Nghiên cứu quá trình cố định và các đặc tính của một số enzyme phân giải polysaccharide

Danh mục các bảng Bảng 1.1: Khả năng chịu nhiệt của các enzyme tự do và enzyme dạng CLEA11 Bảng 1.2: Kết quả hoạt độ và hiệu quả cố định của lipase lên các chất mang28 Bảng 2.1: Tiến hàn

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM

HUỲNH NGỌC OANH

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH CỐ ĐỊNH

VÀ CÁC ĐẶC TÍNH CỦA MỘT SỐ ENZYME

PHÂN GIẢI POLYSACCHARIDE

Chuyên ngành: Hóa Sinh

Mã số: 62 42 30 15

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS Đồng Thị Thanh Thu

TP Hồ Chí Minh – Năm 2010

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Những kết quả trong nghiên cứu này hoàn toàn chưa được công bố bởi bất kỳ tác giả nào khác

Huỳnh Ngọc Oanh

Lời cảm ơn

Luận án được hoàn thành nhờ vào sự giúp đỡ của:

PGS.TS Đồng Thị Thanh Thu – Bộ môn Sinh Hoá, Trường Đại học Khoa

Học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh đã giảng dạy, truyền dạt kiến thức trong suốt thời gian học và tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, đóng góp nhiều ý kiến quý báu, trong quá trình làm luận án này

PGS.TS Nguyễn Đức Lượng – chủ nhiệm bộ môn Công nghệ Sinh học

Trường Đại học Bách khoa TPHCM – đã tạo điều kiện thuận lợi, động viên và góp nhiều ý kiến giúp tôi hoàn thành tốt luận án này

PGS.TSKH Lưu Duẩn, PGS.TS Phạm Thành Hổ, PGS.TS Phạm Thị

Ánh Hồng, PGS.TS Bùi Văn Lệ, PGS.TS Nguyễn Xích Liên, PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn, TS Lê Phi Nga … đã đóng góp nhiều ý kiến quý báu giúp

tôi hoàn thành tốt bản luận án

Ban chủ nghiệm khoa Sinh học, Ban Giám Hiệu, Phòng Sau Đại học

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP HCM Ban chủ nghiệm khoa Kỹ

thuật Hóa học, Ban Giám Hiệu Trường Đại học Bách khoa đã tạo mọi

điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian làm luận án

Các Thầy Cô Khoa Sinh học, Bộ môn Sinh Hóa Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã dạy đỗ tận tình và truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức và

kinh nghiệm quí báu trong suốt thời gian tôi học tại giảng đường đại học

Các Thầy Cô ở Bộ môn Công nghệ Sinh học Trường Đại học Bách khoa Tp.HCM đã tạo điều kiện thuận lợi và hỗ trợ tôi trong suốt thời gian làm

luận án

Mẹ tôi đã có công sinh thành dạy dỗ tôi nên người và gia đình là những

người luôn ở cạnh tôi, là nguồn động viên tinh thần cho tôi trong học tập và cuộc sống

Xin nhận ở tôi một sự biết ơn chân thành và sâu sắc nhất

NCS Huỳnh Ngọc Oanh

Mục lục

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt vi

Danh mục các bảng vii

Danh mục hình xi

Danh mục sơ đồ xv

MỞ ĐẦU 1

Chương 1- TỔNG QUAN 4

1.1- Enzyme cố định 4

1.1.1- Sơ lược về enzyme cố định 4

1.1.2- Các phương pháp cố định enzyme 7

1.1.3- Chất mang 14

1.2- Enzyme thủy phân carbohydrate 30

1.2.1- Enzyme - amylase 30

1.2.2- Glucoamylase-GA 32

1.2.3- Cellulase 34

1.2.4- Pectinase 35

Chương 2- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 38

2.1- Vật liệu và hoá chất 38

2.1.1- Enzyme thương mại 38

2.1.2- Hóa chất 39

2.2- Các phương pháp tiến hành thực nghiệm 39

2.2.1- Các phương pháp định lượng 39

2.2.2- Phương pháp cố định enzyme 45

2.2.3- Phương pháp tính toán 51

Chương 3- KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 54

3.1- Quá trình cố định -amylase 54

3.1.1- Sự cố định Termamyl (-amylase thương mại) trên alginate 54

3.1.2- Sự cố định Termamyl trên CMC – alginate 58

3.1.3- Sự cố định Termamyl trên chitosan-BC 62

3.1.4- Sự cố định Termamyl trên polyacrylamide 65

3.1.5- Sự cố định Termamyl trên celite 67

3.2- Quá trình cố định AMG (glucoamylase thương mại) 74

3.2.1- Sự cố định AMG trên vật liệu alginate-chitosan 74

3.2.2- Sự cố định AMG trên polyacrylamide 76

3.2.3- Sự cố định AMG trên Celite 77

3.2.4- Sự cố định AMG bằng phương pháp nhốt bởi quá trình tạo mạng silica gel 81 3.2.5- Sự cố định AMG theo phương pháp CLEA 82

3.3- Quá trình cố định Cellusoft (cellulase thương mại) 87

3.3.1.- Sự cố định Cellusoft trên alginate 87

3.3.2- Sự cố định Cellusoft trên polyacrylamide 89

3.3.3- Sự cố định Cellusoft theo phương pháp CLEA 92

3.4- Quá trình cố định Pectinex Ultra SPL (pectinase thương mại) 94

3.4.1- Sự cố định Pectinex trên alginate 94

3.4.2- Sự cố định Pectinex trên vật liệu chitosan 98

3.4.3- Sự cố định Pectinex trên polyacrylamide 104

3.4.4- Sự cố định Pectinex trên celite 108

3.4.5- Sự cố định Pectinex trên silica gel 111

3.4.6- Sự cố định Pectinex theo phương pháp CLEA 117

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 120

Kết luận 120

Đề nghị 122

DANH MỤC CÔNG TRÌNH 123

TÀI LIỆU THAM KHẢO 124 PHỤ LỤC

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

AMG, GA : Glucoamylase APTES : Aminopropyltriethoxysilane

Danh mục các bảng

Bảng 1.1: Khả năng chịu nhiệt của các enzyme tự do và enzyme dạng CLEA11 Bảng 1.2: Kết quả hoạt độ và hiệu quả cố định của lipase lên các chất mang28 Bảng 2.1: Tiến hành khảo sát các enzyme cố định và chất mang trong thực nghiệm 53 Bảng 2.2: Khảo sát các thông số và giá trị biểu thị trong thực nghiệm 53 Bảng 3.1: Một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất cố định Termamyl trên alginate 55 Bảng 3.2: Aûnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ dạng Termamyl cố định 56 Bảng 3.3: Ảnh hưởng nồng độ alginate, CMC đến khả năng cố định enzyme 58 Bảng 3.4: Aûnh hưởng nhiệt độ, pH đến hoạt độ dạng Termamyl cố định trên CMC-alginate 59 Bảng 3.5: Aûnh hưởng thời gian bảo quản đến hoạt độ dạng Termamyl cố định 60 Bảng 3.6: Khả năng phân cắt một số cơ chất bởi dạng Termamyl cố định trên gel CMC- alginate 61 Bảng 3.7: Kết quả hiệu suất cố định Termamyl trên BC và chitosan 62 Bảng 3.8: Aûnh hưởng nồng độ chitosan đến hiệu suất cố định Termamyl trên BC-chitosan 63 Bảng 3.9: Aûnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ dạng Termamyl cố định trên BC-chitosan 64 Bảng 3.10: Aûnh hưởng tỉ lệ acrylamide, bis acrylamide đến hiệu suất cố định Termamyl trên polyacrylamide 65

