Khóa luận tốt nghiệp phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn và đánh giá khả năng phân giải lignin, cellulose từ phụ phẩm sau thu hoạch quả vải

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI LIGNIN, CELLULOSE TỪ PHỤ PHẨM SAU THU HOẠCH QUẢ VẢI Người thực : Bùi Thị Phương MSV : 620532 Lớp : K62CNSHB Khoa : Công nghệ sinh học Giáo viên HD : ThS Trịnh Thị Thu Thủy HÀ NỘI – 23/11/2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan khóa luận tốt nghiệp riêng tơi hướng dẫn khoa học Th.S Trịnh Thị Thu Thủy Các số liệu, kết khóa luận trung thực Các thơng tin trích dẫn ghi nguồn gốc rõ ràng công bố tài liệu tham khảo Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên thực i LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực tập nhận quan tâm, hướng dẫn tất thầy cô, bạn bè; học hỏi nhiều kỹ nghiên cứu, nhứng kiến thức quý báu khơng giúp ích q trình làm khóa luận mà cịn tiền đề cho sau Tơi xin chân thành cảm ơn đến giảng viên hướng dẫn Th.S Trịnh Thị Thu Thủy tận tình hướng dẫn dạy nhiều kỹ năng, nhiều kiến thức q trình thực khóa luận tốt nghiệp Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy cô môn Sinh học phân tử - Công nghệ sinh học ứng dụng ban lãnh đạo khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông Nghiệp Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Cuối xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè tập thể lớp K62CNSHB ln đồng hành, giúp đỡ tiếp sức cho suốt quãng thời gian dài làm khóa luận tốt nghiệp Tuy nhiên thiếu nhiều kiến thức, kinh nghiệm kỹ thực hành nên báo cáo tránh khỏi thiếu sót, tơi mong nhận góp ý, nhận xét từ q thầy để báo cáo hồn thiện tốt Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên thực ii MỤC LỤC Lời cảm ơn .ii Mục lục iii Danh mục từ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình vẽ, đồ thị viii Tóm tắt ix Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Yêu cầu đề tài Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Thực trạng phụ phẩm sau thu hoạch vải 2.1.1 Sản lượng thực trạng phụ phẩm sau thu hoạch nơng nghiệp nói chung 2.1.2 Thực trạng phương pháp xử lý phế phụ phẩm sau thu hoạch vải 2.1.2.1 Sản lượng thực trạng phụ phẩm sau thu hoạch vải 2.1.2.2 Các phương pháp xử lý phế phụ phẩm vải 2.2 Các công nghệ ứng dụng xử lý phụ phẩm trồng trọt sau thu hoạch 2.2.1 Sản xuất Than sinh học (Biochar) từ phụ phẩm nông nghiệp 2.2.2 Sản xuất phân ủ compost 2.2.3 Sản xuất nấm từ phụ phẩm nông nghiệp 2.2.4 Một số công nghệ xử lý phụ phẩm nông nghiệp 2.3 Thành phần nguyên liệu vải 10 2.3.1 Thành phần Cellulose 10 2.3.1.1 Tổng quan Cellulose 10 2.3.1.2 Sơ lược enzyme cellulase 11 2.3.1.3 Các vi sinh vật phân giải Cellulose 13 2.3.1.4 Một số ứng dụng enzyme cellulase 15 2.3.2 Thành phần Lignin 18 2.3.2.1 Tổng quan Lignin 18 2.3.2.2 Sơ lược enzyme phân giải Lignin 19 2.3.2.3 Một số vi sinh vật phân giải lignin 22 2.3.2.4 Một số ứng dụng Lignin 25 2.3.3 Thành phần Hemicellulose 25 2.3.3.1 Tổng quan hemicellulose 25 iii 2.3.3.2 Sơ lược enzyme hemicellulase 26 2.4 Tình hình nghiên cứu giới nước ta chế phẩm vi sinh xử lý phụ phẩm nông nghiệp 27 2.