Phân lập và tối ưu một số điều kiện sinh trưởng của vi khuẩn nitrate hóa từ một số mẫu nước thải tại trường đại học nông lâm thái nguyên

Rất nhiều hợp chất gây ô nhiễm trong nước thải có khả năng chuyển hoá cao trong môi trường nước tự nhiên thông qua các phản ứng hoá học, sinh hoá, quang hoá và tác động đến cân bằng sinh

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

-

HOÀNG THỊ THANH NGA

Tên đề tài:

PHÂN LẬP VÀ TỐI ƯU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN SINH TRƯỞNG CỦA

VI KHUẨN NITRATE HÓA TRONG MẪU NƯỚC THẢI TẠI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành/ngành : Công nghệ sinh học

Thái Nguyên – năm 2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

-

HOÀNG THỊ THANH NGA

Tên đề tài:

PHÂN LẬP VÀ TỐI ƯU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN SINH TRƯỞNG CỦA

VI KHUẨN NITRATE HÓA TRONG MẪU NƯỚC THẢI TẠI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành/ngành: Công nghệ sinh học Lớp : 45 - CNSH

Khoa : CNSH & CNTP Khóa học : 2012 – 2016 Giảng viên hướng dẫn: ThS Dương Mạnh Cường

Thái Nguyên – năm 2016

LỜI CẢM ƠN

Được sự đồng ý của Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học-Công nghệ Thực phẩm, trong thời gian thực tập tốt nghiệp, em đã tiến

hành thực hiện đề tài “Phân lập và tối ưu một số điều kiện sinh trưởng của vi khuẩn

Sau thời gian tham gia nghiên cứu thực hiện đề tài, đến nay em đã hoàn thành đề tài nghiên cứu của mình

Nhân dịp này em xin bày tỏ lòng biết ơn tới: ThS Dương Mạnh Cường, Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em thực hiện đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn tới ThS Vi Đại Lâm đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Khoa Công nghệ Sinh học

và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu khoa học trong suốt thời gian học tập

Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ủng hộ, động viên để em có tự tin trong học tập và thực tập tốt nghiệp

Dù đã cố gắng nhiều, xong bài khóa luận không thể tránh khỏi những thiếu sót và hạn chế Kính mong nhận được chỉ bảo, đóng góp ý kiến của quý Thầy Cô cùng toàn thể các bạn

Em xin chân thành cảm ơn

Sinh viên

Hoàng Thị Thanh Nga

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 4.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc các dòng vi khuẩn nghiên cứu 31

Bảng 4.2 Đặc điểm tế bào các dòng vi khuẩn nghiên cứu 32

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của dòng vi khuẩn A1 33

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của dòng vi khuẩn B3 34

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy đến dòng A1 36

Bảng 4.6.Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy của dòng vi khuẩn B3 37

Bảng 4.7 Ảnh hưởng của nguồn cacbon hữu cơ đến sự sinh trưởng của dòng vi khuẩn A1 38

Bảng 4.8 Ảnh hưởng của nguồn cacbon vô cơ kết hợp nguồn cacbon hữu cơ đến sự phát triển của dòng vi khuẩn A1 39

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của nguồn cacbon hữu cơ đến sự sinh trưởng của dòng vi khuẩn B3 40

Bảng 4.10 Ảnh hưởng của nguồn cacbon vô cơ kết hợp với hữu cơ đến sự sinh trưởng của dòng vi khuẩn B3 42

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Chu trình Nitơ trong tự nhiên 5

Hình 4.1 Các dòng vi khuẩn nitrate có hoạt tính trên môi trường Winogradsky I 28

Hình 4.2 Các dòng vi khuẩn nitrate có hoạt tính trên môi trường WinogradskyII 29 Hình 4.3 Dòng vi khuẩn nitrite hóa trên môi trường có chứa thuốc thử Griss 30

Hình 4.4 Dòng vi khuẩn nitrat hóa trên môi trường có chứa thuốc thử Griss 30

Hình 4.5 Hình thái khuẩn lạc dòng vi khuẩn A1, B2 31

Hình 4.6 Hình thái tế bào dòng A1, B3 32

Hình 4.7 Biểu đồ ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của dòng vi khuẩn A1 34

Hình 4.8 Biểu đồ ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của dòng B3 35

Hình 4.9 Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của dòng vi khuẩn A1 36

Hình 4.10 Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của dòng vi khuẩn B3 37

Hình 4.11 Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn hữu cơ đến sự phát triển của dòng vi khuẩn A1 39

Hình 4.12 Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn cacbon vô cơ kết hợp với nguồn cacbon hữu cơ đến sự phát triển của dòng vi khuẩn A1 40

Hình 4.13 Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn hữu cơ đến sự phát triển của dòng vi khuẩn B3 41

Hình 4.14 Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn cacbon vô cơ kết hợp với nguồn cacbon hữu cơ đến sự phát triển của dòng vi khuẩn B3 42

DANH MỤC VÀ KÍ HIỆU VIẾT TẮT

AMO : Amon Monoxygenase AOB : Ammonium

DO : Dissolved Oxygen ATP : Adenosine Tri-Phosphate

h : Giờ

ĐC : Đối chứng TAN :Total amonia nitrogen AOB : Ammonia Oxidizing Bacteria

MỤC LỤC

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 3

1.2.1 Mục tiêu của đề tài 3

1.2.2 Yêu cầu của đề tài 3

1.3 Ý nghĩa của đề tài 3

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Cơ sở khoa học của đề tài 4

2.1.1 Chu trình Nitơ 4

2.1.2 Tác hại của việc dư thừa Nitơ đối với đời sống và môi trường 6

2.1.3 Trạng thái tồn tại và quá trình chuyển hóa của nitơ trong nước thải 9

2.1.4 Quá trình chuyển hóa nitơ vô cơ và vai trò của nhóm vi khuẩn nitrate hóa 10

2.1.4.1 Quá trình Nitrate hóa 10

2.1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nitrate hóa 12

2.1.5 Đặc điểm sinh học và vai trò của vi khuẩn tham gia quá trình nitrate hóa 14

2.1.5.1 Các dòng vi khuẩn tham gia vào quá trình nitrate hóa 14

2.1.5.2 Đặc điểm sinh học và vai trò của vi khuẩn Nitrosomonas 16

2.1.5.3 Đặc điểm sinh học và vai trò của vi khuẩn Nitrobacter 17

2.1.6 Hiện trạng nước thải tại trường Nông Lâm Thái Nguyên 19

2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước và thế giới 20

2.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 20

2.2.2 Tình hình nghiên cứu thế giới 20

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 22

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 22

3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 22

3.2.2 Thời gian nghiên cứu 22

3.3 Dụng cụ, môi trường 22

3.3.1 Dụng cụ thiết bị 22

3.3.2 Môi trường 23

3.3.2.1 Môi trường Winogradsky I 23

3.3.2.2 Môi trường Winogradsky II 23

3.4 Nội dung nghiên cứu 24

3.5 Phương pháp nghiên cứu 24

3.5.1 Phương pháp thu thập mẫu 24

3.5.2 Phương pháp phân lập và tuyển chọn vi khuẩn nitrat hóa 24

3.5.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn 24

3.5.2.2 Phương pháp làm sạch và tuyển chọn dòng vi khuẩn có hoạt lực cao 25

3.5.3 Phương pháp nhuộm gram 25

3.5.4 Phương pháp giữ giống 26

3.5.5 Phương pháp phân tích 26

3.5.6 Xác định một số tính chất sinh lý, sinh hóa đến các dòng vi khuẩn nitrat hóa 27

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

4.2 Thử nghiệm khả năng nitrate hóa 29

4.2.1 Tuyển chọn dòng vi khuẩn có hoạt tính oxy hóa amon thành nitrite 29

4.2.2 Tuyển chọn dòng có hoạt tính nitrite thành nitrate 30

4.3 Định danh vi khuẩn dựa trên đặc điểm hình thái 31

4.4 Tối ưu một số điều kiện pH, nhiệt độ, các nguồn dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn nitrate hóa 33

