Luận án tiến sĩ nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học của polysaccharide từ hạt me (tamarindus indica l) việt nam (tt)

MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Hiện nay, việc tìm kiếm, phát nghiên cứu hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học cao từ nguồn tài nguyên thực vật phong phú nước ta mối quan tâm chung ngành Hoá, Sinh, Y, Dược Việc khai thác, sử dụng nguồn tài nguyên ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm mỹ phẩm có hiệu kinh tế cao Trong vô số loài thực vật Việt Nam, me thuộc chi Tamarindus họ Đậu (Fabaceae) có giá trị sử dụng cao, phận me dùng sống me mà thành phần hóa học chủ yếu polysaccharide sử dụng nhiều ngành công nghiệp thực phẩm dược phẩm Cho đến thời điểm Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu mặt hóa học thành phần có me, me đối tượng nghiên cứu có nhiều triển vọng, có ý nghĩa khoa học thực tế Trên sở phân tích trên, tác giả tập thể hướng dẫn lựa chọn đề tài nghiên cứu luận án là: "Nghiên cứu thành phần hóa học khảo sát hoạt tính sinh học polysaccharide từ hạt me (Tamarindus indica L.) Việt Nam" Mục tiêu luận án: Xác định thành phần hóa học, cấu trúc đánh giá hoạt tính sinh học Tamarind Seed Polysaccharide (TSP) có me Điều chế dẫn xuất sulfate hóa acetyl hóa có hoạt tính sinh học cao TSP tự nhiên từ góp phần sáng tỏ ảnh hưởng mức độ sulfate hóa acetyl hóa đến hoạt tính sinh học Phương pháp nghiên cứu: Luận án thực sở kết nghiên cứu thực nghiệm hệ thống phương pháp nghiên cứu công bố Cụ thể, phương pháp sắc ký gel (GPC), phổ hồng ngoại, phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, tán xạ ánh sáng tĩnh động, tán xạ tia X góc nhỏ, kính hiển vi điện tử quét, phương pháp thử hoạt tính sinh học… Ý nghĩa khoa học luận án: Lần cấu trúc TSP từ me nghiên cứu hoàn chỉnh bao gồm cấu trúc hóa học, cấu trúc không gian cấu trúc bề mặt cách sử dụng phương pháp đại giới nghiên cứu cấu trúc polymer bao gồm phổ NMR, phổ khối ESI-MS,ESI-MS/MS phương pháp tán xạ ánh sáng tĩnh SLS động DLS, tán xạ tia X góc nhỏ SAXS, xây dựng mô hình cấu trúc phân tử TSP dựa cấu trúc hóa học Ý nghĩa thực tiễn luận án: Đã sulfate hóa acetyl hóa TSP tự nhiên để thu mẫu biến tính TSPS TSPA có hoạt tính cao mẫu tự nhiên (Kết nghiên cứu cho thấy dẫn xuất sulfate hóa làm tăng khả ly giải cục máu đông, khả chống đông tụ máu hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định dẫn xuất acetyl hóa làm tăng khả oxy hóa so với mẫu TSP tự nhiên) Các kết luận án đạt được: - Lần cấu trúc TSP từ me nghiên cứu hoàn chỉnh bao gồm cấu trúc hóa học, cấu trúc không gian cấu trúc bề mặt - Đã xây dựng mô hình cấu trúc phân tử TSP dựa cấu trúc hóa học - Hoạt tính sinh học cấu trúc mẫu TSP TSPS với mức độ sulfate hóa khác nghiên cứu để tìm hiểu ảnh hưởng sulfate hóa lên cấu trúc hoạt tính sinh học (Đây điểm luận án so với nghiên cứu nước lĩnh vực) Cấu trúc luận án: Luận án gồm 132 trang: Đặt vấn đề trang; Chương – Tổng quan 18 trang; Chương – Đối tượng phương pháp nghiên cứu 17 trang; Chương – Thực nghiệm 18 trang; Chương – Kết thảo luận 48 trang; Kết luận kiến nghị trang; Danh mục công bố luận án trang; 122 tài liệu tham khảo 13 trang; có 30 bảng biểu 47 hình ảnh đồ thị CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Phần tổng hợp nghiên cứu giới nước nghiên cứu hóa học hoạt tính sinh học polysaccharide CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu luận án polysaccharide phân lập từ me (Tamarind Seed Polysaccharide TSP) Quả me thu hái huyện Thủy Nguyên, Hải Phòng vào tháng 10 năm 2013 huyện Cần Giuộc, Long An vào tháng 11 năm 2014 Cây me có tên khoa học Tamarindus indica.L thuộc họ đậu chi Tamarindus, loài T.indica 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp chiết tách Chiết tách polysaccharide từ me phương pháp chiết tách thông thường, kết hợp phương pháp tinh chế, làm đồng thời tham khảo công bố giới để đưa phương pháp chiết tách tối ưu, phù hợp với đối tượng mục đích nghiên cứu luận án 2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc 2.2.2.1 Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC) Gel Permeation Chromatography (GPC) kỹ thuật sắc ký để phân tách phân tử kích thước