Khóa luận tốt nghiệp phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh bacteriocin từ thực phẩm lên men

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -*** - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN SINH BACTERIOCIN TỪ THỰC PHẨM LÊN MEN Hà Nội, 2021 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -*** - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN SINH BACTERIOCIN TỪ THỰC PHẨM LÊN MEN Sinh viên thực : NGUYỄN NGỌC KHÁNH Lớp : K62CNSHC Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hướng dẫn : PGS TS NGUYỄN XUÂN CẢNH TS NGUYỄN TRƯỜNG SƠN Hà Nội, 2021 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan khố luận cơng trình nghiên cứu khoa học riêng tơi hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Xuân Cảnh – Khoa Công nghệ Sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam Các số liệu kết nêu khoá luận trung thực chưa công bố nghiên cứu khác Các tài liệu trích dẫn khóa luận nêu danh mục tài liệu tham khảo Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm số liệu khóa luận Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên Nguyễn Ngọc Khánh i LỜI CẢM ƠN Sau thời gian thực tập môn Công nghệ Vi sinh, khoa Cơng nghệ sinh học, ngồi cố gắng, nỗ lực khơng ngừng thân để hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp, tơi quan tâm giúp đỡ hướng dẫn tận tình thầy giáo, cán Phịng thí nghiệm Bộ mơn Trước tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc chân thành đến PGS TS Nguyễn Xuân Cảnh - Bộ môn Vi Sinh - Khoa Công nghệ sinh học- Học viện Nông nghiệp Việt Nam TS Nguyễn Trường Sơn – Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật dành nhiều thời gian, tâm huyết, tận tình giúp đỡ trực tiếp hướng dẫn tơi suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn quan tâm, hướng dẫn, bảo thầy cô Bộ môn Vi Sinh - Khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nông Nghiệp Việt Nam anh chị toàn thể bạn bè giúp đỡ nhiều tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực tập để hồn thành khóa luận tốt nghiệp cách tốt Qua đây, gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy, cô cán khoa Công nghệ sinh học tận tình giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận Và cuối cùng, xin chân thành cảm ơn thầy giáo, cô giáo Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình truyền đạt kiến thức vơ quý giá quan trọng thời gian học tập rèn luyện Tôi xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên Nguyễn Ngọc Khánh ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC…… iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii TÓM TẮT……… viii PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan vi khuẩn lactic (Lactic Acid Bacteria - LAB) 2.1.1 Đặc điểm hình thái vi khuẩn lactic 2.1.2.