4.4.1 Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của vi khuẩn 33

4.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của dòng vi khuẩn nitrate hóa 36

4.4.3 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự phát triển của vi khuẩn nitrate hóa 38

5.1 Kết luận 44

5.2 Kiến nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

PHẦN 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Nước thải - nước sau khi sử dụng đã bị nhiễm bẩn từ sinh hoạt, hoạt động công nghiệp, nông nghiệp được thải ra khỏi khu vực đang sử dụng về một nguồn nhận như ao, hồ, sông, biển Trong khi dịch chuyển, một lượng nước thải nhất định

sẽ thấm vào đất tạo ra nước ngầm cũng đem theo chất gây ô nhiễm

Tác nhân gây ô nhiễm môi trường trong nước là các chất có khả năng chuyển hoá thành các chất khác và các chất bền tác động đến cân bằng sinh thái trong môi trường nước nhận Về nguyên tắc, các chất bền trong môi trường được coi là ít độc hại nếu nó không gây hại trực tiếp lên động vât, thực vật sống trong nước hoặc lên con người hoặc một cách gián tiếp tới con người thông qua chuỗi thức ăn Có nhiều

họ chất hữu cơ bền trong môi trường nhưng có tác dụng xấu như gây các loại bệnh nan y, đột biến gen ngay với nồng độ rất thấp Đó là một số họ chất bảo vệ thực vật, hormon, kháng sinh, dược phẩm, cùng một số hợp chất đặc thù khác khi thâm nhập vào cơ thể người và động vật trực tiếp hoặc qua thức ăn Rất nhiều hợp chất gây ô nhiễm trong nước thải có khả năng chuyển hoá cao trong môi trường nước tự nhiên thông qua các phản ứng hoá học, sinh hoá, quang hoá và tác động đến cân bằng sinh thái của môi trường Các chất gây đục vô cơ có khả năng chuyển hoá không lớn, khi tồn tại trong nguồn nước nhận sẽ gây đục, gây hiện tượng cản ánh sáng vào nước, hạn chế sự phát triển của thuỷ thực vật sống trong đó Hậu quả kéo theo là làm giảm nguồn thức ăn của thuỷ động vật, làm giảm nồng độ oxy hoà tan trong nước do quá trình quang hợp của thực vật bị hạn chế, gây khó khăn cho hoạt động của động vật thuỷ sinh (Lê Văn Cát, 2007)

Nitơ là nguyên tố cơ bản của sự sống, có mặt ở tất cả các hoạt động liên quan đến sự sống và trong rất nhiều ngành nghề sản xuất công nghiệp, nông nghiệp Hợp chất hoá học chứa nitơ là thành phần dinh dưỡng trong phạm trù nước thải và là đối tượng gây ô nhiễm khá trầm trọng cho môi trường Nếu như hàm lượng nitơ có trong nước thải xả ra sông, hồ quá mức sẽ gây hiện tượng ô nhiễm, điển hình là hiện

tượng phú dưỡng Trong môi trường phú dưỡng, điều kiện sống (pH, oxy tan) biến động liên tục và mạnh là những tác nhân gây khó khăn, thậm chí là môi trường không thể sống đối với thuỷ động vật Thời gian hay chu kỳ sống của tảo có giới hạn, sau khi phát triển mạnh (bùng nổ tảo hay còn gọi là nước nở hoa) tảo chết lắng xuống lớp đáy và tiếp tục bị phân huỷ trong điều kiện yếm khí Giống loài tảo rất phong phú, trong đó có loài tảo độc (tiết ra độc tố), trong điều kiện phú dưỡng tỷ lệ thành phần tảo thường thay đổi theo chiều hướng bất lợi, hình thành nhiều loại tảo độc (C E Boyd, 1998), khi phát triển mạnh, tảo che chắn ánh sáng không cho thực vật sống ở lớp dưới phát triển, gây độc và làm mất nguồn thức ăn cho thuỷ động vật Khi chết tảo lắng xuống đáy, bị vi sinh vật và nấm phân huỷ làm cạn kiệt nguồn oxy hoà tan cung cấp cho các loài động vật khác Trong khi phân huỷ tảo, các chất dinh dưỡng và hữu cơ lại được chiết ra môi trường nước từ trầm tích, các yếu tố trên lại thúc đẩy vi sinh vật phát triển Vi sinh vật phát triển sẽ bám vào thân, lá thực vật làm giảm khả năng quang hợp của thực vật

Để giải quyết vấn đề trên, việc nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật để xử lý nước bị ô nhiễm đang ngày càng phổ biến Khác với các phương pháp vật lý, hóa học… việc sử dụng vi sinh vật giúp tăng cường khả năng phục hồi, khả năng tự làm sạch môi trường, có tính ổn định cao và thân thiện với môi trường

Trong tự nhiên, vi sinh vật loại bỏ hàm lượng Nitơ dư thừa trong nước bằng cách chuyển hóa nitơ dạng hữu cơ và vô cơ thành dạng khí N2 thoát ra ngoài môi trường Quá trình này diễn ra chủ yếu nhờ các quá trình amon hóa, nitrate hóa và phản nitrate hóa Dạng tồn tại phổ biến của Nitơ trong nước là NH3 cùng các muối

NH4+ Trong đó nitrate hóa là quá trình hiếu khí ( điều kiện có O2), đầu tiên NH4+

được Oxi hóa thành nitrite NO2-, sau đó nitrite NO2- sẽ chuyển hóa thành NO3- Các

biến đổi này được thực hiện bởi các vi sinh vật, ví dụ như vi khuẩn: Nitrobacter, Nitrospira, Nitrococcus Do vậy, việc tìm ra các dòng vi khuẩn chuyển hóa nitrate

và vi khuẩn phân giải nitrate có ý nghĩa quan trọng trong việc thiết lập các quy trình phục hồi sinh học nhằm làm giảm nồng độ nitơ trong nước thải

Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên thuộc Tổ 10, xã Quyết Thắng–Thành Phố Thái Nguyên, nằm ở phía Tây cách trung tâm thành phố khoảng 5km, có diện

tích lớn, khoảng 102,85ha (TUAF, 2015) Có nhiều người dân, sinh viên, nghiên cứu sinh sinh sống học tập và làm việc trong trường Do đó các hoạt động sinh hoạt và làm việc trong trường Nông Lâm thường xuyên gây phát sinh một lượng nước thải lớn, lượng nước thải này thải ra môi trường bên ngoài phần lớn chưa qua xử lý gây ô nhiễm nguồn nước các ao, hồ, suối xung quanh trường và ảnh hưởng tới cuộc sống của chính những người đang sinh sống, học tập và làm việc tại trường

Xuất phát từ thực tế đó em tiến hành nghiên cứu đề tài “Phân lập và tối ưu một số điều kiện sinh trưởng của vi khuẩn Nitrate hóa từ một số mẫu nước thải

phục hồi sinh học trong xử lý Nitơ, góp phần cải tạo môi trường, giảm thiểu ô nhiễm và bảo vệ cảnh quan nhà trường

