nam Thanh táo (Justicia gendarussa Burm f.) 10 1.4 Phương pháp chiết xuất siêu âm 11 1.4.1 Nguyên tắc, chế hoạt động siêu âm 11 1.4.2 Tác động sóng siêu âm 12 1.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến chiết xuất siêu âm 13 1.4.4 Tính ưu việt phương pháp chiết xuất siêu âm so với phương pháp chiết xuất thường 13 1.5 Phản ứng viêm 14 1.5.1 Vai trò đại thực bào (macrophage) đáp ứng viêm 15 1.5.2 Vai trò cytokine đáp ứng viêm 15 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 iv 2.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 18 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 18 2.3 Hóa chất, thiết bị 19 2.4 Phương pháp nghiên cứu 19 2.4.1 Xử lý nguyên liệu 19 2.4.2 Nghiên cứu điều kiện thích hợp để chiết xuất polysaccharide phương pháp siêu âm 19 2.4.3 Chiết xuất polysaccharide theo phương pháp thơng thường có khuấy trộn 21 2.4.4 Các phản ứng định tính polysaccharide 21 2.4.5 Định lượng polysaccharide phương pháp phenol-sunfuric acid 22 2.4.6 Phương pháp tinh polysaccharide 22 2.4.7 Xác định ảnh hưởng pH nhiệt độ đến chất lượng chế phẩm polysaccharide 25 2.4.8 Phương pháp nghiên cứu số tác dụng sinh học polysaccharie tinh từ Thanh táo 25 2.4.9 Phân tích thống kê 30 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Định tính polysaccharide từ dịch chiết Thanh táo 31 3.2 Nghiên cứu điều kiện thích hợp chiết xuất polysaccharide phương pháp siêu âm 33 3.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất chiết xuất polysaccharide 33 3.2.2 Ảnh hưởng tần số sóng siêu âm đến khả chiết xuất polysaccharide 34 3.2.3 Xác định tỷ lệ (ngun liệu/dung mơi) thời gian thích hợp chiết xuất polysaccharide 35 3.3 So sánh chiết xuất polysaccharide phương pháp siêu âm phương pháp thông thường 36 3.4 Tinh polysaccharide 38 v 3.4.1 Tinh sơ polysaccharide TCA 38 3.4.2 Tinh sắc ký qua cột DEAE- cellulose 39 3.4.3 Tinh sắc ký qua cột Sephadex G100 41 3.4.4 Đánh giá độ tinh chế phẩm polysaccharide 42 3.4.5 Sơ đồ tinh polysaccharide TT 42 3.4.6 Ảnh hưởng pH nhiệt độ đến chất lượng chế phẩm polysaccharide TT 44 3.5 Nghiên cứu số tác dụng sinh học polysaccharide tinh 45 3.5.1 Đánh giá hoạt tính độc tố polysaccharide đến khả sống tế bào macrophage 45 3.5.2 Đánh giá ảnh hưởng polysaccharide đến sự giải phóng cytokine tiền viêm viêm 46 3.5.3 Xác định hoạt tính kháng khuẩn polysaccharide 48 3.5.4 Đánh giá hoạt tính độc tố polysaccharide đến khả sống tế bào nguyên sợi da người 51 3.5.5 Đánh giá tác dụng làm lành vết thương TT tế bào nguyên sợi da người 51 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54 Kết luận 54 Đề nghị 54 CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT A490 : Bước sóng 490nm A585 : Bước sóng 585nm A 660 : Bước sóng 660nm BSA : Albumin huyết bị IL-10 : Interleukin-10 IL-6 : Interleukin-6 IL-8 : Interleukin-8 MTT : [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazolium bromide] OD : Optical density TCA : Tricloacetic acid TNFα : Tumor necrosis factor-alpha TT : Thanh táo vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Xây dựng đồ thị chuẩn glucose 22 Bảng 2.2 Xây dựng đồ thị chuẩn protein theo phương pháp Lowry 24 Bảng 3.1 Phản ứng định tính nhận biết polysaccharide 31 Bảng 3.2 So sánh chế phẩm polysaccharide thu từ phương pháp chiết xuất 37 Bảng 3.3 So sánh phương pháp loại protein 38 Bảng 3.4 Các bước tinh polysaccharide chiết siêu âm từ Thanh táo 41 Bảng 3.5 Xác định hoạt tính kháng khuẩn polysaccharide TT 49 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây Thanh táo (Justicia gendarussa Burm f.) Hình 2.1 Hình ảnh Thanh táo (Justicia gendarussa Burm f.) thu nhận Hà Nội 18 Hình 2.2 Máy siêu âm xử lý nguyên liệu 20 Hình 3.1 Phản ứng định tính nhận biết polysaccharide 32 Hình 3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng polysaccharide chiết xuất 34 Hình 3.3 Ảnh hưởng tần số sóng siêu âm đến hàm lượng polysaccharide chiết xuất 35 Hình 3.4 Tỷ lệ (ngun liệu/dung mơi) thời gian thích hợp chiết xuất polysaccharide 36 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn phổ UV dịch chiết polysaccharide TT phương pháp siêu âm phương pháp thông thường có khuấy trộn 38 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn phổ UV polysaccharide từ Thanh Táo tinh phương pháp khác 39 Hình 3.7 Sắc kí qua cột trao đổi ion DEAE cellulose 40 Hình 3.8 Sắc ký qua cột Sephadex G100 41 Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn phổ hấp thụ ánh sáng polysaccharide từ Thanh Táo 42 Hình 3.10 Sơ đồ tinh chế phẩm polysaccharide TT 43 Hình 3.11 Ảnh hưởng pH acid đến chế phẩm polysaccharide TT 44 Hình 3.12 Ảnh hưởng nhiệt độ đến chế phẩm polysaccharide TT 45 Hình 3.13 Ảnh hưởng polysaccharide lên khả sống tế bào RAW264.7 46 Hình 3.14 Ảnh hưởng polysaccharide tinh TT sự giải phóng cytokine viêm tiền viêm 47 Hình 3.15 Xác định hoạt tính kháng khuẩn peptide TT 50 Hình 3.16 Ảnh hưởng polysaccharide TT lên khả sống tế bào nguyên sợi da người 51 Hình 3.17 Hình ảnh kính hiển vi vùng tổn thương tế bào nguyên sợi da người xử lí polysaccharide TT 52 Hình 3.18 Mức độ hàn gắn vết rạch polysaccharide TT nguyên bào sợi 53 48 Polysaccharide tinh từ Thanh táo với nồng độ 10-40 µg/mL (hình 3.14) ức chế trình sản xuất cytokine tiền viêm TNFα, IL-8 IL-6 so với nhóm tế bào gây đáp ứng viêm LPS khơng xử lí (p