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 27 2.4.2 Tình hình nghiên cứu nước 28 Phần VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 3.1 Vật liệu 30 3.1.1 Đối tượng 30 3.1.2 Thiết bị 30 3.1.3 Hóa chất 30 3.1.4 Môi trường 31 3.2 Các phương pháp nghiên cứu 32 3.2.1 Phân lập chủng vi sinh vật từ phế phụ phẩm vải 32 3.2.2 Xác định hoạt tính enzyme cellulase 32 3.2.3 Xác định hoạt tính Lignin 33 3.2.4 Xác định hoạt độ enzyme cellulase 33 3.2.5 Xác định hoạt độ enzyme lignin peroxidase 35 3.2.6 Khảo sát môi trường 35 3.2.7 Xác định pH tối ưu 36 3.2.8 Xác định nhiệt độ tối ưu 37 3.2.9 Xây dựng đường cong sinh trưởng 37 3.2.11 Định danh chủng vi khuẩn 38 3.2.11.1 Định danh dựa đặc điểm hình thái 38 3.2.11.2 Định danh phương pháp sinh học phân tử giải trình tự vùng 16S38 3.2.12 Đánh giá khả sinh trưởng chủng vi sinh vật nuôi mơi trường có chứa phế phụ phẩm vải 40 3.2.13 Xác định thành phần phần trăm lignin, cellulose mẫu phế phẩm vải trước ủ với chủng vi sinh vật 40 3.2.13.1 Xác định thành phần phần trăm lignin 40 3.2.13.2 Xác định thành phần phần trăm cellulose 42 3.2.14 Xác định thành phần phần trăm lignin, cellulose mẫu phế phẩm vải sau ủ với chủng vi sinh vật 42 Phần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 4.1 Kết phân lập chủng vi sinh vật 44 4.2 Sàng lọc đánh giá hoạt tính cellulase, lignin peroxidase chủng vi sinh vật44 iv 4.2.1 Đánh giá hoạt tính enzyme cellulase 44 4.2.1.1 Hoạt tính enzyme cellulase 44 4.2.1.2 Hoạt độ enzyme cellulase 45 4.2.2 Đánh giá hoạt tính enzyme lignin peroxidase 47 4.2.2.1 Hoạt tính lignin peroxidase 47 4.2.2.2 Hoạt độ enzyme lignin peroxidase 48 4.3 Định danh chủng vi sinh vật 48 4.3.1 Định danh dựa đặc điểm hình thái 48 4.3.2 Định danh phương pháp sinh học phân tử giải trình tự vùng 16S rARN 49 4.4 Khảo sát môi trường điều kiện nuôi cấy 50 4.4.1 Khảo sát môi trường nuôi cấy 50 4.4.2 Khảo sát điều kiện nuôi cấy 53 4.4.2.1 Xác định độ pH tối ưu 53 4.4.2.2 Xác định nhiệt độ tối ưu 55 4.4.3 Đường cong sinh trưởng 58 4.5 Đánh giá khả phân hủy cellulose, lignin chủng vi sinh vật 60 4.5.1 Xác định thành phần nguyên liệu vải 60 4.5.2 Xác định khả phân hủy cellulose, lignin chủng vi sinh vật 60 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62 5.1 Kết luận 62 5.2 Kiến nghị 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC 68 v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ABTS 2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) APPL acid-precipitable polymeric lignin CBM Cellulose-binding module CMC Carboxymethyl cellulose DNS 3,5 Dinitrosalicylic acid LB Broth Luria Bertani Broth LiP Lignin peroxidase MnP Mangan peroxidase PCR Polymerase Chain Reaction SDS Sodium dodecyl sulfate SHPT Sinh học phân tử U Unit VP Versatile peroxidase (Peroxidase đa năng) VSV Vi sinh vật vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Một số hóa chất sử dụng 30 Bảng 3.2 Các môi trường nuôi cấy 31 Bảng 3.3 Xây dựng đường chuẩn Glucose 34 Bảng 4.1 Các chủng vi sinh vật phân lập 44 Bảng 4.2 Hoạt tính enzyme cellulase chủng vi sinh vật 45 Bảng 4.3 Hoạt độ cellulase chủng vi sinh vật 46 Bảng 4.4 Hoạt độ lignin peroxidase chủng vi sinh vật 48 Bảng 4.5 Thành phần nguyên liệu vải 60 Bảng 4.6 Thành phần nguyên liệu vải sau ủ 61 Bảng 4.7 Lượng phần trăm nguyên liệu giảm so với trước sau ủ 61 vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 2.1 Phân tử cellulose 11 Hình 2.2 Quá trình phân giải cellulose enzyme cellulase 12 Hình 2.3 Sơ đồ cấu trúc cellulosome 14 Hình 2.4 Cấu trúc phân tử Lignin 19 Hình 2.5 Cấu trúc Laccase 20 Hình 2.6 Cơ chế hoạt động Lignin peroxidase 21 Hình 2.7 Cơ chế hoạt động Mangan peroxidase 21 Hình 2.8 Cấu trúc phân tử Hemicellulose 26 Hình 4.1 Hoạt tính enzyme cellulase chủng vi sinh vật 45 Hình 4.2 Đồ thị đường chuẩn Glucose 46 Hình 4.3 Hoạt tính lignin peroxidase chủng vi sinh vật 47 Hình 4.4 Hình thái chủng M7 (Hình thái khuẩn lạc (1); Hình thái tế bào (2)) 49 Hình 4.5 Hình thái chủng R8 (Hình thái khuẩn lạc (1); Hình thái tế bào (2)) 49 Hình 4.6 Kết chạy điện di 50 Hình 4.7 Đồ thị khảo sát đánh giá số môi trường nuôi cấy chủng M7 51 Hình 4.8 Đồ thị khảo sát đánh giá số mơi trường ni cấy chủng R8 52 Hình 4.9 Đồ thị khảo sát độ pH chủng M7 54 Hình 4.10 Đồ thị khảo sát độ pH chủng R8 55 Hình 4.11 Đồ thị khảo sát nhiệt độ chủng M7 56 Hình 4.12 Đồ thị khảo sát nhiệt độ chủng R8 57 Hình 4.13 Đường cong sinh trưởng chủng M7 58 Hình 4.14 Đường cong sinh trưởng chủng R8 59 viii TÓM TẮT Mỗi năm lượng phế phụ phẩm sau thu hoạch vải thải lớn, thành phần chủ yếu cellulose lignin, hợp chất bền dễ dàng bị thuỷ phân enzyme đặc hiệu vi sinh vật tiết Vì đề tài nghiên cứu “Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn đánh giá khả phân giải lignin, cellulose từ phụ phẩm sau thu hoạch vải” đề xuất thực nhằm giải vấn đề nan giải Với mục tiêu, yêu cầu đặt cho đề tài phân lập tuyển chọn số vi khuẩn có khả phân giải cellulose lignin từ phế phụ phẩm sau thu hoạch vải; xác định số đặc tính enzyme chủng vi khuẩn đó; định danh chủng vi khuẩn khảo sát, đánh giá khả phân hủy phế phụ phẩm sau thu hoạch vải chúng Qua kết chọn chủng tốt M7 R8 Mơi trường ni cấy thích hợp cho chủng môi trường Hansen, pH nhiệt độ 55ºC Kết bước đầu đánh giá khả phân hủy phế phẩm cho thấy hàm lượng cellulose lignin giảm khoảng – 4% so với trước ủ, đặc biệt có mẫu phế phẩm giảm 7.06% Trong thời gian tới tiếp tục tiến hành nuôi cấy sinh khối với quy mô lớn ứng dụng thử nghiệm vào sản xuất chế phẩm vi sinh phân hủy phế phụ phẩm; thử nghiệm tìm cơng thức ủ phù hợp chế phẩm phế phụ phẩm hiệu tốt Từ khóa: phế phụ phẩm sau thu hoạch vải; enzyme phân giải cellulose lignin; khả phân hủy phụ phẩm ix lượng tế bào chết thiếu hụt chất dinh dưỡng; mật độ sinh khối đo với giá trị OD 600 dao động khoảng từ 1.6967 – 1.7943 Cuối giai đoạn suy vong, việc tiêu hao chất dinh dưỡng việc tích lũy chất thải độc hại, làm cho số lượng tế bào giảm; 48h giá trị OD 600 lúc 0.7382 Như thu sinh khối khoảng thời gian từ 24h đến 38h thích hợp nhất, quần thể đạt trạng thái cân bằng, số tế bào sinh mức cao tế bào vi khuẩn thời gian có sức sống tốt nhất, khả hoạt động enzyme cao  Đối với chủng R8 Đường cong sinh trưởng chủng R8 1.8 1.6 OD600 1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 2h 4h 6h 8h 10h 12h 14h 16h 18h 20h 22h 24h 26h 28h 30h 32h 34h 36h 38h 40h 42h 44h 46h 48h Thời gian Hình 4.14 Đường cong sinh trưởng chủng R8 Quan sát đồ thị ta thấy giai đoạn đầu số lượng tế bào tăng trưởng chậm q trình thích nghi với mơi trường mới, phân chia sinh sản, giá trị OD 600 cao đạt 0.3648 thời điểm 10h Tiếp đến pha logarit, số lượng tế bào tăng theo cấp số nhân, tốc độ phân chia tế bào đạt cực đại ổn định; từ 12h đến 26h, giá trị OD 600 tăng mạnh từ 0.4935 lên đến 1.7725 Khoảng thời gian từ 28h đến 38h giai đoạn pha cân bằng, giá trị OD 600 dao động khoảng từ 1.8296 – 1.8227 Trong pha này, vi khuẩn trạng thái 59 cân động học, số tế bào sinh số tế bào cũ chết đi, kết số tế bào sống không tăng không giảm Cuối pha suy vong, số lượng tế bào sống giảm mạnh, giá trị OD 600 thời điểm 48h 0.5673 Trong pha này, tế bào tự phân hủy nhờ enzyme chúng Như thời điểm thu sinh khối thích hợp khoảng thời gian từ 28h đến 38h, với số lượng sinh khối lớn khả hoạt động enzyme mạnh 4.5 Đánh giá khả phân hủy cellulose, lignin chủng vi sinh vật 4.5.1 Xác định thành phần nguyên liệu vải Tiến hành xác định thành phần vải cellulose lignin Để đánh giá hiệu phân hủy chủng vi sinh vật, cần xác định phần trăm trước ủ tất mẫu phế phụ phẩm Bảng 4.5 Thành phần nguyên liệu vải Mẫu phế phụ phẩm Lignin (%) Cellulose (%) Lá 21.48 35.00 Cành 21.94 35.50 Hạt 19.48 13.00 Vỏ 29.44 33.00 Theo nghiên cứu Latika Bhatia cộng (2014) xác định thành phần vỏ vải bao gồm 40 ± 0.38% cellulose, 28 ± 0.18% hemicellulose 25 ± 0.31% lignin Hai kết khác sử dụng phương pháp khác để xác định thành phần sai