Phân lập, đánh giá và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng oxy hóa ammonium từ bùn đáy áo nuôi tôm hải phòng

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP, ĐÁNH GIÁ VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG OXY HÓA AMMONIUM TỪ BÙN ĐÁY AO NI TƠM HẢI PHỊNG HÀ NỘI - 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP, ĐÁNH GIÁ VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG OXY HÓA AMMONIUM TỪ BÙN ĐÁY AO NI TƠM HẢI PHỊNG Sinh viên thực : VŨ THỊ THU THOAN Lớp : K63 CNSHC Mã sinh viên : 637277 Giảng viên hướng dẫn : PSG TS NGUYỄN VĂN GIANG HÀ NỘI-2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi, Vũ Thị Thu Thoan xin cam đoan: Đề tài nghiên cứu khoa học: “Phân lập, đánh giá tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả oxy hóa ammonium từ bùn đáy ao ni tơm Hải Phịng” tơi thực từ tháng 3/2022 đến tháng 9/2022 hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Văn Giang – Giảng viên Bộ môn Công nghệ Vi sinh – Khoa Công nghệ Sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam Số liệu kết nghiên cứu đề tài hoàn tồn trung thực, chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khoa học nước quốc tế Các tài liệu tham khảo trích dẫn rõ ràng Mọi giúp đỡ cảm ơn Hà Nội, ngày , tháng 9, năm 2022 Sinh viên thực Vũ Thị Thu Thoan i LỜI CẢM ƠN Sau thời gian thực tập Bộ môn Công nghệ Vi sinh – Khoa Công nghệ Sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, quan tâm, giúp đỡ thầy cô giáo, anh chị, bạn bè phịng thí nghiệm mơn, nỗ lực, cố gắng thân, hồn thành khóa luận tốt nghiệp Trước tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Văn Giang, Giảng viên cao cấp Bộ môn Công nghệ Vi sinh tận tình hướng dẫn, bảo, động viên tinh thần, cung cấp tài liệu, thông tin khoa học cần thiết, liên quan đến đề tài cho Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến tập thể cán làm việc phịng thí nghiệm Bộ mơn Cơng nghệ Vi sinh tạo điều kiện, quan tâm giúp đỡ suốt q trình nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn vơ hạn tới công sinh thành, dưỡng dục bố mẹ Cảm ơn gia đình người bạn thân ln bên, tiếp thêm động lực, nguồn cổ vũ lớn lao cho suốt thời gian qua Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày , tháng 9, năm 2022 Sinh viên thực Vũ Thị Thu Thoan ii TÓM TẮT Hiện nay, nitơ trở thành nguyên tố gây nhiễm nước sơng, hồ tượng phú dưỡng ven biển Ammonium - trạng thái tồn nitơ môi trường nước nguyên nhân gây thiệt hại nuôi trồng thủy sản Ammonium chất độc lồi động vật có xương sống, nồng độ cao gây mê, co giật, chí tử vong Chính thế, nghiên cứu phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn oxy hóa ammonium địa hy vọng tìm giải pháp làm giảm nồng độ ammonium cải thiện chất lượng nước Từ 02 mẫu bùn đáy 01 mẫu nước ao nuôi tôm thu thôn Lộc Xá, xã Đồn Xá, huyện Kiến Thụy, Hải Phịng phân lập 23 chủng vi khuẩn có khả oxy hóa ammonium mơi trường khống đặc hiệu Khả oxy hóa ammonium chủng vi khuẩn phân lập đánh giá phương pháp so màu định lượng NH4+ tiêu thụ NO2- sinh Bốn chủng vi khuẩn có khả oxy hóa ammonium cao HP 1.1, HP 2.9, HP 2.11 HP 3.4 chọn lọc để nghiên cứu đặc điểm sinh lí, sinh hóa ảnh hưởng điều kiện ni cấy (pH, nguồn carbon, thời gian nuôi cấy, điều kiện sục khí) đến khả loại bỏ ammonium Kết nghiên cứu cho thấy, hầu hết chủng vi khuẩn sinh trưởng phát triển tốt, cho hiệu chuyển hóa tối ưu pH 7, nguồn carbon NaHCO3, thời gian nuôi cấy ngày, điều kiện sục khí Kết góp phần bổ sung thơng tin nhóm vi khuẩn hữu ích phục vụ ni trồng thủy sản, có tiềm ứng dụng taọ chế phẩm sinh học xử lí nước ao ni iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ẢNH ix PHẦN 1: MỞ ĐẦU .1 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Mục đích đề tài .3 1.3 Yêu cầu đề tài 1.4 Ý nghĩa đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4 2.1 Ammonium tự nhiên .4 2.1.1 Tổng quan chu trình nitơ 2.1.2 Quá trình cố định nitơ sinh học 2.1.3 Quá trình nitrate hóa 2.2 Tính chất vật lý hóa học ammonium 2.