Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn ưa nhiệt sinh enzyme cellulase từ đống ủ thức ăn cho trâu bò (khóa luận tốt nghiệp)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN ƯA NHIỆT SINH ENZYME CELLULASE TỪ ĐỐNG Ủ THỨC ĂN CHO TRÂU BÒ” HÀ NỘI - 2021 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN ƯA NHIỆT SINH ENZYME CELLULASE TỪ ĐỐNG Ủ THỨC ĂN CHO TRÂU BÒ” Sinh viên thực : Nguyễn Thị Thu Trang Khóa : 62 Ngành : Cơng nghệ sinh học Người hướng dẫn : ThS Trần Thị Hồng Hạnh HÀ NỘI – 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực không chép kết nghiên cứu trước Tơi xin cam đoan tài liệu, thơng tin trích dẫn ghi rõ nguồn gốc phần tài liệu tham khảo Hà Nội, ngày tháng năm Sinh viên Nguyễn Thị Thu Trang i 2021 LỜI CẢM ƠN Sau thời gian thực tập Bộ môn Công nghệ vi sinh – Khoa Công nghệ Sinh học, nhận quan tâm giúp đỡ dìu dắt tận tình Thầy Cơ cán phịng thí nghiệm môn cố gắng, nỗ lực thân, tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Đầu tiên tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới Thạc sĩ Trần Thị Hồng Hạnh – Giảng viên Bộ môn Công nghệ Vi sinh – Khoa Công nghệ Sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam Cô dành nhiều thời gian, tâm huyết, tận tình hướng dẫn dạy dỗ tơi suốt q trình thực khố luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn tồn thể Thầy/Cơ Bộ mơn Cơng nghệ Vi sinh quan tâm, tận tình dạy suốt thời gian qua Đồng thời xin gửi lời cảm ơn đến tồn thể Thầy/Cơ cán Khoa Công nghệ Sinh Học dạy dỗ, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian làm khóa luận vừa qua Tơi xin cảm ơn Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Lãnh đạo Học viện Thầy/Cô giáo Học viện tạo điều kiện cho tơi thực khóa luận tốt nghiệp Cuối với tất lịng kính trọng biết ơn vô hạn, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Bố Mẹ người thân nuôi nấng, động viên tạo động lực suốt thời gian qua Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên Nguyễn Thị Thu Trang ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT viii TÓM TẮT ix PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm đống ủ 2.2 Hệ vi sinh vật đống ủ 2.3 Khái quát vi khuẩn ưa nhiệt 2.4 Đặc điểm đặc trưng vi khuẩn ưa nhiệt (L Shivlata T Satyanaryana, 2015) 2.5 Enzyme cellulase 2.5.1 Khái niệm nguồn gốc enzyme cellulase (Nguyễn Đức Lượng, 2004) 2.5.2 Phân loại enzyme cellulase 2.5.3 Cấu trúc enzyme cellulase (Nguyễn Thị Cúc, 2014) 10 2.5.4 Sự thủy phân cellulose enzyme cellulase từ vi sinh vật 10 2.5.5 Một số ứng dụng enzyme cellulase 11 2.6 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn ưa nhiệt sinh enzyme cellulase nước giới 14 2.6.1 Tình hình nghiên cứu nước 14 2.6.2 Tình hình nghiên cứu giới 15 PHẦN III NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Vật liệu nghiên cứu 17 iii 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17 3.1.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 17 3.2 Hóa chất, mơi trường, dụng cụ, thiết bị 17 3.2.1 Hóa chất 17 3.2.2 Môi trường 17 3.2.3 Dụng cụ thiết bị 18 3.3 Phương pháp nghiên cứu 18 3.3.1 Phương pháp thu mẫu 18 3.3.2 Phương pháp phân lập, thu mẫu 19 3.3.3 Phương pháp giữ giống vi sinh vật 19 3.3.4 Xác định hoạt tính enzyme cellulase phương pháp khuếch tán đĩa thạch 20 3.3.5 Xác định hoạt độ cellulase định lượng đường khử với thuốc thử DNS 20 3.3.6 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố môi trường đến khả sinh enzyme cellulase chủng vi khuẩn 24 3.3.7 Khảo sát số đặc điểm hóa sinh 25 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Phân lập chủng vi khuẩn ưa nhiệt từ đống ủ thức ăn cho trâu bị 29 4.2 Xác định hoạt tính enzyme cellulase phương pháp khếch tán đĩa thạch .31 4.3 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến khả sinh enzyme cellulase 32 4.3.