Bảng 3.11: Aûnh hưởng pH, nhiệt độ đến hoạt độ dạng Termamyl cố định trên polyacrylamide 66 Bảng 3.12: Khảo sát phương pháp hoạt hóa celite 67 Bảng 3.13: Khảo sát tỉ lệ enzyme:celite đến hiệu suất cố định Termamyl 68 Bảng 3.14: Ảnh hưởng của nồng độ 3-APTES đến hiệu suất cố định 68 Bảng 3.15: Yếu tố nhiệt độ và pH ảnh hưởng đến hoạt độ dạng Termamyl cố định trên celite 69 Bảng 3.16: Sự biến đổi hoạt độ dạng Termamyl cố định theo điều kiện bảo quản 70 Bảng 3.17: Khả năng tái sử dụng chất mang celite 70 Bảng 3.18: Hiệu suất cố định enzyme sau khi bọc alginate so với enzyme cố định trên celite không bọc alginate 71 Bảng 3.19: So sánh hiệu suất cố định trên các dạng chất mang chitosan và alginate cố định AMG 75 Bảng 3.20: Một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất cố định AMG trên celite77 Bảng 3.21: Aûnh hưởng pH, nhiệt độ đến hoạt độ dạng AMG cố định trên celite 78 Bảng 3.22: Aûnh hưởng nồng độ alginate và thời gian cố định đến hiệu suất cố định AMG trên celite-alginate 79 Bảng 3.23: Aûnh hưởng nhiệt độ, pH đến hoạt độ AMG cố định trên celite-alginate 80 Bảng 3.24: Hiệu suất cố định AMG bởi quá trình tạo mạng silica gel 82 Bảng 3.25: Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất cố định AMG theo phương pháp CLEA 84 Bảng 3.26: Aûnh hưởng nồng độ alginate và tỉ lêï enzyme đến hiệu suất cố định Cellusoft trên alginate 88

Bảng 3.27: Ảnh hưởng thời gian bảo quản đến hoạt độ dạng Cellusoft cố định trên alginate 89 Bảng 3.28: Aûnh hưởng của nồng độ polyacrylamide đến hiệu suất cố định Cellusoft 90 Bảng 3.29: Aûnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ dạng Cellusoft cố định trên polyacrylamide 91 Bảng 3.30: Một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất cố định Cellusoft theo phương pháp CLEA 92 Bảng 3.31: Ảnh hưởng nồng độ alginate đến sự cố định Pectinex 94 Bảng 3.32: Aûnh hưởng nhiệt độ, pH đến hoạt độ dạng Pectinex cố định trên alginate 95 Bảng 3.33: Ứng dụng pectinase cố định trong xử lý dịch chanh dây 96 Bảng 3.34: Một số yếu tố aÛnh hưởng đến hiệu suất cố định Pectinex trên chitosan 98 Bảng 3.35: Ảnh hưởng nồng độ alginate đến hiệu suất cố định Pectinex trên dạng phức chitosan bọc alginate 100 Bảng 3.36: Aûnh hưởng thời gian bảo quản đến hoạt độ dạng Pectinex cố định trên chitosan bọc alginate 100 Bảng 3.37: So sánh hiệu suất cố định Pectinex trên dạng phức chất mang chitosan-alginate 101 Bảng 3.38: Ảnh hưởng thời gian cố định và kích thước tạo hat gel đến hiệu suất cố định Pectinex trên chitosan-carrageenan 102 Bảng 3.39: Khảo sát ảnh hưởng điều kiện bảo quản đến hoạt độ dạng Pectinex cố định trên chiosan-carrageenan 103 Bảng 3.40: Aûnh hưởng tỉ lệ bis : acrylamide và tỉ lệ enzyme đến hiệu suất cố định Pectinex 104

Bảng 3.41: Ảnh hưởng của phương pháp hoạt hóa đến hiệu suất cố định Pectinex trên celite 108 Bảng 3.42: Ảnh hưởng một số yếu tố đến hiệu suất cố định Pectinex trên celite 109 Bảng 3.43: Một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất cố định Pectinex theo phương pháp 1 112 Bảng 3.44: Ảnh hưởng chất hoạt hóa silica gel và tỉ lệ enzyme đến hiệu suất cố định Pectinex 114 Bảng 3.45: Ảnh hưởng pH, nhiệt độ đến hoạt độ dạng Pectinex cố định trên silica gel 115 Bảng 3.46: Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng sự cố định Pectinex theo phương pháp CLEA 117

Danh mục hình

Hình 1.1: Mô tả enzyme cố định 4

Hình 1.2: Phương pháp nhốt enzyme 8

Hình 1.3: Enzyme nhốt trong hệ sợi 8

Hình 1.4: Enzyme hấp phụ lên chất mang 9

Hình 1.5: Enzyme liên kết ion với chất mang 9

Hình 1.6: Enzyme gắn lên chất mang bằng liên kết đồng hóa trị .10

Hình 1.7: Enyme cố định bằng liên kết chéo .10

Hình 1.8: Kỹ thuật CLEA .11

Hình 1.9: Các khối tủa CLEA của lipase ở nấm Candida Antarctica A/B, mỗi khối tủa CLEA chứa hơn 8 triệu phân tử enzyme (x 3500) .12

Hình 1.10: Sự bố trí không gian của enzyme cố định .12

Hình 1.11: Các cách khắc phục về bố trí không gian cố định enzyme .13

Hình 1.12: Mô tạo enzyme liên hợp cố định .14

Hình 1.13: Đơn phân tạo nên alginate .16

Hình 1.14: Liên kết tạo gel khi alginate tiếp xúc với Ca2+ .17

Hình 1.15: Cấu trúc mạng lưới gel alginate khi alginate tiếp xúc với Ca2+ 17 Hình 1.16: Cấu trúc của cellulose vi khuẩn và thực vật .19

Hình 1.17: CMC trong dung dịch AlCl3 .20

Hình 1.18: Cấu tạo của carrageenan .21

Hình 1.19: Sự tạo chitosan bằng quá trình deacetyl hóa chitin .22

Hình 1.20: Quá trình polymer hóa của polyacrylamide .24

Hình 1.21: Một vài chất mang vô cơ thông dụng trong cố định enzyme .25

Hình 1.22: Cấu trúc chất mang silica gel .27

Hình 1.23: Sự hình thành nhóm hydroxyl diễn ra trên bề mặt của silica gel 27 Hình 1.24: Vị trí tấn công của -amylase .30