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới trình oxy hóa ammonium .8 2.3.1 Nồng độ oxy hòa tan 2.3.2 Nhiệt độ 2.3.3 pH môi trường 2.3.4 Độc tính 10 2.4 Ảnh hưởng ammonium đến sinh lí khả miễn dịch tơm 10 2.5 Tổng quan vi khuẩn oxy hóa ammonium 13 2.5.1 Giới thiệu vi khuẩn oxy hóa ammonium 13 iv 2.5.2 Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn oxy hóa ammonium điển hình 16 2.6 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn có khả oxy hóa ammonium giới nước 19 2.6.1 Tình hình nghiên cứu giới 19 2.6.2 Tình hình nghiên cứu nước 21 PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 23 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 23 3.2 Đối tượng nghiên cứu 23 3.3 Vật liệu thí nghiệm 23 3.3.1 Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm 23 3.3.2 Hóa chất 24 3.4 Phương pháp nghiên cứu 27 3.4.1 Phương pháp định lượng ammonium nước 27 3.4.2 Phương pháp định lượng nitrite nước 27 3.5 Nội dung nghiên cứu 28 3.5.1 Phân lập, ni cấy chủng vi khuẩn có khả oxy hóa ammonium từ bùn đáy ao ni tơm Hải Phòng 28 3.5.2 Đánh giá khả oxy hóa ammonium dòng vi khuẩn phân lập 29 3.5.3 Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn tuyển chọn 32 3.5.4 Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến khả oxy hóa ammonium chủng vi khuẩn tuyển chọn 36 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 4.1 Phân lập chủng vi khuẩn có khả oxy hóa ammonium 38 4.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả oxy hóa ammonium 40 4.2.1 Kết dựng đường chuẩn NH4+ 41 4.2.2 Kết dựng đường chuẩn NO2- 41 4.2.3 Khả oxy hóa ammonium chủng vi khuẩn phân lập 42 v 4.3 Nghiên cứu đặc điểm hóa sinh số chủng vi khuẩn tuyển chọn 44 4.4 Khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào chủng vi khuẩn tuyển chọn 46 4.5 Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến khả oxy hóa ammonium 48 4.5.1 Ảnh hưởng pH 48 4.5.2 Ảnh hưởng nguồn carbon vô 50 4.5.3 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 52 4.5.4 Ảnh hưởng chế độ sục khí 53 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 5.1 Kết luận 55 5.2 Kiến nghị 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC 63 vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ viết đầy đủ amo Ammonia monooxygenase AOB Ammonium oxidizing bacteria BCG Bromocresol green BOD Biochemical oxygen demand BTB Bromothymol blue DNA Deoxyribonucleic acid DO Dissolved oxygen FAO Food and Agriculture Organization FISH Fluorescent in situ hybridization ISO International Organization for Standardization LB Luria and Bertani MNP Most probable number MO Methyl orange MR Methyl red NED N-1-Naphthyl ethylendiamine PCR Polymerase chain reaction PhR Phenol red RNA Ribonucleic acid RuBisCO Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase-oxygenase SCA Simmon citrate agar TAN Total ammonia nitrogen TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam VP Voges-Proskauer vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Một số đặc điểm chọn lọc đại diện điển hình thuộc nhóm vi khuẩn nitrat hóa tự dưỡng 13 Bảng 2: Sự khác biệt chi nhóm vi khuẩn oxy hóa ammonium tự dưỡng 15 Bảng 1: Các hóa chất sử dụng nghiên cứu 24 Bảng 2: Thành phần thuốc thử nồng độ NH4+ để dựng đường chuẩn 30 Bảng 3: Thành phần thuốc thử nồng độ NO2- để dựng đường chuẩn 31 Bảng 1: Kết phân lập vi khuẩn có khả oxy hóa ammonium 39 Bảng 2: Đặc điểm sinh hóa tế bào vi khuẩn tuyển chọn 44 Bảng 3: Hoạt tính enzyme ngoại bào chủng vi khuẩn tuyển chọn (đơn vị: mm) 47 viii Kết nghiên cứu tương đồng với kết Hoàng Phương Hà cs (2008) Rất mơi trường dịch thể, NaHCO3 chất dễ phân li tạo thành CO2 H2O, nên vi khuẩn dễ dàng sử dụng Đặc biệt q trình oxy hóa ammonium tạo