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh enzyme cellulase 32 4.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh enzyme cellulase 33 4.3.3 Ảnh hưởng nguồn pH đến khả sinh enzyme cellulase 34 4.3.4 Ảnh hưởng nguồn carbon đến khả sinh enzyme cellulase 35 4.3.5 Ảnh hưởng nguồn chất CMC đến khả sinh enzyme cellulase36 4.3.6 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh enzyme cellulase 37 4.4 Khảo sát số đặc điểm hóa sinh 38 4.4.1 Khả di động 38 4.4.2 Thử nghiệm Methyl Red (MR) 39 iv 4.4.3 Phản ứng catalase 39 4.4.4 Thử nghiệm cirate 40 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 5.1 Kết luận 41 5.2 Kiến nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC 51 v DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1: Đặc điểm khuẩn lạc hình thái tế bào chủng vi khuẩn phân lập 30 Bảng 4.2: Hoạt tính cellulase chủng phân lập 31 Bảng 4.3: Một số đặc điểm hóa sinh chủng BV1 BV3 40 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Một số dạng vi khuẩn (EcoClean, 2020) Hình 2.2: Một số hình dạng xạ khuẩn (EcoClean, 2020) Hình 2.3: Một số hình dạng nấm thơng thường (EcoClean, 2020) Hình 2.4: Cấu trúc chất cellulose 10 Hình 4.1: Đặc điểm khuẩn lạc số chủng phân lập 29 Hình 4.2: Hoạt tính cellulase số chủng vi khuẩn sau ngày ni cấy 31 Hình 4.3: Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh enzyme cellulase 33 Hình 4.4: Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh enzyme cellulase chủng BV1 sau 48 nuôi cấy BV3 sau 72 nuôi cấy 34 Hình 4.5: Ảnh hưởng pH đến khả sinh enzyme cellulase chủng BV1 sau 48 nuôi cấy BV3 sau 72 ni cấy 35 Hình 4.6: Ảnh hưởng nguồn carbon đến khả sinh enzyme cellulase chủng BV1 sau 48 nuôi cấy BV3 sau 72 nuôi cấy 36 Hình 4.7: Ảnh hưởng CMC đến khả sinh enzyme cellulase chủng BV1 sau 48 nuôi cấy BV3 sau 72 nuôi cấy 37 Hình 4.8: Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh enzyme cellulase chủng BV1 sau 48 nuôi cấy BV3 sau 72 nuôi cấy 38 Hình 4.9: Khả di động chủng BV1 BV 39 Hình 4.10: Kết thử nghiệm MR chủng BV1 BV3 39 Hình 4.11: Kết thử nghiệm catalase chủng BV1 BV3 39 Hình 4.12: Kết phản ứng cirate chủng BV1 BV3 40 vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Giải nghĩa Chữ viết tắt LB CMC MR Luria and Bertani Carboxymethyl cellulose Methyl Red µl Microliter sp Species ml Mililter viii Antranikian G, Bertoldo C (2002) Strarch-Hydrolyzing enzymes from thermophilic archaea and bacteria Current Opinion in Chemical Biology 6:151-160 Ariffin H, Abdullah N, Umi Kalsom MS, Shirai Y and Hanssan MA (2006) Production and Characterisation of cellulase by Bacillus pumilus EB3, Internation Journal of Engineering and Technology, vol 3, phương pháp 47-53 Bragger J.M, Daniel R.M, Coolbear T, Morgan H.W (1989) Very stable enzyme from extemely thermophilic archaeabacteria and eubacteria Applied Microbiology and Biotechnology 31: 556-561 Bergey D H (1919) Thermophilic Bacteria Laboratory of Hygiene, University of Pennsylvania Baharuddin Azhari Samsu, Razak Mohamad Nafis Abd, Hock Lim Siong, Ahmad Mohd Najib, Abd-Aziz Suraini, Rahman Nor' Aini Abdul, Shah Umi Kalsom Md, Hassan Mohd Ali, Sakai Kenji, Shirai Yoshihito (2010) Isolation and Characterization of