Đặc điểm di truyền vi khuẩn lactic 2.2 Tổng quan bacteriocin 2.2.1 Lịch sử nghiên cứu phát triển 2.2.2 Giới thiệu bacteriocin 12 2.2.3 Phân loại bacteriocin sinh tổng hợp LAB 14 2.2.4 Các tính chất bacteriocin 18 2.2.5 Cơ chế tổng hợp bacteriocin 20 2.2.6 Cơ chế hoạt động bacteriocin 23 2.2.7.Ứng dụng bacteriocin 26 2.3.Thực trạng nghiên cứu bacteriocin giới 32 2.4 Thực trạng nghiên cứu bacteriocin Việt Nam 33 iii PHẦN III NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 35 3.2 Đối tượng nghiên cứu 35 3.3 Dụng cụ, thiết bị hóa chất 36 3.3.1 Dụng cụ 36 3.3.2 Thiết bị 36 3.3.3 Hoá chất 36 3.4 Môi trường sử dụng nghiên cứu 37 3.5 Nội dung nghiên cứu 37 3.6 Phương pháp nghiên cứu 38 3.6.1 Phương pháp thu thập mẫu 38 3.6.2 Phương pháp phân lập 38 3.6.3 Phương pháp giữ giống vi khuẩn (Lương Đức Phẩm, 2015) 39 3.6.4 Phương pháp khảo sát khả sinh bacteriocin đối kháng với vi khuẩn kiểm định 39 3.6.5 Phương pháp xác định chất yếu tố kháng khuẩn (Marwa et al., 2015) 40 3.6.6.Phương pháp nghiên cứu số đặc điểm chủng vi khuẩn chọn lọc 41 3.6.7 Phương pháp xử lý số liệu 43 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 4.1 Phân lập chủng vi khuẩn lactic 44 4.2 Đánh giá khả sinh bacteriocin đối kháng với vi khuẩn kiểm định 46 4.3 Xác định chế đối kháng 50 4.3.1 Xử lý với enzyme proteinase K 50 4.3.2 Đánh giá độ bền nhiệt bacteriocin 52 4.4 Nghiên cứu số đặc điểm chủng vi khuẩn chọn lọc 54 4.4.1 Đánh giá khả di động 54 4.4.2 Đánh giá khả sinh acid lactic 55 iv 4.5 Ảnh hưởng thành phần môi trường nuôi cấy đến khả sản xuất bacteriocin chủng vi khuẩn 57 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 5.1 Kết luận 60 5.2 Kiến nghị 60 PHẦN VI TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC……… 71 v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT µl Microliter Cs Cộng DNA Deoxyribonucleic acid FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations kDa Kilodalton LAB Lactic acid bacteria LB Luria Bertani MRS De Man, Rogosa and Sharpe RNA Ribonucleic acid vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1.Sự khác biệt bacteriocin kháng sinh 11  Bảng 2.2: Các bacteriocin phổ biến tổng hợp vi khuẩn lactic 14  Bảng 2.3 Độ bền nhiệt, pH enzyme thủy phân số bacteriocin sinh tổng hợp vi khuẩn lactic (Henchard and Sahl, 2002 ) 20  Bảng 3.1: Các mẫu thực phẩm lên men sử dụng nghiên cứu 35  Bảng 3.2 Các chủng vi khuẩn kiểm định 36  Bảng 4.1 Kết phân lập chủng vi khuẩn 44  Bảng 4.2 Khả đối kháng chủng vi khuẩn phân lập 47  Bảng 4.3 Khả sinh acid chủng DD2.1 DT1.1 55  vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Cấu trúc amino acid Nisin – đại diện phân lớp Ia (Vesterlund, 2004) 15 Hình 2.2: Cấu trúc số bacteriocin đại điên lớp II (Todoroy, 2009) 17 