H+, làm giảm pH mơi trường Chính sử dụng muối bicarbonat cịn đóng vai trị chất đệm, giúp điều chỉnh pH môi trường, lí tưởng cho mơi trường sống vi khuẩn (Campos & cs., 1999; Ruiz & cs., 2003) 4.5.3 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy Việc nghiên cứu xác định thời gian nuôi cấy chủng vi khuẩn để hiệu oxy hóa ammoniumum đạt cao quan trọng Thời gian hệ hay thời gian phân chia ngắn nhóm vi khuẩn oxy hóa ammonium (Spieck & Bock, 2005), nhiên hầu hết nhóm vi khuẩn biết đến cần vài ngày vài tuần để thực trình tự nhiên Điều phụ thuộc chủ yếu vào loại chất nền, lượng oxy có đất nước, nhiệt độ, độ pH (Spieck & Bock, 2005; Werner & Newton, 2005) 0.900 0.120 0.100 0.700 0.600 0.080 0.500 0.060 0.400 0.300 0.040 0.200 0.020 0.100 0.000 0.000 days days days 10 days 12 days Thời gian nuôi cấy 14 days NH4+ HP 1.1 NH4+ HP 2.9 NH4+HP 2.11 NH4+ HP 3.4 NO2- HP 1.1 NO2- HP 2.9 NO2- HP 2.11 NO2- HP 3.4 Nồng độ NO2- sinh (mg/L) Nồng độ NH4+ tiêu thụ (mg/L) 0.800 Hình 16: Đồ thị hàm lượng NH4+ tiêu thụ NO2- sinh bốn chủng vi khuẩn tuyển chọn mốc thời gian 4, 6, 8, 10, 12, 14 ngày nuôi cấy Các chủng vi khuẩn tuyển chọn ni cấy mơi trường khống lỏng AOB (Spieck & Bock, 2005) xác định hàm lượng NH4+ tiêu thụ 52 NO2- sinh mốc thời gian ngày, ngày, ngày, 10 ngày, 12 ngày 14 ngày Kết đồ thị hình 4.16 cho thấy, khả loại bỏ NH4+ chủng vi khuẩn tăng dần từ ngày thứ đến ngày thứ đạt giá trị cao ngày thứ (HP 1.1 đạt 0,673 mg/L, HP 2.9 đạt 0,539 mg/L, HP 2.11 đạt 0,637 mg/L, HP 3.4 đạt 0,743 mg/L) Hầu hết lượng NH4+ tiêu thụ giảm dần từ ngày thứ trở Kết phù hợp với nghiên cứu Rodríguez cs (2017) (Rodríguezrodríguez & cs., 2017) Ở giai đầu, vi khuẩn phát triển mạnh nên khả loại bỏ NH4+ có chiều hướng tăng dần Khi trình oxy hóa NH4+ diễn liên tục thời gian dài khiến cho pH môi trường giảm dần, lượng oxy hòa tan cạn kiệt khiến cho tốc độ sinh trưởng nhóm vi khuẩn bị ức chế Chính mà khả loại bỏ NH4+ giảm 4.5.4 Ảnh hưởng chế độ sục khí Oxy hịa tan nhu cầu bắt buộc cho q trình oxy hóa ammonium Theo lí thuyết, để oxy hóa mg N-NH3 cần khoảng 3,43 mg oxy hòa tan Hoạt tính oxy hóa ammonium bị ức chế hồn tồn nồng độ oxy hịa tan thấp 0,2 mg/L Hơn nữa, DO thấp thời gian dài cịn làm giảm phong phú nhóm vi khuẩn oxy hóa ammonium lên đến 28% (Liu & cs., 2021) Ba chế độ sục khí khác sử dụng nghiên cứu để đánh giá ảnh hưởng yếu tố đến khả oxy hóa ammonium chủng vi khuẩn tuyển chọn Nồng độ tiếp giống ban đầu 5% Nghiệm thức đối chứng tương ứng với chế độ sục khí nước ao ni tôm không bổ sung dịch vi khuẩn Chế độ (CT1): bình thí nghiệm sục khí liên tục ngày Chế độ (CT2): bình thí nghiệm sục khí gián đoạn giờ/2 lần/ngày ngày Chế độ (CT3): bình thí nghiệm để tĩnh ngày Các chủng vi khuẩn nuôi môi trường nước ao nuôi tôm, lấy Khoa Thủy sản – Học viện Nông nghiệp Việt Nam Nồng độ NH4+ 53 đo mẫu nước ban đầu 1,20 ± 0,001 mg/L Sau ngày thí nghiệm, tiến hành thu mẫu nước để xác định hiệu suất oxy hóa ammonium bốn chủng vi khuẩn tuyển chọn chế độ sục khí khác Kết thể đồ thị sau: Hiệu suất oxy hóa NH4+ (%) 70.00 60.00 50.00 40.00 NH4+ - CT 30.00 NH4+ - CT 20.00 NH4+ - CT 10.00 0.00 HP 1.1 HP 2.9 HP 2.11 HP 3.4 Chủng vi khuẩn Hình 17: Ảnh hưởng chế độ sục khí đến hiệu suất oxy hóa ammonium bốn chủng vi khuẩn tuyển chọn Kết thể hình 4.17 cho thấy tốc độ loại bỏ NH4+ chủng vi khuẩn tuyển chọn điều kiện sục khí cao hẳn so với chế độ tĩnh Sau ngày ni cấy, chế độ sục khí liên tục - CT 1, hiệu suất oxy hóa hầu hết chủng vi khuẩn đạt 50% (HP 1.1 đạt 57,19 %, chủng HP 2.9 đạt 62,58%, chủng HP 2.11 đạt 52,34%, chủng 3.4 đạt 48,53%) Trong đó, chế độ tĩnh – CT 3, hiệu suất oxy hóa bốn chủng đạt 30,27%, 27,84%, 30,06%, 37,34%; giảm đáng kể so với CT1 Ở chế độ CT2 - sục khí gián đoạn, chủng vi khuẩn cho hiệu oxy hóa tương đối cao (HP 1.1 đạt 49,87%, HP 2.9 đạt 35,85%, HP 2.11 đạt 34,45%, HP 3.4 đạt 51,41%) Việc