Nghiên cứu ứng dụng phương pháp đột biến nhằm tăng cường khả năng đối kháng bệnh héo xanh cà chua do vi khuẩn RALSTONIA SOLANACEARUM của một số chủng vi khuẩn đối kháng

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ………… o0o………… TRẦN QUANG MINH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐỘT BIẾN NHẰM TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG BỆNH HÉO XANH CÀ CHUA DO VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ………… o0o………… TRẦN QUANG MINH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐỘT BIẾN NHẰM TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG BỆNH HÉO XANH CÀ CHUA DO VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Ngun http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tơi xin cảm ơn phịng Đào tạo thầy cô giáo Cơ sở đào tạo sau đại học Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam quan tâm, tạo điều kiện cho q trình học tập Để hồn thành luận văn tốt nghiệp này, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn kính trọng sâu sắc tới TS Lê Như Kiểu – Trưởng môn Vi sinh vật – Viện Thổ nhưỡng Nơng hóa tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ tơi suốt q trình thực tập Tôi xin gửi lời cảm ơn đến cô anh chị môn Vi sinh vật – Viện Thổ nhưỡng Nơng hóa giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực tập Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè động viên, góp ý giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thời gian thực tập Hà Nội, ngày 28 tháng 12 năm 2010 Học viên Trần Quang Minh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BẢNG KÝ HIỆU VIẾT TẮT ADN Axít deoxyribonucleic AO Acridine da cam ARN Axít ribonucleic Bp Base pair (cặp bazơ) rARN ARN riboxom Chc Các bon hữu CFU Colony forming unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc) CT Công thức cs Cộng ĐC Đối chứng Nts Nitơ tổng số PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) Pts Phốt tổng số VSV Vi sinh vật VSVĐK Vi sinh vật đối kháng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC BẢNG Tên bảng Trang Bảng Đặc tính sinh lý sinh hố vi khuẩn R.solanacearum Bảng Đánh giá độc tính vi khuẩn Ralstonia solanacearum 26 Bảng Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn phân lập 34 từ đất bệnh bệnh Bảng Nguồn gốc đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn 44 phân lập Bảng Hoạt lực đối kháng chủng vi khuẩn với đại diện 45 chủng R solanacearum Bảng Đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn đối kháng 47 Bảng Kết định danh chủng vi khuẩn đối kháng 49 chương trình NCBI BLAST Bảng Kích thước vịng đối kháng thể đột biến chủng 50 DM nồng độ xử lý AO 24 µl/ml Bảng Kích thước vòng đối kháng thể đột biến chủng 51 DM nồng độ xử lý AO 30 µl/ml Bảng 10 Kích thước vịng đối kháng thể đột biến chủng BK 53 nồng độ xử lý AO 24µl/ml Bảng 11 Kích thước vịng đối kháng thể đột biến chủng 54 BK1 nồng độ xử lý AO 30 µl/ml Bảng 12 Tác động số thể đột biến lên bệnh héo xanh cà chua 57 điều kiện nhà kính Bảng 13 Ảnh hưởng số thể đột biến đến khả sinh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 http://www.lrc-tnu.edu.vn trưởng phát triển cà chua giống HT7 tuần tuổi Bảng 14 Kết thử độc tính chế phẩm đối kháng chuột 59 Bảng 15 Kết xử lý thống kê trọng lượng chuột thí nghiệm 60 Bảng 16 Ảnh hưởng thành phần môi trường lên men đến mật độ 63 hoạt tính sinh học hai thể đột biến Bảng 17 Ảnh hưởng nhệt độ môi trường lên men đến mật độ 67 hoạt tính sinh học hai thể đột biến Bảng 18: Ảnh hưởng độ pH môi trường lên men đến mật độ hoạt 67 tính sinh học hai thể đột biến Bảng 19 Mật độ vi khuẩn đột biến chất mang khác 67 sau