Hình 1.25: -amylase từ các nguồn khác nhau .31

Hình 1.26: Vị trí phân cắt tinh bột bằng -amylase và GA .32

Hình 1.27: Enzyme GA từ các nguồn khác nhau 33

Hình 1.28: Sự tác động của phức hợp cellulase lên cellulose 34

Hình 1.29: Cấu trúc phân tử enzyme -1,4-D-Glucanohydrolase 34

Hình 1.30: Cấu trúc và cơ chế xúc tác của endo-PG II của Asp niger 36

Hình 1.31: Enzyme polygalacturonase từ các nguồn khác nhau .36

Hình 2.1: Quá trình tạo hạt gel calcium alginate nhốt enzyme .45

Hình 3.1: Hạt gel bảo quản ở 50oC và nhiệt độ phòng .54

Hình 3.2: Lượng maltose tạo thành theo thời gian phản ứng bởi dạng Termamyl cố định trên alginate 57

Hình 3.3: Khả năng tái sử dụng của Termamyl cố định trên alginate .57

Hình 3.4: Termamyl cố định lên gel CMC- alginate .58

Hình 3.5: Khả năng tái sử dụng của dạng Termamyl cố định trên CMC- alginate .61

Hình 3.6: Hạt gel chitosan .62

Hình 3.7: Khả năng tái sử dụng của dạng Termamyl cố định trên BC-chitosan 64

Hình 3.8: Khả năng tái sử dụng của dạng Termamyl cố định trên polyacrylamide .66

Hình 3.9: Celite hoạt hóa chưa cố định (1) và Termamyl cố định trên celite (2)67 Hình 3.10: Khả năng tái sử dụng của dạng Termamyl cố định trên celite 70

Hình 3.11: Termamyl cố định trên celite bọc alginate .71

Hình 3.12: Khả năng tái sử dụng của dạng Termamyl cố định trên celite-

alginate .72

Hình 3.13: AMG cố định trên polyacrylamide .76

Hình 3.14: Khả năng tái sử dụng của dạng AMG cố định trên celite 78

Hình 3.15: Hạt gel AMG cố định trên celite-alginate .79

Hình 3.16: Khả năng thủy phân tinh bột và dextrin bởi dạng AMG cố định trên celite-alginate .80

Hình 3.17: Khả năng tái sử dụng của dạng AMG cố định trên celite-alginate ở các nhiệt độ khác nhau 81

Hình 3.18: AMG kết tủa (dạng CLEA) khi dùng NaCl bão hòa và glutaraldehyde .83

Hình 3.19: Aûnh hưởng lượng PEI đến sự cố định AMG .85

Hình 3.20: Lượng glucose tạo thành theo thời gian thủy phân tinh bột của AMG cố định dạng CLEA 85

Hình 3.21: Khả năng tái sử dụng của AMG cố định dạng CLEA 86

Hình 3.22: Aûnh hưởng pH đến hoạt độ dạng Cellusoft tự do và dạng cố định trên alginate .88

Hình 3.23: Aûnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ dạng Cellusoft tự do và dạng cố định trên alginate .88

Hình 3.24: Sự tạo gel polyacryacrylamide bởi đệm khác nhau .90

Hình 3.25: Hạt gel Cellusoft cố định trên polyacrylamide 90

Hình 3.26: Khả năng tái sử dụng của dạng Cellusoft cố định trên polyacrylamide .91

Hình 3.27: Khả năng tái sử dụng của Cellusoft cố định dạng CLEA 93

Hình 3.28: Ảnh hưởng điều kiện bảo quản đến hoạt độ dạng Pectinex cố định trên alginate .95

Hình 3.29: Khả năng phân cắt pectin trong nước chanh dây bởi pectinase 96 Hình 3.30: Khả năng phân cắt pectin trong dịch nho bởi Pectinex cố định 96

Hình 3.31: Khả năng tái sử dụng của dạng Pectinex cố định trên alginate 97 Hình 3.32: Khả năng tái sử dụng của dạng Pectinex cố định trên chitosan bọc alginate 101 Hình 3.33: Khả năng tái sử dụng của dạng Pectinex cố định trên chitosan-carrageenan .103 Hình 3.34: Hạt gel Pectinex cố định trên polyacrylamide 105 Hình 3.35: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ dạng Pectinex cố định trên

polyacrylamide 105 Hình 3.36: Ảnh hưởng pH đến hoạt độ dạng Pectinex cố định trên

polyacrylamide 106 Hình 3.37: Khả năng tái sử dụng của dạng Pectinex cố định trên

polyacrylamide .106 Hình 3.38: Khả năng phản ứng liên tục bởi dạng Pectinex cố định trên

polyacrylamide .107 Hình 3.39: Pectinex cố định trên celite .108 Hình 3.40: So sánh ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt độ dạng

Pectinex cố định và tự do trên celite .110 Hình 3.41: So sánh ảnh hưởng pH phản ứng đến hoạt độ dạng Pectinex cố định và tự do trên celite .110 Hình 3.42: Khả năng tái sử dụng của dạng Pectinex cố định trên celite 111 Hình 3.43: Pectinex cố định trong quá trình tạo silica gel từ thủy tinh lỏng112 Hình 3.44: Khả năng tái sử dụng của dạng Pectinex cố định trên silica gel theo phương pháp 1 .113 Hình 3.45: Khả năng tái sử dụng của dạng Pectinex cố định trên silica gel theo phương pháp 2 116 Hình 3.46: Các mẫu Pectinex cố định bởi glutaraldehyde và PEI (1%) 117 Hình 3.47: Khả năng tái sử dụng của Pectinex dạng CLEA .118