1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài

1.2.1 Mục tiêu của đề tài

Phân lập các dòng vi khuẩn nitrate hóa trong một số mẫu nước, làm cơ sở để tiến hành định danh các chủng và xây dựng các quy trình phục hồi sinh học nhằm giảm thiểu lượng Nitơ trong các mẫu nước thải

1.2.2 Yêu cầu của đề tài

- Thu thập một số mẫu nước tại các địa điểm trong trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

- Phân lập được dòng vi khuẩn nitrate hóa trong các mẫu nước thải

- Tối ưu một số điều kiện sinh trưởng của các dòng vi khuẩn nitrate hóa đã phân lập được

1.3 Ý nghĩa của đề tài

- Ý nghĩa khoa học

Kết quả của đề tài là tài liệu tham khảo cho những nghiên cứu tiếp theo về

xử lý ô nhiễm môi trường nước Giảm thiểu lượng nitơ trong nước thải nhằm xây dựng các quy trình phục hồi sinh học, giảm thiểu ô nhiễm môi trường

-Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả của đề tài góp phần nâng cao công tác quản lý và xử lý tốt hơn nguồn nước thải tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cơ sở khoa học của đề tài

2.1.1 Chu trình Nitơ

Nitơ là yêu cầu của tất cả các sinh vật sống cho tăng trưởng Nó xảy ra trong các axit amin bao gồm tế bào protein và nucleotide tạo nên vật liệu di truyền của tế bào Nó cũng xuất hiện trong các vitamin có chức năng như coenzyme Hầu hết các nitơ trong sinh quyển không thể sử dụng đến các sinh vật cho trao đổi chất của chúng cần bởi vì nó là một phần của các thành tạo đá mà không chuyển qua dễ dàng Nitơ còn là một khí nhiệt động ổn định, chiếm 78% các khí trong khí quyển Nitơ có thể tồn tại trong nhiều trạng thái oxy hóa xảy ra trong hệ thống đất và nước Những dạng nitơ được chuyển độc quyền bởi các hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật Sự biến đổi khác nhau của nitơ là một phần của chu kỳ nitơ (hình 1.1), trong đó đảm bảo rằng nitơ trong môi trường liên tục trở mình Các quá trình này là sự amoni hóa, nitrat hóa, khử nitơ, và cố định đạm

nitrogenase và cần cả sắt và molypden cho hoạt động Hai nhóm sinh vật nhân sơ

có khả năng cố định ntơ:(1)sinh vật sống tự do, đại diện bởi Azotobacter, Clostridium,và vi khuẩn lam dạng sợi;(2) sinh vật cộng sinh,vi khuẩn cố định đạm, đại diện bởi Rhizobium.Vi khuẩn cố định đạm xảy ra trong đất và nước nơi mà chúng sửa chữa ntơ trước khi đưa trong tế bào vi khuẩn Rhizobium sống trong hội

cộng sinh với cây họ đậu như cỏ đinh lăng, đậu phộng Các vi khuẩn này xảy ra ở gốc các nốt sần trên cây nơi mà vi khuẩn cố định đạm được sử dụng cho mực đích dinh dưỡng Trong quá trình trao đổi, thực vật cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn và một môi trường có lợi cho cố định đạm Cộng sinh cố định đạm chiếm hầu hết các nitơ cố định trong môi trường (Alfred Brown, Heidi Smith, 2014)

Hình 1.1 Chu trình Nitơ trong tự nhiên

(Nguồn Alfred Brown, Heidi Smith, 2014)

2 Sự amoni hóa

Khi các sinh vật sống chết đi, chúng vẫn còn phân hủy trong đất bởi một loạt các vi sinh vật Protein bị phân hủy bởi protease, giải phóng các acid amin trong đó nhóm amin được loại bỏ bằng cách khử amin để giải phóng NH3 Acid nucleic cũng

bị phân hủy, giải phóng NH3, và chất thải động vật như acid uric cũng bị phân hủy

để sản xuất NH3 Quá trình sản xuất NH3 trong đất được gọi là sự amoni hóa

Nitrosomonas Nitrobacter

NH4+ NO2- NO3Amomiunion Nitrite ion Nitrate ion

-Vi khuẩn và thực vật có thể hấp thụ amoniac tổng hợp protein mới cần thiết cho

sự tăng trưởng Một loạt các vi khuẩn thực hiện sự amoni hóa trong đất là Bacillus, Pseudomonas, và nhiều loài vi sinh vật khác (Alfred Brown, Heidi Smith, 2014)

3 Quá trình Nitrate hóa

Là một quá trình tự dưỡng NH3 được oxi hóa thành NO2- và NO3- bởi các

vi khuẩn trong một điều kiện hiếu khí được gọi là quá trình nitrate hóa Đây là

những vi khuẩn hóa dưỡng vô cơ lấy được của nhu cầu năng lượng từ quá trình oxy hóa ammonia và nitrite để sửa chữa CO2 cho các yêu cầu cacbon của chúng

Nitrosomonas oxy hóa ammonia thành nitrite sau đó nitrite bị oxy hóa bởi Nitrobacter nitrate để hoàn tất quá trình nitrat hóa đất Bởi vì nitrite và nitrate có thể

được sử dụng bởi các thực vật như một nguồn nitơ, các vi khuẩn đóng một vai trò rất quan trọng trong tạo màu mỡ của đất Người nông dân chọn các hoạt động của vi khuẩn nitrate bằng cách cày bừa đất, tạo hiếu khí làm điều kiện thuận lợi cho quá trình nitrate hóa (Alfred Brown, Heidi Smith, 2014)

4 Quá trình khử Nitrate

Các vi khuẩn kị khí như Paracoccus denitrificans và Pseudomonas sử dụng

nitrate như một chất nhận electron cuối cùng trong quá trình kỵ khí hoặc hô hấp nitrare Quá trình này được gọi là khử nitơ, được thải vào khí quyển Nitrate giảm ở hầu hết các bước sau đó được thải vào khí quyển Quá trình này xảy ra trong đất ngập nước vì ở đó có môi trường kỵ khí và điều đó có thể chiếm mất đáng kể các loại phân bón nitơ áp dụng cho cấy trồng của nông dân Quá trình này được đẩy mạnh trong xử

lý nước thải vì nó ngăn chặn sự giải phóng của nitrate và nitrite và hệ thống nước tự nhiên nơi các ion này có thể gây độc hại đối với cá và các động vật hoang dã Khử nitơ là một phần quan trọng của chu kỳ vì nó đảm bảo rằng nguồn nitơ trong tự nhiên không bị cạn kiệt, các chu kỳ tiếp tục chạy và vi khuẩn chính là các sinh vật để thực hiện quá trình khử nitơ (Alfred Brown, Heidi Smith, 2014)

2.1.2 Tác hại của việc dư thừa Nitơ đối với đời sống và môi trường

 Tác hại của các hợp chất chứa Nitơ đối với đời sống

Trong những thập niên gần đây, mức NO3- trong nước uống tăng lên đáng kể Nguyên nhân là do sự sử dụng phân đạm vô cơ tăng, gây rò rỉ NO3- xuống nước ngầm Hàm lượng NO3- trong nước uống tăng gây ra nguy cơ về sức khoẻ đối với cộng đồng Ủy ban châu Âu quy định mức tối đa của NO3- trong nước uống là 50 mg/l, Mỹ là 45 mg/l, Tổ chức sức khoẻ thế giới (WHO): 100 mg/l Bản thân NO3- không gây rủi ro cho sức khỏe, tuy nhiên NO3- giảm thành NO2- do men khử nitrat

và gây độc NO2- ảnh hưởng đến sức khoẻ với 2 khả năng sau: chứng máu Methaemoglobin và ung thư tiềm tàng

* Hội chứng Methaemo- globinaemia (hội chứng xanh xao trẻ em)

Khi có mặt NO2

thì haemoglobin của máu bị chuyển hóa thành methaemoglobin Đối với người trưởng thành, methaemoglobin nhanh chóng được chuyển thành oxyhaemoglobin nhờ hệ thống khử như NADH-methaemoglobin reductase, nhưng đối với trẻ sơ sinh 3 tháng tuổi trở xuống hệ enzyme này chưa phát triển hoàn chỉnh Sự hình thành methaemoglobin làm giảm khả năng vận chuyển oxy trong máu tới các tế bào và cơ quan trong cơ thể, làm xuất hiện bệnh da xanh (Trần Văn Nhân, Ngô Thị Nga, 1999) và dễ bị đe dọa đến cuộc sống đặc biệt trẻ dưới 6 tháng tuổi

* Ung thư tiềm tàng

Ở Việt Nam khác với nhiều nước trên thế giới, nước ngầm bị nhiễm NH4+

rất nặng Tuy nhiên NH4+ không độc nhưng dưới tác động của vi khuẩn hiếu khí, nó dễ dàng chuyển hóa thành NO2-, NO2- có thể chuyển hóa thành axit nitric (HNO2) trong điều kiện pH axit Axit nitric là một tác nhân nitro hóa mạnh, khi tiếp xúc với các thành phần thực phẩm, kể cả axit amin dễ tạo thành nitrosamine là một tác nhân gây ung thư (Perry, 1999) Rất nhiều nghiên cứu trên động vật như chuột, thỏ… Cho thấy các hợp chất N-nitroso được đưa vào theo đường ăn uống trực tiếp sẽ gây tổn thương hoại tử ở ruột, gan và tạo nên xung huyết của phổi Phức hợp N-nitrso-methylurea cũng gây xung huyết và tổn thương dạ dày, ruột, tụy và làm ảnh hưởng đến tủy sống Các nghiên cứu tác động của nitrosamine tới các động vật có vú, chim, cá và một số loài đông vật lưỡng cư khác cho thấy sự phát triển của tế bà ung thư và chúng thường xuất hiện ở gan, thực quản, hệ hô hấp, thận…(Perry, 1999)

Ngoài ra, amoni có mặt trong nước ngầm làm giảm hiểu quả của khâu khử trùng bằng clo, do nó phản ứng với clo để tạo thành các cloramin, có tác dụng sát khuẩn yếu hơn nhiều so với clo (khoảng 1000 lần) Mặt khác, nó còn giảm khả năng xủ lý sắt, mangan bằng công nghệ truyền thống Amoni là nguồn dinh dưỡng, tạo điều kiện cho các vi sinh vật nước, kể cả tảo, phát triển nhanh, làm ảnh hưởng đến chất lượng nước thương phẩm, đặc biệt độ trong, mùi, vị nhiễm khuẩn (CEEITA, 2001)

 Tác hại của ô nhiễm nitơ đối với môi trường nước

Các hợp chất hữu cơ chứa nitơ rất dễ bị oxi hóa sinh hóa để thành CO2, H2O dưới tác dụng của các vi sinh vật hiếu khí Sau đó tác dụng với NO3 để tạo thành

N2, CO2,H2O thực hiện quá trình khử nitrat dưới tác dụng của các vi khuẩn khử nitơ Sau đó là quá trình phân hủy yếm khí tạo ra CH4, H2S gây sự ô nhiễm (Nguyễn Thị Kim Thái, Lê Thị Hiền Thảo, 2003)

Sự có mặt của các hợp chất chứa nitơ và phospho với hàm lượng lớn trong các nguồn nước mặt như sông, hồ gây nên hiện tượng phú dưỡng ở nước

Hiện tượng phú dưỡng là sự dư thừa dinh dưỡng trong môi trường nước, nó

diễn ra chậm, dẫn đến sự phát triển bùng phát nhanh chóng của một số loài thực vật thủy sinh bậc thấp như tảo, rong, rêu ảnh hưởng tới cân bằng sinh học nước

Những thực vật phát triển trong điều kiện phú dưỡng khi chết sẽ tạo nên khối lượng lớn các chợp chất hữu cơ Những chất hữu cơ này trong quá trình oxi hóa sẽ tiêu thụ nhiều oxi hòa tan trong nước (nhờ quá trình khuếch tán bề mặt từ khí quyển) Điều này dẫn đến sự thiếu hụt oxi nghiêm trọng Quá trình phân giải chất hữu cơ xảy ra theo hướng kỵ khí, làm biến đổi hình thái của một số hợp chất vô cơ trong nước như tăng nồng độ các chất có tính khử (H2S, NH3, ) chuyển hóa các ion kim loại (Fe,Pb,Zn,Cr ) tích tụ cặn lắng ở dạng khó hòa tan do liên kết với các gôc anino (PO43- ;NO3- ) làm tăng tính độc của nguồn nước Sự tích tụ xác động thực vật thủy sinh do thiếu oxi làm tăng chiều dày bùn đáy Thủy vực bị lấp đầy dần trở nên lầy hóa Cân bằng sinh học bị phá vỡ với sự biến mất của nhiều loài động, thực vật và một số loài tảo mới xuất hiện (Lê Văn Khoa, 2007)

Nguyên nhân của hiện tượng phú dưỡng là nguồn nước thải có chứa Nitơ và Phospho Sự phú dưỡng nước ao, hồ và các sông kênh dẫn nước thải gần các thành phố lớn đã trở thành hiện tượng phổ biến ở hầu hết các nước trên thế giới Hiện tượng phú dưỡng hồ và kênh thoát nước thải tác động tiêu cực tới hoạt động văn hoá, làm biến đổi hệ sinh thái nước ao, hồ, tăng thêm mức độ ô nhiễm không khí trong khu vực

Hiện nay, phú dưỡng thường gặp trong các hồ đô thị, các sông và kênh dẫn nước thải Đặc biệt là tại khu vực Hà Nội, sông Sét, sông Lừ, sông Tô Lịch đều có màu xanh đen hoặc đen, có mùi hôi thối do thoát khí H2S Hiện tượng này tác động tiêu cực tới hoạt động sống của dân cư đô thị, làm biến đổi hệ sinh thái của nước hồ, tăng thêm mức độ ô nhiễm không khí của khu dân cư

2.1.3 Trạng thái tồn tại và quá trình chuyển hóa của nitơ trong nước thải

Trong nước thải, các hợp chất của nitơ tồn tại dưới 3 dạng: các hợp chất hữu

cơ, amoni và các hợp chất dạng oxy hoá (NO2-, NO3-)(Trần Đức Hạ,2006) Các dạng này là các khâu trong chuỗi phân hủy hợp chất chứa Nitơ hữu cơ, ví dụ: protein và hợp phần của protein

Các hợp chất chứa Nitơ là các chất dinh dưỡng, chúng luôn luôn chuyển hóa trong tự nhiên