tháng lưu giữ bảo quản Bảng 20 Thành phần lý hóa than bùn 69 Bảng 21 Thành phần lý hóa bột bã mía 69 Bảng 22 Kích thước vịng đối kháng thể đột biến chế 71 phẩm Bảng 23 Một số tính chất hóa học sinh học đất thí nghiệm 73 (Mê Linh- Hà Nội) Bảng 24 Khả phòng chống bệnh héo xanh cà chua thể đột 74 biến ruộng trồng xã Tiền Phong- Mê Linh- Hà Nội Bảng 25 Ảnh hưởng chế phẩm vi khuẩn đột biến đến suất 76 cà chua xã Tiền Phong- Mê Linh- Hà Nội Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Ngun http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC HÌNH Tên hình Trang Hình Cây cà chua bị bệnh héo xanh R Solanacearum 39 Hình Biểu triệu chứng nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn lát 40 cắt dọc đoạn thân cà chua Hình Một số hình thái khuẩn lạc đại diện cho vi khuẩn 41 gây bệnh héo xanh cà chua Hình Sản phẩm PCR chủng vi khuẩn gây bệnh cà 43 chua Hình Hoạt tính đối kháng số chủng vi khuẩn 46 Hình Hoạt tính đối kháng số thể đột biến 52 Hình Khả phòng trừ bệnh héo xanh số thể đột biến 56 điều kiện nhà lưới Hình Hình ảnh chuột sau tuần thí nghiệm 60 Hình Hoạt tính đối kháng thể đột biến chế phẩm sau 72 tháng Hình 10 Các giai đoạn bón chế phẩm vi sinh vật đột biến Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 74 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Cơ sở khoa học đề tài Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Mục tiêu đề tài Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình gieo trồng cà chua Việt Nam giới 1.2 Bệnh héo xanh cà chua 1.3 Mức độ phổ biến gây hại R solanacearum 1.4 Vi khuẩn Ralstonia solanacearum 1.4.1 Hình thái phân loại 1.4.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá vi khuẩn R solanacearum 1.4.3 Tính độc Ralstonia solanacearum 1.5 Các đường xâm nhiễm vi khuẩn R solanacearum 1.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển vi khuẩn R.solanacearum 1.6.1 Nhiệt độ khơng khí 1.6.2 Nhiệt độ đất 1.6.3 Cường độ chiếu sáng 1.6.4 Độ ẩm đất 1.6.5 Ảnh hưởng loại đất 1.7 Biện pháp phòng trừ 1.7.1 Biện pháp hóa học 1.7.2 Biện pháp sinh học 1.8 Phòng trừ bệnh hại trồng phương pháp sinh học 1.8.1 Khái niệm 1.8.2 Lựa chọn tác nhân phòng trừ sinh học 1.8.3 Sử dụng tác nhân vi sinh vật phòng bệnh hại thực vật 1.9 Nghiên cứu đột biến 1.9.1 Khái niệm đột biến 1.9.2 Gây đột biến nhân tạo tác nhân vật lý 1.9.3 Gây đột biến nhân tạo tác nhân hoá học 1.10 Phương pháp phát đột biến 1.10.1 Phương pháp đề kháng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên i Trang 1 2 3 4 6 11 11 11 12 12 12 12 13 13 13 14 14 15 15 16 16 17 17 19 19 http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.10.2 Phương pháp làm giàu chậm 1.10.3 Phương pháp làm giàu hạn chế 1.10.4 Phương pháp làm giàu nhờ penicilline 1.10.5 Phương pháp lọc 1.10.6 Trong phương pháp in 1.11 Mục đích tạo thể đột biến 1.12 Ảnh hưởng liều lượng cường độ chất gây đột biến 1.13 Thành tựu chọn tạo giống vi sinh vật phương pháp đột biến 1.13.1 Một số thành tựu chọn tạo giống vi sinh vật phương pháp đột biến giới Việt Nam II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phân lập tuyển chọn chủng Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh cà chua 2.2.1.1 Thu mẫu phân lập vi khuẩn gây bệnh 2.2.1.2 Đánh giá tính độc R solanacearum 2.2.1.3 Nhận dạng vi khuẩn R solanacearum kỹ thuật PCR 2.2.2 Phương pháp phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật đối kháng 2.2.