Thermophilic Cellulase-Producing Bacteria from Empty Fruit Bunches-Palm Oil Mill Effluent Compost American Journal of Applied Sciences (1): 56-62 Barns, S.M , Fundya, R.E., Jeffries, M.W., Pace, N.R (1994) Remarkable archaeal diversity detected in a Yellowstone National Park hot spring enviroment, Proc Natl Acad.Sci USA 91 1609-1613 10 Bonjour, F., Graber, A., aragno, M (1988) Isolatin of Bcillus schlegeliia, a thermophilic hydrogen oxidizing, aerobic autotroph, from geothermal and non-geothermal enviroments Microb Ecol 16331-337.’ 11 Champreda V, Sarunyou Wuoriranta, Ukrit Rattanachomsri, Thanapor Laothanachareon, Lily Eurwilaichitr, Yasuo Igarashi (2010) Analysis of Thermophilic lignocellulose degrading microbial consortium and multi-species lignocelluloselytic enzyme system Enzyme and Microbial Technol 47:283-290 12 Cherry JR and Fidantsef (2003) Directed evolution of industrial enzyme: an update Curr Opin Biotechnol 14:438-443 45 13 Ghose TK (1987) Measurement of cellulase activities, pure and Appl Chem, vol 59, phương pháp 257-268 14 Carver S.M, Pertti Vuoriranta, Olli H Tuovinen (2011) A thermophilic microbial fuel cell design Journal of Power Sources 196:3757-3760 15 Cheryan, M.S., P.M Shah and K Witjitra 1997 Production of acetic acid by Clostridium thermoaceticum Adv Appl Microbiol 43(6):1385–1392 16 Durre, P (1998) New insights and novel developments in clostridial acetone/butanol/isopropanol fermentation Appl Microbiol Biotechnol 49:639-648 17 Deacon J., (2011) The Microbial World: thermophilic microorganisms Institute of cell and Molecular Biology, The University of Edinburgh 18 Dees P.M, Ghiorse William.C (2001) Microbial diversity in hot synthetic compost as revealed by PCR-amplified rRNA Sequences from cultivated isolates and extracted DNA FEMS Microbiology Ecology 35:207-216 19 El-Naggar N.E-A., Abdelwahed N.A.M., Saber W.I.A., Mohamed A.A (2014) Bioprocessing of some agro-industrial residues for endoglucanase production by the new subsp.; “Streptomyces albogriseolus” subsp cellulolyticus strain NEAE-J, Brazilian Journal of Microbiology 45, 2, 743-756 20 Howard, R.L., E Abotsi., E.L.J Rensburg and S Howard (2003) Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production Afr J Biotechnol 2(12):602-619 21 Haug R.T (1993) The practical Book of compost Engineering Lewis Publishers, Boca Raton 22 Harayama S (1998) Artifical evolution of DNA shuffling Trends in Biotechnology 16:76-82 23 Hassen A, Kaouala B, Naceur J, Mohamed C and Abdellatif B (2002) Microbial charabacteria during composting of municipal solid waste p 357-368 46 24 Hussein, Khudhair, Mohammed (2017) Isolation and screening of thermophilic bacteria for producing cellulase enzyme using agricultural wasle Journal of Al-Nahrain university 103-107 25 Hung-Der Jang and Kou-Shu Chen (2003) Production and characterization of thermostable cellulase from Streptomyces transformant T3-1 World Jounarl of Microbiology and Biotechnology 19: 263-268 26 Kiran T, Asad W, Aiaz M, Hanif M, Rasool SA (2018) Industrially relevant cellulase production by indigenous thermophilic Bacillus licheniformis TLW-3 strain: Isolation-Molecular identification and enzyme yeld optimization 31:2333-2340 27 Kutzer H.J (2008) Microbiology of composting Ober-Ramstandt Germanny 2: 36-90 28 Liang R, Qin Z, Peng V, Zhou X, Zhow Q, Chen H, Hopop D.A, Keiser T, Deng Z (1994) Development of gene cloring system for Stemtomyces hygroscopicus subsp, yingchengensis, a produccer