Danh mục sơ đồ

Sơ đồ 1.1: Các phương pháp cố định enzyme 7

Sơ đồ 1.2: Phân loại chất mang 16

Sơ đồ 2.1: Các bước cố định enzyme trên alginate 45

Sơ đồ 2.2: Cố định AMG trên alginate theo phương pháp hấp phụ 45

Sơ đồ 2.3: Cố định enzyme trên gel CMC-alginate 46

Sơ đồ 2.4: Cố định enzyme trên chitosan đã hoạt hóa bởi glutaraldehyde 46

Sơ đồ 2.5: Quá trình tạo hạt (chitosan-enzyme) + alginate 46

Sơ đồ 2.6: Quá trình tạo hạt (alginate-enzyme) + chitosan 46

Sơ đồ 2.7: Quá trình tạo hạt chitosan + (alginate-enzyme) 47

Sơ đồ 2.8: Cố định enzyme trên phức chitosan- carrageenan 47

Sơ đồ 2.9: Cố định enzyme trên BC 47

Sơ đồ 2.10: Cố định enzyme lên chất mang BC-chitosan 48

Sơ đồ 2.11: Cố định enzyme trên polyacrylamide 48

Sơ đồ 2.12: Quá trình hoạt hóa celite bằng cồn, acid nitric, glutaradehyde 48

Sơ đồ 2.13: Cố định enzyme trên celite 49

Sơ đồ 2.14: Cố định enzyme lên celite hoạt hóa bằng H2O2, APTES 49

Sơ đồ 2.15: Cố định enzyme trên phức hợp celite-alginate 49

Sơ đồ 2.16: Cố định enzyme trong quá trình tạo mạng silica gel 50

Sơ đồ 2.17: Cố định enzyme trong quá trình taọ mạng silica gel và alginate 50

Sơ đồ 2.18: Các bước hoạt hóa silica gel 50

Sơ đồ 2.19: Cố định enzyme trên silica gel đã hoạt hoá 51

Sơ đồ 2.20: Cố định enzyme theo phương pháp CLEA 51

MỞ ĐẦU

Trong tế bào sống của sinh vật luôn xảy ra các quá trình chuyển hóa hết sức phức tạp và luôn theo những qui luật nhất định Các quá trình chuyển hóa này đều được thực hiện và điều khiển bởi rất nhiều enzyme khác nhau Enzyme không chỉ tham gia các phản ứng hóa học trong tế bào mà còn thực hiện các phản ứng ngoài tế bào Các enzyme được khai thác và ứng dụng ngày càng rộng rãi trong đời sống và sản xuất Những sản phẩm tạo thành từ polysaccharide bởi sự xúc tác của nhóm enzyme thủy phân polysaccharide có một giá trị thực tiễn rất lớn Chính vì thế, đã từ lâu loài người đã biết sử dụng chúng trong sản xuất rượu bia, tương , chao … Việc nghiên cứu nhóm enzyme này vẫn được tiến hành ở nhiều nước vàø ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau

Một trong những hướng nghiên cứu về enzyme đang được phát triển mạnh là nghiên cứu cố định chúng trên các chất mang nhằm tăng khả năng ứng dụng, từ đó làm tăng giá trị kinh tế của enzyme Phần lớn các enzyme khi tách khỏi tế bào thường tồn tại ở trạng thái tự do, hòa tan trong nước Ơû trạng thái này chúng rất dễ bị phá hủy dưới tác động của các yếu tố bên ngoài như pH, nhiệt độ và các yếu tố khác Ơû trong tế bào, chúng được bảo vệ bởi cả một hệ thống vật chất và các cơ quan như mạng vi sợi, vi ống Bao quanh là màng nguyên sinh chất, thành tế bào Dựa trên những hiện tượng tự nhiên đó, các nhà khoa học đã tìm ra được nhiều phương pháp khác nhau để cố định enzyme tự do Cố định enzyme là

gắn hoặc nhốt enzyme vào một chất mang phù hợp để nhằm mục đích chuyển enzyme từ trạng thái hòa tan sang trạng thái không hòa tan, để sử dụng chúng được nhiều lần Ngày nay, kỹ thuật cố định enzyme đã được thực hiện trong các nghiên cứu khoa học và cả trong các ứng dụng thực tế

Các kết quả nghiên cứu cũng cho thấy rằng: không một enzyme nào lại phù hợp với tất cả các loại chất mang và cũng không một chất mang nào lại phù hợp với tất cả các enzyme Điều này cho thấy cố định enzyme không phải là một công việc đơn giản nếu xét về mặt khoa học và thực tiễn của nó

Ở Việt Nam tình hình nghiên cứu cố định một số enzyme cũng đang được nghiên cứu ở qui mô phòng thí nghiệm, tuy nhiên chưa có hệ thống và chưa áp dụng enzyme cố định vào qui mô công nghiệp rộng rãi Công trình nghiên cứu của chúng tôi là một đóng góp nhỏ cho sự phát triển kỹ thuật cố định enzyme nói riêng và các vật liệu sinh học nói chung để có thể đáp ứng khả năng mở rộng và tính kinh tế trong việc khai thác các enzyme để ứng dụng trong công nghiệp, mơi trường, dược phẩm và trong sự phát triển của các thiết bị hiện đại như các cảm biến sinh học

Một trong những nhóm enzyme được nghiên cứu thu nhận, tinh sạch và ứng dụng rộng rãi nhất là nhóm enzyme phân giải polysaccharide Đã có những nghiên cứu cố định một vài enzyme trong nhóm này nhưng nhìn chung chưa có một công trình nào nghiên cứu hoàn chỉnh làm sáng tỏ về sự phù hợp giữa chất mang và enzyme khi cố định và về sự cố định đồng thời enzyme trên nhiều chất mang khác nhau để tăng hiệu quả gắn

Chính vì những vấn đề và đặc biệt ý nghĩa khoa học và thực tiễn trên, chúng

tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu qui trình cố định và các đặc tính của một số enzyme phân giải polysaccharide” Với mục tiêu là: Khảo sát khả

năng cố định của 4 enzyme thuộc nhóm thủy phân carbohydrate trên các chất mang khác nhau và khảo sát một số đặc tính của enzyme dạng cố định tạo được

Để đạt được mục tiêu trên, chúng tôi đã đưa ra những nội dung nghiên cứu cần thực hiện như sau:

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng cố định các enzyme: amylase, glucoamylase, cellulase và pectinase - trên nhiều loại chất mang khác nhau: hữu cơ và vô cơ, tự nhiên và tổng hợp, dạng kết hợp để làm chất mang cố định enzyme Từ đó đưa ra những kỹ thuật cố định cho mỗi enzyme trên mỗi chất mang cố định

 Xác định một số đặc tính của enzyme cố định thông qua một số yếu tố: t0, pH… điều kiện bảo quản, khả năng tái sử dụng và ứng dụng qua hệ thống cột phản ứng

Qua quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi cố gắng làm rõ một số điểm mới trong những nghiên cứu trước đây như:

- Mỗi enzyme có khả năng cố định trên các vật liệu khác nhau

- Mỗi vật liệu làm chất mang có khả năng cố định enzyme khác nhau Mỗi một vật liệu đều có tính chất rất riêng biệt mà thiên nhiên “ban tặng” và chúng ta có thể sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau trong đó có lĩnh vực sinh học

+ Vật liệu vô cơ ‘háo nước’ như celite, silica gel là rất có tiềm năng để cố định enzyme

+ Vật liệu ghép: kết hợp vật liệu vô cơ và hữu cơ, “layer by layer” đã cải thiện được một số tính chất của enzyme cố định trong môi trường phản ứng

- Kết hợp nhiều kỹ thuật cố định để tăng hiệu suất cố định enzyme như kết hợp bẫy, nhốt và liên kết, kết hợp hấp phụ và liên kết… và có một số thành công khi sử dụng kỹ thuật CLEA tạo liên kết chéo giữa các enzyme

Chương 1- TỔNG QUAN

1.1- Enzyme cố định

1.1.1- Sơ lược về enzyme cố định

Mô hình hai pha của enzyme cố định

Hình 1.1: Mô tả enzyme cố định

1.1.1.1- Định nghiã: Enzyme không hòa tan (insoluble enzyme) hay enzyme cố

định (immobilized enzyme): là enzyme được gắn lên chất mang tạo dạng không hoà tan trong dung dịch phản ứng [9],[14],[54]