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân loại chủng vi khuẩn đối kháng 2.2.3.1 Xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa 2.2.3.2 Phân loại vi sinh vật đối kháng phương pháp tự gen phần tử 16S rARN 2.2.4 Phương pháp xử lý đột biến 2.2.5 Phương pháp đánh giá khả phòng chống bệnh héo xanh cà chua chế phẩm vi sinh vật điều kiện nhà lưới quy mơ nhỏ 2.2.6 Đánh giá tính an tồn chủng vi sinh vật đối kháng 2.2.7 Phương pháp đánh giá khả kiểm soát bệnh héo xanh cà chua chế phẩm vi sinh đối kháng đồng ruộng 2.2.8 Phương pháp xử lý số liệu III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập tuyển chọn vi khuẩn R.solanacearum gây bệnh héo xanh cà chua 3.1.1 Thu mẫu, phân lập tuyển chọn vi khuẩn gây bệnh 3.1.2 Thử nghiệm tính độc chủng R solanacearum 3.1.3 Nhận dạng vi khuẩn R solanacearum kỹ thuật PCR 3.2 Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật đối kháng với R solanacearum từ mẫu đất trồng cà chua Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ii 19 20 20 20 20 21 21 22 22 24 24 25 25 25 26 27 29 32 32 34 35 36 37 37 38 39 39 39 42 42 43 http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.2.1 Thu mẫu, phân lập vi khuẩn đối kháng 3.2.2 Đánh giá hoạt lực đối kháng chủng vi khuẩn 3.3 Nghiên cứu hoạt tính sinh học phân loại chủng vi sinh vật đối kháng 3.3.1 Nghiên cứu hoạt tính sinh học 3.3.2 Phân loại vi sinh vật đối kháng phương pháp giải trình tự gen phần tử 16S rARN 3.4 Xử lý đột biến tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính đối kháng cao với vi khuẩn R Solanacearum gây bệnh héo xanh phương pháp đột biến 3.4.1 Xử lý đột biến tuyển chọn thể đột biến 3.5 Đánh giá khả kiểm soát bệnh héo xanh cà chua số thể đột biến nhà lưới 3.6 Đánh giá tính an tồn chủng vi sinh vật đối kháng 3.7 Nghiên cứu, sản xuất chế phẩm vi sinh vật đột biến phòng trừ bệnh héo xanh cà chua 3.7.1 Giống vi sinh vật 3.7.2 Môi trường nhân giống 3.7.3 Nghiên cứu lựa chọn môi trường sản xuất 3.7.4 Một số yếu tố ảnh hưởng q trình lên men thu sinh khối 3.7.4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình lên men vi khuẩn đột biến 3.7.4.2 Ảnh hưởng pH đến trình lên men vi khuẩn đột biến 3.7.4.3 Nghiên cứu lựa chọn chất mang 3.7.4.4 Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm vi khuẩn đột biến 3.7.4.5 Đánh giá hoạt tính đối kháng chế phẩm đột biến thời gian bảo quản 3.8 Đánh giá hoạt tính đối kháng chế phẩm điều kiện đồng ruộng IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ V TÀI LIỆU THAM KHẢO A Phần tiếng Việt B Phần tiếng Anh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên iii 43 45 47 47 48 50 50 55 58 61 61 61 62 64 64 65 69 70 71 72 77 77 78 79 79 82 http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 25 Ảnh hưởng chế phẩm vi khuẩn đột biến đến suất cà chua xã Tiền Phong- Mê Linh- Hà Nội Nhóm cơng thức Tên cơng thức thí nghiệm CT1: Đất + R solanacearum (ĐC) CT2: Đất + R solanacearum + DM Nhóm CT3: Đất + R solanacearum + BK CT4: Đất + R solanacearum + BK37 CT5: Đất + R solanacearum + DM12 LSD 5% ĐC: Đất CT6: Đất + DM Nhóm CT7: Đất + BK CT8: Đất + BK37 CT9: Đất + DM12 LSD 5% Năng suất trung bình (kg/5m2) 4,90 6,73 8,47 12,07 13,90 2,27 10,0 19,07 18,77 19,73 19,87 5,13 Năng suất so với ĐC ( %) 37,4 72,9 146,3 183,7 90,7 87,7 97,3 98,7 Kêt bảng 25 cho thấy:Ở công thức có bổ sung chế phẩm vi sinh đối kháng làm tăng tỷ lệ sống sót nên suất thu hoạch cà chua cao so với công thức đối chứng điều kiện từ 37,4% đến 183% điều kiện lây nhiễm nhân tạo 87,7% đến 97,3% điều kiện có mầm bệnh tự nhiên Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 76 IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1.1 Đã phân lập 05 chủng vi khuẩn HX1, HX2, HX3, HX4 HX5 chủng vi khuẩn gây bệnh héo xanh cà chua; định danh xác 05 chủng thuộc lồi R solanacearum; 1.2 Đã phân lập tuyển