số q trình thực thí nghiệm 4.5.2 Xác định khả phân hủy cellulose, lignin chủng vi sinh vật Để tìm hiểu khả phân hủy phế phụ phẩm sau thu hoạch vải chủng vi sinh vật, tiến hành thí nghiệm ủ hai chủng vi sinh vật với mẫu phế phụ phẩm điều kiện bình thường thời gian ngày Sau kết thúc 60 thí nghiệm, tiến hành xác định lại thành phần phần trăm nguyên liệu so sánh với phần trăm ban đầu Bảng 4.6 Thành phần nguyên liệu vải sau ủ Mẫu phế Chủng M7 Chủng R8 phẩm Lignin (%) Cellulose (%) Lignin (%) Cellulose (%) Lá 19.04 31.50 17.61 32.5 Cành 19.04 34.00 19.48 33.0 Hạt 17.61 11.50 15.93 11.50 Vỏ 25.34 30.50 22.38 31.00 Bảng 4.7 Lượng phần trăm nguyên liệu giảm so với trước sau ủ Mẫu phế Chủng M7 Chủng R8 phẩm Lignin (%) Cellulose (%) Lignin (%) Cellulose (%) Lá 2.44 3.50 3.87 2.50 Cành 2.90 1.50 2.46 2.50 Hạt 1.87 1.50 3.55 1.50 Vỏ 4.10 2.50 7.06 2.00 Từ kết thu bảng ta thấy sau ủ mẫu phế phẩm với dịch enzyme chủng vi khuẩn qua ngày điều kiện phòng, thành phần phần trăm cellulose lignin mẫu phế phẩm giảm khoảng – 4% so với trước ủ Đặc biệt thành phần phần trăm lignin mẫu vỏ ủ với dịch enzyme chủng R8 giảm đến 7.06% Kết cho thấy khả phân hủy cellulose lignin phế phụ phẩm vải chủng M7 R8 tương đối tốt Theo báo cáo nghiên cứu Đinh Thị Hồng Duyên năm 2017 với đề tài “Tuyển chọn vi khuẩn có khả phân huỷ phế phụ phẩm sau thu hoạch vải” sử dụng chế phẩm V19 V98 để ủ với phế phụ phẩm, độ chênh lệch độ hoai mục so với đối chứng không sử dụng chế phẩm vào khoảng 12 – 14% sau 35 ngày ủ Như hai kết nghiên cứu gần tương đương 61 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ mẫu phế phụ phẩm thu vườn vải thiều Lục Ngạn (Bắc Giang) phân lập làm 12 chủng vi sinh vật Qua số thí nghiệm đánh giá tuyển chọn chủng tối ưu có khả phân hủy cellulose lignin tốt chủng M7 chủng R8 Mơi trường ni cấy thích hợp cho chủng môi trường Hansen, pH nhiệt độ 55ºC Kết bước đầu đánh giá khả phân hủy phế phụ phẩm vải cho thấy hàm lượng cellulose lignin giảm khoảng – 4% so với trước ủ, đặc biệt có mẫu phế phẩm giảm 7.06% Dựa vào kết nghiên cứu, ta chọn chủng M7 R8 để tiến hành nghiên cứu sử dụng sản xuất chế phẩm vi sinh với quy mô công nghiệp 5.2 Kiến nghị Tiếp tục tiến hành nuôi cấy sinh khối với quy mô lớn ứng dụng thử nghiệm vào sản xuất chế phẩm vi sinh phân hủy phế phụ phẩm Thử nghiệm tìm cơng thức ủ phù hợp chế phẩm phế phụ phẩm hiệu tốt 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Nguyễn Bảo Châu (2018) Nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật xử lý mùn cưa làm chất nuôi trồng mộc nhĩ tái sử dụng bã thải để trồng nấm sị Viện Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam, 155tr Nguyễn Lân Dũng (2014) Giáo trình vi sinh vật học Nhà xuất Hà Nội Trần Hoàng Dũng , Huỳnh Văn Hiếu , Trần Duy Dương Nguyễn Thành Công (2018) Phân lập chủng vi sinh vật có khả phân giải cellulose mạnh phục vụ sản xuất chế phẩm phân hủy rơm rạ Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, 60(6):32-36 Đinh Hồng Duyên, Nguyễn Thế Bình Vũ Thanh Hải (2015) Tuyển chọn đánh giá khả sử dụng xạ khuẩn để xử lý phụ phẩm sau thu hoạch vải Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nơng thơn, 15: 42-48 Đinh Hồng Duyên, Nguyễn Thế Bình Vũ Thanh Hải (2017) Tuyển chọn vi khuẩn có khả phân huỷ phế phụ phẩm sau thu hoạch vải Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, tập 53(B):61-70 Ngân Hà (2018) Giải pháp xử lý rơm bỏ mang lại kinh tế cao, Bản tin Nông nghiệp VnExpress ngày 08/06/2018, Truy cập ngày 02/10/2021 từ https://vnexpress.net/thoi-su/giai-phap-xu-ly-rom-bo-di-mang-lai-kinh-te-cao3760671.html Nguyễn Vũ Mai Linh, Phan Thị Hồng Thảo, Trần Thị Hương, Nguyễn Thị Hồng Liên, Đặng Thị