sục khí chế độ hay cường độ khác coi thơng số xác định tiềm oxy hóa ammonium (Insel & cs., 2005) Kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu Lê Thanh Huyền cs (2014), Yang cs (2015) (Lê Thanh Huyền & cs., 2014; Yang Lei & cs., 2015) 54 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ 02 mẫu bùn đáy 01 mẫu nước ao nuôi tôm lấy thơn Lộc Xá, xã Đồn Xá, huyện Kiến Thụy, Hải Phòng phân lập 23 chủng vi khuẩn có khả oxy hóa ammonium Lượng NH4+ tiêu thụ 23 chủng vi khuẩn sau ngày nuôi cấy dao động từ 0,181 – 0,473 mg/L Đã chọn chủng có khả loại bỏ NH4+ cao mẫu HP 1.1, HP 2.9, HP 2.11, HP 3.4 Khả oxy hóa ammonium chủng vi khuẩn tuyển chọn tăng dần từ ngày thứ đến ngày thứ đạt cao ngày thứ 8, sau giảm dần pH nguồn carbon vơ thích hợp cho sinh trưởng phát triển dòng vi khuẩn tuyển chọn pH NaHCO3, điều kiện sục khí Kết nhuộm Gram cho thấy chủng HP 1.1, HP 2.9 HP 2.11 Gram âm, riêng chủng HP 3.4 cho kết nhuộm Gram dương Cả bốn chủng cho kết dương tính với phản ứng catalase phản ứng MR, cho kết âm tính với phản ứng indol Hai chủng vi khuẩn HP 2.9 HP 2.11 có khả di động dương tính với phản ứng VP Khảo sát khả sử dụng citrate, kết cho thấy có chủng HP 2.9 có khả sử dung citrate nguồn carbon 5.2 Kiến nghị Sử dụng kĩ thuật sinh học phân tử để định danh dòng vi khuẩn tuyển chọn Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh nhằm ứng dụng xử lí nước ao ni trồng thủy sản 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bùi Thế Vinh, Hà Thanh Toàn & Diệp C N (2011) Phân lập nhận diện vi khuẩn chuyển hóa nitơ từ chất thải trại ni bị sữa, chất thải sữa ứng dụng xử lý nước thải nhà máy sản xuất sữa Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ (18a): 194-200 Csi (2020) Báo cáo ngành thủy sản Việt Nam Đỗ Quang Trung, Trần Thị Tuyết Thu & Anh L T (2022) Vi khuẩn Bacillus sp nội sinh phân lập từ cỏ mần trầu (eleusine indica) cải thiện hiệu khả loại bỏ amoni nước ni tơm Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 20(3): 359-369 Hồng Phương Hà & Cúc N T K (2010) Một số tính chất sinh học bốn chủng vi khuẩn nitrate hóa phân lập Hà Nội Lê Thanh Huyền, Đào Ánh Tuyết & Đỗ Mạnh Hào (2014) Một số đặc điểm chủng vi khuẩn oxy hóa amonium phân lập từ vùng ven biển Hải Phịng Tạp chí Khoa học Công nghệ biển 14(3A): 152-158 Nguyễn Hữu Đồng, Nguyễn Thị Việt, Đinh Thị Thu Hằng, Phan Đỗ Hùng, Nguyễn Quang Lịch & Duân T H (2019) Khả nitrit hóa amoni chủng vi khuẩn Pseudomoonas Aeruginosa HT1 phân lập từ nước thải sau biogas trang trại chăn ni lợn Hà Tĩnh Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Nông nghiệp phát triển nông thôn 128(3C): 119– 132 Nguyễn Văn Minh, Dương Nhật Linh, Võ Ngọc Yến Nhi & Tin H X (2012) Phân lập sàng lọc vi khuẩn nitrat hóa để xử lí nước ni trồng thủy sản Tạp chí KHoa học Công nghệ, Trường Đại học Mở-TP HCM 7(1): 31-38 Phạm Thị Tuyết Ngân, Vũ Hùng Hải, Huỳnh Trường Giang & Út V N (2021) Phân lập tuyển chọn vi khuẩn chuyển hóa đạm từ bùn đáy ao cá tra (Pangsianodon hypophthalmus) Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nông thôn (8): 77-83 56 Tài liệu tiếng Anh Abad Rodríguez Rodríguez S M I., Lilliana Piedra Castro, Ricardo Jiménez & Vargas M J P H (2017) Isolation of ammonium- and nitriteoxidizing bacterial strains from soil, and their potential use in the reduction of nitrogen in household waste water 65(4): 1527-1539 Allan M a H (1990) Acute and chronic toxicity of ammonia to juvenile Metapenaeus macleayi and Penaeus monodon and the influence of low dissolved-oxygen levels 91(3): 265-280 Artha O., Pramono H & Sari L (2019) Identification of extracellular enzyme-producing bacteria (proteolytic, cellulolytic, and amylolytic) in the sediment of extensive ponds in Tanggulrejo, Gresik Balouiri M., Sadiki M & Ibnsouda S K (2016) Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review Journal of pharmaceutical analysis 6(2): 71-79 Beccari M., Di Pinto A., Ramadori R & Tomei M (1992) Effects of dissolved oxygen and diffusion resistances on nitrification kinetics Water Research 26(8): 1099-1104 Bhaskar K V & Charyulu P (2005) Effect of environmental factors on nitrifying bacteria isolated from the rhizosphere of Setaria italica (L.) Beauv African Journal of Biotechnology 4(10): 1145-1146 Bock E., Koops H.