chọn 09 chủng D1, D3, D7, D8, LG10, D12 , K4, K8, K9 thể hoạt tính đối kháng với vi khuẩn R solanacearum, tất chủng đối kháng có kích thước vòng ức chế từ  12 mm; 1.3 Dựa vào kết đặc điểm sinh lý, sinh hóa kết tra cứu theo khóa phân loại chi phổ biến chủng D8, D12, K8, K9 thuộc chi Pseudomonas, chủng D3 thuộc chi Burkholderia, Chủng D10 thuộc chi Erwinia, chủng D1, D7, K4 thuộc chi Bacillus - Dựa vào kết giải trình tự đoạn 16S rARN kết luận chủng vi khuẩn DM(D8) thuộc loài Pseudomonas fluorescens 1.4 Tuyển chọn 02 chủng đột biến DM12 BK37 có hoạt tính đối cao kháng vi khuẩn gây bệnh héo xanh cà chua điều kiện invitro; - Các chủng sử dụng sản xuất chế phẩm không ảnh hưởng tiêu cực đến khả sinh trưởng phát triển cà chua non an toàn chuột 1.5 Đã hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm vi khuẩn đột biến - Các thể đột biến có khả trì hoạt lực đối kháng cao chế phẩm bảo quản điều kiện bình thường (6 tháng) Kết thử nghiệm đồng ruộng cho thấy: Trong điều kiện bổ sung mầm bệnh nhân tạo chủng BK DM có tỷ lệ sống sót 13,34 % 10 % Đối với cơng thức thí nghiệm sử dụng chủng đột biến BK37 tỷ lệ lên tới 43,34 %; cơng thức thí nghiệm sử dụng chủng đột biến DM12 45 %; Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 77 Trên mầm bệnh tự nhiên sẵn có, tỷ lệ sống sót công thức sử dụng vi khuẩn đối kháng dạng dại 11,66 %; tỷ lệ sống sót cơng thức thí nghiệm có sử dụng chủng đột biến BK37 20%; công thức thí nghiệm sử dụng chủng đột biến DM12 21,66% Đặc biệt công thức sử dụng chủng đột biến làm tăng tỷ lệ cà chua sống sót từ 8,4 % (BK37) đến 10 % (DM12) điều kiện lây nhiễm mầm bệnh nhân tạo 30 % (BK37) đến 35 % (DM12) điều kiện sử dụng mầm bệnh tự nhiên so với chủng dạng dại KIẾN NGHỊ 2.1 Sử dụng phương pháp khác để định danh xác chủng vi khuẩn Bacillus K4 (Dùng Kit API, Bioblog…) 2.2 Tiếp tục thử nghiệm chế phẩm vi sinh vật đối kháng bệnh héo xanh cà chua diện rộng hơn, vùng sinh thái khác để khẳng định rõ hiệu lực chế phẩm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 78 V TÀI LIỆU THAM KHẢO A Phần tiếng Việt Nguyễn Ngọc Cường, Lê Như Kiểu, Hoàng Hoa Long, Đào Thị Thu Hằng, Trần Duy Quý (1997 - 1998), “Đặc trưng vi khuẩn Pseudomonas solanacearum gây bệnh héo xanh cà chua miền Bắc Việt Nam phương pháp chẩn đoán nhanh”, Kết nghiên cứu khoa học - Viện Di truyền Nông nghiệp, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr 313 - 320 Nguyễn Xuân Cảnh, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn ánh Nguyệt, Phạm Minh Hương, Ngơ Đình Bính Nguyễn Văn Tuất (2003), “Một số kết nghiên cứu sản xuất ứng dụng thuốc trừ sâu sinh học BT điều kiện Việt Nam”, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, tr 178 183 Nguyễn Hoàng Chiến, Vương Trọng Hào (2001), “Nghiên cứu khả sinh tổng hợp chất kháng sinh chống vi khuẩn gây héo xanh cà chua chủng xạ khuẩn Streptomyces albogriseolus V6”, Tạp chí Sinh học, tập 23-3b, tr 96 – 101 Cục Bảo vệ thực vật (1987), Phương pháp điều tra phát sâu bệnh hại trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr 138 Đường Hồng Dật (1997), Sổ tay bệnh hại trồng, tập II, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr 420 Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứu Vi sinh vật học, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty, Dương Đức Tiến (1975), Vi sinh vật học tập 1, NXB Đại học THCN, Hà Nội Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 79 Nguyễn Lân Dũng (1976), Thực tập Vi sinh vật học (Dịch từ gốc Egokob N.X), NXB Đại học THCN, Hà Nội Nguyễn Ngọc Dũng, Nguyễn Thị Tuyết Nhung, Nguyễn Minh Anh (2003), “Sử dụng vi khuẩn Pseudomonas sinh