lớn dựa rửa giải chúng cột GPC xác định vài thông số cấu trúc quan trọng bao gồm trọng lượng trung bình Mw, trọng lượng phân tử trung bình số Mn, đặc trưng polymer phân bố trọng lượng phân tử 2.2.2.2 Phương pháp phổ IR Ngày nay, phương pháp phổ hồng ngoại (IR) phương pháp vật lý sử dụng rộng rãi phân tích cấu trúc nói chung phân tích cấu trúc ionic polysaccharide nói riêng [1,2] Phương pháp mang đến thông tin cấu trúc quan trọng để xác định kiểu nhóm chức phân tử polysaccharide 2.2.2.3 Phương pháp phổ NMR Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân phương pháp hữu hiệu để nghiên cứu cấu trúc polysaccharide Trong phương pháp nghiên cứu cấu trúc polysaccharide phổ 1H 13C-NMR thường sử dụng Trong số trường hợp phổ 1H-NMR dùng để định lượng polysaccharide có mẫu phân tích [2,25] 2.2.2.4 Phương pháp phổ MS Hiện phương pháp phổ khối lượng với kỹ thuật phổ khối nhiều lần (Tandem – mass spectrometers) đời gần đồng thời kĩ thuật: ion hóa phu mù điện ESI (Electrospray Ionisation) ion hóa giải hấp laser nhờ mạng lưới MALDI (Matrix-Assited Laser Desorption Ionisation) Đây bước nhảy vọt mặt kĩ thuật đưa khối phổ thành công cụ mạnh nghiên cứu phân tử sinh học lớn, trao giải Nobel 2002 với thành tựu cộng hưởng từ hạt nhân Một ưu điểm kĩ thuật ESI phân tử lớn có nhiều trung tâm điện tích tỷ lệ khối lượng/điện tích trở nên đủ nhỏ phép chất phân tích máy khối phổ thông thường [4,5] Kỹ thuật MALDI-ToF-MS ESI–MS phương pháp hữu hiệu việc xác định trọng lượng phân tử xyloglucan dẫn xuất sau thủy phân enzym hóa, hai kỹ thuật thu liệu nhanh chóng phân mảnh nhỏ 2.2.2.5 Phương pháp tán xạ ánh sáng (LS) tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) Hiện phương pháp tán xạ (LS) hữu hiệu để nghiên cứu cấu trúc không gian phân tử chất tan dung dịch Phương pháp dựa vào đường cong tán xạ ta biết thông số cấu trúc trọng lượng, kích thước hình dạng phân tử chất tan 2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 2.2.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào Hoạt tính gây độc tế bào tiến hành để đánh giá khả ức chế phát triển tế bào ung thư không ung thư in vitro mẫu chiết, để kiểm tra độc tính thuốc với dòng tế bào ung thư không ung thư Phép thử dựa vào khả nhuộm màu SRB (Sulforhodamine B) bám vào protein tế bào cố định acid trichloroaxetic (TCA) Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo thành phần protein tế bào nhuộm Sulforhodamine B (SRB) Giá trị OD máy đo tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, lượng tế bào nhiều (lượng protein nhiều) giá trị OD lớn 2.2.3.2 Hoạt tính chống oxy hóa Những phép thử đo hoạt tính chống oxy hóa có liên quan đến chuyển nguyên tử hydrogen hay chuyển e độc thân Cơ chế hai phép thử xảy đồng thời phụ thuộc vào cấu trúc chất chống oxy hóa pH Phép thử theo chế chuyển nguyên tử hydrogen đựa theo việc đo khả chất chống oxy hóa để quét gốc tự cho hydrogen Trong phép thử dựa chế chuyển e độc thân, phản ứng xác định khử proton khả ion hóa nhóm chức (IP), phép thử phụ thuộc vào pH, pH cao giá trị IP thấp tăng khử proton Những hợp chất có IP  45kcal/mol chế phản ứng thường chuyển e độc thân Phản ứng chuyển e độc thân thường chậm chịu ảnh hưởng âm tính hợp phần vết, chất nhiễu đặc biệt kim loại 2.2.3.3 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định thực dựa phương pháp khuếch tán đĩa thạch Đây phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh hay yếu mẫu thử thông qua đường kính khuếch tán Các vi sinh vật kiểm định tiến hành hoạt hóa trước tiến hành thử nghiệm môi trường dịch thể đặc biệt Sau pha loãng tới nồng độ thích hợp trước tiến hành thử nghiệm Chất kháng sinh so sánh Ampicilin, Streptomycin, Amphotericin B mẫu trắng 2.2.3.4 Hoạt tính chống đông tụ máu Đông máu trình máu chuyển từ thể lỏng thành thể đặc chuyển fibrinogen thành fibrin không hòa tan sợi fibrin bị trùng hợp tạo thành mạng lưới giam giữ thành phần máu làm máu đông lại Đông máu chống đông trình phức tạp, hai tượng xảy ra, song song tiến triển, cuối để nhằm cầm máu, tránh tượng đông máu tràn lan gây tắc nghẽn mạch máu hình thành đủ Kết đánh giá qua quan sát trực quan dùng pipet hút kiểm tra trạng thái máu 2.2.3.5 Hoạt tính ly giải