1.1.1.2- Đặc điểm của enzyme cố định

Enzyme cố định có các ưu và nhược điểm sau đây [9],[52]:

Ưu điểm:

 Có thể tái sử dụng nhiều lần, hoạt tính ít thay đổi trong những lần tái sử dụng Đặc điểm này có ý nghĩa lớn trong kĩ thuật, nhờ đó mà có thể giảm chi phí cho việc sản xuất enzyme và sử dụng

 Không lẫn vào sản phẩm cuối của phản ứng nên không phải chi phí cho

việc tách enzyme ra khỏi sản phẩm Sản phảm cuối có thể có độ tinh sạch

tương đối cao

 Có độ bền cao hơn, bảo quản tốt hơn enzyme tự do, vì thế trong nhiều

trường hợp có thể cho enzyme cố định hoạt động ở những điều kiện nhiệt

độ, pH không bình thường do chúng được bảo vệ bởi chất mang Điều này

rất có lợi trong các quy trình sản xuất công nghiệp (có thể cơ khí hóa và tự

động hóa)

 Sử dụng được dễ dàng cho việc cơ khí hoá và tự động hoá trong quá trình

sản xuất

Nhược điểm: Hoạt tính của enzyme cố định thường nhỏ hơn hoạt tính của

enzyme hòa tan cùng loại, do khi enzyme gắn vào chất mang cấu trúc của

enzyme có thể thay đổi ở mức độ nhất định Do sự thay đổi cấu trúc không gian

của enzyme có thể làm cho sự tương tác của enzyme và cơ chất chậm lại, phản

ứng xảy ra yếu hơn Hoặc do khi ta nhốt enzyme vào trong gel, gel sẽ bao lấy

enzyme tạo thành vật cản đối với cơ chất, vì vậy sự tiếp xúc giữa cơ chất và trung

tâm hoạt động của enzyme gặp khó khăn hơn so với enzyme tự

do.[9],[18],[39],[82]

1.1.1.3- Các yếu tố ảnh hưởng đến enzyme cố định

Hoạt tính enzyme cố định phụ thuộc vào bản chất và tính chất hóa học của

chất mang: tính chất vật lý (tính hòa tan, tính bền, độ trương, tính ưa nước hay kỵ

nước) và bản chất hóa học của chất mang đều có ảnh hưởng đến khả năng liên

kết, tính bền, hoạt tính sinh học của enzyme cố định Enzyme cố định thường bền

nhiệt so với enzyme tan, chất mang cũng có tác dụng làm giảm sự biến tính của

enzyme [9],[18]

Khi bị giới hạn trong không gian nhất định, sẽ có nhiều kiểu tương tác khác của chất mang polymer lên môi trường bao xung quanh phân tử enzyme cố định:

 Kiểu thứ nhất: chất mang nhờ các tính chất đặc trưng của mình sẽ kéo hoặc đẩy các cơ chất, sản phẩm và các chất khác sẽ làm thay đổi nồng độ các chất ở môi trường vi mô sát với enzyme

 Kiểu thứ hai: chất mang ngăn cản sự khuếch tán tự do theo hướng đến cũng như đi khỏi enzyme làm thay đổi hiệu quả xúc tác của enzyme

- Hoạt tính enzyme cố định phụ thuộc vào sự khuếch tán của cơ chất, sản phẩm và các chất khác Tốc độ khuếch tán phụ thuộc vào các yếu tố:

 Kích thước lỗ gel của chất mang polymer

 Trọng lượng phân tử của cơ chất

 Sư chênh lệch nồng độ giữa vùng môi trường vi mô xung quanh enzyme và dung dịch tự do

- Ảnh hưởng của pH lên enzyme cố định: Điện tích chất mang có ảnh hưởng đáng kể đến pH tối ưu của enzyme cố định pH tối ưu này có thể chuyển sang phía kiềm hay acid so với pH tối ưu của enzyme hòa tan cùng loại

Sự ảnh hưởng này là do trường tĩnh điện của chất mang tạo nên Khi lực ion thấp thì nồng độ H+ gần chất mang điện tích âm cao hơn, còn gần các chất mang điện tích dương thì nồng độ H+ thấp hơn, như vậy pH bị dịch chuyển về phía kiềm và ngược lại Còn khi lực ion lớn điện tích chất mang được trung hòa bởi các ion trái dấu và pH tối ưu của enzyme cố định cũng giống như enzyme hòa tan [34],[73],[78]

Thực hiện đề tài sẽ giúp chúng tôi tìm hiểu biết rõ hơn những đặc điểm của enzyme cố định

1.1.2- Các phương pháp cố định enzyme

Enzyme cố định thường là những enzyme hòa tan được gắn vào chất mang

bằng nhiều kỹ thuật khác nhau

Sơ đồ 1.1: Các phương pháp cố định enzyme [52],[54]

1.1.2.1- Phương pháp nhốt enzyme

a- Phương pháp nhốt enzyme trong gel

Dựa trên cơ sở tạo ra một màng bao bọc hay một polymer, các chất tham

gia phản ứng và sản phẩm của cả phản ứng có thể thẩm thấu vào trong hoặc ra

ngoài thông qua màng bao bọc này nhưng enzyme sẽ được giữ lại trong hạt gel

Nguyên liệu tạo gel để nhốt enzyme như polyacrylamide, alginate,

-carrageenan, gelatin…

Các phương pháp cố định enzyme

Các phương pháp cho enzyme hòa tan

Các phương pháp cho enzyme không hòa tan

Phương pháp tạo

Nhốt enzyme trong khuôn gel (gel entrapment)

Hấp phụ vật lý

Liên kết ion

Liên kết kim loại

Liên kết đồng hóa trị

Nhốt enzyme trong hệ sợi (fiber) entrapment)

Tạo vi nang (microapsulation)

Nhốt enzyme trong gel Nhốt enzyme trong vi nang

Hình 1.2: Phương pháp nhốt enzyme[69],[120]

b- Phương pháp nhốt enzyme trong hệ sợi

Phương pháp nhốt enzyme trong hệ sợi có khả năng xúc tác phản ứng tốt hơn phương pháp nhốt enzyme trong gel Các sợi sử dụng để nhốt enzyme thường là vật liệu cellulose, dẫn xuất cellulose, những sợi nhân tạo, có độ bền với acid, kiềm, các loại ion và các dung môi hữu cơ hòa tan [52]

Hình 1.3: Enzyme nhốt trong hệ sợi [54],[111]

c- Nhốt enzyme trong cấu trúc mạng lưới

Nhốt phân tử enzyme trong mạng lưới polymer mà không có liên kết đồng hóa trị giữa chất mang và phân tử enzyme Trong các chất mang vô cơ thì chỉ có silica gel là áp dụng được phương pháp này Kỹ thuật sol-gel dựa trên mạng lưới silica nhờ sự tham gia của tiền chất ban đầu (như Na2SiO3) Trong phương pháp này người ta có thể bổ sung các chất hữu cơ để thúc đẩy sự trùng ngưng như polypeptide, polyamine, dẫn xuất polypeptide hoặc dẫn xuất polyamine.[72],[97], [99]