huỳnh quang phòng chống nấm gây bệnh trồng”, Proceedings Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc, tr 66 - 69 10 Đỗ Tấn Dũng (2002), Nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn (Pseudomonas solanacearum Smith) hại số trồng ngoại thành Hà Nội vùng phụ cận, Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp, Trường đại học Nông nghiệp I Hà Nội 11 Đỗ Tấn Dũng (1995a), “Tính phổ biến bệnh vi khuẩn gây héo rũ (Bacterial Wilt) số trồng cạn vùng Hà Nội phụ cận”, Tạp chí Bảo vệ Thực vật, 2, tr 38 - 42 12 Đỗ Tấn Dũng (1995b), “Một số kết nghiên cứu bệnh vi khuẩn héo rũ cà chua”, Tạp chí Bảo vệ Thực vật, 2, tr 47 - 50 13 Đỗ Tấn Dũng (1995c), “Kết nghiên cứu bệnh héo xanh cà chua vùng Đông Anh , Hà Nội (1992 - 1995)”, Kết nghiên cứu khoa học Khoa Trồng trọt 1994 - 1995, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội, tr 186 192 14 Đỗ Tấn Dũng, Đào Đức Thứ, Lê Lương Tề (1997), “Một số kết điều tra nghiên cứu bệnh héo rũ thuốc (Pseudomonas solanacearum Smith) vùng Hà Nội phụ cận”, Tạp chí Bảo vệ Thực vật, 6, tr 20 - 24 15 Quản Lê Hà, Ngô Minh Ngọc (2003), “Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật đối kháng bảo quản cam”, Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc, tr 227 - 230 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 80 16 Hướng dẫn nghiên cứu bệnh vi khuẩn thực vật, Izrainxki V.P.(1988), (Hà Minh Trung, Nguyễn Văn Hành dịch) NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr 258 17 Kết nghiên cứu bệnh hại khoai tây, Kết nghiên cứu Khoa học Bảo vệ thực vật năm 1971-1976, Viện Bảo vệ thực vật, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr 146, (Hà Minh Trung, Vũ Khắc Nhượng dịch) 18 Kiraly Z., Klement Z., Solymosy F., Voros J (1982), Những phương pháp nghiên cứu bệnh cây, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr 183 - 199 19 Lương Đức Phẩm, Nguyễn Thế Trang, Nguyễn văn HIếu (2003), “Bước đầu nghiên cứu tìm chủng vi khuẩn có khả đối kháng với nấm bệnh Phytophthora sp gây thối cổ rễ vải nõn dừa”, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, tr 400 -402 20 Lê Lương Tề (1997), “Ảnh hưởng số yếu tố sinh thái bệnh héo rũ vi khuẩn hại lạc vùng đất bạc màu trung du Bắc Bộ”, Tạp chí Bảo vệ thực vật, 4, tr - 21 Đoàn Thị Thanh, Nguyễn Xuân Hồng, Vũ Triệu Mân (1995), “Nghiên cứu vi khuẩn Pseudomonas solanacearum số ký chủ miền Bắc Việt Nam, Các cơng trình nghiên cứu nghiên cứu sinh, 5, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr 273 - 278 22 Phạm Chí Thành (1988) Giáo trình Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng, tr 31 - 134 23 Phạm Văn Toản (2003), “Khả sử dụng hỗn hợp vi sinh vật làm phân bón chức cho số trồng nông nghiệp, công nghiệp lâm nghiệp”, Hội nghị Công nghệ Sinh học tồn quốc, tr 127 - 131 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 81 24 Phạm Xuân Tùng (1995), “ Di truyền tính chống chịu héo tươi Pseodomonas solanacearum Smith khoai tây”, Tạp chí Nơng nghiệp Cơng nghiệp Thực phẩm, 391, tr 33 - 35 25 Phạm Văn Ty, Đào Thị Lương (2003), “Khả sinh kháng sinh chống vi khuẩn gây bệnh héo xanh Streptomyces arabicus 112”, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, tr 145 - 149 26 Nguyễn Hương Trà, Nguyễn Thị Hồng Hà, Nguyễn Thuỳ Châu (2003), “Phân lập tuyển chọn số chủng vi khuẩn Lactic sinh chất diệt khuẩn sinh học Bacteriocin”, Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc, tr 403 - 406 27 Viện Bảo vệ thực vật, I (1997), Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr 99 B Phần tiếng Anh 29 Aarons S R., Danesh D and Young N D (1993), Mapping genes for bacterial wilt resistance