cục máu đông Hình thành cục máu đông phản ứng tự nhiên để thể tự bảo vệ Tuy nhiên, cục máu đông trở nên nguy hiểm hình thành bên mạch máu Chúng di chuyển tới khắp nơi thể, lên não làm tắc mạch máu não gây đột quỵ, đến tim làm hẹp động mạch vành gây nhồi máu tim, điều thực nguy hiểm, chí đe dọa tính mạng Kết đánh giá thay đổi khối lượng ly giải huyết khối trước sau thí nghiệm Phần trăm ly giải cục máu đông tính chênh lệch khối lượng trước sau ly giải cục máu đông CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 3.1 Thu hái, định danh xử lý mẫu me 3.1.1 Thu hái định danh Quả me thu hái vùng Thủy Nguyên, Hải Phòng vào tháng năm 2013 Cần Giuộc –Long An vào tháng 12 năm 2014 Cây me (có tên khoa học Tamarindus indica L chi Tamarindus thuộc họ Đậu (Fabaceae)) giám định TS Bạch Thị Như Quỳnh - Khoa Kỹ thuật Y học - Trường Đại học Y Dược Hải Phòng Tiêu số 56891 số 56891A mẫu me lưu giữ Khoa Kỹ thuật Y học - Trường Đại học Y Dược Hải phòng 3.1.2 Xử lý mẫu Quả me sau thu hái rửa chất bẩn thô vòi nước, sấy 60-700C 48h, sau tách bỏ vỏ, tách riêng phần hạt me thịt me Thịt hạt me sấy lại 600C đến khối lượng không đổi, hạt me tách bỏ vỏ cứng sau nghiền nhỏ giữ bình hút ẩm Thịt hạt me dùng để chiết tách TSP 3.2 Chiết tách tinh chế Tamarind Seed Polysaccharide (TSP) từ thịt hạt me 3.2.1 Xác định thành phần hóa học thịt hạt me Xác định hàm ẩm, protein, chất béo, lượng tro, cacbonhydarate sợi thô tiến hành theo phương pháp AOAC thực 03 lần lấy kết trung bình Hàm ẩm xác định phương pháp khối lượng Chất béo thô phân tích cách chiết mẫu bột hạt me khô với ether dầu hỏa bình chiết Soxhlet Lượng protein thô có mẫu xác định phương pháp micro- Kjeldahl cải tiến Cocon Dian Phân tích tổng carbohydrate xác định phương pháp phenolacid sulfuric Xác định lượng tro, sợi thô: Xác định lượng sợi thô theo phương pháp AOCS-AOAC Xác định ượng axit tổng số: Lượng axit tổng xác định phương pháp trung hòa theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4589:1988 3.2.2 Chiết tách tinh chế TSP từ thịt hạt me Tiến hành khảo sát quy trình chiết tách sau: Dùng lượng ethanol phù hợp cho vào lượng bột me, khuấy mạnh để loại màu chất hữu có trọng lượng phân tử thấp, trình lập lại lần thu bột me màu nâu nhạt Quy trình 1: Theo quy trình Rupali Singh cộng Quy trình 2: Theo Phani Kumar cộng Quy trình 3: Chiết tách TSP theo quy trình Rao cộng Mẫu sau chiết tách loại bỏ protein theo phương pháp Oliveira.R cộng [76, 102] Sau loại protein lipid, mẫu tiến hành tinh chế màng thẩm tách MWCO 10000K hãng Thermo Scientific - USA để thu TSP có độ cao Sơ đồ chiết tách đưa Hình 3.1 Hình 3.1 Sơ đồ chiết tách TSP từ hạt me 3.3 Điều chế dẫn xuất 3.3.1 Sulfate hóa Tamarind seed polysacchride sulfate hóa (TSPS) tổng hợp theo phương pháp Lihong Fan, Xiaolin Chen cộng Bằng cách thay đổi tỷ lệ tác nhân sulfate hóa (Bảng 3.2), thu mẫu TSPS có mức độ sulfate hóa (DS) khác Bảng 3.1 Ký hiệu mẫu tỉ lệ số mol chất tạo tác nhân sulfate hóa STT Mẫu nNaHSO3 nNaNO2 TSPS1 0.050 0.086 TSPS2 0.050 0.059 TSPS3 0.050 0.045 TSPS4 0.051 0.029 TSPS5 0.051 0.016 TSPS6 0.050 0.007 Hình 3.2 Sơ đồ tổng hợp TSPS Xác định mức độ sulfate hóa: Xác định hàm lượng sulfate TSP phương pháp phân tích khối lượng 3.3.2 Acetyl hóa Tamarind seed polysacchride acetyl hóa (TSPA) tổng hợp theo phương pháp Xiao-xiao Liu cộng theo sơ đồ Hình 3.3 Hình 3.3 Sơ đồ tổng hợp TSPA Tiến hành tổng hợp TSPA có mức độ acety hóa (DA) khác cho TSP tác dụng với tác nhân acetyl có nồng độ khác Bảng 3.2 Bảng 3.2 Ký hiệu mẫu nồng độ tác nhân acetyl hóa STT Mẫu TSPA1 n(CH3CO)2O 0.011 TSPA2 TSPA3 TSPA4 TSPA5 TSPA6 0.021 0.032 0.042 0.053 0.064 Xác định mức độ acetyl hóa: Xác định hàm lượng acetyl TSP phương pháp phân tích thể tích theo Luis cộng 3.4 Xác định thành phần cấu trúc hóa học TSP 3.4.1 Xác định thành phần đường Để xác định thành phần đường phương pháp HPLC, mẫu TSP thủy phân hoàn toàn TFA 4M nhiệt độ 800C thời gian 8h Phân tích hệ thống HPLC Shimazu- Nhật Bản với detector RI, Trung tâm Phân tích Kiểm định – Viện Công nghiệp Thực phẩm Với chất chuẩn loại đường đơn hãng Sigma 3.4.2 GPC GPC đo máy HPLC Agilent 1100 PTN Phân tích trung tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia TP HCM Với pha động NaNO3 0,1N, detector RI, cột đo TSK G3000-PW, nồng độ mẫu TSP 0,001mg/ml Các liệu xử lý phần mềm Jiangshen Workstation 3.4.3 Phổ IR Phổ hồng ngoại FT-IR ghi máy FT-IR Affinity-1S Shimadzu Khoa Hóa học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, vùng số sóng 4000-400 cm-1 Mẫu ép viên với KBr 3.4.4 Phổ NMR Phổ NMR ghi máy Bruker Avance III 500MHz Trung tâm phương pháp phổ ứng dụng -Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Mẫu pha dung môi D2O +1% CD3COOD với nồng độ mg/ml DSS sử dụng làm chất nội chuẩn, đo nhiệt độ 70oC với kỹ thuật đo khử tín hiệu nước 3.4.5 Phổ MS Để tiến hành đo phổ khối, mẫu TSP thủy phân TFA 2M nhiệt độ 800C thời gian 4h để tạo oligosaccharide Phổ ESI-MS ghi thiết bị LTQ Orbitrap XLTM hãng Thermo SCIENTIFIC Khoa Hóa học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, với nguồn ion hóa phun mù điện tử kiểu ion hóa dương 3.4.6 Phương pháp SEM Ảnh SEM thực hệ thiết bị Nova nano SEM 450 Khoa Vật lý - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội 3.4.7 Phương pháp LS Thí nghiệm tiến hành đo 5° dải đo từ 30-150 thiết bị SLS-6500 & EDLS-9000 Đại học Điện- Truyền thông Osaka, Nhật Bản Nguồn sáng laze He-Ne (o= 632,8 nm) Chuẩn bị mẫu nồng độ 2,0; 4,0; 6,0; 8,0; 10,0 mg/ml NaCl 0,1N (mẫu đo lọc nhiều lần qua màng lọc Millipore 0,45µm MF) Số gia số khúc xạ (dn/dc) đo bước sóng = 632,8 nm với khúc xạ kế Brice-Phoenix Số liệu phân tích phương pháp Zimm [21,119] 3.4.8 Phương pháp SAXS Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) thực BL19B2, Spring 8, Hyogo, Nhật Bản 3.5 Đánh giá hoạt tính sinh học Các hoạt tính sinh học thường tiến hành thử nghiệm polysaccharide tự nhiên biến tính Các phương pháp thử tuân theo qui định chung thử hoạt tính sinh học như: chuẩn bị mẫu thử, mẫu đối chứng, ghi, đọc kết quả, tính toán nồng độ IC50 3.5.1 Hoạt tính gây độc tế bào Hoạt tính gây độc tế bào xác định Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam Các dòng tế bào nuôi cấy dạng đơn lớp môi trường nuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm mM L-glutamine, 10 mM HEPES, 1,0 mM natri pyruvate, bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO) Tế bào cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ 10 (1:3) nuôi tủ ấm CO2 điều kiện 370C, 5% CO2 Chất thử (20 l) pha DMSO 10% đưa vào giếng (khay 96 giếng) để có nồng độ 150 g/ml; 75g/ml; 38 g/ml; 19 g/ml, tế bào cố định vào đáy giếng TCA, nhuộm SRB 370C, sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết hàm lượng màu chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ bước sóng 540 nm Xác định khả sống sót tế bào có mặt chất thử từ xác định khả ức chế tế bào theo công thức sau: % ức chế tế bào = 100% - % sống sót 3.5.2 Hoạt tính chống oxy hóa Hoạt tính chống oxy hóa tiến hành Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Xác định khả khử sắt: tiến hành theo phương pháp Zhu cộng [122] Lấy 0,2 ml mẫu có nồng độ mg/ml thêm hỗn hợp gồm 0,2 ml đệm phosphate pH= 7,2 0,2 mL dung dịch kali ferricyanide 1% Hỗn hợp giữ 500C 20 phút Sau đó, thêm tiếp 0,2mL CCl3COOH 10% Sau cùng, lấy 0,125 ml hỗn hợp 0,125ml nước cất đặt vào giếng 96 lỗ với 0,02 mL FeCl3 Độ hấp thụ hỗn hợp tăng bước sóng 655 nm khả khử hỗn hợp Xác định hoạt tính oxy hóa tổng số theo phương pháp Huimin cộng [42] Lấy 0,3 ml mẫu có nồng độ mg/ml thêm vào ml chất phản ứng bao gồm (0,6 M acid sulfuric, 28 mM natri phosphate mM amoni molybdate) Để phản ứng 950C giờ, để nguội đo bước sóng 695 nm Hoạt tính oxy hóa tổng số tính theo axid ascorbic Xác định hoạt tính ức chế trình peroxy hóa lipid màng tế bào[26]: Tách não chuột (chuột chủng dòng BALB/c) nghiền đồng thể dung dịch đệm phosphate (pH 7,4), theo tỉ lệ 1:10 nhiệt độ 0-50C Phản ứng bao gồm 1ml dịch đồng thể thêm vào 0.2ml nồng độ mẫu thử 0.8ml đệm phosphate Ủ 370C/15 phút (tự oxy hóa) ủ 370C phút với hệ Fenton (FeSO4 0,1 mM: H2O2 15 mM theo tỉ lệ 1:1) Kết thúc phản ứng 1ml dung dịch acid tricloroacetic 10% Li tâm lấy dịch Bổ sung 1ml acid thiobarbituric 0.8% 1000C 15 phút Cuối làm lạnh ống nghiệm tiến hành đo cường độ màu máy quang phổ ELISA bước sóng 532 nm Chất đối chứng malonyl dialdehyd (Sigma, USA) Thí