E

1.1.2.2- Phương pháp tạo liên kết enzyme với chất mang

a- Phương pháp hấp phụ

Hình 1.4: Enzyme hấp phụ lên chất mang [54]

Nhược điểm của phương pháp này là enzyme không tan dễ dàng hòa tan trở

lại (nhả hấp phụ) khi thay đổi pH hoặc lực ion của dung dịch chung quanh.[111]

b- Phương pháp liên kết hóa học

Đây là phương pháp cố định enzyme đảm bảo liên kết vững chắc giữa enzyme với chất mang

Liên kết trực tiếp: Nối đồng hóa trị liên kết giữa các phân tử enzyme riêng biệt

thành một liên hiệp các phân tử enzyme không hòa tan

Liên kết trực tiếp chất mang và enzyme không cần chất hoạt hóa (chất trung

gian), trường hợp này ít phổ biến

Liên kết gián tiếp: Liên kết phân tử enzyme với chất mang thông qua một chất

trung gian (chất hoạt hóa) Cách này được sử dụng phổ biến [4],[111]

* Phương pháp tạo liên kết ion

Hình 1.5: Enzyme liên kết ion với chất mang [111]

Người ta gắn enzyme vào chất mang dựa trên khả năng tạo liên kết ion giữa

chất mang và enzyme Liên kết ion thường không bền bằng sự hấp phụ của

enzyme đối với chất mang Chất mang được sử dụng trong phương pháp này

thường là CMC, cellulose phosphate…v.v

* Phương pháp tạo liên kết

Đây là phương pháp cố định enzyme phổ biến nhất Phương pháp này cơ

bản dựa trên sự tạo ra nối cộng hóa trị giữa giá thể và enzyme Chất mang thường

sử dụng là polymer hữu cơ, dẫn xuất cellulose, polymer tổng hợp, chất mang vô

cơ Quá trình gắn enzyme lên chất mang thông qua một chất hoạt hóa

Hình 1.6: Enzyme gắn lên chất mang bằng liên kết [54],[111]

c- Phương pháp tạo liên kết chéo

Hình 1.7: Enyme cố định bằng liên kết chéo [61]

Đây là phương pháp dựa trên liên kết chéo của chính phân tử protein hay

enzyme qua cầu nối là chất hoạt hoá Liên kết chéo enzyme vừa có giá thành cao

vừa phải sử dụng với số lượng nhiều, vì enzyme có vai trò như một chất mang

Chất liên kết với enzyme thường được sử dụng là glutaraldehyde, 3-aminopropyltriethoxysilane [99]

* Kỹ thuật tạo khối tinh thể enzyme liên kết chéo (CLEA)

Hình 1.8: Kỹ thuật CLEA [106]

Một kỹ thuật được phát triển là tạo khối enzyme liên kết chéo (cross-linked enzyme aggregates – CLEA), phương pháp này là sự kết tủa đơn giản enzyme từ dung môi nước bằng cách bổ sung muối hoặc nước pha lẫn với dung môi hữu cơ, các phân tử protein sẽ kết hợp với nhau theo tương tác vật lý Việc kết hợp theo tương tác vật lý này được thực hiện bởi liên kết hydro mà không làm thay đổi cấu trúc bậc ba, cũng như không làm biến tính protein Những liên kết chéo của khối enzyme này giữ cho khối enzyme ở trạng thái không tan một cách bền vững bằng cách duy trì siêu cấu trúc hình thành trước đó và tăng hoạt tính xúc tác của chúng [76],[106]

Phương pháp này được thực hiện thông qua phản ứng xúc tác với glutaraldehyde có nhóm NH2 hoạt động trên bề mặt protein và sử dụng polyaldehyde từ sự oxi hóa dextran [61]

Bảng 1.1: Khả năng chịu nhiệt của các enzyme tự do và enzyme dạng CLEA [106]

Enzyme tự do Phân tử CLEA

* Cố định lipase theo phương pháp tạo CLEA [106]

Hình 1.9: Các khối phân tử CLEA của lipase ở nấm Candida Antarctica A/B, mỗi

khối tủa CLEA chứa hơn 8 triệu phân tử enzyme (x 3500) [106]

Ngày nay kỹ thuật cố định enzyme phát triển thêm hướng ứng dụng mới hiện đại: cảm biến sinh học dùng trong phân tích y học, thực phẩm, mơi trường

Sự phát triển nghiên cứu enzyme không tan còn liên quan đến phát triển các

“biochip”, cố định hoặc xây dựng các phân tử sinh học (DNA, protein/enzyme) trên các “chip” rất nhạy hay các chất mang nano (nano carrier) … [1],[70],[124]

1.1.2.3- Một số mô hình về kỹ thuật cố định enzyme –chất mang

A: Sự cố định không gian- Cố định trong hạt gel

B: Sự cố định kỵ nước- Sự hấp phụ bằng ligand kỵ

nước

Hình 1.10: Sự bố trí không gian của enzyme cố định [54]

Khắc phục vấn đề về bố trí không

gian: dùng chất mang có thành phần liên

kết giữ phân tử enzyme ở vị trí thích hợp

Khắc phục vấn đề hạn chế về không gian bằng việc định hướng vị trí cố định enzyme

Sự thay đổi môi trường vi mô của

enzyme cố định bằng sự biến đổi hóa học

với các phân tử ưa nước nhiều chức năng

Liên kết hóa học bề mặt phân tử enzyme cố định với đại phân tử tạo chuỗi- bền vững và linh động tạo liên kết bề mặt trùng hợp protein

Dùng tay gắn trung gian ưa nước để giảm sự hạn chế về không gian

Hình 1.11: Các cách khắc phục về bố trí không gian cố định enzyme [54]

Hình 1.12: Mô hình tạo enzyme liên hợp cố định [54]

Khi cố định giữa enzyme và chất mang chúng ta cần biết ưu nhược điểm của từng phương pháp và từ đó sẽ đưa ra những giải pháp để khắc phục Khi enzyme cố định xúc tác cơ chất kích thước lớn thì sự hiện diện của bề mặt chất mang có thể ảnh hưởng mạnh đến việc tiếp cận của cơ chất đến trung tâm hoạt động của enzyme

Khi nghiên cứu lựa chọn chất mang khác nhau sao cho phù hợp để cố định enzyme và vị trí liên kết cố định phải tránh tiếp xúc với vị trí trung tâm hoạt động của enzyme

1.1.3- Chất mang

Đặc điểm, tiùnh chất của chất mang là cơ sở cho sự lựa chọn phương pháp cố định enzyme Không có chất mang nào thích hợp cho tất cả các loại enzyme và cũng không có enzyme nào thích hợp cho tất cả các loại chất mang vật liệu cố định.[14],[85]