in tomato with DNA markers In: Hartman G I and Hayward A.C (eds) Bacterial Wilt Proceedimgs of an international sympsium, Kaoh-siung, Taiwan, ROC, 28-31 October 1992 ASIAR Proceeding 45, 170 - 175, ACIAR, Canberra 30 Abo-El-Dahab M., and El-Goorani M (1969), Antagonism among strains of Pseudomonas solanacearum, Phytopathology 59, pp 1005 1007 31 Anderson R.C., and Gardner D.E (1999), An evaluation of the wiltcausing bacterium R solanacearum as a potebtial biological control agent for the alien kahili ginger (Hedychium gardnerianum) in Hawaiian forest, Biological Control 15, pp 89 - 96 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 82 32 Anuratha C., and Gnanamanickam S (1990), Biological control of bacterial wilt caused by Pseudomonas solanacearum in India with antagonistic bacteria, Plant and Soil 124, pp 109 - 116 33.Arnheim, N., Erlich H (1992), Polymerase chain reaction stratgy Annu Rev Biochem 61, p 131- 156 33 Aspiras r B and Cruz A R (1986), Potential biological control of bacterial wilt in tomato and potato with Bacillus polymyxa Fu6 and Pseudomonas fluorescences In: Presley G.J ed., Bacterial wilt in Asia and the South Pacific, ACIAR Proceeding, 13, pp 89 - 92 34 Averre C., and Kelman A (1964), Severity of bacterial wilt as influenced by ratio virulent of two avirulent cells of Pseudomonas solanacearum in inoculum, Phytopathology 54, pp 779 - 783 35 AVRDC Internal Review and Planning Workshop (2000), - December, 2000 at Asian Vegetable Research and Development Center, Tainan 741, Taiwan 36 Boucher C A., Gough C.L., and Arlat M (1992), Molecular genetics of pathogenicity determinants of Pseudomonas solanacearum with special emphasis on hrp genes, Annual Review of phytopathology 30, pp 443 - 461 37 Buddenhagen I., and Kelman A (1964), Biological and physiological aspects of bacterial wilt caused by Pseudomonas solanacearum, Annual Review of Phytopathology 2, pp 203 - 230 38 Buddenhagen I W (1965), The relation of plant pathogenic bacteria to the soil In Ecology of Soil-borne Plant Pathogens: Preclude to Biological Control University of California Press, Berkeley, pp 269 282 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 83 39 Buddenhagen I.W., and Kelman A (1991), Biological and physiological aspects of bacterial wilt caused by Pseudomonas solanacearum, Annu Rev Phytopathol 29, pp 65 - 72 40 Chae Gun Phae., Makoto Shoda., Nobuhiro Kita (1992), Control of crown and root rot and bacterial wilt of tomato by Bacillus subtilis NB22, Phytopath Soc Japan 58, pp 329 - 339 41 Chen W., and Echandi E (1984), Effects of avirulent bacteriocinproducing strains of Pseudomonas solanacearum on the control of bacterial wilt of tobacco, Plant Pathology 33, pp 245 - 253 42 Comparison of two methods of 16S rARN sequencing for bacterial identification, (2002), http://www.cacmid.ca/abstracts/a5.html 43 Denny T P., Black S R (1991), Gentic evidence that extracellular polysaccharide is a virulence factor of Pseudomonas solanacearum, Science 220, pp 1214 - 1335 44 De Vos P., M Goor M., Gillis., and J De Ley (1985), Ribosomal ribonucleic acid cistron similarities of phytopathogenic Pseudomonas species int, J Syst Bact 35, pp 169 - 184 45 Emil Q., Javier (1994), Foreword Bacterial wilt: The Disease and Its Causative Agent, Pseudomonas solanacearum edited by Hayward, A.C and Hartman G.L Cab international 46 FAO [Food and Agriculture Organization of the United Nations] (1992) FAO Statistics Series 104 FAO (1990), Yearbook Production 45, pp 130 47 Fravel D.R (1988), Role of antibiosis in the biocontrol of plant disaese, Annu Rev