Các hợp chất hữu cơ chưa nitơ được phân hủy bởi nhóm vi khuẩn Amon hóa, Amoni ở môi trường nước gây độc cho cá tôm và các vi sinh vật thủy sinh khác Nếu trong môi trường nước chứa nhiều hợp chất hữu cơ và Amoni thì chứng tỏ mới

bị ô nhiễm Amoni trong điều kiện kỵ khí cũng có thể hình thành từ các ion nitrate

(NO3-) do quá trình hô hấp kỵ khí còn gọi là quá trình amon hóa nitrate

Hình 1.2 Chuỗi phân hủy các hợp chất Nito hữu cơ

(Nguồn acc-biotech.com)

Vi khuẩn nitrobacte

r

Quá trình chuyển hóa từ Amoni thành nitrite (NO2- ) cần thời gian để các vi sinh vật phân hủy, do đó nếu trong môi trường nước có chứa hàm lượng Nitrite (NO2- ) là chủ yếu thì thì nước đã bị ô nhiễm một thời gian dài Các ion nitrite (NO2) là sản phẩm trung gian của quá trình oxy hóa amoniac nhờ các vi khuẩn

nitrosomonas, tuy nhiên nó cũng có thể là sản phẩm chung gian của quá trình khử

nitrate trong điều kiện kỵ khí

Nếu môi trường nước chứa nhiều hợp chất dạng nitrate (NO3-) thì chứng tỏ quá trình phân hủy nitơ đã ở giai đoạn cuối, nitrate là sản phẩm cuối cùng của quá trình oxy hóa các hợp chất hữu cơ chứa nitơ trong nước thải Các ion nitrate (NO3-) bền vững trong điều kiện hiếu khí, chúng dễ dàng được tảo, rêu và các thực vật thủy sinh hấp thụ Trong điều kiện kỵ khí các ion nitrate (NO3- ) dễ bị khử thành N2O,

NO và Nitơ phân tử và hòa vào không khí

2.1.4 Quá trình chuyển hóa nitơ vô cơ và vai trò của nhóm vi khuẩn nitrate hóa

2.1.4.1 Quá trình Nitrate hóa

Quá trình nitrate hoá là quá trình oxy hoá các muối amon thành muối nitrate nhờ sự hoạt động của một nhóm vi sinh vật được gọi chung là nhóm vi khuẩn nitrate hoá Đây là nhóm vi khuẩn hiếu khí tự dưỡng hoá năng và bao gồm hai nhóm nhỏ tham gia vào hai giai đoạn của quá trình này Người đầu tiên nghiên cứu về vi khuẩn nitrate hóa và hoạt động sinh lý của chúng là nhà khoa học Nga Winogradsky Năm 1889, ông chứng minh vi khuẩn nitrate hóa là những loài vi sinh vật dinh dưỡng vô cơ bằng tổng hợp hóa học Ông cũng khẳng định quá trình nitrate hóa gồm 2 giai đoạn: oxy hóa muối amonium thành nitrite và oxy hóa nitrite thành nitrate Hai giai đoạn này được thực hiện do hai loài vi khuẩn khác nhau Vi khuẩn oxy hóa muối amonium thành nitrite có ba nhóm

chính là Nitrosomonas, Nitrisocytis và Nitrosopira Nitrosomonas có hình cầu hoặc hình bầu dục ngắn, Gram âm, không sinh bào tử Nitrosopira là loài biến đổi

nhiều hình thái, nhưng dạng điển hình là trực khuẩn (Lê Xuân Phương, 2008) Quá trình nitrate hoá là quá trình oxy hoá các muối NH4+ thành NO3- nhờ sự hoạt động của một nhóm vi sinh vật được gọi chung là nhóm vi khuẩn nitrate hoá Đây

là nhóm vi khuẩn hiếu khí tự dưỡng hoá năng và bao gồm hai nhóm nhỏ tham gia

vào hai giai đoạn của quá trình này Giai đoạn 1 là giai đoạn oxy hoá NH4+ thành

NO2- được gọi là giai đoạn nitrite hoá Giai đoạn 2 là giai đoạn oxy hoá NO2thành NO3- được gọi là giai đoạn nitrate hoá (Cole, 1994)

-Ý nghĩa của quá trình nitrate hóa trong việc làm sạch nước: nó phản ánh mức

độ khoáng hóa của các hợp chất hữu cơ có trong nước thải, quan trọng hơn qua quá trình này có thể tích lũy một lượng oxy dự trữ có thể ứng dụng để oxy hóa các chất hữu cơ không chứa nitơ khi lượng oxy tự do (lượng oxy hòa tan) đã tiêu hao hoàn toàn trong quá trình đó Sự có mặt của nitrate trong nước thải phản ánh mức độ khoáng hóa hoàn toàn của các chất hữu cơ

 Giai đoạn nitrite hoá

Nitrite hóa là quá trình oxy hóa amon thành nitrite nhờ enzym

Amonmonoxygenaza (AMO) của vi khuẩn xúc tác trong điều kiện hiếu khí

NH4+ +1/2 O2 → NO2 + 2H+ + 2H2O + Q Năng lượng này được vi khuẩn sử dụng để đồng hoá CO2 thành cacbonhữu cơ (sinh khối vi khuẩn) Nhóm vi khuẩn nitrite hoá bao gồm 4 giống khác nhau: Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosobrio, Nitrozolobus và Nitrosospira(D.Barnes, 1983)

Đầu tiên amon bị oxy hóa thành hydroxylamin nhờ enzym AMO

NH3 + O2 + 2e + 2H+ → NH2OH + H2O Quá trình này không giải phóng năng lượng ở dạng ATP, nhưng lại đòi hỏi nguồn điện từ để tạo ra hydroxylamin Nguồn điện từ có được do sinh ra khi oxy hóa NADH2 thành NAD+ và truyền qua cytochroen Một phần nguồn điện từ trong quá trình oxy hóa amon thành hydroxylamin đi vào chuỗi truyền điện tử trong màng

nguyên sinh chất của vi khuẩn Nitrosomonas, phần còn lại dùng để oxy hóa

hydroxylamin thành nitrite Cơ chất của Amon monoxyenaza sử dụng là NH3, không dùng NH4+

 Giai đoạn nitrate hoá

NO2- tạo thành trong giai đoạn nitrite hoá sẽ tiếp tục bị oxy hoá thành NO3nhờ một nhóm vi khuẩn khác theo phương trình:

-NO2- + O2 → NO3- + Q

Nhóm vi khuẩn thực hiện nitrate hoá này bao gồm 3 giống: Nitrobacter, Nitrospira và Nitrococcus Vi khuẩn nitrate hóa phân bố rất ít trong các thủy vực

sạch, nghèo dinh dưỡng, trong các thủy vực giàu dinh dưỡng số lượng của chúng có nhiều hơn, nhưng cao nhất cũng chỉ khoảng 10 tế bào/ml nước Số lượng của chúng trong thủy vực dao động theo mùa rõ rệt: các cực tiểu thường thấy vào mùa đông hoặc đầu mùa xuân, còn các cực đại thì trong mùa hè Quá trình nitrate hoá là một khâu quan trọng trong vòng tuần hoàn nitơ trong thủy vực Quá trình này có tầm quan trọng trong quản lý chất lượng nước trong nuôi trồng thủy sản Khi quá trình này xảy ra mạnh chất thải amon độc hại sẽ được chuyển hoá nhanh sang dạng nitrat không độc (Lê Xuân Phương, 2008)