of three useful antifungar compounds by elimination of three barriers to DNA transfer J Bacteriol 176: 2090-2095 29 Ole, K., T.V Borchert and C.C Fuglsang (2002) Industrial enzyme applications Curr Opin Biotech 13:345-351 30 M.A Milala, A Shugaba, A Gidado, A.C Ene and J.A Wafar (2005) Studies on the Use of Agricultural Wastes for Cellulase Enzyme Production by Aspegillus niger Research Journal of Agriculture and Biological Sciences 1(4): 325-328 31 Mark R Wilkins, Wilbur W Widmer, Karel Grohmann, Randall G Cameron (2007) Hydrolysis of grapefruit peel waste with cellulase and pectinase enzymes Bioresource Technology, Volume 98, Issue 8, Pages 1596-1601 32 Malherbe S, Cloete T.E (2002) Lignocellulose biodegradation: Fundamental and applications Reviews in Environmental Science and Biotechnology 1:105-114 47 33 Maryam B, Abdul Quadir, Mariam Zameer, Sajid Rashid Ahmad, Rubina Nelofer, Nadia Jamil, Sameen Arzoo, Rubab Afzaal (2018) Production of cellulase by Bacillus cellulisilyticus using lignocellulosis Material Polish Journal of environmental studies 27: 2659-2667 34 Muhammad Irfan, Asma Safdar, Quratulain syed, Muhammad Nadeem (2012) Isolation and creening of cellulo,ytic bacteria from soil and optimization of cellulase production and activity Turk J biochem 37 (3):287-293 35 Murunmaya, K P., Mahesh, K S., Kumananda, T., (2013) Isolation and characterization of a thermophilic Bacillus sp.with protease activity isolated from hot spring of Tarabalo Odisha, Indida Iran J Microbiol, 5(2): 159-165 36 Mustin M (1987) Le compost, gestion de la matière organiqe F Dubusc Eds, Paris: 954 37 McKellar, M.E , Nelson, E.B (2003) Compost-induced suppression of soil-borne damping-off is mediated by fatty-acid-metabolizing seedcolonizing microbial communities Appl Environ Microbiol 69 : 452-460 38 Pantazaki AA, pritsa AA, Kyriadakidis DA (2002) Biotechnologically relevant enzymes from Thermus thermophilus Applied Microbiology Biotechnology 58:1-12 39 Peters S, Koschinsky S, Schwieger F, Christoph T.C (2000) Succesion of microbial communities during hot composting as detected by PCR-single-Strandconformation polymorphism-based genetic profiles of small-subunit rRNA genes Environmental microbiology and biodegradation 3:930-936 40 Peter L Bergquist, Moreland D Gibbs, Daniel D Morris, V S Junior Te'o, David J Saul, Hugh W Morgan (1999) Molecular diversity of thermophilic cellulolytic and hemicellulolytic bacteri FEMS Microbiology Ecology, Volume 28, Issue 2, Pages 99–110 41 Ponnuswamy V, Samuel Gnana Prakash Vincent (2013) A simple method for the detection of protease activity on agar plates using bromocresolgreen dye J Biochem Tech 4: 628-630 48 42 Rezessy-Szabos M.J, Quang D Nguyen, Hoschke A, Braet C, Hajos G Claeyssens M (2007) A novel thermostable α-galactosidase from the thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus CBS 1770:55-62 43 Rodriguez G.O, Zanphorlin L.M, Cabral H, Arantes E, Assis D, Juliano L (2011) Purification and characterization of a new alkakine serine protase from the thermophilic fugus Myceliophthora sp Process Biochemistry 46: 2137-2143 44 Ray, A.K., A Bairagi., G.K Sarkar and S.K Sen (2007) Optimization of fermentation conditions for cellulase production by Bacillus subtilis CY5 and Bacillus circulans TP3 isolated from fish gut Acta Ichthyol Piscat 37(1):47-53 45 Sharma N, Vyas G, Pathania S (2013) Culturable Diversity of thermophilic Microorganismsm Found in Hot Springs of Northern Himalayas