Phytopathol 26, pp 75 - 91 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 84 48 Geels and Schippers (1983), Selection of Antagonistic Fluorescent Pseudomonas sp and their Root Colonization and Persistance following Treatment of Seed Potato, Phytopath Z, 108, pp 193 - 206 49 Giuliano Bernal et al (2002) Isolation and partial purification of a metabolite from a mutant strain of Bacillus sp with antibiotic activity against plant pathogenic agents EJB Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717 - 3458 Vol.5 No.1, Issue of April 15 50 Gross D., and Vidaver A (1990), Bacteriocins In: Klement Z., Rudolph K., and sands D., (eds) Methods in Phytobacteriology, pp 246-249 Akademiae Kiado, Budapest, Hungary 51 Hamidah S., and Lum K Y (1993), BW of groundnut in Malaysia, pp 10 in G.B.W: procceedings of the Second Working Group meeting, Nov 1992, Asian Vegetable Research and Development Center, Tainan, Taiwan 52 Hayward A C (1960), Characteristics of Pseudomonas solanacearum Journal of Applied Bacteriology 27, pp 265 - 277 53 Hayward A C (1994), The hosts of Pseudomonas solanacearum In: Bacterial Wilt: The disease and its causative agent, Pseudomonas solanacearum Ed Hayward and Hartman CAB Internation, UK, pp - 24 54 Hayward A C., Fegan M., Taghavi M (1997), Phylogeny, diversity and molecular diagnostics of Ralstonia solanacearum, The 2nd IBWS, Guadelloupe, France, 22-27 June 1997, Book of abstract, pp 14 55 He L.Y., Sequeira L., and Kelman A (1983), Characteristics of strains of Pseudomonas solanacearum from China, Plant Disease 67, pp 1357 1362 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 85 56 Henson J M., French R (1993), The Polymerase Chain Reaction and plant disease diagnosis, Annu Rev Phytopathol 31, pp 81 - 109 57 Kelman A (1953), The Bacterial Wilt caused by Pseudomonas solanacearum A literature review and bibliography North Corolina Agricultural Experimental Station Bulletin 99, pp.194 58 Kelman A (1954), The relationship of pathogenicity in P solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium, Phytopathology 44, pp 693 - 695 59 Kelman A., and L Sequeira (1965), Root-to-root spread of Pseudomonas solanacearum Phytopathol 55, pp 304 - 309 60 Kelman A., and Hruschka J (1973), The role of motility and aerotaxis in the selective increase of avirulent bacteria in still broth cultures of Pseudomonas solanacearum, Journal of general Microbiology 76, pp 177-188 61 Kelman A., Hartman C L., and Hayward A.C (1994), Introduction in Bacteial Wilt Hayward, A C and Hartman G L (Eds), CAB, pp 1- 62 Kelman A (1997), One hundred and one years of research on Bacterial wilt Reports of the Second International Bacterial Wilt Symposium held in Kamala-Nayar., Mathew J., Kuriyan J., and Nayar K (1988), Role and association of root-knot nematode (Meloidogyne incognita) in the bacterial wilt of brinjal incited by Pseudomonas solanacearum, Journal of Bacteriology 170, pp 1326-1332 63 Master Class on Bacterial Molecular Genetics: Its Importance on Bacterial Wilt (1996), [Asian Vegetable Research and Development Center], pp 40-41 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 86 64 Mew T.M., and Ho W.C (1977), Effect of soil temperature on resistance of tomato cultivars to bacterial wilt, Phytopathology 67, pp 909-911 65 Meyer, J.-M., A Stintzi., D De Vos., P Cornelis., R Tappe., K Taraz., and H Budzikiewicz (1997), Use of siderophores to type pseudomonads: the three Pseudomonas aeruginosa pyoverdine systems Microbiology 143, pp 35-43 66 Meyer, J.