nghiệm lặp lại lần 3.5.3 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định tiến hành theo phương pháp khuyếch tán đĩa thạch Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ 11 Nha trang theo phương pháp Vanden; Uchechukwu.U; Nehad.M cộng Chất đối chứng Cloramphenicol (10g/đĩa) khuẩn Gr(+), Tetracylin (30g/đĩa) với khuẩn Gr (-) mẫu trắng (dung môi nước) Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm : Vi khuẩn Gr (-): E coli (vi khuẩn đại tràng), Pseudomonas aeruginosa (trực khuẩn mủ xanh), L.mon Vi khuẩn Gr (+): Bacillus cereus (đường ruột), Streptococcus faecalis (tiêu hóa), Staphylococcus aureus(tụ cầu khuẩn)- Nâm men: Candida albicans (nấm sinh dục) 3.5.4 Hoạt tính chống đông tụ máu Hoạt tính chống đông tụ máu tiến hành Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Hút 10 µl mẫu nghiên cứu dextrose nước cất vào ống eppendof Hút 50 µl máu chuột (chuột nhắt trắng dòng BALB/c) vào ống eppendof có mẫu thử aspirin dextrose nước cất Lắc nhẹ để nhiệt độ phòng Ghi thời giam máu bị đông tụ Dextrose (Sigma) sử dụng làm đối chứng tham khảo Các thí nghiệm lặp lại lần 3.5.5 Hoạt tính ly giải cục máu đông Hoạt tính ly giải cục máu đông in vitro tính hành Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam thực theo phương pháp Dang, Wang cộng Lấy 0,5 ml máu từ hốc mắt chuột cho vào eppendof vô trùng (đã cân trước), ủ 37°C 45 phút Sau hình thành cục máu đông, hút loại bỏ hết huyết (không làm ảnh hưởng đến cục máu đông hình thành) Tiến hành cân ống eppendof có cục máu đông trước ly giải để xác định trọng lượng cục máu đông theo công thức: “khối lượng cục máu đông trước ly giải = khối lượng ống chứa cục máu động – khối lượng ống” Với ống eppendof chứa cục máu đông cân trước, thêm vào 100 μl mẫu TSPS (nồng độ 50 mg/ml) TSP (nồng độ 25 mg/ml) Mẫu đối chứng 100 μl DMSO 100%; đối chứng tham khảo streptokinase (5 IU) Tất ống đem ủ 37°C 90 phút quan sát ly giải cục máu đông Sau ủ, hút loại bỏ chất lỏng tiến hành cân ống để xác định khối lượng cục máu đông không bị ly giải Phần trăm ly giải cục máu đông tính chênh lệch khối lượng trước sau ly giải cục máu đông Tiến hành lặp lại thí nghiệm lần với máu hai chuột loại 12 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xác định thành phần hóa học hạt thịt me Thành phần hóa học me bào gồm cacbonhydrate, protein, chất béo, lượng tro, sợi thô, axit tổng thành phần bị ảnh hưởng môi trường phát triển Kết nghiên cứu thành phần thịt hạt me đưa Bảng 4.1 Bảng 4.1 Thành phần me Thành phần (% khối lượng) Me Hải Phòng Me Long An Hạt me Thịt me Hạt me Thịt me Độ ẩm 11,2 20,6 11,2 22,8 Protein 13,0 9,2 18,0 8,9 Chất béo 3,9 0,6 3,1 0,4 Sợi thô 3,0 3,0 4,6 3,7 Tro 2,5 2,4 2,2 3,2 Carbohydrate 66,4 63,7 60,9 60,2 - 9,2 - 11,0 Acid tổng (mg/100g) Như vậy, loài me nghiên cứu có hàm lượng protein hàm lượng lipid thành phần khác tương đương so với công bố Thành phần carbohydrate phần chủ yếu hạt thịt me So sánh với kết phân tích hàm lượng polysaccharide hạt thịt me giới 11, 30, 31 mẫu me thu hái Thủy Nguyên - Hải Phòng Cần Giuộc – Long An có hàm lượng polysaccharide tương đương 4.2 Lựa chọn quy trình chiết tách mẫu nghiên cứu Kết hiệu suất chiết tách TSP từ hạt thịt me theo quy trình nêu Phần thực nghiệm đưa Bảng 4.2 Kết cho thấy hàm lượng TSP thu tương đối cao, với TSP từ hạt me khoảng 26,2-39,3% trọng lượng từ thịt me 12,6-17,5% trọng lượng Bảng 4.2: Hiệu suất chiết tách TSP (%w) Theo quy Theo quy Theo quy trình trình trình 28,0 39,3 38,7 TSP từ hạt me 14,5 17,5 16,8 TSP từ thịt me 26,2 36,0 35,7 TSP từ hạt me 12,6 16,5 16,2 TSP từ thịt me 13 Ghi Thủy Nguyên, Hải Phòng Cần Giuộc, Long An Kết phân tích thành phần đường TSP thịt hạt me mẫu thu hái Hải Phòng đưa Bảng 4.3 Kết cho thấy TSP từ thịt hạt me có thành phần đường giống bao gồm loại đường glucose, galactose xylose với tỷ lệ khác Kết thể giống phổ 1H-NMR mẫu (Hình 4.1) Bảng 4.3 Thành phần đường TSPchiết từ hạt thịt me Mẫu TSP (từ hạt me) TSP (từ thịt me) Glucose 1 Thành phần đường (% mol) Xylose Galactose 0,33 0,22 0,27 0,15 Hình 4.1 Phổ 1H-NMR mẫu TSP chiết từ hạt me a) từ hạt me, b) từ thịt me Trong nghiên cứu cấu trúc polysaccharide, thông số cần kiểm tra độ đa phân tán mức