-P., Ahlers B & Harms H (1992) Oxidation of inorganic nitrogen compounds as energy source The Prokaryotes (Ed 2): 414-430 Bothe H., Ferguson S & Newton W E (2006) Biology of the nitrogen cycle Elsevier 14-15 Bouwman A F., Pawłowski M., Liu C., Beusen A H., Shumway S E., Glibert P & Overbeek C (2011) Global hindcasts and future projections of coastal nitrogen and phosphorus loads due to shellfish and seaweed aquaculture Reviews in Fisheries Science 19(4): 331-357 10.Brenner D J., Krieg N R., Staley J T & Garrity Sc D 2005 GM, Boone DR, De Vos P, Goodfellow M, Rainey FA, Schleifer KH, editors Bergey's Manual® of Systematic Bacteriology, Volume 2: The proteobacteria, Part B: The gammaproteobacteria Berlin: Springer 11.Campos J., Garrido-Fernandez J., Mendez R & Lema J (1999) Nitrification at high ammonia loading rates in an activated sludge unit Bioresource Technology 68(2): 141-148 12.Chankaew S., Sompong O & Sangnoi Y (2018) Nitrogen removal efficiency of salt-tolerant heterotrophic nitrifying bacteria 13.Chen J., Xu J., Zhang S., Liu F., Peng J., Peng Y & Wu J (2021) Nitrogen removal characteristics of a novel heterotrophic nitrification and aerobic denitrification bacteria, Alcaligenes faecalis strain WT14 Journal of Environmental Management 282: 111961 14.Chen J C & Lei S C J J o t W A S (1990) Toxicity of ammonia and nitrite to Penueus monodon juveniles 21(4): 300-306 57 15.Chen S., Ling J & Blancheton J.-P (2006) Nitrification kinetics of biofilm as affected by water quality factors Aquacultural engineering 34(3): 179-197 16.Colt J E & Armstrong D (1981) Nitrogen toxicity to crustaceans, fish, and molluscs 17.Cui Y., Ren X., Li J., Zhai Q., Feng Y., Xu Y & Ma L (2017) Effects of ammonia-N stress on metabolic and immune function via the neuroendocrine system in Litopenaeus vannamei Fish & Shellfish Immunology 64: 270-275 18.Dobler L J., Gibbons J M & Evtodienko V Y 2006 Quick acting toxic ammonia test for aqueous samples Google Patents 19.Downing A (1964) Effect of inhibitors on nitrification in the activatedsludge process J Proc Inst Purif.: 537-637 20.Eaton C., & Greenberg (1995) Standard Methods for Examination of Water Wastewater by Lenore S Clescerl, Arnold E Greenberg, Andrew D Eaton 21.Elbanna K., El-Shahawy R & Atalla K (2012) A new simple method for the enumeration of nitrifying bacteria in different environments Plant, Soil and Environment 58(1): 49-53 22.Fao (2020) The State of World Fisheries and Aquaculture 2020 5-6 23.Fiencke C., Spieck E & Bock E (2005) Nitrifying bacteria Trong: Nitrogen fixation in agriculture, forestry, ecology, and the environment Springer: 255-276 24.Frankland P F & Frankland G C (1890) V The nitrifying process and its specific ferment.—Part I Philosophical Transactions of the Royal Society of London.(B.) (181): 107-128 25.Giomi F & Beltramini M (2007) The molecular heterogeneity of hemocyanin: its role in the adaptive plasticity of Crustacea Gene 398(12): 192-201 26.He T., Xie D., Li Z., Ni J & Sun Q (2017) Ammonium stimulates nitrate reduction during simultaneous nitrification and denitrification process by Arthrobacter arilaitensis Y-10 Bioresource Technology 239: 66-73 27.Hoang P H., Nguyen H T., Tran T T., Tran T T., Do L P & Le T N C (2016) Isolation and selection of nitrifying bacteria with high biofilm formation for treatment of ammonium polluted aquaculture water Journal of Vietnamese Environment 