Vi khuẩn tham gia vào quá trình phản nitrate hóa bao gồm các loại vi khuẩn

kỵ khí không bắt buộc như: Pseudomonas, Bacillus…Trong điều kiện hiếu khí,

chúng oxy hóa các chất hữu cơ bằng oxy của không khí Còn trong điều kiện kỵ khí, chúng tiến hành oxy hóa các hợp chất hữu cơ bằng con đường khử hydro để chuyển hydro cho nitrate và nitrite Quá trình này không có lợi vì nó làm mất nitơ trong thủy vực và tạo thành các chất độc đối với thủy sinh vật như NH3, NO2- Trong đa

số sinh cảnh, vi sinh chỉ có thể khử nitrate thành nitrite, chứ không có thể khử tiếp thành các dạng hợp chất khác Do đó, ở đâu có quá trình phản nitrate hóa xảy ra mạnh thì ở đó có nhiều nitrite

2.1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nitrate hóa

Các vi khuẩn hoá năng vô cơ nói chung sở hữu những cơ chế hoá sinh đặc biệt giúp chúng tồn tại và phân bố trong một khoảng không gian rất rộng ở mặt đất và dưới nước Người ta cũng phân lập được chúng trong cát và nước mưa Do là vi sinh vật tự dưỡng, nên chúng có khả năng tự tổng hợp sinh khối nhờ có cơ chế sinh hoá chứa đủ hệ enzyme phân giải các chất vô cơ, ví dụ như một

số loài có thể đồng thời oxi hoá urea và methane cùng lúc với dị hoá rất nhiều loại hydrocarbon khác nhau Hơn nữa, các tế bào này có khả năng duy trì sự sống trong điều kiện thiếu nguồn cơ chất bằng nhờ giảm hoạt động hô hấp nội bào và đồng hoá xuống mức thấp nhất (Phạm Thị Tuyết Ngân, 2012) Ta sẽ xem xét các yếu tố ảnh hưởng cụ thể như sau:

 Nồng độ ammonia

Theo nghiên cứu của Anthonisen và cộng sự (1976) thì khi hàm lượng ammonia vượt quá từ 10 đến 150 mg/l thì sẽ ức chế quá trình nitrite hoá Quá trình nitrate hoá nhạy cảm hơn, nếu ammonia vượt hơn mức 0,1 đến 1 mg/l thì vi khuẩn nitrate hoá đã bị ức chế Đối với nồng độ ion NO2-

thì từ 0,22 đến 2,8 mg/l sẽ ức chế quá trình nitrate hoá Hiện chưa có nghiên cứu nào ghi nhận nồng độ NO3- ở mức nào sẽ ức chế quá trình nitrate hoá Nồng độ oxy hoà tan (DO) Tuy vi khuẩn nitrate hoá là loài hiếu khí bắt buộc nhưng chúng có thể sống trong thời gian dài ở điều kiện thiếu oxy dưới các tầng nước phía đáy hồ, trong các bể xử lý nước thải và bùn hoạt tính Người ta đã ghi nhận được mật độ 102 tế bào/ml vi khuẩn nitrite hoá trong một bể xử lý kị khí có nồng độ TAN 52 mg/l Ở các bể xử lý nước thải liên tục thì nồng độ vi khuẩn nitrite hoá đạt tối ưu ở nồng độ oxi hoà tan khoảng 0,2 mg/l Quá trình nitrite hoá vẫn xảy ra ở mức độ oxi hoà tan thấp 0,05 mg/l mà vẫn phân giải được một lượng đáng kể ammonia Đối với vi khuẩn nitrate hoá thì có sức sống tương tự như vậy, trong một số trường hợp mật độ tế bào còn nhiều hơn vi khuẩn nitrite hoá vài lần Việc phát triển các bể xử lý hiếu khí kín có một vài khu vực kị khí cục bộ đã cho phép tiến hành đồng thời quá trình nitrate hoá và phản nitrate hoá, chuyển từ ammonia ra đến N2 Nồng độ oxi hoà tan tối ưu cho hệ vi khuẩn nitrate hoá phát triển tốt là 3-4 mg/l O2

 Nhiệt độ

Vi khuẩn nitrate hoá là loại vi khuẩn ưa ấm, nhiệt độ tối thích cho chúng phát triển trong khoảng 25-30°C Đối với quá trình nitrite hoá vẫn diễn ra ở nhiệt độ từ 7-35°C trong khi quá trình nitrate hoá thì nhiệt độ diễn ra rộng hơn từ 5-42°C

 pH

Hầu hết các vi khuẩn nitrate hoá có giá trị pH tối ưu dao động trong khoảng 7,5 -8,0 Tại giá trị pH nhỏ hơn 6 hoặc lớn hơn 10 thì quá trình nitrate hoá diễn ra rất chậm và bị ức chế Quá trình oxi hoá ammonia bởi vi khuẩn nitrite hoá

làm giảm tính kiềm của môi trường Vi khuẩn Nitrosomonas thì hoạt động trong khoảng pH = 6,7-9,2 trong khi vi khuẩn Nitrobacter thì hoạt động trong khoảng

pH 8 -9,2 Sự thích nghi của vi khuẩn đối với giá trị pH quá cao hoặc quá thấp đều đòi hỏi phải có một khoảng thời gian Trong nhiều nghiên cứu cho thấy các chủng vi khuẩn tự dưỡng có thể thích nghi được ở cả giá trị pH rất thấp như 3-

4 hoặc giá trị pH rất cao 11-12 Trong các nguồn nước thải thường có pH nằm trong dải trung tính và kiềm nhẹ, vì thế quá trình nitrate hoá vẫn diễn ra thuận lợi mà ít

cần sự tác động chỉnh pH về pH tối thích Sự có mặt của các chất độc Nitrosomonas

sp và Nitrobacter sp đều nhạy cảm với một vài hợp chất độc thường gặp trong nước thải Tuy nhiên, mức độ nhạy cảm của Nitrosmonas sp thường cao hơn với Nitrobacter sp., các hợp chất này gây ngừng quá trình nitrate hoá vì ức chế các hệ

enzyme trên màng của tế bào Hầu hết các hợp chất diệt khuẩn đều tác động nghiêm trọng đến hoạt động sống của vi khuẩn nitrate hoá

2.1.5 Đặc điểm sinh học và vai trò của vi khuẩn tham gia quá trình nitrate hóa

2.1.5.1 Các dòng vi khuẩn tham gia vào quá trình nitrate hóa

 Vi khuẩn nitrite hóa

Vi khuẩn có khả năng oxy hóa amon thành nitrite hầu hết thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí bắt buộc Các vi khuẩn này không lấy năng lượng từ sự oxy hóa chất hữu cơ mà lấy năng lượng từ sự oxy hóa các hợp chất chứa nitơ vô cơ Chúng thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, không sinh bào tử, tế bào hình cầu, hình que, hình xoắn

Một số đại diện đặc trưng cho nhóm này là giống Nitrosomonas, Nitrococcus, Nitrozolobus, Nitrosospira (Phạm Thị Tuyết Ngân, 2012) Trong số đó giống Nitrosomonas mà đặc biệt là loài Nitrosomonas europaea được áp dụng nhiều

nhất trong quá trình nitrite hóa Đó là những vi khuẩn hình bầu dục, nhỏ bé kích thước từ 0,4 - 0,6 1 - 1,8 µm, không sinh bào tử, có thể có tiêu mao khá dài, có

khả năng tích lũy nhiều chất nhầy quanh tế bào Cơ chất oxy hóa của Nitrosomonas

là amoniac, ure, guanin, các cơ chất hữu cơ không được sử dụng làm nguồn oxy hóa (Hoàng Phương Hà và cs, 2010)