độ phân bố trọng lượng phân tử, sắc đồ phép đo GPC TSP thu từ hạt thịt me đưa Hình 4.2 Sắc đồ GPC cho thấy TSP chiết tách từ thịt me có mức độ đa phân tán cao không thích hợp cho việc nghiên cứu cấu trúc lựa chọn TSP chiết tách từ hạt làm đối tượng nghiên cứu luận án Hình 4.2 Sắc đồ GPC mẫu TSP chiết từ a) hạt me, b) thịt me Thành phần đường mẫu TSP chiết từ hạt me mẫu thu hái vị trí đưa Bảng 4.4 Kết cho thấy thành phần đường hai mẫu TSP chiết tách từ hạt me có nguồn gốc Hải Phòng Long An 14 gần giống Do cho nghiên cứu lựa chọn mẫu hạt me thu hái Hải Phòng Bảng 4.4 Thành phần đường TSP TSP (chiết tách từ hạt me) Mẫu me Hải Phòng (% mol) Glucose Xylose Galactose 0,33 0,22 Mẫu me Long An (% mol) Glucose Xylose Galactose 0,29 0,20 Phổ 1H-NMR mẫu TSP tách chiết từ hạt me thu hái Hải Phòng quy trình khác đưa Hình 4.3 Theo phổ 1HNMR quy trình thấy phân tách pic không rõ độ chuyển dịch hóa học từ 1-3 ppm xuất nhiều pic lạ không thuộc polysaccharide, từ 4,8-5,5 ppm chân pic tù đỉnh pic không rõ ràng chứng tỏ nhiều tạp chất có mẫu Phổ 1H-NMR theo quy trình quy trình pic rõ nét Kết cho thấy mẫu TSP theo quy trình quy trình có độ cao hơn, kết hợp với kết hiệu suất chiết tách (Bảng 4.2), quy trình lựa chọn để chiết tách TSP cho nghiên cứu 4.3 Xác định cấu trúc TSP Hiện GPC phương pháp hữu hiệu để xác định trọng lượng phân tử phân bố trọng lượng phân tử polymer Kết đo GPC với kết phân tích thành phần đường mẫu TSP đưa Bảng 4.5 Thành phần đường TSP từ hạt me thu hái Thủy Nguyên – Hải phòng gồm 03 loại đường glucose, xylose galactose, với tỷ lệ mol Glc : Xyl : Gal = : 0,33 : 0,22 Với trọng lượng phân tử mẫu TSP thu 1,16x106 Da, kết tương tự với công trình công bố trọng lượng phân tử TSP từ nguồn khác nằm khoảng từ 115kDa đến 2500kDa [32,33,50] Bảng 4.5 Trọng lượng phân tử thành phần đường TSP Mẫu TSP Kết GPC Mw 1,16x10 Da Mw/Mn 4,46 Thành phần đường (%mol) Glucose Xylose Galacstose 0,33 0,22 Phổ IR TSP từ hạt me (Hình 4.4) thể dao động đặc trưng nhóm có mặt phân tử TSP, dao động 3325 cm-1 thể đặc trưng dao động hóa trị nhóm -OH; số sóng 1417 cm-1 1396 cm-1 thể đặc trưng dao động δ CH2 glucose galactose; số sóng 1078cm-1 thể đặc trưng dao động (C-O), (C-C) đặc trưng vòng pyranose, số sóng 999 cm-1 thể dao động (C-O), (C-C), số sóng 943cm-1 thể dao động vòng pyranose, số sóng 895 cm-1 thể dao động nhóm δ (C-1-H) -amomeric [51] Kết phân tích phổ IR đưa theo Bảng 4.6 15 Bảng 4.6 Kết phân tích thành phần phổ IR TSP -1 Tần số (cm ) 3325 1417, 1396 1078 999 943 895 Nhóm đặc trưng (OH) δ CH2 (C-O), (C-C) (C-O), (C-C) δ (C-1-H) Vòng Liên kết Glucose, galactose Vòng -anomeric Vậy phổ IR mẫu thấy xuất nhóm dao động đặc trưng polysaccharide, có nhóm dao động liên kết (OH), δ CH2 , (C-O), (C-C) vòng, (C-O), (C-C) liên kết C-6-H2-O-6, δ(C-1-H), dao động vòng -anomer, không thấy có nhóm chức acid Vậy phân tử polysaccharide có liên kết glycoside nhóm OH gốc đường Phổ 1H 13C-NMR TSP đưa Hình 4.5a b Phổ H-NMR cho thấy phổ phức tạp với độ rộng vạch lớn trùng chập, điển hình cho mẫu polymer có cấu trúc phức tạp Tại vùng anomer phổ 1H-NMR (δ 4,56 - 5,11 ppm) 13C-NMR (δ 101,4 - 106,9 ppm) có pic Các tín hiệu từ δ3.39-4.51 ppm phổ 1H-NMR δ 69,077,7ppm phổ 13C-NMR thuộc proton carbon vòng pyranose Các pic khoảng δ 62,9-64,2ppm carbon vị trí C6 glucose galactose C5 xylose Các phổ thu tín hiệu tạp chất tín hiệu đặc trưng protein vùng 6,0-7,0 ppm, điều chứng tỏ protein loại khỏi mẫu nghiên cứu [24,25] Phổ COSY TSP đưa Hình 4.6 Trên phổ 1H-NMR cho thấy có tín hiệu vùng anomer δ 5,12; 4,93; 4,56 4,55 ppm ký hiệu tương ứng A, B, C D Sự cộng hưởng từ H1 đến H6 nhóm C, D H1 đến H5 nhóm A, B gán cho tín hiệu phổ COSY Kết hợp với kết từ phân tích thành phần đường TSP gồm loại đường glucose, galactose xylose, kết luận C D thuộc glucose galactose; A B thuộc xylose Trên sở độ dịch chuyển hóa học proton, độ dịch chuyển hóa học tất cacbon đường A, B, C D gán dựa phổ HSQC (Hình 4.7) Trên phổ HSQC, tín hiệu C1/H1 (106,96/4,56ppm); (105,05 /4,55 ppm) C6/H6 (64,50/3.75–3,95 ppm) thuộc C D (-glucose -galactose) C6 D tồn dạng tham gia không tham gia liên kết glycoside có tín hiệu 69,00/3,95ppm 65,50/3,75ppm Tín hiệu C5/H5 (64,50/3,60 