Nhung, Nguyễn Văn Hiếu, Nguyễn Ngọc Minh, Nguyễn Kiều Băng Tâm Trần Anh Tuấn (2020) Phân lập tuyển chọn xạ khuẩn ưa nhiệt có khả phân hủy lignin từ mẫu mùn thu nhận Nhà máy giấy Bãi Bằng Tạp chí Cơng thương Nguyễn Ngơ Yến Ngọc, Lương Bảo Uyên Bùi Minh Trí (2014) Phân lập, đánh giá tối ưu hóa điều kiện ni cấy số chủng vi sinh vật có khả phân hủy đồng thời lignin cellulose Tạp chí sinh học, 36(1se):34-41 Trần Thạnh Phong (2004) Khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme cellulase từ T reesei A niger môi trường lên men bán rắn Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM, tr 24-36 Võ Văn Phước Quệ Cao Ngọc Điệp (2011) Phân lập nhận diện vi khuẩn phân giải cellulose Tạp chí Khoa học, 18a:177-184 Ngọc Quỳnh (2021) Lãng phí sử dụng phụ phẩm nông nghiệp, Bài viết Báo điện tử Hanoimoi ngày 10/09/2021, Truy 63 cập ngày 02/10/2021 từ http://www.hanoimoi.com.vn/tin-tuc/Kinh-te/1011601/lang-phi-su-dung-phu-phamtrong-nongnghiep?fbclid=IwAR31UUU2KMSmEPiFaf350KcKHbhblCrnT2J4NcvGJxjSZArrK WU_l2oFZvE Nguyễn Xuân Thành, Vũ Thị Hoàn, Nguyễn Thế Bình, Đinh Hồng Duyên (2007) Thực tập vi sinh vật chuyên ngành Nhà xuất Nông nghiệp Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm (2004), Công nghệ enzyme, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Thị Thu Thủy, Trần Thị Xuân Phương, Cao Thị Dung, Lê Thị Hương Xuân Trương Thị Hồng Hải (2017) Phân lập, tuyển chọn số chủng vi sinh vật có khả phân giải cellulose bước đầu ứng dụng xử lí phế phụ phẩm nơng nghiệp làm phân hữu vi sinh Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp, tập 1(1):159168 Hồ Sỹ Tráng (2006), Cơ sở hóa gỗ cellolose tập 2, NXB Khoa học Kỹ thuật: -14 Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng (1982) Enzyme VSV tập 2, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Nguyễn Quốc Việt, Nguyễn Vũ Việt Linh, Nguyễn Ngọc Kim Tuyến, Phạm Ngọc Sinh Nguyễn Anh Thư (2019) Quy trình xác định hàm lượng lignin sơ dừa Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Võ Thị Xuyến (2006) Bước đầu nghiên cứu tạo chế phẩm cellulase từ số chủng VSV khả thuỷ phân cellulose Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM Tài liệu tiếng anh Ahring, BK., Biswas, R., Ahamed, A., Teller, PJ., Uellendahl, H (2015) Making lignin accessible for anaerobic digestion by wet-explosion pretreatment Bioresour Technol 175:182–8 Bamforth, C.W., (2009) “Current perspectives on the role of enzymes in brewing,” Journal of Cereal Science, vol 50, no 3, pp 353–357 Bandounas, L., Wierckx, NJP., Winde, JH de and Ruijssenaars, HJ (2011) Isolation and characterization of novel bacterial strains exhibiting ligninolytic potential BMC Biotechnol 11: 94-102 Bayer E.A., et al (2004) The cellulosomes: multienzyme machines for degradation of plant cell wallpolysaccharides Annu Rev Microbiol 58, 521-554 64 Billings, AF., Fortney, JL., Hazen, TC., Simmons, B., Davenport, KW., Goodwin, L., et al (2015) Genome sequence and description of the anaerobic lignin-degrading bacterium Tolumonas lignolytica sp nov Stand Genomic Sci 10:106 Blanchette, RA (1995) Degradation of the lignocellulose complex in wood Can J Bot 73:999 Boyd, R.F., 1984 General microbiology Mosby: 197 Bugg, TD., Ahmad, M., Hardiman, EM., Rahmanpour, R (2011) Pathways for degradation of lignin in bacteria and fungi Nat Prod Rep 28:1883–96 Bugg, TD., Ahmad, M., Hardiman, EM., Singh, R (2011) The emerging role for bacteria in lignin degradation and bio-product formation Curr Opin Biotechnol 22:394–400 Camarero, S (1999) Description of a versatile peroxidase involved in the natural degradation of lignin that has both manganese peroxidase and lignin