 Vi khuẩn nitrate hóa

Cũng như các loại vi khuẩn tự dưỡng khác, vi khuẩn nitrate hóa dùng năng lượng sinh ra để khử CO2 của không khí và tạo nên các chất hữu cơ cần thiết cho cơ

thể chúng Loại vi khuẩn nitrate hóa điển hình nhất là Nitrobacter Chúng là những

tế bào hình que nhỏ, kích thước khoảng 0,8×1,0µm, Gram âm (-), không sinh bào

tử Hai loài Nitrobacter chủ yếu là N Winogradski( không di động) và N Agilic (di động) Cơ chất oxy hóa duy nhất của Nitrobacter là nitrite (Trần Hiếu Nhuệ và cs, 1996) Nitrobacter cũng có thể sinh trưởng và phát triển trên các môi trường có

chứa chất hữu cơ, hoặc chất hữu cơ có kích thích sự sinh trưởng và phát triển cũng

như hoạt tính chuyển hoá của chúng (Lê Văn Khoa, 1995) Nitrobacter rất nhạy

cảm với điều kiện không thuận lợi của môi trường, nồng độ NaNO2 0.5 g/l bắt đầu kìm hãm sự sinh trưởng của chúng

Năng lượng thu được từ quá trình oxy hóa NH4+ sẽ được các vi khuẩn sử dụng để sinh tổng hợp vật chất của tế bào từ CO32- Do chỉ nhận được rất ít năng lượng từ quá trình oxy hóa nên tốc độ phát triển của các vi khuẩn oxy hóa amon và oxy hóa nitrit tự dưỡng là hết sức chậm chạp Thời gian thế hệ là 0,4-2,5 ngày đối

với Nitrosomonas và 0,3-1,5 ngày đối với Nitrobacter ( Cole J.A de Graaf, 1994)

 Các vi khuẩn dị dƣỡng tham gia vào quá trình nitrite hóa

Trong những năm gần đây, bên cạnh các vi khuẩn tự dưỡng bắt buộc người

ta đã phát hiện ra một số vi khuẩn dị dưỡng có khả năng oxy hóa NH4+

và các hợp chất hữu cơ chứa nitơ thành NO2-, NO3- như: Methylomonsa, Methanica, Ethylosinus trichosprium, Methylococcus capsulatus, Pseudomonas methanicus, Thiosphaera pantotropha, Thibacillus novellus Cơ chế hóa sinh của quá trình nitrate hóa do vi

khuẩn dị dưỡng vẫn chưa hoàn toàn sáng tỏ Có lẽ sự oxy hóa nitơ có thể xảy ra theo cả hai con đường vô cơ và hữu cơ

Quá trình nitrate hóa nhờ các vi khuẩn dị dưỡng có tầm quan trọng đặc biệt bởi nó dễ sinh trưởng và phát triển ở mọi môi trường, cả ở những nơi giàu hay nghèo chất hữu cơ Trong khi đó các vi khuẩn tự dưỡng thường có mặt ở những nơi

có ít chất hữu cơ Mặc dù khả năng oxy hóa NH4+, các vi khuẩn tự dưỡng nhỏ hơn

từ 103-104 lần khả năng oxy hóa NH4+ của các vi khuẩn tự dưỡng, nhưng bù lại đó chúng có khả năng phát triển nhanh hơn nhiều lần Hơn nữa ngoài khả năng oxy hóa

NH4+, các vi khuẩn tự dưỡng còn có cả enzyme khử nitrate thành nitơ phân tử, ngay

cả trong điều kiện có oxy bởi vậy chúng là những vi khuẩn lý tưởng trong xử lý các môi trường bị ô nhiễm bởi NH4+

, NO2-, NO3-

2.1.5.2 Đặc điểm sinh học và vai trò của vi khuẩn Nitrosomonas

Nitrosomonas là một trong 5 giống vi khuẩn oxy hóa ammonium (AOB) gồm: Nitrosomonas, Nitrosocystis, Nitrosocossus, Nitrosogloea và Nitrosospira

(Stanley và Mandel, 1971) Tất cả các vi sinh vật này đều giống nhau về mặt sinh lý-sinh hóa nhưng khác nhau về mặt đặc điểm hình thái học và cấu trúc học Vi

khuẩn Nitrosomonas là nhóm vi khuẩn tự dưỡng hoá năng và hiếu khí bắt buộc

Chúng sử dụng NH3 như nguồn năng lượng chủ yếu cho hoạt động tổng hợp carbon từ

CO2 để đáp ứng nhu cầu cacbon của chúng AOB thuộc 2 nhóm là γ-Proteobacteria chỉ có giống Nitrosococcus với 2 loài Nitrosococcus oceani và Nitrosococcus halophilus

và nhóm β-Proteobacteria với 2 giống Nitrosomonas sp và Nitrosospira sp ( Thomas

B, 1994) Các loài thuộc giống Nitrosococcus chỉ có thể được tìm thấy trong môi trường nước mặn Nitrosospira phân bố chủ yếu và chiếm ưu thế ở nội địa Giống Nitrosomonas thường phân bố rộng rãi trong đất, bùn nước ngọt và nước lợ, trong đó N europaea chiếm số lượng cao Phần lớn những loài vi khuẩn thuộc giống Nitrosomonas không

có khả năng di động nên cần phải bám vào bề mặt giá thể như đá, cát, giá thể sinh học… giúp chúng phát triển thuận lợi Khả năng bám là nhờ chúng tiết ra chất nhầy từ màng bao

bên ngoài cho biết N europaea có khả năng di động

Nitrosomonas thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, đều có hình que nhưng các tế

bào vi khuẩn khác nhau có hình dạng và kích thước khác nhau Có 3 hình dạng cơ bản được xác định: hình que rất ngắn rộng 0,8 µm và dài 1 - 2 µm, hình que rộng 1

1,3 µm và dài 2 2,5 µm, hình dạng thứ ba là những tế bào rộng 1,2 µm và dài 2 2,5 µm Những đặc điểm về hình dạng tế bào như mô tả trên giúp phân biệt với

-giống Nitrosospira là những tế bào dạng sợi xoắn, vòng xoắn hay thể xoắn, trong khi đó Nitrosococcus có hình cầu và các tế bào dính chặt với nhau (Smith A.C, 2005) Nitrosomonas sống ở những nơi giàu NH3 và các muối vô cơ như trong bùn đáy ao, nước cống, nước ngọt, trên tường của các tòa nhà cũ, các thủy vực bị ô nhiễm chứa nhiều hợp chất nitơ nhằm tránh ánh sáng Chúng sinh sản bằng

cách phân đôi Dưới các điều kiện thích hợp có thể tăng lên gấp đôi sau 7 giờ Ở

điều kiện bình thường, chúng tăng lên gấp đôi sau 15 - 20 giờ Nitrosomonas

không hình thành bào tử, có vách tế bào phức tạp được bao quanh bởi lớp màng nhầy Không giống với các loài vi khuẩn dị dưỡng khác chúng không thể sống trong môi trường khô Trong nước, chúng có thể sống sót một giai đoạn ngắn ở các điều kiện bất lợi nhờ vào việc dùng các vật chất dự trữ bên trong tế bào Khi các vật chất này hết chúng sẽ chết