8(1): 33-40 28.Insel G., Artan N & Orhon D (2005) Effect of aeration on nutrient removal performance of oxidation ditch systems Environmental engineering science 22(6): 802-815 29.Jain A., Soni S & Verma K K (2021) Combined liquid phase microextraction and fiber-optics-based cuvetteless microspectrophotometry for sensitive determination of ammonia in water and food samples by the indophenol reaction Food chemistry 340: 128156 58 30.Jayamohan S., Ohgaki S & Hanaki K (1988) Effect of DO on kinetics of nitrification Water supply 6(3): 141-150 31.Kathyayani S A., Poornima M., Sukumaran S., Nagavel A & Muralidhar M (2019) Effect of ammonia stress on immune variables of Pacific white shrimp Penaeus vannamei under varying levels of pH and susceptibility to white spot syndrome virus Ecotoxicology and environmental safety 32.Koops H.-P., Purkhold U., Pommerening-Röser A., Timmermann G & Wagner M (2005) The lithoautotrophic ammonia-oxidizing bacteria Bergey’s manual of systematic bacteriology, volume two: the proteobacteria, part A introductory essays, Springer 141-147 33.Lee Y.-W., Ong S.-K & Sato C (1997) Effects of heavy metals on nitrifying bacteria Water Science and Technology 36(12): 69-74 34.Li Y., Zhou F., Huang J., Yang L., Jiang S., Yang Q., He J & Jiang S (2018) Transcriptome reveals involvement of immune defense, oxidative imbalance, and apoptosis in ammonia-stress response of the black tiger shrimp (Penaeus monodon) Fish & Shellfish Immunology 83: 162-170 35.Liu G., Wu X., Li D., Jiang L., Huang J & Zhuang L (2021) Long-Term Low Dissolved Oxygen Operation Decreases N(2)O Emissions in the Activated Sludge Process Environ Sci Technol 55(10): 6975-6983 36.Lou F., Gao T & Han Z (2019) Effect of salinity fluctuation on the transcriptome of the Japanese mantis shrimp Oratosquilla oratoria International journal of biological macromolecules 140: 1202-1213 37.Lu X., Kong J., Luan S., Dai P., Meng X., Cao B & Luo K (2016) Transcriptome analysis of the hepatopancreas in the Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) under acute ammonia stress PloS one 11(10): e0164396 38.Madigan M T., Martinko J & Parker J (2003) Brock Biología de los microorganismos 12 ed Editorial Pearson Prentice Hall Iberia, Madrid Pp 1064 39.Mcdevitt S (2009a) Methyl Red and Voges Proskauer Test Protocols 40.Mcdevitt S (2009b) Methyl red and voges-proskauer test protocols American Society for Microbiology 41.Meiklejohn J (1950) The isolation of Nitrosomonas europaea in pure culture Microbiology 4(2): 185-191 42.Mével G & Prieur D (2000) Heterotrophic nitrification by a thermophilic Bacillus species as influenced by different culture conditions Can J Microbiol 46(5): 465-73 43.Naqvi A A., Adhikari S., Pillai B R & Sarangi N (2007) Effect of ammonia‐N on growth and feeding of juvenile Macrobrachium rosenbergii (De‐Man) Aquaculture Research 38(8): 847-851 44.Poole C 2020 Handbooks in separation science: Liquid-phase extraction New York: Elsevier 45.Qiu L., Shi X., Yu S., Han Q., Diao X & Zhou H (2018) Changes of ammonia-metabolizing enzyme activity and gene expression of two 59 strains in shrimp Litopenaeus vannamei under ammonia stress Frontiers in physiology 9: 211 46.Reiner K (2010) Catalase Test Protocol 47.Rittmann B E & Mccarty P L (2001) Environmental biotechnology: principles and applications McGraw-Hill Education trang trang 48.Rodríguezrodríguez A., Mauinchaustegui S., Piedracastro L., Jiménezmontealegre R & Herreravargas J (2017) Isolation of ammonium-and nitrite-oxidizing bacterial strains from soil, and their potential use in the reduction of nitrogen in household waste water Revista de Biología Tropical 65(4): 1527-1539 49.Roger N Reeve (2002) Introduction to enviromental anlysis 50.Ruiz G., Jeison D & Chamy R (2003) Nitrification with high nitrite accumulation for the treatment of wastewater with high ammonia concentration Water Research 37(6): 1371-1377 51.Salma U., Uddowla M H., Kim M., Kim J M., Kim B K., Baek H.