peroxidase substrate interaction sites J Biol Chem 274:10324–30 Galante, Y.M., DeConti, A., and Monteverdi, R., (1998) “Application of Trichoderma enzymes in food and feed industries,” in Trichoderma and Gliocladium—Enzymes, G F Harman and C P Kubicek, Eds., vol of Biological Control and Commercial Applications, pp 311–326, Taylor & Francis, London, UK Eliot, E., 1997 The science of composting CRC Press: 504 Francesca, GM., Lanzalunga, O., Lapi, A., Piparo, MGL.,, Mancinelli, S (2001) Isotopeeffect profiles in the oxidative N-Demethylation of N,N-Dimethylanilines catalysed by lignin peroxidase and a chemical model Eur J Org Chem 2001:2305–10 Francisco J Ruiz-Dueñas and Ángel T Martínez (2009) Microbial degradation of lignin: how a bulky recalcitrant polymer is efficiently recycled in nature and how we can take advantage of this Microbial Biotechnology, 2(2):164-177 Jayasinghe, PA., Hettiaratchi, JP., Mehrotra, AK., Kumar, S (2011) Effect of enzyme additions on methane production and lignin degradation of landfilled sample of municipal solid waste Bioresour Technol 102:4633–7 Harkin J.M., John R (1973) Syringaldezine, an effective reagent for detecting Laccase and Peroxidase in fungi Experientia, 29(4): 381 - 387 Howard, RL., Abotsi, E., Rensburg, ELJ., Howard, S (2003), "Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production", Afr J Biotechnol, 2(12): 602-619 65 Keerthana, S., Kalaiselvi, P., Maheshwari, M., and Kalaiselvi, T., (2019) Isolation and Screening of Lignin and Cellulose Degrading Proficient Microbial Strains from Diverse Biotic Substrates Based on Qualitative Traits International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, 8(7):475-483 Kluepfel, D., et al (1986) Characterization of cellulase and xylanase activities of Streptomyces lividans Applied microbiology and biotechnology 24, 230-234 Miller G (1959), "Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars", Anal Chem, 31: 426-428 Mnich, E., Vanholme, R., Oyarce, P., Liu, S., Lu, F., Goeminne, G., et al (2017) Degradation of lignin β-aryl ether units in Arabidopsis thaliana expressing LigD, LigF and LigG from Sphingomonas paucimobilis SYK-6 Plant Biotechnol J 15:581–93 Latika Bhatia and Sonia Johri (2017) FTIR mapping of peels of Litchi chinensis after acid streatment and its SSF for ethanol production by Pachysolen tannophilus MTCC 1077 Indian Jourmal of Biotechnology, 16:433-445 Laurent P., L Buchon, J.F.G Michel, N Orange, (2000) Production of pectate lyases and cellulases by Chyrseomonas luteola strain MFCL0 depends on the growth temperature and the nature of the culture medium: evidence for two critical temperatures App and Env Micro 66 (4) 1538- 1543 Peng, X., Kelly, RM., Han, Y (2018) fermentative Caldicellulosiruptor trophic Cupriavidus Sequential kronotskyensis and necator for converting rice processing with chemolithoauto straw and CO to polyhydroxybutyrate Biotechnol Bioeng 115:1624–9 Ralph, J., Lundquist, K., Brunow, G., Lu,, F., Kim, H., Schatz, P.F., et al (2004) Lignins: natural polymers from oxidative coupling of 4-hydroxyphenyl-propanoids Phytochem Rev 3, 29–60 doi: 10.1023/B:PHYT.0000047809.65444.a4 Reiter, J., Strittmatter, H., Wiemann, LO., Schieder, D., Sieber, V (2013) Enzymatic cleavage of lignin β-O-4 aryl ether bonds via net internal hydrogen transfer Green Chem 15:1373 Rodriguez, A., Perestelo, F., Carnicero, A., Regalado, V., Perez, R., Fuente, G de la., Falcon, M.A., (1996) Degradation of natural lignins and lignocellulosic substrates by soilinhabiting fungi imperfecti FEMS Microbiology Ecology, 21(3):213-219 Shahriarinour, M., et al (2011) Screening, isolation