1.1.3.1- Một số đặc điểm của chất mang

a- Yêu cầu của chất mang lý tưởng

 Rẻ, tăng hiệu quả kinh tế

 Có tính chất cơ lý bền vững, ổn định Nhờ tính chất này, chất mang mới chịu được các điều kiện của môi trường như khuấy trộn, áp lực trong các quy trình sản xuất

 Bền vững về mặt hoá học, không tan trong môi trường phản ứng

 Bền vững với sự tấn công của các vi sinh vật khác

 Có độ trương nở lớn Tăng khả năng cố định enzyme, tăng khả năng tiếp xúc của cơ chất với enzyme cố định trong chất mang

 Có cấu trúc lỗ xốp, siêu lỗ, ở dạng hạt, màng, phim mỏng, sợi.[9],[14]

b- Yếu tố ảnh hưởng đến khả năng cố định enzyme của chất mang

 Nồng độ enzyme: nồng độ enzyme càng cao thì sự cố định càng nhiều

 Thời gian tiếp xúc: xác định thời gian phù hợp, đủ để enzyme tiếp xúc với bề mặt của vật liệu cố định và gắn kết bền vững

- Kích thước của vật liệu cố định : tốc độ cố định càng tăng khi kích thước chất

mang càng giảm

 Nhiệt độ : khi nhiệt độ tăng, tốc độ gắn kết tăng nhưng không vượt qua nhiệt độ làm vô hoạt enzyme

 pH : quá cao hoặc quá thấp đều làm giảm khả năng cố định, thông thường sự cố định tối đa ơ ûpH điểm đẳng điện

 Thành phần môi trường: các chất làm giảm tính hòa tan của enzyme trong pha nước, sẽ làm tăng khả năng liên kết [18]

1.1.3.2- Phân loại chất mang

Dựa vào nguốn gốc bản chất hóa học của chất mang mà chúng ta phân loại:

Sơ đồ 1.2: Phân loại chất mang

a- Một số chất mang hữu cơ tự nhiên

Chuỗi polyguluronic có dạng nếp gấp, chuỗi polymannuronic có dạng thẳng

Vì vậy nó sẽ có tính chất khác nhau khi kết hợp với các ion hóa trị hai.[8],[62]

Hình 1.13: Đơn phân tạo nên alginate [136]

Tính chất tạo gel của alginate: Khi cho kết hợp với cation hoá trị cao, thường

dùng Ca2+, sẽ xuất hiện những vùng nối giữa các mạch phân tử trong alginate và tạo gel, gel sẽ được hình thành ở nhiệt độ phòng hay nhiệt độ bất kì nhỏ hơn

100oC Khả năng tạo gel của các ion hoá trị hai được sắp xếp theo trình tự sau:

Pb2+ > Cu2+ > Ba2+ > Sr2+ > Cd2+ > Ca2+ > Zn2+ > Co2+ > Ni2+ [56],[58]

Hình 1.15: Cấu trúc mạng lưới gel alginate khi alginate tiếp xúc với Ca 2+ [38]

Một số ví dụ cố định enzyme trên alginate

 Invertase cố định trên hạt calcium alginate (thủy phân saccharose): Hiệu suất cố định protein đạt 64,27% Hiệu suất hoạt tính enzyme cố định đạt 39,14% so với invertase tự do Số lần tái sử dụng là 6 lần với 12giờ /lần [5]

 Khảo sát quá trình cố định lipase trong chất mang alginate (Sangbum Kim và cộng sự): Kết quả cho thấy hiệu suất cố định protein tăng theo nồng độ alginate trong khi hiệu suất cố định enzyme lại giảm Nồng độ CaCl2 ít ảnh hưởng tới hiệu suất cố định protein hiệu suất cố định không bị ảnh hưởng bởi tỉ lệ enzyme : alginate trong khoảng từ 0,125 đến 0,5 với nồng độ alginate 2% và 1,5% Hoạt tính riêng của enzyme cố định giảm khi kích thước hạt tăng [66]

Hình 1.14: Liên kết tạo gel khi alginate tiếp xúc với Ca 2+ [56]

 Nghiên cứu quá trình cố định CWI (cell wall invertase) trên alginate (Aleksandra Milovanovic) Sau 40 chu trình, CWI cố định giữ nguyên 90% hoạt tính [23]

 Cố định enzyme -glucosidase trong hạt alginate tăng khả năng chịu nhiệt hơn là bẫy trong gel polyacrylamide -glucosidase cố định trong gel polyacrylamide đề kháng sự thủy phân protein cao hơn bẫy trong hạt alginate.[90]

 Cố định -D-glucosidase trên gel alginate, những hạt enzyme sau khi sấy bị mất đi 49% hoạt tính so với ban đầu Sự mất hoạt tính có thể hạn chế ở pH 5,0 nếu có dùng glutaraldehyde trước đó.[117]

 Endo--glucanase (Trichoderma reesei) được cố định trong hạt calcium

alginate giữ được 75% hoạt tính ban đầu Mặt khác, thời gian bán hủy của endoglucanase cố định là 4,6 giờ ở 550C và 5,4 giờ ở 600C [54]

 Khảo sát sự thoát ra của glucose oxidase khi nhốt trong gel calcium alginate: tăng nồng độ sodium alginate và CaCl2 làm giảm bớt enzyme bị thoát ra [58]

 Người ta còn dùng alginate để cố định tế bào vi sinh vật, ví dụ như: Sản xuất

cồn bằng kỹ thuật cố định tế bào nấm men Sac.cerevisiae trên alginate.[18]

* Cellulose

Vật liệu cellulose và dẫn xuất của nó như CM cellulose, DEAE cellulose, triacetate cellulose [45] … cũng được sử dụng rộng rãi làm chất mang để cố định Cellulose có tính chất cơ lý khá tốt, giá rẻ nhưng lại không đồng nhất và ổn định [69] Sau đây là một vài dạng vật liệu cellulose được trình bày:

- Cellulose vi khuẩn (Bacterial cellulose-BC)

C ellulose thực vật (x200): 200mm ; Cellulose vi khuẩn (x20000): 2mm

Hình 1.16: Cấu trúc của cellulose vi khuẩn và thực vật [57]

Cấu tạo: Cellulose vi khuẩn không chứa lignin và hemicellulose Kích thước của

cellulose vi khuẩn còn nhỏ hơn cả kích thước của sợi tổng hợp hoá học có đường kính nhỏ nhất

Tính chất của BC: BC là một sản phẩm polysaccharide ngoại bào của vi khuẩn

BC là dạng polymer có độ tinh sạch cao so với các dạng cellulose khác BC có thể bị phân hủy hoàn toàn và là nguồn năng lượng có thể phục hồi Cấu trúc BC có các trục đơn giúp cho lớp màng tạo thành trở nên mảnh hơn Sợi cellulose được tổng hợp có trọng lượng nhẹ, kích thước ổn định và sức căng cao BC có độ bền sinh học cao Tính chất nổi bật của BC là khả năng giữ nước (99%) [57],[100]