-J., Park H., Mykles D L & Kim H.-W (2012) Five hepatopancreatic and one epidermal chitinases from a pandalid shrimp (Pandalopsis japonica): cloning and effects of eyestalk ablation on gene expression Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology 161(3): 197-207 52.Schloesing T & Muntz A (1877) Sur la nitrification par les ferments organises CR Acad Sci 84: 301-3 53.Sharma B & Ahlert R (1977) Nitrification and nitrogen removal Water Research 11(10): 897-925 54.Singh R., Kumar M., Mittal A & Mehta P K (2016) Microbial enzymes: industrial progress in 21st century Biotech 6(2): 1-15 55.Soliman M & Eldyasti A (2018) Ammonia-Oxidizing Bacteria (AOB): opportunities and applications—a review Reviews in Environmental Science and Bio/Technology 17(2): 285-321 56.Solorzano L (1969) Determination of ammonia in natural waters by the phenolhypochlorite method 1 This research was fully supported by US Atomic Energy Commission Contract No ATS (11‐1) GEN 10, PA 20 Limnology and oceanography 14(5): 799-801 57.Soriano S & Walker N (1968) Isolation of ammonia‐oxidizing autotrophic bacteria Journal of Applied Bacteriology 31(4): 493-497 58.Spieck E & Bock E J T l n.-o b B s M o S B (2005) The Proteobacteria, Part Introductory Essays 149-153 59.Stenstrom M K & Poduska R A (1980) The effect of dissolved oxygen concentration on nitrification Water Research 14(6): 643-649 60.Tajer A (2016) What’s the function of nitrogen (n) in plants Diunduh dari www greenwaybiotech com 61.Teske A., Alm E., Regan J., Toze S., Rittmann B & Stahl D (1994) Evolutionary relationships among ammonia-and nitrite-oxidizing bacteria Journal of bacteriology 176(21): 6623-6630 60 62.Wang J & Chu L (2016) Biological nitrate removal from water and wastewater by solid-phase denitrification process Biotechnology advances 34(6): 1103-1112 63.Ward B B., Arp D J & Klotz M G (2011) Nitrification American Society for Microbiology Press trang trang 64.Warington R (1879) XLIX.—On nitrification.(Part II.) Journal of the Chemical Society, Transactions 35: 429-456 65.Werner D & Newton W E (2005) Nitrogen fixation in agriculture, forestry, ecology, and the environment (4) Springer Science & Business Media trang trang 66.Whitfield M (1978) The hydrolysis of ammonium ions in sea waterexperimental confirmation of predicted constants at one atmosphere pressure Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom 58(3): 781-786 67.Williams M P M (2009a) Citrate test protocol 68.Williams M P M (2009b) Indol test protocol 69.Winogradsky S (1890) Recherches sur les organisms de la nitrification Ann Inst Pasteur 4: 213-231,257-275,760-771 70.Xiao J., Li Q.-Y., Tu J.-P., Chen X.-L., Chen X.-H., Liu Q.-Y., Liu H., Zhou X.-Y., Zhao Y.-Z & Wang H.-L (2019) Stress response and tolerance mechanisms of ammonia exposure based on transcriptomics and metabolomics in Litopenaeus vannamei Ecotoxicology and environmental safety 180: 491-500 71.Yang L., Ren Y.-X., Zhao S.-Q., Liang X & Wang J.-p (2015) Isolation and characterization of three heterotrophic nitrifying-aerobic denitrifying bacteria from a sequencing batch reactor Annals of Microbiology 66(2): 737-747 72.Yang X.-P., Wang S.-M., Zhang D.-W & Zhou L.