ppm) gán cho -xylose Tín hiệu C4 (81,00 ppm) C6 (69,50 ppm) -glucose -galactose, tín hiệu 82,00 ppm C2 -xylose bị dịch chuyển phía trường thấp so 16 với carbon không tham gia liên kết glycoside, điều chứng tỏ xylose tham gia liên kết glycoside vị trí C2 glucose và/hoặc galactose tham gia liên kết vị trí C4 C6 Khi so sánh độ chuyển dịch hóa học vùng anomer glucose galactose galactose nằm trường thấp hơn, kết luận D glucose, điều phù hợp TSP thuộc lớp chất xyloglucan nên glucose mạch tồn nhiều trạng thái không tham gia liên kết glycoside tham gia liên kết vị trí khác Liên kết glycoside xác định dựa phổ HMBC (Hình 4.8) Trên phổ HMBC thể mối tương quan H1 nhóm B (xylose) C6 nhóm D (glucose), H6 nhóm D (glucose) C1 nhóm A (xylose) B (xylose) H1 nhóm D (glucose) C4 nhóm D (glucose), H1 nhóm C (galactose) C2 nhóm A (xylose) Như vậy, qua phân tích phổ NMR kết hợp với phân tích thành phần đường kết luận TSP có mạch (14)--Glucose với mạch nhánh -Xylose -Galactose(12)--Xylose có liên kết (16) với glucoside mạch Bảng 4.7 Độ dịch chuyển hóa học phổ 1H (125/500MHz, D2O, δ ppm) Đặc trưng C-1/H1 A nhóm -xylose 101.50/ 5,12 B nhóm cuối không khử -xylose C -Galactose D -Glucose C-2/H2 82.00/ 3.65 C-3/H-3 C-4/H-4 72.00/ 3,92 74.50/ 3.65 13 C NMR TSP C-5/H5 C-6/H-6 64.50/ 3.60 101.50/ 4.93 74-75/ 3.55 75.50/ 3.72 72.50/ 3.60 64.50/ 3.60 106.96/ 4.56 72.50/ 3.60 75.50/ 3.70 71-72/ 3.90 72-73/ 3.60 64.50/ 3.75 105.05/ 4.55 76.00/ 3.40 75.50/ 3.67 81.00/ 3.60 76.00/ 3,80 64.50; 69.00/ 3.75; 3,95 Để nghiên cứu chuỗi trúc TSP chiết từ hạt me tiến hành phân tích phổ khối ESI-MS TSP-oligosacharide thu phương pháp thủy phân TSP nêu phần thực nghiệm Phổ ESIMS TSP-oligosaccharide đưa Hình 4.10 Pic sở mảnh m/z 413 [Glc-Glc-Glc-5H2O+H]+1 điều lần khẳng định TSP có mạch tạo thành từ glucose Pic mảnh m/z 457 gán cho [Glc[Xyl]-Glc+H]+1 hay nhóm [Glc[Xyl-Gal]+H]+1, pic mảnh m/z 615 [Glc-Glc-Glc-Glc+H]+1 Pic mảnh m/z 1011 gán cho +1 [Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-Glc[Xyl] ]-Glc+H] Pic mảnh m/z 1077 [Glc[Xyl]+1 Glc[Xyl-Gal]-Glc-Glc]+H] pic mảnh m/z 1224 của: [Glc[Xyl]-Glc[XylGal]-Glc[Xyl-Gal]+H] +1 17 Kết phổ ESI-MS TSP-oligosaccharide chủ yếu tạo thành phân cắt mạch nhánh -Gal -Xyl để tạo mảnh có số khối thấp Phổ ESI-MS/MS mảnh m/z 1224, pic mảnh m/z 525 đặc trưng cho nhóm ion [Glc-Glc-Glc-Glc-5H2O+H]+1, pic mảnh m/z 631 đặc trưng cho nhóm [Glc-Glc-Glc-Glc-H2O+H]+1, pic mảnh m/z 661 đặc trưng cho nhóm [Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-Glc -3H2O+H]+1, pic mảnh m/z 833 đặc trưng cho nhóm [Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-Glc-Glc+2H2O+H]+1, pic mảnh m/z 935 đặc trưng cho nhóm [Glc[Xyl]-Glc[Xyl-Gal]-Glc[Xyl-Gal]+H]+1, pic mảnh m/z 1025 đặc trưng cho nhóm [Glc[Xyl]-Glc[Xyl-Gal]-Glc-Glc -3H2O+H]+1, pic mảnh m/z 1157 đặc trưng cho nhóm [Glc[Xyl-Gal]-Glc[Xyl] -Glc[Xyl ]-Glc -3H2O+H]+1 Phổ ESI-MS/MS mảnh m/z 1077 đưa Hình 4.12, pic mảnh m/z 401 thể mảnh [Glc[Xyl-Gal] -3H2O+H]+1 mảnh +1 [Glc[Xyl]-Glc] -3H2O+H] , pic mảnh m/z 479 thể mảnh [Glc-Glc+1 Glc-Glc -H2O+H] , pic mảnh m/z 773 thể đặc trưng mảnh +1 [Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-Glc-Glc -5H2O+H] , pic mảnh m/z 879 thể mảnh +1 [Glc[Xyl]-Glc[Xyl-Gal]-Glc] -H2O+H] , pic mảnh m/z 945 thể mảnh +1 [Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-Glc-Glc[Xyl] -3H2O+H] pic mảnh m/z 1011 thể +1 mảnh [Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-Glc+H] Phổ ESI-MS/MS mảnh m/z 1011 thu Hình 4.13 Theo hình pic sở mảnh m/z 545 gán cho nhóm [Glc[-Xyl-Gal]+1 4H2O+H] , pic mảnh m/z 879 gán cho nhóm [Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-Glc+1 Glc-H2O+H] , pic mảnh m/z 929 gán cho nhóm [Glc[Xyl]-Glc[Xyl]+1 Glc-Glc+H] , pic mảnh m/z 945 gán cho nhóm [Glc-Glc[Xyl]-Glc[Xyl]+1 Glc[Xyl]-3H2O+4H] , pic mảnh m/z 992 gán cho nhóm [Glc-Glc[-Xyl]+ Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-H2O+H] Phổ ESI-MS/MS mảnh m/z 457 đưa Hình 4.14, pic mảnh m/z 200 thể đặc trưng nhóm [Glc-Glc -6H2O+H]+1, pic mảnh m/z 309 thể đặc trưng nhóm [Glc-Glc -H2O+H]+1, pic mảnh m/z 337 đặc trưng cho nhóm [Glc-Glc-Glc -6H2O+3H]+1, pic mảnh m/z 397 thể đặc trưng nhóm [Glc-Glc-Glc-4H2O+H]+1, pic mảnh m/z 439 thể đặc trưng nhóm [Glc-Glc-Glc+3H]+1 Phổ ESI-MS/MS mảnh m/z 413 đưa Hình 4.15, pic mảnh m/z 181 thể đặc trưng nhóm [Glc+2H]+1, pic mảnh m/z 254 thể đặc trưng nhóm [Glc[Xyl] -3H2O+3H]+1, pic mảnh m/z 309 thể đặc trưng nhóm [Glc-Glc -H2O+H]+1, pic mảnh m/z 311 thể đặc trưng nhóm [Glc[Xyl]+H]+1, pic mảnh m/z 386 thể đặc trưng nhóm [Glc-Glc-Glc-3H2O+3H]+1 Các kết từ phổ ESI-MS cho phép xác định TSP galactoxyloglucan có tập hợp mảnh -Glc-Glc-Glc-, -Glc-Xyl18 Glc, -Glc-Xyl-Gal- Kết hợp với kết phân tích NMR, cấu trúc hóa học monomer TSP đưa Hình 4.16, theo danh pháp lớp chất xyloglucan, cấu trúc chuỗi TSP có dạng GXL Xy l GlcGlcGlc GalXy l Hình 4.16 Cấu trúc hóa học monomer TSP Ảnh SEM cho thấy cấu trúc bề mặt TSP hợp chất cao phân tử có dạng vô định hình, kết phù hợp với công bố trước Jongil Choi [47] Kết phép đo LS tổng hợp Bảng 4.14 Bảng 4.14 Kết từ phép đo LS TSP Mẫu dn/dc (ml/g) Mw x 10 TSP 0.137 11.55 -5 Mw/Mn Rg (nm) Rh (nm)  (=Rg/Rh) 4.36 211.7 229.4 0.92 Giá trị  TSP 0,92 điều cho thấy phân tử TSP có dạng hình cầu, đặc điểm hình dạng tương tự polysaccharide từ hạt đậu tương hạt lanh [89,119] Mô hình dạng TSP đưa Hình 4.19 Hình 4.19 Mô hình dạng phân tử TSP Vậy TSP chiết tách từ hạt me polysaccharide phân nhánh có trọng lượng phân tử 1,15 x106Da Trong dung dịch nước phân tử TSP có dạng hình cầu Cấu trúc không gian TSP kích thước cỡ nano xác định phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) Kết đo SAXS dung dịch TSP 0,5% nước biểu diễn qua đường tán xạ biểu đồ Kratky Guinier (Hình 4.20 a, b,c) Các dạng biểu đồ điển hình polysaccharide trung tính 19 Qua biểu đồ Guinier, xác định bán kính từ hồi chuyển Rgc=1,3nm, với polysaccharide mạch thẳng không phân nhánh carrageenan hay heparin giá trị Rgc khoảng 0,4-0,53nm [104,105] điều cho thấy TSP có mạch nhánh tương đối dài, kết phù hợp với cấu trúc hóa học xác định theo phương pháp phổ IR, NMR ESI-MS Kết cho thấy đường tán xạ thu từ thực nghiệm tính toán dựa mô hình cấu trúc phân tử trùng Điều lần khẳng định cấu trúc hóa học TSP đưa Hình 4.16 Vậy đưa nhận định sau TSP chiết tách từ hạt me Về cấu trúc hóa học: TSP chiết tách từ me thu thập huyện Thủy Nguyên – Hải Phòng polysaccharide mạch nhánh với cấu trúc chuỗi dạng GXL, cấu trúc hóa học phân tử TSP đưa Hình 4.22 Xy l GlcGlcGlc GalXy l n Hình 4.22 Cấu trúc phân tử TSP Về cấu trúc bề mặt: TSP chất vô định hình Về cấu trúc không gian: TSP có dạng hình cầu 4.4 Điều chế dẫn xuất 4.4.1 Dẫn xuất TSPS Phổ IR 13C-NMR sử dụng để kiểm tra cấu trúc mẫu TSP sulfate hóa TSPS4 Trên phổ IR TSP TSPS (Hình 4.23) cho thấy phổ TSPS4 xuất tín hiệu 1213 cm-1 thể dao động đặc trưng nhóm S=O; tín hiệu 824 cm-1 thể dao động đặc trưng nhóm sulfate vị trí axial [113] Trên phổ 13C-NMR TSPS4 xuất pic δ 69.7ppm, mẫu không sulfate vùng δ 64,3ppm, chứng tỏ vị trí C6 galactose hoặc/và glucose bị sulfate (bị chuyển dịch phía trường yếu 5-6 ppm) Ngoài phổ xuất pic vùng δ 80-84ppm thể sulfate vị trí C4, với mẫu không sulfate vùng δ 74-78 ppm Kết phổ 13C NMR khẳng định TSP bị sulfate vài vị trí: C6 galactose và/hoặc glucose, C4 galactose và/hoặc xylose 20 Kết đo tán xạ ánh sáng mẫu TSP TSPS4 đưa bảng 4.17 Bảng 4.17 Kết từ phép đo GPC LS TSP TSPS Sample TSP TSPS4 dn/dc (ml/g) 0.137 0.161 Mw x 10 11.55 2.69 -5 Mw/Mn 4.36 1.52 Rg (nm) 211.7 216.6 Rh (nm) 229.4 186.4  (=Rg/Rh) 0.92 1.16 Kết cho thấy giá trị  TSP TSPS4 tương ứng 0.92 1.16, điều chứng tỏ TSP TSPS4 có cấu trúc không gian dạng hình cầu Tuy nhiên tăng giá trị  sulfate hóa giải thích việc thay phần nhóm hydroxyl nhóm sulfate dẫn đến làm thay đổi cấu trúc không gian chuỗi đường phân tử TSPS lực đẩy nhóm sulfate làm cho cấu trúc không gian TSPS bị dãn rộng (extended structure) so với TSP Ảnh SEM TSPS4 đưa Hình 4.25, cấu trúc bề mặt TSPS4 hợp chất cao phân tử không trạng thái vô định hình mà chuyển sang trạng thái tinh thể Cấu trúc không gian dẫn xuất sulfate TSP kích thước cỡ nano xác định phương pháp SAXS Kết đo SAXS mẫu TSPS1 (DS=8,1%) TSPS4 (DS=26,2%), nồng độ 0,5% w nước biểu diễn qua đường tán xạ biểu đồ Kratky Guinier (Hình 4.26 a, b,c) Qua biểu đồ Kratky thấy khác nhau, mẫu TSPS4 có pic khoảng góc tán xạ nhỏ q