and to explore their Potential for Production of Industrially Important Enzymes Scholars Academic Journal of biosciences 46 Sadhu, S., & Maiti, T (2013) Cellulase Production by Bacteria: A Review Microbiology Research Journal International, 3(3), 235-258 47 Steger K, Jarvis A, Vasara T, Romantschuk M, Sundh (2007) Effects of differing temperature managerment on development of actinobacteria populations during composting Research in Microbiology 158: 617-624 48 Stetter Karl O (1996) Hyperthermophilic procaryotes FEMS Microbiology reviews 18: 149-158 49 Slamet, I., Mnh, A., (2018) Isolation of Thermophilic Bacteria from Bora Hot Spring in Central Sulawesi, Biosaintifika Journal of Biology of Biology Education 10 (2): 291-297 50 Suáres-Estrella, F , Arcos-Nievas, M.A., Moral R., Vargas-Garciá, M.C., López, M.J., Moreno, J (2012) Invivo control of plant pathogens by microorganisms isolated from agro-industrial composts ScienceDirect Bio Control 67: 509-515 51 Shivlata L and Satyanarayan T (Published Online 25/09/2015) 49 Thermophilic and alkaliphilic Actinobacteria: biology and potential applications 52 Trautmann N.M and Krasny (1997) Composting in the classroom Produced by Photosynthesis Production, Inc, Ithaca, NY 53 Taleb, A., A.A Khadiga., W.A Mashhoor., A.N Sohair., M.S Sharaf., A Abdel and H.M Hoda (2009) Nutritional and Environmental Factors Affecting Cellulase Production by Two Strains of Cellulolytic Bacilli Australian Journal of Bas ic and Applied Sciences 3(3):2429-2436 54 Tong G.C, I-son N, Li C.W, Yeh Y.F, Chen P.T, ChirmJ.L, Ma C.H, Yu S.m, Ho T.D (2008) Anovel endo-glucanase from the thermophilic bacterium Geobacillus sp 70PC53 with high activity and stability over a broad range of temperatures Springer: extremophiles 13: 425-437 55 Vipul Verma, Alpika Verma and Akhilesh Kushwaha (2012) Isolation and production of cellulase enzyme from bacteria idolated from agricultural fields in district Hardoi, Uttar Pradesh, India, Advances in Applied science Research (1): 171-174 56 Yeoman C.J, Han Y, Dodd D, Schrocder C.M, Mackie R.I, Cann I.K (2010) Thermostable enzymes as biocatalysts in the biofuel industry Advances in Applied Microbiology 70:1-55 57 Weigel, J (1990) Temperatire spans for growth : hypothesis and discussion FEMS Microbiol Rev 75 : 155-170 58 Winkelmann, G (1992) Microbial Degradation of Natural Products Biochemical Education 20(3):191-192 59 Zeikus J.G (2002) Thermophilic bacteria Ecology, physiology and technology 50 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Hình ảnh khuẩn lạc tế bào loại khuẩn phân lập Tên chủng Hình thái khuẩn lạc BV BV BV BV 51 Hình thái tế bào BV BV BV BV 52 Phụ lục 2: Xây dựng đường chuẩn glucose Dựa vào đường chuẩn glucose để xác định nồng độ glucose Từ xác định hoạt độ cellulase chủng vi khuẩn nghiên cứu Đường chuẩn vẽ phần mềm excel 2013 dựa số liệu đo ta có đồ thị sau: Hình 4.3: Đồ thị đường chuẩn glucose 53 Phụ lục 3: Kết dựng đường chuẩn glucose Phụ lục 4: Kết thí nghiệm ảnh hưởng thời gian ni cấy chủng BV1 Phụ lục 5: Kết thí nghiệm ảnh hưởng thời gian ni cấy đến chủng BV3 54 Phụ lục 6: kết ảnh hưởng nhiệt độ đến chủng BV1 BV3 Tại 300C Tại 450C Tại 370C Tại 400C Tại 500C 55 Phụ lục 7: Kết ảnh hưởng pH đến chủng BV1 BV3 Chủng BV1 Chủng BV3 56 Phụ lục 8: Ảnh hưởng nguồn carbon đến chủng BV1 BV3 Chủng BV1 Chủng BV3 57 Phụ lục 9: Ảnh hưởng nguồn chất CMC đến chủng BV1 BV3 58 Phụ lục 10: Kết ảnh hưởng nguồn nito đến chủng BV1 BV3 Chủng BV1 Chủng BV3 59