-X (2011) Isolation and nitrogen removal characteristics of an aerobic heterotrophic nitrifying–denitrifying bacterium, Bacillus subtilis A1 Bioresource Technology 102(2): 854-862 73.Yue F., Pan L., Xie P., Zheng D & Li J (2010) Immune responses and expression of immune-related genes in swimming crab Portunus trituberculatus exposed to elevated ambient ammonia-N stress Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology 157(3): 246-251 74.Yulong Chen, Wenyong Tan & Yang D (2015) Isolation and identification of nitrite oxidizing Asian Agrcultural Reseach 7(6): 94-96 75.Zhang D., Su H., Antwi P., Xiao L., Liu Z & Li J (2019) High-rate partial-nitritation and efficient nitrifying bacteria enrichment/out-selection via pH-DO controls: Efficiency, kinetics, and microbial community dynamics Science of the Total Environment 692: 741-755 76.Zhou K., Zhou F., Huang J., Yang Q., Jiang S., Qiu L., Yang L., Zhu C & Jiang S (2017) Characterization and expression analysis of a chitinase 61 gene (PmChi-4) from black tiger shrimp (Penaeus monodon) under pathogen infection and ambient ammonia nitrogen stress Fish & Shellfish Immunology 62: 31-40 77.Zou E & Bonvillain R (2004) Chitinase activity in the epidermis of the fiddler crab, Uca pugilator, as an in vivo screen for molt-interfering xenobiotics Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology 139(4): 225-230 62 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Giá trị đo OD 640 mn ống nghiệm dựng đường chuẩn NH4+ Phụ lục 2: Giá trị đo OD 543 nm ống nghiệm dựng đường chuẩn NO2Ống nghiệm ĐC Nồng độ NO2- (mg/L) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 OD543nm 0.068 0.145 0.236 0.305 0.408 63 Phụ lục 3: Kết xác định khả oxy hóa ammonium chủng vi khuẩn phân lập sau ngày nuôi cấy STT Tên mẫu NH4 + tiêu thụ Hiệu suất oxy hóa NO2- sinh (mg/L) (%) (mg/L) HP 1.1 0.450 30.02 0.068 HP 1.2 0.421 28.13 0.057 HP 1.3 0.343 22.89 0.043 HP 1.4 0.340 22.68 0.040 HP 1.5 0.181 12.06 0.023 HP 1.6 0.213 14.25 0.029 HP 2.1 0.308 20.57 0.047 HP 2.2 0.346 23.11 0.045 HP 2.3 0.214 14.32 0.025 10 HP 2.4 0.241 16.06 0.027 11 HP 2.5 0.323 21.59 0.030 12 HP 2.6 0.340 22.68 0.034 13 HP 2.7 0.335 22.39 0.031 14 HP 2.8 0.417 27.84 0.050 15 HP 2.9 0.441 29.44 0.058 16 HP 2.10 0.395 26.38 0.016 17 HP 2.11 0.438 29.22 0.055 18 HP 3.1 0.403 26.89 0.041 19 HP 3.2 0.362 24.20 0.031 20 HP 3.3 0.445 29.73 0.042 21 HP 3.4 0.473 31.62 0.072 22 HP 3.5 0.388 25.87 0.036 23 HP 3.6 0.447 29.87 0.057 64 Phụ lục 4: Nồng độ NH4+ tiêu thụ nồng độ NO2- sinh chủng vi khuẩn tuyển chọn giá trị pH khác (đơn vị: mg/L) Các giá trị pH Tên chủng pH4 pH5 pH6 pH7 pH8 pH9 HP 1.1 0.307 0.350 0.354 0.435 0.371 0.317 HP 2.9 0.305 0.331 0.343 0.430 0.363 0.330 HP 2.11 0.295 0.342 0.334 0.415 0.373 0.307 HP 3.4 0.316 0.319 0.328 0.469 0.326 0.317 HP 1.1 0.045 0.059 0.064 0.074 0.069 0.041 Nồng độ NO2- HP 2.9 0.021 0.035 0.058 0.063 0.068 0.046 sinh (mg/L) HP 2.11 0.035 0.037 0.042 0.057 0.052 0.046 0.042 0.053 0.071 0.089 0.075 0.066 vi khuẩn Nồng độ NH4+ tiêu thụ (mg/L) HP 3.4 Phụ lục 5: Nồng độ NH4+ tiêu thụ nồng độ NO2- sinh chủng vi khuẩn tuyển chọn nguồn carbon khác (đơn vị: mg/L) Tên nguồn Tên chủng NH4+ tiêu thụ NO2- sinh carbon vi khuẩn (mg/L) (mg/L) HP 1.1 0.597 0.098 HP 2.9 0.476 0.082 HP 2.11 0.521 0.064 HP 3.4 0.634 0.093 HP 1.1 0.449 0.083 HP 2.9 0.299 0.061 HP 2.11 0.283 0.055 HP 3.4 0.511 0.070 HP 1.1 0.433 0.092 HP 2.9 0.424 0.066 HP 2.11 0.435 0.077 HP 3.4 0.511 0.080 NaHCO3 Na2CO3 CaCO3 65 Phụ lục 6: Nồng độ NH4+ tiêu thụ nồng độ NO2- sinh chủng vi khuẩn tuyển chọn mốc thời gian nuôi cấy khác (đơn vị: mg/L) Tên chủng Thời gian nuôi cấy (ngày) vi khuẩn Nồng độ NH4+ tiêu thụ (mg/L) Nồng độ NO2- sinh (mg/L) 10 12 14 HP 1.1 0.435 0.473 0.673 0.529 0.513 0.469 HP 2.9 0.422 0.456 0.539 0.530 0.526 0.414 HP 2.11 0.445 0.446 0.637 0.625 0.611 0.604 HP 3.4 0.441 0.568 0.743 0.728 0.593 0.507 HP 1.1 0.066 0.086 0.099 0.082 0.075 0.072 HP 2.9 0.055 0.067 0.080 0.069 0.059 0.045 HP 2.11 0.063 0.075 0.085 0.077 0.072 0.067 HP 3.4 0.052 0.093 0.102 0.092 0.082 0.079 Phụ lục 7: Hiệu suất oxy hóa NH4+ chủng vi khuẩn tuyển chọn chế độ sục khí khác (đơn vị:%) Tên chủng VK HP 1.1 HP 2.9 HP 2.11 HP 3.4 CT 50,19 62,58 52,34 48,53 CT 49,87 35,85 34,45 51,41 CT 30,27 27,84 30,06 37,34 Chế độ sục khí 66