and selection of cellulolytic fungi from oil palmempty fruit bunch fibre Biotechnology 10, 108-113 66 Sigma Prod Sigma quality control test procedure No P-6782 https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigmaaldrich/docs/Sigma/Enzyme_Assay/ p6782enz.pdf Singh, A., Kuhad, R.C., and Ward, O.P., (2007) “Industrial application of microbial cellulases,” in Lignocellulose Biotechnologgy: Future Prospects, R C Kuhad and A Singh, Eds., pp 345–358, I.K.International Publishing House, New Delhi, India Tsegaye, B., Balomajumder, C., and Roy, P., (2018) Biodelignification and hydrolysis of rice straw by novel bacteria isolated from wood feeding termite 447 Wilson, K (2001) Preparation of Genomic DNA from Bacteria Current Protocols in Molecular Biology, 56(1), 2.4.1–2.4.5 doi:10.1002/0471142727.mb0204s56 Woo, HL (2014) Complete genome sequence of the lignindegrading bacterium Klebsiella sp strain BRL6-2 Stand Genomic Sci 9:19 Weidong Wang, LeiYan, Zongjun Cui, Yamei Gao, Yanjie Wang, Ruiyong Jing (2011) Characterization of a microbial consortium capable of degrading lignocellulose Bioresource Technology, 102(19):9321-9324 Zabel, RA., Morrell, JJ (2020) Wood microbiology decay and its prevention 2nd ed Elsevier Inc 67 PHỤ LỤC Phụ lục Khảo sát môi trường nuôi cấy  Đối với chủng M7 Bảng P.1 Khảo sát môi trường chủng M7 Thời Bước gian sóng OD Mơi trường OD600 0.0505 0.6817 0.6408 0.7280 OD540 0.0237 0.0628 0.0852 0.0750 OD405 0.0890 0.1410 0.1303 0.1302 OD600 0.0703 0.9825 1.0052 1.0177 OD540 0.0235 0.0952 0.1357 0.1273 OD405 0.1051 0.1730 0.1679 0.1575 OD600 0.0463 0.9986 1.4484 1.4933 OD540 0.0361 0.1031 0.1637 0.1568 OD405 0.1126 0.2486 0.2791 0.2336 OD600 0.0259 0.8529 0.9454 0.9366 OD540 0.0270 0.0595 0.1139 0.1233 OD405 0.0930 0.1987 0.2078 0.2106 (nm) 12h 24h 36h 48h  Đối với chủng R8 Bảng P.2 Khảo sát môi trường chủng R8 Thời gian 12h 24h Bước sóng Mơi trường OD (nm) OD600 0.0615 0.4329 0.4958 0.5420 OD540 0.0160 0.0557 0.0954 0.0655 OD405 0.0990 0.1189 0.1211 0.1102 OD600 0.0687 0.7782 0.8806 0.8730 OD540 0.0304 0.1058 0.1355 0.1048 68 36h 48h OD405 0.1329 0.1422 0.1360 0.1335 OD600 0.0453 0.5741 1.2606 0.9439 OD540 0.0331 0.1561 0.1731 0.1333 OD405 0.1479 0.1762 0.1922 0.1880 OD600 0.0220 0.3448 0.8210 0.6772 OD540 0.0226 0.1257 0.1313 0.1046 OD405 0.1056 0.1409 0.1481 0.1440 Phụ lục Khảo sát điều kiện nuôi cấy 2.1 Xác định độ pH tối ưu  Đối với chủng M7 Bảng P.3 Khảo sát độ pH chủng M7 Thời Bước gian sóng OD pH OD600 0.1870 0.1251 0.7516 0.6549 0.6608 0.5356 OD540 0.0615 0.0694 0.0979 0.0548 0.0657 0.0510 OD405 0.1163 0.1134 0.1375 0.1407 0.1152 0.1096 OD600 0.7016 0.7043 1.3616 1.2842 0.9221 1.1036 OD540 0.0887 0.0823 0.1295 0.0962 0.0939 0.0916 OD405 0.1334 0.1369 0.1805 0.1674 0.1321 0.1280 OD600 1.3517 1.3390 1.7866 1.5795 1.2907 1.2104 OD540 0.1024 0.1092 0.1622 0.1329 0.1171 0.1254 OD405 0.1566 0.1608 0.2570 0.2389 0.1735 0.1344 OD600 0.9913 0.6833 1.2024 0.8974 0.8122 0.8702 OD540 0.0922 0.0877 0.1387 0.1256 0.1075 0.1028 OD405 0.1052 0.1173 0.1811 0.1879 0.1401 0.1123 (nm) 12h 24h 36h 48h  Đối với chủng R8 69 Bảng P.4 Khảo sát độ pH chủng R8 Thời Bước gian sóng OD pH OD600 0.2835 0.3330 0.7593 0.6468 0.5865 0.4127 OD540 0.0644 0.0682 0.0880 0.0681 0.0742 0.0526 OD405 0.0988 0.1022 0.1286 0.1205 0.1031 0.1002 OD600 0.4088 0.6894 1.0171 0.8524 0.6462 0.8613 OD540 0.0898 0.0915 0.1126 0.0996 0.1015 0.0857 OD405 0.1051 0.1289 0.1485 0.1478 0.1143 0.1107 OD600 0.6443 0.9840 1.2422 0.9605 0.4870 0.3446 OD540 0.1132 0.1021 0.1442 0.1243 0.1247 0.1072 OD405 0.1142 0.1357 0.1906 0.1812 0.1366 0.1188 OD600 0.4797 0.7316 0.9335 0.6114 0.1667 0.1445 