- Độ nhớt của dung dịch CMC phụ thuộc vào phương pháp sản xuất CMC, chiều dài của chuỗi polymer, mức độ thay thế nhóm carboxymethyl

Hình 1.17: CMC tạo gel trong dung dịch AlCl 3 [25]

- Sự hòa tan của CMC bị ảnh hưởng bởi dung môi, pH của dung dịch, chiều dài của chuỗi polymer, lực tác động

- Dung dịch CMC bền với sự tấn công của vi sinh vật, chỉ có vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase mới có khả năng phân hủy CMC [47],[64],[87]

Cố định enzyme trên gel CMC bằng phương pháp nhốt enzyme vào chất mang Chất hoạt hóa sử dụng là: epichlorohydrin để hoạt hóa nhóm hydroxyl, hay N, N-dicyclohexilcarbodiimide hoạt hóa nhóm COOH [45],[47]

Ví dụ cố định pancreatin trên CMC [87]

* Carrageenan

Carrageenan chiết tách từ tảo đỏ (Năm 1862 Stanford) [113]

Cấu tạo: Carrageenan là một polysaccharide gồm các đơn vị thành phần là

disaccharide cấu tạo từ các dẫn xuất của galactose Carrageenan gồm hai đơn phân 1, 3-D-galactopyranosyl và 1, 4-D-galactosyl

Carrageenan chia ra làm ba nhóm: , ,  dựa vào vị trí của nhóm sulfate trong đơn phân 1, 3-D-galactopyranosyl và 1, 4-D-galactosyl

Hình 1.18: Cấu tạo của carrageenan [133]

Tính chất của - carrageenan

Độ nhớt cao và khả năng tạo gel đã được ứng dụng vào một số lĩnh vực như

thực phẩm, cố định enzyme và tế bào

Nhiệt độ tạo gel và tan chảy gel -carrageenan giống như gel agar, có biến đổi thuận nghịch với nhiệt độ Nhiệt độ tạo gel của -carrageenan nằm trong khoảng từ 350C đến 650C và tan ra ở nhiệt độ từ 55 đến 850C Độ bền của gel

-carrageenan phụ thuộc cation bổ sung vào và nguồn gốc của -carrageenan [15],[113]

Cố định enzyme trên gel carrageenan

 Cố định esterase lên carrageenan [68]

 Cố định -chymotrypsin trên hạt -carrageenan [43]

 Cố định acetylcholinesterase lên Ca-alginate và alginate/-carrageenan: enzyme tự do và enzyme cố định cùng nhiệt độ và pH tối ưu là 7 và 30oC [101]

* Chitosan

Cấu tạo: Chitosan là một polysaccharide có công thức là:

[-(1, 4)-2-amino-2-deoxy-D-glucose]n được thu nhận khi khử acetyl chitin.[16],[75]

Hình 1.19: Söï táo chitosan baỉng quaù trình khöû acetyl cụa chitin [75]

Tính chaât cụa chitosan

- Ñoô hoøa tan

o Chitosan khođng tan trong dung mođi höõu cô, acid noăng ñoô cao vaø kieăm

o Khạ naíng hoøa tan cụa chitosan ôû pH trung tính taíng khi möùc ñoô acetyl hoùa

taíng (DA) vaø khi DA = 0,6 thì chitosan coù theơ tan hoaøn toaøn ôû mói giaù trò pH

- Dáng phöùc cụa chitosan: Chitosan coù tính kî nöôùc ñoô tröông nôû keùm, dieôn tích beă maịt tieâp xuùc khođng lôùn neđn thöôøng ñöôïc gaĩn thaønh dáng copolymer vôùi caùc monomer öa nöôùc nhö acrylamide, acrylic acid, methylmethacrylate, caùc DNA,

protein, caùc polysaccharide khaùc ñeơ khaĩc phúc caùc nhöôïc ñieơm tređn [16],[22]

- Caùc dáng xöû lyù khaùc nhau cụa chitosan [79],[83]

* Gel chitosan chuaơn bò baỉng caùch xöû lyù chitosan trong dung dòch acid acetic 10%

hoaịc acid acetic 5% (Moore & Roberts 1980)

* Dung dòch chitosan: hoaø tan chitosan vôùi acid acetic hoaịc acid formic Ñoô nhôùt dung dòch taíng khi taíng noăng ñoô chitosan vaø nhieôt ñoô giạm (Roberts 1992)

* Maøng chitosan: dung dòch chitosan ñoơ leđn moôt taâm kính phaúng, ñeơ boẫc hôi hoaøn toaøn, nhuùng vaøo dung dòch NaOH 1M ñeơ trung hoøa acid vaø röûa nhieău laăn sau ñoù ñaịt leđn taâm kính sách vaø giöõ ôû 60oC cho ñeân khođ

* Có thể taọ dạng hạt chitosan: bơm dung dịch chitosan qua hệ thống nhỏ giọt rơi

xuống một dung dịch đông tụ, thường là dung dịch kiềm như NaOH, KOH,

Na2CO3, K2CO3, ammoniac và ethylene amin vì chitosan không tan trong kiềm

Chitosan được đánh giá là một vật liệu sinh học có giá trị cao Sản phẩm

chitosan được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: thực phẩm, mỹ phẩm,

y học, môi trường, công nghệ sinh học… [15],[83]

Một số ví dụ cố định enzyme trên chitosan

 -glucosidase (Aspergilus phoenicis) cố định lên chitosan đã được hoạt hóa

bởi glutaraldehyde pH hoạt động tối ưu của -glucosidase cố định và tự do đều

là 4,5 nhưng ở pH thấp hơn enzyme cố định hoạt động tốt hơn Khả năng chịu

nhiệt được cải thiện đáng kể so với enzyme tự do, enzyme cố định có khả năng

hoạt động đến gần 80oC Nhược điểm là tính đặc hiệu chỉ bằng 10% so với

enzyme tự do [50]

 Penicillin G acylase cố định lên chitosan hoạt hóa bởi glutaraldehyde [19]:

+ Cố định theo liên kết đa hóa trị: lượng enzyme cố định là 82%

+ Cố định theo liên kết đơn hóa trị: lượng enzyme cố định là 85%

Hoạt tính của enzyme cố định giảm 50% sau 20 lần tái sử dụng hoặc sau 40

giờ

 Cố định BMP–2 (Bone morphogenetic protein-2) lên màng chitosan để tăng

khả năng tái tạo xương.[119]

Ngoài ra sự cố định các loại enzyme xúc tác phản ứng thủy phân

trên chitosan hoạt hoá bởi glutaraldehyde với hiệu suất cao như:

-galatosidase, alkaline phostphatase, pullulanase, urease [74],[99],[104]

b- Polymer tổng hợp hoá học – polyacrylamide

Tuy nhiên polymer tổng hợp thường có giá thành cao, khả năng tương thích sinh học kém và thường khó phân hủy trong tự nhiên gây ô nhiễm môi trường

Hình 1.20: Quá trình polymer hóa cuả polyacrylamide [133]