Hình 2.3 Cơ chế tổng hợp bacteriocin nhóm I (Chen and Hoover, 2003) 21 Hình 2.4 Cơ chế tổng hợp bacteriocin nhóm II (Chen and Hoover, 2003) 22 Hình 2.5 Cơ chế hoạt động bacteriocin ( Yang et al., 2014) 23 Hình 2.6: Cơ chế hoạt động bacteriocin vi khuẩn Gram dương (Cotter et al., 2013) 24 Hình 2.7: Hoạt động số bacteriocin vi khuẩn Gram âm (Cotter á., 2013) 25 Hình 4.2 Hình ảnh số khuẩn lạc chủng vi khuẩn phân lập 46 Hình 4.2 Khả kháng khuẩn chủng vi khuẩn lactic 48 Hình 4.4 Khả kháng khuẩn chủng vi khuẩn phân lập sau xử lí với enzyme proteinase K 51 Hình 4.5.Biểu đồ thể khả kháng khuẩn sau xử lí enzyme phân giải protein (proteinase K) 51 Hình 4.6 Biểu đồ thể khả đối kháng với vi khuẩn kiểm định sau xử lý nhiệt độ 53 Hình 4.7: Khả di động 02 chủng DT1.1 DD2.1 55 Hình 4.8 Khả sinh acid chủng DD2.1 DT1.1 56 Hình 4.9 Biểu đồ hoạt tính bacteriocin chủng DD2.1 DT1.1 môi trường nuôi cấy khác (G: Glucose; Y: Yeast extract; N: NaCl) .57 viii Phụ lục 3: Khả đối kháng với vi khuẩn kiểm định sau xử lí nhiệt độ Đường kính vòng kháng khuẩn (D-d) mm Nhiệt độ Đối chứng 40oC/30 phút 60oC/30 phút Chủng Escherichia coli Salmonella GL1.3 14± 0.1 13± 0.1 GL1.4 12± 0.1 14 ± 0.1 DD2.1 13 ± 0.1 12 ± 0.1 DT1.1 16± 0.1 22± 0.1 QT2.1 12± 0.1 11± 0.1 GL1.3 13 ± 0.1 13 ± 0.1 GL1.4 14 ± 0.1 11 ± 0.1 DD2.1 12 ± 0.1 11 ± 0.1 DT1.1 19 ± 0.1 18 ± 0.1 QT2.1 13 ± 0.1 12 ± 0.1 GL1.3 13 ± 0.1 13 ± 0.1 GL1.4 12 ± 0.1 10 ± 0.1 DD2.1 11 ± 0.1 10 ± 0.1 DT1.1 18 ± 0.1 16 ± 0.1 QT2.1 0 73 80oC/30 phút o 100 C/30 phút 100oC/30phút (tiếp theo) GL1.3 ± 0.1 10 ± 0.1 GL1.4 13 ± 0.1 11 ± 0.1 DD2.1 11 ± 0.1 ± 0.1 DT1.1 11 ± 0.1 11 ± 0.1 QT2.1 10 ± 0.1 ± 0.1 GL1.3 0 GL1.4 11 ± 0.1 12 ± 0.1 DD2.1 10 ± 0.1 11 ± 0.1 DT1.1 10 ± 0.1 ± 0.1 QT2.1 0 GL1.3 0 GL1.4 ± 0.1 ± 0.1 DD2.1 0 DT1.1 0 QT2.1 0 74 Phụ lục 4: Khả đối kháng với vi khuẩn kiểm định sau xử lí nhiệt độ 40oC/ 30 phút Escherichia coli Salmonella 60oC/ 30 phút Escherichia coli Salmonella 75 80oC/ 30 phút Escherichia coli Salmonella 100oC/ 30 phút Escherichia coli Salmonella 76 100oC/ 30 phút (tiếp theo) Escherichia coli Salmonella 77 Phụ lục 1: Đặc điểm hình thái 18 chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu thực phẩm lên men Chủng Hình dạng Hình dạng Màu sắc Dạng rìa Kích (mm) khuẩn lạc tế bào GL1.3 Tròn Que ngắn Trắng đục Nguyên 1-3 GL1.4 Tròn Que dài Trắng đục Nguyên 1-2 GL2 Tròn Que ngắn Trắng đục Nguyên 2-3 DD1.3 Tròn Que dài Trắng đục Nguyên 0,5 DD1.4 Tròn Que dài Trắng đục Nguyên 1-2 DD2.1 Tròn Que dài Trắng đục Xù xì DT1.1 Trịn Que dài Trắng đục Ngun 0,5 DT1.2 Tròn Que dài Trắng đục Nguyên 1,5 DT2.3 Tròn Que dài Trắng đục Nguyên 1-2 HN1.3 Tròn Que dài Trắng đục Nguyên HN1.4 Tròn Que ngắn Trắng đục Nguyên 0,5 QT1.2 Dài Que dài Trắng đục Nguyên 0,5 QT1.3 Tròn