OD540 0.1007 0.0972 0.1293 0.1172 0.1156 0.0956 OD405 0.0977 0.1126 0.1541 0.1433 0.1037 0.0985 (nm) 12h 24h 36h 48h 2.2 Xác định nhiệt độ tối ưu  Đối với chủng M7 Bảng P.5 Khảo sát nhiệt độ chủng M7 Thời Bước gian sóng OD Nhiệt độ 30°C 37°C 40°C 45°C 50°C 55°C 60°C (nm) 12h 24h OD600 7817 0.8521 0.7908 OD540 0.0872 0.0986 0.1011 0.1007 0.0977 0.1153 0.0978 OD405 0.0988 0.1253 0.1195 0.1059 0.1035 0.1246 0.1042 OD600 1.0518 1.2490 1.2158 1.0370 1.1530 1.2771 1.1950 OD540 0.1092 0.1382 0.1210 0.1263 0.1128 0.1485 0.1202 OD405 0.1350 0.1646 0.1588 0.1344 0.1410 0.1673 0.1312 70 0.8131 0.8827 0.9319 0.7659 36h 48h OD600 1.3671 1.5744 1.4425 1.3716 1.6418 1.8248 1.5435 OD540 0.1258 0.1452 0.1325 0.1458 0.1386 0.1602 0.1359 OD405 0.1547 0.2031 0.2103 0.1562 0.1955 0.2378 0.1958 OD600 1.1219 1.3086 0.9079 1.1205 1.5430 1.6846 1.2149 OD540 0.1167 0.1254 0.1173 0.1360 0.1194 0.1342 0.1171 OD405 0.1021 0.1677 0.1569 0.1137 0.1348 0.1635 0.1206  Đối với chủng R8 Bảng P.6 Khảo sát nhiệt độ chủng R8 Thời Bước gian sóng OD Nhiệt độ 30°C 37°C 40°C 45°C 50°C 55°C 60°C (nm) 12h 24h 36h 48h OD600 0.6369 0.8117 0.7819 0.8136 0.9112 1.0284 0.6100 OD540 0.0964 0.1049 0.0915 0.0892 0.0905 0.1152 0.1028 OD405 0.1058 0.1137 0.1022 0.1159 0.1091 0.1266 0.1015 OD600 1.0653 1.2078 1.1412 1.2098 1.3045 1.3276 1.1737 OD540 0.1189 0.1268 0.1156 0.1139 0.1172 0.1396 0.1274 OD405 0.1217 0.1355 0.1257 0.1354 0.1288 0.1437 0.1209 OD600 1.4262 1.6651 1.5085 1.5152 1.6254 1.7682 1.5025 OD540 0.1357 0.1402 0.1325 0.1386 0.1390 0.1587 0.1416 OD405 0.1369 0.1689 0.1672 0.1605 0.1627 0.1903 0.1541 OD600 0.9783 1.3520 1.2236 1.1661 1.3261 1.5497 1.2247 OD540 0.1219 0.1293 0.1201 0.1247 0.1236 0.1491 0.1306 OD405 0.0960 0.1243 0.1355 0.1271 0.1309 0.1425 0.1210 71 Phụ lục Đường cong sinh trưởng Bảng P.7 Đường cong sinh trưởng chủng M7 R8 Mẫu 2h 4h 6h 8h 10h 12h 14h 16h M7 0.1526 0.2096 0.2592 R8 0.1337 0.2109 0.2697 Mẫu 18h 20h 22h 24h M7 1.090 1.105 1.2291 1.4918 1.2371 1.5155 34h 36h 38h R8 Mẫu 0.301 0.305 0.3529 0.514 0.3648 0.493 0.6968 0.8986 0.7015 0.8818 26h 28h 30h 32h 1.6967 1.745 1.6448 1.772 1.785 1.829 1.7945 1.7982 1.8315 1.8392 40h 44h 46h 48h 42h M7 1.802 1.8248 1.7943 1.682 1.4802 1.249 0.9937 0.7382 R8 1.845 1.8485 1.8227 1.734 1.4601 1.213 0.8856 0.5673 Phụ lục Đánh giá khả sinh trưởng chủng vi sinh vật ni mơi trường có bổ sung phế phụ phẩm Để xác định khả sống sót, sinh trưởng phát triển chủng vi sinh vật ủ chúng với phế phụ phẩm, tiến hành nuôi thử nghiệm chủng vi sinh vật môi trường có bổ sung phế phẩm với tỷ lệ khác Sau 36h đem đo với bước sóng OD khác nhau, đánh giá khả hoạt động chúng Bảng P.8 Khả sinh trưởng chủng ni mơi trường có phế phụ phẩm Chủng M7 Bước sóng Đối OD (nm) chứng (0%) OD600 1.4391 1% (1) 1% (2) 5% (1) 5% (2) 1.8775 1.7380 0.8699 0.8597 OD540 0.1493 0.1556 0.1319 0.1475 0.1378 72 0.2812 0.2601 0.2549 0.1763 0.1827 OD600 1.3827 1.5911 1.5326 0.8209 0.9210 OD540 0.1396 0.1599 0.1452 0.1283 0.1311 OD405 0.1965 0.1879 0.1802 0.1298 0.1377 Chủng M7 1.5 0.2 0.15 0.1 0.5 0.05 0% 1% (1) 1% (2) 5% (1) 5% (2) OD540 OD405 1.4 1.2 0.8 0.1 0.6 0.4 0.05 0 OD600 1.8 1.6 0.2 0.15 OD600 OD hoạt độ enzyme 0.25 Chủng R8 0.25 OD hoạt độ enzyme 0.3 OD600 R8 OD405 0.2 0% 1% (1) 1% (2) 5% (1) 5% (2) OD540 OD405 OD600 Hình P.1 Đồ thị đánh giá khả sinh trưởng chủng ni mơi trường có phế phụ phẩm Từ kết đo sau 36h nuôi bảng ta thấy nuôi môi trường có bổ sung 1% phế phụ phẩm chủng M7 R8 sinh trưởng hoạt động tốt hơn, cao ống đối chứng không bổ sung chế phẩm Ở ống ni có bổ sung 5% phế phẩm khả sinh trưởng chủng vi khuẩn giảm mạnh Từ thí nghiệm đưa phương pháp tỷ lệ ủ trộn hợp lý để đạt hiệu tốt 73