 Các thông số sinh lý của vi khuẩn Nitrosomonas

Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của Nitrosomonas khoảng 25 – 30°C Tỉ

lệ sinh trưởng bị giảm 50% ở 18°C Ngưng hoạt động ở 4°C Khả năng chịu đựng ở

nhiệt độ thấp của Nitrosomonas cao hơn ở Nitrobacter Vì vậy trong các thủy vực

nước lạnh xảy ra trường hợp tích lũy NO2- khoảng pH thích hợp là 7,8 - 8,0 Tại

mức pH thấp hơn 7, Nitrosomonas sẽ phát triển chậm và làm tăng lượng NH3 trong thủy vực Sự phát triển của chúng bị ức chế ở pH = 6,5 Tại mức pH đó hầu hết NH3 trong nước sẽ trở thành chất độc ôn hòa, ở trạng thái ion hóa NH3 Nhu cầu oxy hòa tan (DO): quá trình nitrite hóa sẽđạt cao nhất nếu DO ở mức lớn hơn 80% trạng thái bão hòa và sẽ không xảy ra nếu nồng độ DO = 2 mg/L hoặc thấp hơn Hàm lượng chất dinh dưỡng tối thiểu:tất cả các vi khuẩn nitrate hóa đều cần một lượng chất dinh dưỡng vô cơ tối thiểu, trong số đó cần thiết và quan trọng nhất là phosphorus

để sản xuất ra ATP (Adenosine Tri-Phosphate) Sự chuyển hóa ATP cung cấp năng lượng cho các chức năng của tế bào Phosphorus thông thường có sẵn trong nước dưới dạng lân hòa tan PO43- Tất cả các loài thuộc giống Nitrosomonas sử

dụng NH3 như là nguồn năng lượng cho sự chuyển hóa thành NO2- Amonia đầu tiên bị khử hydro thành amine (NH2) sau đó bị oxy hóa thành NO2- Tiến trình

chuyển hóa đó cho phép Nitrosomonas sử dụng một số hợp chất của amine Một vài loài của Nitrosomonas có khả năng sử dụng urea như nguồn năng lượng như vi khuẩn N nitrosa, N ureae, N Marina

2.1.5.3 Đặc điểm sinh học và vai trò của vi khuẩn Nitrobacter

Giống Nitrobacter gồm hai loài đã được phát hiện: loài N.agilis do

Wignogradsky phân lập từ đất năm 1890 Sự hình thành NO3- là giai đoạn quan

trọng trong chu trình nitơ, nhưng số lượng các loài tham gia vào quá trình này

không nhiều Nitrobacter là nhóm nổi trội, tuy nhiên vào thời điểm đó chỉ mới được công nhận Nitrobacter agilis Vi khuẩn Nitrobacter thuộc nhóm vi khuẩn tự dưỡng hoá năng vô cơ và hiếu khí bắt buộc Nitrobacter nhận nguồn năng lượng từ

quá trình oxy hoá NO2- thành NO3- Ngoài ra còn mô tả có 4 giống khác nhau nằm

trong lớp phụ α-, β-, γ-Proteobacteria và ngành Nitrospira Nitrospira phân bố

trong môi trường nước mặn có hình que dài và rất mảnh, chiều rộng 0,3 - 0,4 µm

và dài 2,7 - 6,5 µm Nitrobacter thuộc lớp phụ α-Proteobacteria phân bố ở nước

ngọt, lợ, đất, bùn và đá Trong 4 giống thuộc nhóm vi khuẩn nitrit hóa chỉ có

Nitrobacter được chứng minh có nhiều trong đất và bùn , chúng giữ vai trò

quan trọng nhất trong bước thứ hai của quá trình ( A.A.Van de Graaf, 1995) Mặc

dù có tối thiểu 4 giống vi khuẩn nitrate hóa tồn tại trong tự nhiên nhưng phần lớn những hiểu biết về các vi sinh vật này đều xuất phát từsự nghiên cứu trên giống

Nitrobacter (Lê Văn Khoa, 1995, Trần Hiếu Nhuệ và cs, 1996) Theo các tác giả

này các loại vi khuẩn tựdưỡng dùng năng lượng sinh ra để khử CO2 của không khí và tạo nên các chất hữu cơ cần thiết cho cơ thể chúng Loại vi khuẩn nitrate

hóa điển hình nhất là Nitrobacter Chúng là những tế bào hình que nhỏ, kích thước khoảng 0,8 x 1,0µm, Gram (-), không sinh bào tử Hai loài Nitrobacter

chủ yếu là N Winogradskyi (không di động) và N Agilic (di động) Cơ chất oxy hóa duy nhất của Nitrobacter là nitrite Nitrobacter cũng có thể sinh trưởng và

phát triển trên các môi trường có chứa chất hữu cơ, hoặc chất hữu cơ kích thích sự sinh trưởng và phát triển cũng như hoạt tính chuyển hóa của chúng (Lê Văn

Khoa, 1995) Nitrobacter rất nhạy cảm với điều kiện không thuận lợi của môi

trường, nồng độ NaNO2 0,5 g/L bắt đầu kìm hãm sự sinh trưởng của chúng Năng lượng thu được từ quá trình oxy hóa NH4- sẽ được các vi khuẩn sử dụng để sinh tổng hợp vật chất của tế bào từ CO32-.Do chỉ nhận được rất ít năng lượng từ quá trình oxy hóa nên tốc độ phát triển của các vi khuẩn oxy hóa amon và oxy hóa nitrit

tựdưỡng là hết sức chậm chạp Thời gian thế hệ là 0,4 - 2,5 ngày đối với

Nitrosomonas và 0,3 - 1,5 ngày đối với Nitrobacter.

2.1.6 Hiện trạng nước thải tại trường Nông Lâm Thái Nguyên

Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên thuộc xã Quyết Thắng – TP Thái Nguyên, là khu vực rộng lớn với tổng diện tích 102,85 ha (TUAF, 2015) Trong khu vực trường có rất nhiều sinh viên, nông dân, sinh sống, nghiên cứu học tập và làm việc trong trường, bên cạnh đó còn có những trang trại chăn nuôi, trồng trọt lớn do đó hằng ngày thường xuyên phát sinh một lượng nước thải lớn, lượng nước thải này thải

ra môi trường bên ngoài mà phần lớn trong đó chưa qua xử lý hoặc xử lý chưa triệt để gây ô nhiễm nguồn nước ở kênh, mương, suối, ao, hồ xung quanh nhà trường ảnh hưởng tới môi trường sinh thái xung quanh, gây ra mùi khó chịu ảnh hưởng tới chính cuộc sống của chính những người đang sinh sống và làm việc trong trường

Để hạn chế vấn đề ô nhiễm nhất là ô nhiễm nguồn nước và để cải thiện cảnh quan nhà trường, lãnh đạo nhà trường cần tuyên truyền hơn nữa cho sinh viên học tập tại nhà trường, cho người dân sinh sống làm việc trong trường không xả rác thải, nhất là nước thải sinh hoạt ra ngoài môi trường nước, các trang trại chăn nuôi (chại nuôi lợn, nuôi bò ) cần xây dựng nhiều công trình xử lý chất thải xử lý triệt để các tác nhân gây ô nhiễm, các công trình xử lý sinh học thân thiện với môi trường như

bể biogas, hố ủ phân ngoài ra cần kiểm tra lại các công trình xử lý rác thải hiện có triệt để không ở các các khu tập chung đông người như khu ký túc xá, các phòng thí nghiệm các khu học tập và giải trí trong trường Để hướng tới tạo không gian xung quanh nhà trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên là ngôi Trường xanh, sạch đẹp

Hình 1.3 Nguồn nước ô nhiễm thu được từ Khu kí túc xá sinh viên

Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên