Tuyển chọn một số vi sinh vật có khả năng chuyển hóa một số chất ô nhiễm của bùn thải ao nuôi tôm

U TRUN T MN U T HCM N ỨU V P T TR ỂN N N N ỆP N N Ệ BÁO CÁO NGHIỆM THU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂN CHUYỂN HÓA MỘT SỐ CHẤT Ô NHIỄM CỦA BÙN THẢI AO NUÔI TÔM KS Trần Hải My KS Phan Thị Hồng Hải Th nh ph Hồ h Minh, h ng 01/2017 O BAN QU N LÝ KHU NÔNG NGHI P CÔNG NGH CAO TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu) TUYỂN CHỌN MỘT SỐ VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂN CHUYỂN HÓA MỘT SỐ CHẤT Ô NHIỄM CỦA BÙN THẢI AO NUÔI TÔM Ơ QU N Ủ TRÌ (Ký tên, đóng dấu xác nhận) CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI (Ký tên) Th nh ph Hồ h Minh, h ng 01/2017 TÓM TẮT Từ mẫu bùn thải ao nuôi tôm thu đƣợc Cần Giờ, đề tài phân lập đƣợc 10 chủng Bacillus, 26 chủng Pseudosomonas, chủng Nitrobacter, 13 chủng Nitrosomonas, 19 chủng xạ khuẩn Streptomyces, chủng xạ khuẩn Micromonospora, 10 chủng nấm men có nang bào tử chủng nấm men không sinh bào tử Từ chủng vi sinh vật phân lập đƣợc từ sƣu tập giống, tuyển chọn đƣợc 51 chủng vi khuẩn, chủng nấm men 19 chủng xạ khuẩn có khả chịu mặn 30‰ để tiến hành khảo sát đặc tính ua đó, tuyển chọn đƣợc chủng có hoạt tính protease tốt hai chủng vi khuẩn B25, B29 chủng xạ khuẩn X17, S11 S1; chủng có hoạt tính cellulase tốt chủng xạ khuẩn S1 S11 chủng nấm men N1; chủng có hoạt tính amylase tốt chủng vi khuẩn B29 B28 chủng xạ khuẩn S11 Hai chủng vi khuẩn có khả nitrat hóa tốt chủng V13 chủng V7, chủng V13 có khả oxy hóa thành NO2- mạnh chủng V7 có khả oxy hóa + thành NO3- mạnh Các chủng vi sinh vật khảo sát có khả hấp thu Pb tốt Zn u Trong đó, chủng có khả hấp thu Pb tốt chủng vi khuẩn V23 V24, chủng xạ khuẩn X3, X11; chủng có khả hấp thu Zn tốt chủng vi khuẩn V41 chủng nấm men N10; chủng có khả hấp thu Cu tốt chủng vi khuẩn V23 chủng nấm men N3 Trang ii BM20-QT.QLKH MỤ LỤ Trang Trang phụ bìa i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH SÁCH B NG vii DANH SÁCH HÌNH viii T T ĐỀ TÀI MỞ ĐẦU ƢƠ TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1.2 Sự tích tụ bùn thải ao nuôi tôm 1.1.2 Đặc tính thành phần hóa học bùn thải ao ni tơm 1.2 Hiện trạng xử lý bùn thải ao nuôi tôm ô nhiễm môi trƣờng từ bùn thải ao nuôi tôm 1.3 Một số giải pháp xử lý bùn ao nuôi tôm 1.3.1 Quy hoạch ao nuôi tôm 1.3.2 Xử lý hệ thống đất ngập nƣớc điều kiện tự nhiên 1.3.3 Xử lý phƣơng pháp ủ compost 1.4 Vi sinh vật có khả chuyển hóa số thành phần gây ô nhiễm bùn thải ao nuôi tôm 1.4.1 Đối với chất hữu 1.4.2 Đối với kim loại nặng 10 1.4.3 Đối với nitơ 11 1.5 Một số nghiên cứu bùn thải ao nuôi tôm 11 ƢƠ ỘI DUNG NGHIÊN CỨU 15 Trang iii BM20-QT.QLKH 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 15 2.1.1 Thời gian 15 2.1.2 Địa điểm 15 2.2 Vật liệu hóa chất 15 2.2.1 Vật liệu 15 2.2.2 Hóa chất 15 2.3 Nội dung nghiên cứu 15 2.4 hƣơng pháp thực xử lý thống kê 16 2.4.1 Nội dung 1: Phân lập số vi khuẩn từ bùn thải ao nuôi tôm 16 2.4.2 Nội dung 2: Tuyển chọn số vi sinh vật có khả chuyển hóa số chất nhiễm bùn thải ao nuôi tôm 19 2.4.2.1 Thí nghiệm 1: Xác định khả chịu mặn 19 2.4.2.2 Thí nghiệm 2: Xác định hoạt tính protease 20 2.4.2.3 Thí nghiệm 3: Xác định hoạt tính cellulase 21 2.4.2.4 Thí nghiệm 4: Xác định hoạt tính amylase 23 2.4.2.5 Thí nghiệm 5: Xác định khả nitrat hóa 24 2.4.2.6 Thí nghiệm 6: Xác định khả hấp thu kim loại nặng 24 ƢƠ ẾT QU VÀ TH O LUẬN 26 3.1 Nội dung 1: Phân lập số vi sinh vật từ bùn thải ao nuôi tôm 26 3.2 Nội dung 2: Tuyển chọn số vi sinh vật có khả chuyển hóa số chất nhiễm bùn thải ao nuôi tôm 50 3.2.1 Thí nghiệm 1: Xác định khả chịu mặn 50 3.2.2 Thí nghiệm 2: Xác định hoạt tính protease 57 3.2.3 Thí nghiệm 3: Xác định hoạt tính cellulase 62 3.2.4 Thí nghiệm 4: Xác định hoạt tính amylase 67 3.2.6 Thí nghiệm 6: Xác định khả hấp thu kim loại nặng 74 Trang iv BM20-QT.QLKH ƢƠ ẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 79 4.1 Kết luận 79 4.2 Kiến nghị 80 TÀI LI U THAM KH O 81 PHỤ LỤC Trang v BM20-QT.QLKH D N S Viết tắt Ữ V ẾT TẮT Thuật ngữ tiếng việt ctv Cộng tác viên Đ Đối chứng KL Khuẩn lạc KLN Kim loại nặng KTCC Khuẩn ty chất KTKS Khuẩn ty khí sinh RNM Rừng ngập mặn TN Thí nghiệm VSV Vi sinh vật Trang vi BM20-QT.QLKH D N Bảng S BẢN Tựa bảng Trang 3.2 Tổng số vi sinh vật phân lập đƣợc 27 3.3 ết định danh sơ chủng vi khuẩn phân lập 28 3.4 Màu sắc T 42 T S chủng xạ khuẩn phân lập 3.5 ình thái đại thể vi thể chủng xạ khuẩn phân lập 44 3.6 ết định danh sơ chủng nấm men phân lập 47 3.10 chịu mặn chủng vi khuẩn 51 3.11 chịu mặn chủng nấm men 55 3.12 chịu mặn chủng xạ khuẩn 56 3.13 Đƣờng kính vịng phân giải casein chủng vi khuẩn sau 48 nuôi cấy 57 3.14 Đƣờng kính vịng phân giải casein chủng nấm men sau 24 ni cấy 59 3.15 Đƣờng kính vòng phân giải casein chủng xạ khuẩn sau ngày nuôi cấy 60 3.16 oạt độ protaese chủng vi sinh vật tuyển chọn 62 3.17 Đƣờng kính vịng phân giải M chủng vi khuẩn sau 48 ni cấy 62 3.18 Đƣờng kính vịng phân giải M chủng nấm men sau 24 ni cấy 64 3.19 Đƣờng kính vịng phân giải M chủng xạ khuẩn sau ngày nuôi cấy 65 3.20 oạt độ cellulase chủng vi sinh vật tuyển chọn 66 3.21 Đƣờng kính vịng phân giải tinh bột chủng vi khuẩn sau 48 ni cấy 67 3.22 Đƣờng kính vịng phân giải tinh bột chủng nấm men sau 24 ni cấy 69 3.23 Đƣờng kính vịng phân giải tinh bột chủng xạ khuẩn sau ngày nuôi cấy 69 3.24 oạt độ amylase chủng vi sinh vật tuyển chọn 71 3.25 hản ứng màu ion với thuốc thử riess sau ngày nuôi cấy 72 3.26 àm lƣợng Cu, Pb Zn lại môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn 75 3.27 àm lƣợng Cu, Pb Zn lại môi trƣờng nuôi cấy nấm men 76 3.28 àm lƣợng b cịn lại mơi trƣờng ni cấy xạ khuẩn 77 Trang vii BM20-QT.QLKH DANH SÁCH HÌNH Hình Tựa hình Trang 1.1 Hệ thống ni tơm theo Dự án VIET/97/030 2.1: Sơ đồ bƣớc định danh vi khuẩn Gram âm (George, 2005) 17 2.2: Sơ đồ bƣớc định danh vi khuẩn ram dƣơng (George, 2005) 18 3.1 ình ảnh vi thể ram (-) 38 3.2 ình ảnh vi thể ram (+) 38 3.3 ình ảnh bào tử số vi khuẩn 38 3.4 Một số dạng khuẩn lạc đặc trƣng chủng vi khuẩn phân lập đƣợc 39 3.5 Thử nghiệm xidase 40 3.6 Thử nghiệm tính di động 40 3.7 Thử nghiệm Catalase 40 3.8 Thử nghiệm lên men actose 40 3.9 Thử nghiệm lên men lucose 40 3.10 Thử nghiệm MR 41 3.11 Thử nghiệm VP 41 3.12 Thử nghiệm itratase 41 3.13 Thử nghiệm itrate 41 3.14 Thử nghiệm ndol 42 3.15 Thử nghiệm Urease 42 3.16 Một số dạng khuẩn lạc đặc trƣng chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc 47 3.17 Một số hình dạng đặc trƣng bào tử xạ khuẩn phân lập đƣợc 47 3.18 Một số hình ảnh tế bào nấm men đặc trƣng dƣới vật kính X100 50 3.19 Một số dạng khuẩn lạc đặc trƣng chủng nấm men phân lập đƣợc 50 3.20 Vòng phân giải casein môi trƣờng thạch đĩa số chủng vi sinh vật 61 Trang viii BM20-QT.QLKH 3.21 Vòng phân giải M môi trƣờng thạch đĩa số chủng vi sinh vật 66 3.22 Vòng phân giải tinh bột môi trƣờng thạch đĩa số chủng vi sinh vật 71 3.23 Thang chuẩn để đánh giá mức độ phản ứng màu ion với thuốc thử riess72 Trang ix BM20-QT.QLKH Phú Vang, Thừa Thiên Huế, Hội nghị khoa học toàn quốc sinh thái tài nguyên sinh vật lần thứ 5, Trang 1116-1121 Nguyễn Đức ƣợng, Phan Thị Huyền Nguyễn Ánh Tuyết (2011), Thí nghiệm cơng nghệ sinh học Tập Thí nghiệm vi sinh vật học, Nhà xuất đại học quốc gia Tp Hồ Chí Minh 10 Phan Thị Thu Mai (2012), Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật sinh enzyme phytase, Luận văn thạc sỹ Trƣờng đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội 11 Nguyễn Văn Mạnh Bùi Thị ga (2011), Đánh giá mức độ tích tụ nhiễm bùn đáy ao nuôi thâm canh tôm s (Penaeus monodon), Tạp chí Nơng Nghiệp Phát triển nơng thơn, Số 9, Trang 73-79 12 Phạm Thị Tuyết Ngân (2012), Nghiên cứu quần thể vi khuẩn chuyển hóa đạm bùn đáy ao nuôi tôm sú (Penaeus monodon), Luận án tiến sĩ chuyên ngành nuôi trồng thủy sản nƣớc mặn, lợ, Trƣờng Đại học Cần Thơ 13 ƣơng Đức Phẩm (2009), Công nghệ xử lí nước thải biện pháp sinh học, Nhà xuất Giáo dục Việt Nam, Hà Nội 14 Trần Thanh Phong (2011), Khảo sát hàm lượng dưỡng chất đánh giá tính khả thi chế tạo phân hữu bùn đáy ao nuôi tôm sú duyên hải cầu ngang Trà Vinh, Luận văn tốt nghiệp đại học, Đại học Cần Thơ 15 Nguyễn Văn h c han Thị hƣợng Trang (2014), Phân lập, định danh xác định đặc tính có lợi chủng Bacillus spp từ ao nuôi tôm t nh Bến Tre, Tạp chí Khoa học Đại học Sư phạm Tp HCM, Số 64, Trang 94-102 16 Nguyễn Thanh hƣơng Trần Ngọc Hải (2004), Giáo trình kỹ thuật sản xuất giống nuôi giáp xác, Khoa Thủy sản - Đại học Cần Thơ 17 Vũ Thị an hƣơng (2015), Tuyển chọn vi khuẩn lactic có hoạt lực phân giải chất hữu cao từ bùn ao nuôi tôm Thừa Thiên Huế, Hội nghị khoa học sinh viên, Đại học quốc gia Hà Nội Trang 82 BM20-QT.QLKH 18 Khuất Hữu Thanh Lê Anh Xuân (2012), Phân lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus ứng dụng xử lý bùn đáy ao ni tơm cơng nghiệp, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nông thôn, Số 2, Trang 86-90 19 Võ Hồng Thi, Nguyễn Hoàng Mỹ, Nguyễn Phạm Huyền (2012), Hoạt tính protease số chủng Bacillus phân lập từ nƣớc thải chế biến thịt thủy hải sản, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Số 28, Trang 116-124 20 Tất nh Thƣ Võ Thị ƣơng (2010), Đặc tính hóa lý bùn thải ao ni tơm Sóc Trăng, Tạp chí Khoa học trường Đại học Cần Thơ, Số 16a, Trang 209-215 21 Phạm Nguyễn Yến Trinh (2011), Nghiên cứu xử lý bùn đáy ao ni cá tra làm phân bón, Luận văn thạc sỹ sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên Tp HCM 22 Chiêm Thị Bích Vân (2007), Nghiên cứu sản xuất amylase từ Aspergillus oryzae, Luận văn tốt nghiệp trƣờng Đại học Cần Thơ, ần Thơ Tiếng Anh 23 Akar, T and Tunali, S (2006), Biosorption characteristic of Aspergillus flavusbiomass for removal of Pb(II) and Cu(II) ions from an aqueous solution, Bioresourse Technology, 97, pp 1780-1787 24 Anson, M.L (1939), The estimation of pepsin, trypsin, papain and cathepsin with hemoglobin, The Journal of General Physiology, 22(1), pp 79-89 25 Ashwini, K and Sampathkumar, S (2014), Isolation and screening of potent amylase-producing marine actinomycetes from seabed, Malaya Journal of Biosciences, 1(4), pp 273-276 26 Balakrishman, S., Johh, K.R George, M.R (2003), Antibiotic susceptibility of Bacillus spp isolated from shrimp (Penaeus monodon) culture ponds, Indian Journal of Marine Sciences, 32(1), pp 81-84 27 Cabral, J.P.S (1992), Selective binding of metal ions to Pseudomonas syringaecells, Microbios, 71, pp 47-53 Trang 83 BM20-QT.QLKH 28 Das, P., Solanki, R and Monisha, K (2014), Isolation and screening of cellulolytic actinomycetes from diverse habitats, International Journal of Advanced Biotechnology and Research, 5(3), pp 438-451 29 Engel, M.S and Alexander, M (1958), Growth and autotrophic metabolism of Nitrosomonas europaea, Journal Bacteriology, 76(2), pp 217-222 30 Gebreyohannes, G (2015), Isolation and optimization of amylase producing bacteria and actinomyces from soil samples of Maraki and Tewedros campus, University of Gonda, north west Ethiopia, African Journal of Microbiology Research, 9(31), pp 1877-1882 31 George, M.G (2005), Bergey's manual of systematic bacteriology, In: Don, J.B., Noel, R.K and James, T.S (eds.), United States 32 Gothandam, K.M., Suganthi, C., Mageswari, A., Karthikeyan, S., Anbalagan, M and Sivakumar, A (2013), Journal of Genetic Engineering and Biotechnology, 11(1), pp 47-52 33 Gulve, R.M and Deshmukh, A.M (2011), Enzymatic activity of actinomycetes isolated from marine sediments, Recent Research in Science and Technology, 3(5), pp 80-83 34 Harwood, C.S and Gibson, J (1988), Anaerobic and aerobic metabolism of diverse aromatic compounds by the photosynthetic bacterium Rhodopseudomonas palustris, International journal of systematic bacteriology, 42, pp 186-188 35 Huang, C and Huang, C.P (1996), Applycation of Aspergillus oryzae and Rhizopusoryzae for Cu (II) removal, Water Research and Technology, 9, pp 1985-1990 36 James, R.F., Byron, S.M and John, A.Z (1961), A method for the determination of relative amounts of malted-wheat, fungal (Aspergillus oryzea) and bacteria (Bacillus subtilis) alpha-amylase in mixcultures, and its application to malted wheat, Cereal Chemistry, 38, pp 479-486 Trang 84 BM20-QT.QLKH 37 Jayasree, D., Sandhya Kumari, T.D., Kavi Kishor, P.B., Vijaya Lakshmi, M and Lakshmi Narasu, M (2009), Optimization of production protocol of alkaline protease by Streptomyces pulvereceus, InterJRI Science and Technology, 1(2), pp 79-82 38 Keivan, N., Bakar, N.K.A and Abas, M.R (2009), Investigation of heavy metals mobility in shrimp aquaculture sludge - comparison of two sequential extraction procedures, Microchemical Journal, 91(2), pp 227-231 39 Ling, T.Y., Malini, M.R and Nyanti, L (2008), Heavy metals in shrimp pond sludge, water and muscles, Journal Science and Technology in the Tropics, 4(1), pp 5763 40 Liu, Y., Yang, S.F., Xu, H., Woon, K.H., Lin, Y.M and Tay, J.H (2003), Biosorption kinetics of cadimium (II) on aerobic granular sludge, Process Biochemistry, 38, pp 997-1001 41 Lo, W, Chua, H, Lam, K.H and Bi, S.P (1999), A comparative investigation on the biosorption of lead by filamentous fungal biomass, Chemosphere, 39, pp 2723-2736 42 Lodder, J (1970), The yeast, A taxonomic study, North-Holland, Amsterdam 43 Mohanta, Y.K (2014), Isolation of cellulose-degrading actinomycetes and evaluation of their cellulolytic potential, Bioengineering and Bioscience, 2(1 ), pp 1-5 44 Narendhirakannan, R.T., Sudarshan, S.R and Mannivannan, A (2014), Screening of cellulase producing microorganisms from lake area containing water hyacinth for enzymatic hydrolysis of cellulose, Journal of Advanced Scientific Research, 5(3), pp 2330 45 Panwichian, Kantachote and Wittayaweerasak (2010), Isolation of purple nonsulfur bacteria for the removal of heavy metals and sodium from contaminate shrimp ponds, Electronic Journal of Biotechnology, 13(4) 46 Prabavathi, R., Mathivanan, V and Ambika, A (2012), Screening of protease enzyme by construction of metagenomic library from marine soil sediments, International Journal of Pharma Sciences and Research, 3(7), pp 396-399 Trang 85 BM20-QT.QLKH 47 Shanmugapriya, K., Saravana, P.S., Krishnapriya, Manoharan, M., Mythili, A and Joseph, S (2012), Isolation, screening and partial purification of cellulase from cellulase producing bacteria, International Journal of Advanced Biotechnology and Research, 3(1), pp 509-514 48 Shirling, E.B and Gottlieb, D (1966), Method for characterization of Streptomyces species, International of systematic bacteriology, 16(3), pp 313-340 49 Sumithra,V., Sudha, S.S and Jayasankar, N.S (2015), Isolation, screening and assay of halophilic protease from saltpan samples of tuticorin district, Scrutiny International Research Journal of Microbiology and Biotechnology, 2(2), pp 7-12 50 Tansel, Y.H (2013), Isolation and characterization of amylase producing yeasts and improvement of amylase production, Turkish Journal of Biochemistry, 38(1), pp 101-108 51 Van de Graaf, A.A., Mulder, A., Peter de Bruijn, Jette, M.S.M., Robertson, L.A and Kuenen, J.G (1995), Anaerobic oxidation of ammonium is a biologically mediated process, Applied and Environmental Microbiology, 61(4), pp 1246-1251 52 Waksman, S.A (1961), The Actinomycetes: Classification, identification and description of genera and species, The Williams and Wilkins Co., Baltimore 53 Viswanathan, K., Jeyanthi Rebecca, L., Arumugam, P and Anbarasu, K (2015), Isolation and screening of protease producing marine actinomycetes from Chennai coastal region, International Journal of Advanced Research in Biological Sciences, 2(8), pp 153157 54 Volesky, B (1992), Removal of heavy metals by biosorption, In: Ladisch, M.R and Bose, A (Editors), Hamessing Biotechnology for the 21St Century, American Chemical Society, Washington, D.C 55 Zin, L.M.M., Win, M.T and Myo, M (2015), Study on the cellulase enzyme producing activity of bacteria isolated from manure waste and degrading soil, International Journal of Technical Research and Applications, 3(6), pp 165-169 Trang Web Trang 86 BM20-QT.QLKH 56 ghiệm thu đề tài “ hảo sát tính chất bùn đáy ao ni tơm s (Penaeus monodon) thâm canh bán thâm canh vùng am quốc lộ t nh ạc iêu”, http://skhcn.baclieu.gov.vn/DETAIDUANKHCN/default.aspx?Source=/DETAIDUANK HCN&Category=&ItemID=101&Mode=1 (đọc ngày 19/01/2016) Trang 87 BM20-QT.QLKH P Ụ LỤ Phụ lục 1: Thành phần môi trƣờng Môi trƣờng Skim Milk: Casein 10 g/L, cao nấm men g/L, KH2PO4 0,1 g/L, K2HPO4 0,3 g/L, NaCl g/L, agar 20 g/L, pH 6,5 Môi trƣờng CMC: CMC 10 g/L, tryptone g/L, FeSO4 0,004 g/L, K2HPO4 g/L, MgSO4 0,5 g/L, NaCl 0,5 g/L, agar 20 g/L, pH Môi trƣờng tinh bột: Tinh bột 10 g/L, tryptone g/L, FeSO4 0,004 g/L, K2HPO4 g/L, MgSO4 0,5 g/L, NaCl 0,5 g/L, agar 20 g/L, pH Môi trƣờng ing’s ( ): ao nấm men g/L, pepton 20 g/L, glycerol5 mL/L, K2HPO4 12,5%12 mL/L, MgSO4.7H2O 6,25%25 mL/L, agar 20 g/L Môi trƣờng Winogradsky: (NH4)2SO4 g/L, K2HPO4 g/L, MgSO4 0,5 g/L, FeSO4 0,4 g/L, NaCl g/L, pH Môi trƣờng khảo sát hoạt độ cellulose: Na-CM-cellulose g/L, 1L dung dịch đệm citrate- phosphate có pH5, agar 20 g/L Mơi trƣờng pepton-glucose: Peptone 10 g/L, glucose 20 g/L, agar 20 g/L Môi trƣờng Yeast extract-peptone-dextrose growth (YEPD): Cao nấm men 10 g/L, Pepton 20 g/L, Glucose 20 g/L, agar 20 g/L Môi trƣờng ISP4: Tinh bột tan 10 g/L; K2HPO4 g/L; MgSO4.7H2O g/L; NaCl g/L; (NH4)2SO4 g/L; CaCO3 g/ ; Vi lƣợng 1mL/L (100 mL dung dịch vi lƣợng gồm: MnCl2.4H2O 0,1g; FeSO4.7H2O 0,1g; ZnSO4.7H2O 0,1g), agar 20 g/L 11 Môi trƣờng Gause 1: Tinh bột tan 20 g/L; K2HPO4 0,5 g/L; MgSO4.7H2O 0,5 g/L; NaCl 0,5 g/L; (NH4)2SO4 g/L; KNO3 0,5 g/L; FeSO4 0,01 g/L; Agar 18 g/L; pH 7,4 12 Môi trƣờng ause 2: 10 g/L; Agar 18 g/L; pH - 7,4 ƣớc chiết thịt 30 mL; pepton g/L; NaCl g/L; glucose Phụ lục 2: Phƣơng pháp tiến hành nhuộm Gram phản ứng sinh hóa 2.1 Phƣơng pháp nhuộm Gram B1: Nhỏ giọt nƣớc lên phiến kính sạch, lấy sinh khối vi khuẩn tạo huyền phù nóng nhẹ lửa đèn cồn B2: Phủ hồn tồn vết bơi với thuốc nhuộm crystal violet Để yên 30 giây nhẹ nhàng rửa trôi thuốc nhuộm nƣớc B3: Phủ vết bôi với dung dịch iodine 30 giây, rửa nhẹ nhàng với nƣớc Giữ phiến kính góc nghiêng nhỏ, rửa cồn không thấy thuốc nhuộm chảy theo, rửa lại với nƣớc ƣu ý: Thời gian rửa cồn khơng nên q giây B4: Phủ hồn tồn vết bôi với safranin để yên 30 giây, rửa nƣớc B5: Thấm khơ phiến kính với giấy thấm quan sát kính hiển vi dƣới vật kính X100 sử dụng giọt dầu B6: Quan sát ghi nhận lại kết quả: Gram, hình thái tế bào vi khuẩn 2.2 Thử nghiệm oxidase B1: Cấy chuyền VSV lên ống thạch nghiêng NA Ủ ống nghiệm cấy VSV 370C vòng 24 – 48h B2: Nhúng mảnh giấy lọc vào dung dịch 1% tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride B3: Dùng que cấy thu lấy sinh khối, dàn lên vị trí có thuốc thử giấy lọc Ghi nhận xuất màu xanh dƣơng vài ph t 4: Đọc kết quả: Oxidase (+) xuất màu xanh dƣơng đậm, oxidase (-) khơng có xuất màu xanh 2.3 Thử nghiệm catalase B1: Cấy chuyền VSV lên ống thạch nghiêng NA Ủ ống nghiệm cấy VSV 370C vòng 24 – 48h B2: Dùng que cấy lấy sinh khối lên phiến kính B3: Nhỏ giọt H2O2 lên vị trí có sinh khối vi khuẩn phiến kính 4: Đọc kết quả: Thử nghiệm catalase (+) có bọt khí xuất hiện, thử nghiệm catalase (-) khơng có xuất bọt khí 2.4 Thử khả di động B1: Cấy ria VSV vào ống nghiệm chứa môi trƣờng NA Ủ ống nghiệm cấy VSV 370C vòng 24h B2: Sau 24h, cấy chuyền VSV làm sang ống nghiệm chứa môi trƣờng thạch mềm NA 5% agar Cấy đâm sâu que cấy xuyên vào môi trƣờng ống nghiệm đến độ sâu khoảng 2cm Các ống nghiệm cấy VSV đƣợc ủ 370C 24 – 48h Nếu (-) ủ tiếp 21- 250 đến ngày Thực song song ống đối chứng không đƣợc cấy VSV B3: Sau 24 – 48h, quan sát ghi nhận kết quả: Thử nghiệm (+) VSV mọc lan khỏi đƣờng cấy làm đục môi trƣờng xung quanh, (-) VSV ch mọc theo đƣờng cấy môi trƣờng xung quanh Ống đối chứng khơng có VSV tăng trƣởng, mơi trƣờng 2.5 Thử khả lên men glucose B1: Cấy ria VSV vào ống nghiệm chứa môi trƣờng NA Ủ ống nghiệm cấy VSV 370C vòng 24h B2: Sau 24h, cấy chuyền VSV làm sang ống nghiệm chứa môi trƣờng Phenol Red Broth Base có bổ sung nguồn Glucose Ủ ống nghiệm cấy VSV 370C 18-20h 3: Đọc kết thử nghiệm lên men glucose (+) môi trƣờng chuyển thành màu vàng, (-) môi trƣờng màu đỏ Sinh (+) có bọt khí sinh ống Durham 2.6 Thử khả lên men lactose B1: Cấy ria VSV vào ống nghiệm chứa môi trƣờng NA Ủ ống nghiệm cấy VSV 370C vòng 24h B2: Sau 24h, cấy chuyền VSV làm sang ống nghiệm chứa môi trƣờng Phenol Red Broth Base có bổ sung nguồn Lactose Ủ ống nghiệm cấy VSV 370C 18-20h 3: Đọc kết : thử nghiệm lên men lactose (+) môi trƣờng chuyển thành màu vàng, (-) môi trƣờng màu đỏ Sinh (+) có bọt khí sinh ống Durham 2.7 Thử nghiệm MR B1: Cấy ria VSV vào ống nghiệm chứa môi trƣờng NA Ủ ống nghiệm cấy VSV 370C vòng 24h B2: Sau 24h, cấy chuyền VSV làm sang ống nghiệm chứa môi trƣờng lỏng Glucose Phosphate Ủ ống nghiệm cấy VSV 370C – ngày B3: Sau – ngày, thêm vài giọt thuốc thử Methyl red vào ống nghiệm dịch nuôi cấy, đọc kết ngay: Thử nghiệm MR (+) mơi trƣờng có màu đỏ sau bổ sung thuốc thử, MR (-) có màu vàng Trƣờng hợp có màu cam, cần ủ tiếp mơi trƣờng có giống ngày thực lại thử nghiệm 2.8 Thử nghiệm VP B1: Cấy ria VSV vào ống nghiệm chứa môi trƣờng NA Ủ ống nghiệm cấy VSV 370C vòng 24h B2: Sau 24h, cấy chuyền VSV làm sang ống nghiệm chứa môi trƣờng lỏng Clark – Lubs Ủ ống nghiệm cấy VSV 370C 24 – 48h B3: Sau 24 – 48h, nhỏ giọt dung dịch 5% α-naphthol cồn tuyệt đối vào ống nghiệm dịch ni cấy, sau nhỏ giọt dung dịch KOH 40% Lắc nhẹ ống ph t, đọc kết sau 20 phút chậm 4h Thử nghiệm V (+) có màu đỏ bề mặt môi trƣờng, VP (-) bề mặt môi trƣờng không đổi màu 2.9 Thử nghiệm Nitratase B1: Cấy ria VSV vào ống nghiệm chứa môi trƣờng NA Ủ ống nghiệm cấy VSV 370C vòng 24h B2: Cấy sinh khối chủng vào ống nghiệm chứa mơi trƣờng lỏng Nitrate Broth, ủ 370 vịng qua đêm B3: Sau 24 thời gian ủ, bổ sung vài giọt l1 để acid hóa mơi trƣờng, sau bổ sung 0,5 ml dung dịch Griess I 0,5 ml dung dịch Griess II Thử nghiệm nitratase (+) có xuất màu hồng Trƣờng hợp khơng có màu hồng xuất hiện, tiếp tục bổ sung lƣợng nhỏ bụi kẽm Nếu phản ứng cho màu hồng thử nghiệm Nitratase (-), ngƣợc lại không chuyển màu thử nghiệm nitrate (+) 2.10 Thử nghiệm Citrate B1: Cấy ria VSV vào ống nghiệm chứa môi trƣờng NA Ủ ống nghiệm cấy VSV 370C vòng 24h B2: Sau 24h, cấy chuyền VSV làm sang môi trƣờng SCA (Sodium citrate g/L, NaCl g/L, K2HPO4 g/L, NH4H2PO4 g/L, MgSO4 0,2 g/L, Bromothymol blue 0,008g/L, agar 20g/L, pH 6.8), ủ ống nghiệm cấy VSV 350C 24 – 48h B3: Sau 24 – 48h, quan sát đổi màu môi trƣờng Thử nghiệm (+) xuất VSV lạc môi trƣờng chuyển sang màu xanh dƣơng, (-) khơng có khuẩn lạc mơi trƣờng giữ ngun màu xanh lục 2.11 Thử nghiệm khả sinh ndol B1: Cấy ria VSV vào ống nghiệm chứa môi trƣờng NA Ủ ống nghiệm cấy VSV 370C vịng 24h B2: Cấy VSV sang mơi trƣờng nƣớc tryptone, ủ ống nghiệm cấy VSV 370C 24 – 48h B3: Sau 24 – 48h, nhỏ giọt thuốc thử Erlich vào dịch nuôi cấy, để yên vài phút, theo dõi tạo thành nàu đỏ lớp dung môi hữu Thử nghiệm (+) có xuất lớp màu đỏ bề mặt mơi trƣờng, (-) có màu vàng thuốc thử bề mặt môi trƣờng 2.12 Thử nghiệm Urease B1: Cấy ria VSV vào ống nghiệm chứa môi trƣờng NA Ủ ống nghiệm cấy VSV 370C vòng 24h B2: Cấy chuyền vi khuẩn làm qua ống nghiệm chứa môi trƣờng lỏng Rustigian – Stuart’s Urea roth ắc nhẹ ống để trộn vi khuẩn ủ 370C vòng 24 h B3: Quan sát, ghi nhận chuyển màu vào thời điểm 8, 12, 24, 48h sau ủ Thử nghiệm Urease (+) môi trƣờng trở thành màu đỏ tím, thử nghiệm (-) mơi trƣờng có màu vàng cam không đổi 2.13 Kiểm tra khả sinh bào tử B1: Nhỏ giọt nƣớc lên phiến kính sạch, lấy sinh khối vi khuẩn tạo huyền phù nóng nhẹ lửa đèn cồn 2: Thêm nƣớc vào cốc, đun sơi Đặt giá nhuộm lên cốc đặt phiến kính lên Đặt nhẹ mẫu giấy thấm lên phiến kính để giữ thuốc nhuộm lại phiến kính B3: Phủ phiến kính với thuốc nhuộm lục malachite hơ nƣớc vòng phút Tiếp tục thêm thuốc nhuộm để tránh tình trạng thuốc nhuộm bị khơ phiến kính Rửa nƣớc 30 giây B4: Nhuộm lại với safranin 30 giây rửa lại với nƣớc 30 giây B5: Thấm khơ phiến kính với giấy thấm quan sát kính hiển vi dƣới vật kính X100 sử dụng giọt dầu B6: Quan sát ghi nhận lại kết quả: Tế bào sinh dƣỡng có màu hồng, bào tử bắt màu xanh Phụ lục 4: Bảng tổng hợp kết phân tích Nội dung 2: Tuyển chọn số vi sinh vật có khả chuyển hóa số chất nhiễm bùn thải ao ni tơm Thí nghiệm 6: Xác định khả hấp thu kim loại nặng Bảng 4.1 àm lƣợng Pb cịn lại dịch ni chủng vi khuẩn Lặp lại Lặp lại Lặp lại Kí hiệu chủng Abs Pb (mg/kg) Abs Pb (mg/kg) Abs Pb (mg/kg) V23 0,4579 2,99 0,3543 2,81 0,3165 2,52 V24 0,4924 3,79 0,4064 3,37 0,2594 3,19 V37 0,2938 5,3 0,2939 5,36 0,3086 5,04 V39 0,6151 4,27 0,2663 4,28 0,286 4,1 V41 0,1705 5,57 0,4494 5,89 0,3098 5,64 B21 0,5274 7,06 0,534 7,9 0,1145 6,62 B24 0,1502 4,78 0,6583 4,71 0,2622 4,66 B26 0,1593 10,37 0,1625 10,5 0,1554 9,92 Bảng 4.2 Kí hiệu chủng àm lƣợng Cu cịn lại dịch ni chủng vi khuẩn Lặp lại Abs Cu (mg/kg) V23 0,0471 V24 Lặp lại Lặp lại Abs Cu (mg/kg) Abs Cu (mg/kg) 3,13 0,0438 3,01 0,0449 3,24 0,5698 41,2 0,6002 45,2 0,6088 44,1 V39 0,4233 29,3 0,4164 29 0,4124 29,4 V41 0,3683 25,4 0,358 24,9 0,3724 25,2 Bảng 4.3 àm lƣợng Zn lại dịch ni chủng vi khuẩn Kí hiệu chủng Lặp lại Abs Lặp lại Lặp lại Zn (mg/kg) Abs Zn (mg/kg) Abs Zn (mg/kg) V23 0,1188 2,31 0,119 2,35 0,0859 2,12 V24 0,5667 16,4 0,5585 16,2 0,5708 16,7 V39 0,0889 2,21 0,085 2,09 0,0858 2,14 V41 0,0673 1,67 0,0754 1,79 0,0696 1,64 B26 0,2202 22,2 0,209 22 0,2131 22,2 Bảng 4.4 Kí hiệu chủng àm lƣợng Pb cịn lại dịch ni chủng nấm men Lặp lại Lặp lại Lặp lại Abs Pb (mg/kg) Abs Pb (mg/kg) Abs Pb (mg/kg) N3 0,3714 14,07 0,3911 14,65 0,3957 14,81 N10 0,3699 13,79 0,3641 13,72 0,3823 6,14 N12 0,1653 10,71 0,1705 10,8 0,3169 5,73 S1 0,3089 11,23 0,3084 11,22 0,6172 12,07 Bảng 4.5 Kí hiệu chủng àm lƣợng Cu cịn lại dịch ni chủng nấm men Lặp lại Lặp lại Lặp lại Abs Cu (mg/kg) Abs Cu (mg/kg) Abs Cu (mg/kg) N3 0,3513 23,6 0,3037 20,2 0,3527 24,3 N10 0,3944 27,3 0,4084 28,1 0,4079 28 N12 0,3917 26,2 0,3779 26,4 0,3731 25,7 Bảng 4.6 Kí hiệu chủng àm lƣợng Zn cịn lại dịch ni chủng nấm men Lặp lại Lặp lại Lặp lại Abs Zn (mg/kg) Abs Zn (mg/kg) Abs Zn (mg/kg) N3 0,2265 23,2 0,2322 24 0,2356 24,4 N10 0,5637 16 0,5662 16,4 0,5614 15,9 N12 0,2329 23,3 0,2356 24,4 0,2307 23,7 Bảng 4.7 àm lƣợng Pb cịn lại dịch ni chủng xạ khuẩn LL1 LL2 LL3 Kí hiệu chủng Abs Pb (mg/kg) Abs Pb (mg/kg) Abs Pb (mg/kg) X3 0,3813 0,29 0,3418 0,25 0,3749 0,24 X11 0,5599 0,38 0,3417 0,22 0,4256 0,32 X15 0,5674 3,83 0,3157 4,01 0,2866 2,39 X17 0,174 0,1 0,2466 0,15 0,1654 0,1