Que dài Trắng đục Nguyên 1-2 QT1.4 Tròn Que dài Trắng đục Nguyên 0,5 QT2.1 Tròn Que dài Trắng sữa Nguyên 1-2 QT3.1 Tròn Que dài Trắng đục Nguyên 1-2 QT3.2 Tròn Que dài Trắng đục Nguyên 0.5 QT3.3 Tròn Que dài Trắng đục Nguyên 2-3 78 thước Phụ lục 2: Đặc điểm sinh hoá chủng vi khuẩn sinh bacteriocin STT Kí hiệu Hình thái khuẩn chủng lạc Màu GL1.3 trắng Catalase Hình thái tế Hình bào nhuộm Gram đục, khuẩn lạc trịn, bề mặt lồi, rìa nguyên Gram dương - Song cầu khuẩn trơn nhẵn Màu trắng đục , GL1.4 khuẩn lạc Gram dương tròn, - Cầu khuẩn nhẵn, bề mặt lồi Khuẩn DD2.1 nhỏ, lạc màu tròn Gram trắng - Khuẩn DT1.1 nhỏ, lạc màu dương Cầu khuẩn ngà, đục, rìa xù xì trịn trắng đục, khuẩn lạc mọc Gram dương - Cầu khuẩn dẹt (lài) - Khuẩn lạc tròn, QT2.1 Gram dương màu trắng sữa, bề - Cầu khuẩn mặt lồi 79 ảnh Phụ lục 3: Khả đối kháng với vi khuẩn kiểm định sau xử lí nhiệt độ Nhiệt độ Đối chứng 40oC/30 phút 60oC/30 phút Chủng Đường kính vịng kháng khuẩn (D-d) mm Escherichia coli Salmonella GL1.3 14± 0.1 13± 0.1 GL1.4 12± 0.1 14 ± 0.1 DD2.1 13 ± 0.1 12 ± 0.1 DT1.1 16± 0.1 22± 0.1 QT2.1 12± 0.1 11± 0.1 GL1.3 13 ± 0.1 13 ± 0.1 GL1.4 14 ± 0.1 11 ± 0.1 DD2.1 12 ± 0.1 11 ± 0.1 DT1.1 19 ± 0.1 18 ± 0.1 QT2.1 13 ± 0.1 12 ± 0.1 GL1.3 13 ± 0.1 13 ± 0.1 GL1.4 12 ± 0.1 10 ± 0.1 DD2.1 11 ± 0.1 10 ± 0.1 DT1.1 18 ± 0.1 16 ± 0.1 QT2.1 0 80 80oC/30 phút o 100 C/30 phút 100oC/30phút (tiếp theo) GL1.3 ± 0.1 10 ± 0.1 GL1.4 13 ± 0.1 11 ± 0.1 DD2.1 11 ± 0.1 ± 0.1 DT1.1 11 ± 0.1 11 ± 0.1 QT2.1 10 ± 0.1 ± 0.1 GL1.3 0 GL1.4 11 ± 0.1 12 ± 0.1 DD2.1 10 ± 0.1 11 ± 0.1 DT1.1 10 ± 0.1 ± 0.1 QT2.1 0 GL1.3 0 GL1.4 ± 0.1 ± 0.1 DD2.1 0 DT1.1 0 QT2.1 0 81 Phụ lục 4: Khả đối kháng với vi khuẩn kiểm định sau xử lí nhiệt độ 40oC/ 30 phút Escherichia coli Salmonella 60oC/ 30 phút Escherichia coli Salmonella 82 80oC/ 30 phút Escherichia coli Salmonella 100oC/ 30 phút Escherichia coli Salmonella 83 100oC/ 30 phút (tiếp theo) Escherichia coli Salmonella 84 Phụ lục 5: Ảnh hưởng thành phần môi trường đến khả sinh bacteriocin Thành phần môi trường G 1% G 2% G 3% Y 1% Y 2% Y 3% N 1% N 2% N 3% Chủng Đường kính vịng kháng khuẩn (D-d) mm Salmonella Escherichia coli DD2.1 9± 0.1 5± 0.1 DT1.1 5± 0.1 3± 0.1 DD2.1 10± 0.1 6± 0.1 DT1.1 7± 0.1 5± 0.1 DD2.1 13± 0.1 10± 0.1 DT1.1 12± 0.1 8± 0.1 DD2.1 5± 0.1 7± 0.1 DT1.1 4± 0.1 7± 0.1 DD2.1 6± 0.1 8± 0.1 DT1.1 7± 0.1 10± 0.1 DD2.1 8± 0.1 9± 0.1 DT1.1 9± 0.1 12± 0.1 DD2.1 ± 0.1 ± 0.1 DT1.1 ± 0.1 4.5 ± 0.1 DD2.1 6.5 ± 0.1 4.5 ± 0.1 DT1.1 ± 0.1 5.5± 0.1 DD2.1 3.5 ± 0.1 ± 0.1 DT1.1 ± 0.1 ± 0.1 85 Phụ lục 5: Ảnh hưởng thành phần môi trường đến khả sinh bacteriocin Glucose 1%, 2%, 3% Salmonella Escherichia coli Yeast Extract 1%, 2%, 3% Salmonella Escherichia coli 86 NaCl 1%, 2%, 3% Salmonella Escherichia coli 87