-M., and A Stintzi (1998), Iron metabolism and siderophores in Pseudomonas and related species, In T C Montie, pp 201-243 67 Meyer, J.-M., V A Geoffroy., C Baysse., P Cornelis., I Barelmann., K Taraz., and H Budzikiewicz (2002) Siderophore-mediated iron uptake in fluorescent Pseudomonas: characterization of the pyoverdine-receptor binding site of three cross-reacting pyoverdines, Arch Biochem Biophys 397, pp 179-183 68 Mieslerova B., Lebeda A., Chetelat R.T (2000), Variation in response of wild Lycopersicon and Solanum sp against tomato powdery mildew (Oidium lycopersici) J Phytopathol 148, pp 303-311 69 Nei M., Kumar S (2000), Molecular evolution and phylogentic Oxford University Press 70 Nesmith W., and Jenkins W (1985), Influence of antagonists and controlled matric potential on the survival of Pseudomonas solanacearum in four North Carolina soil, Phytopathology 75, pp 1182-1187 71 Orgambide G., Montrozier H., Servin P., Roussel J., Demery D., and Trigalet A (1991), High heterogenity of the exopolysaccharides of Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 87 Pseudomonas solanacearum strain GMI 1000 and the complete structure of the major polysaccharide, J Biol Chem 266, pp 83128321 72 Phae C G., Shoda M., and Ushiyama K (1992), Biological Control of crown and root rot and Bacterial wilt of tomato by bacillus subtilis NB 22, Annals of the Phytopathological Society of Japan, 58, pp 329339 73 Poussier S (2000) Gentic diversity of Ralstonia solanacearum as assessed by PCR-RFLP of the hrp gen region, AFLP and 16S rRNA sequence analysis, and identification of an African subdivision Microbiology 146, pp 1679-1692 74 Sasaki T., T Nishiyama., M Shintan., and T Kenri (1997), Evaluation of a new method for identification of bacterial based on sequence homology of the 16S gene rRNA, PDAJ Pharm Sci and Tech 51, pp 242-247 75 Sequiera L., and William P H (1963), Synthesis of IAA by wilt and mutants strains of Pseudomonas solanacearum, Abstr., Plant Physiol 28, pp 27 76 Sequeira L (1983), Mechanisms of induced resistance in plants, Annu Rev Microbiol 37, pp 51-79 77 Stefan R J., Atlas R M (1991), Polymerase Chain Reaction: the applications in enviromental microbiology, Annual Rev Microbiol 20, pp 257-262 78 Tan Y.J., Duan N.X., Liao B.S., and Zeng D.F (1994), ACIAR bacterial wilt, Newsletter 10, pp Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 88 79 Tanaka H., Negishi H and Maeda H (1990), Control of tobacco Bacterial wilt by an avirulent strain of Pseudomonas solanacearum M4S and its bacteriophage, Annals of the Phytopathological Society of Japan, 56, pp 243-246 80 Tong, Y.H.; Ji, Z.L.; Xu, J.Y.; Chen, X.J (2003), Colonization of antagonistic bacteria against Botrytis cinerea on tomato Chinese Journal of Biological Cotrol, vol 19(2), pp 78-81 81 Trigalet A., Demery D (1986), Invasivness in tomato plants on T5induced avirulent mutants of Pseudomonas solanacearum, Physiol Mol Plant Dis 67, pp 423-430 82 Trigalet A and Trigalet-Demery D (1990), Use of avirulent mutants of Pseudomonas solanacearum for the biological control of bacteral wilt of tomato plants, Physiological and Molecular Plant Pathology 36, pp 27-38 83 Trigalet A., Frey P., and Trigalet- Demery D (1994), Biological control of Bacterial wilt caused by Pseudomonas solanacearum: State of the Art and understanding Bacterial wilt: The disease and its causative agent, Pseudomonas solanacearum, Journal of Genral Plant Pathology 36, pp 225-233 84 Trigalet A (2002), Biological control of bacterial wilt caused by Pseudomonas solanacearum State of the Art and Understanding, Journal of Genral Plant Pathology 68, pp 125-231 85 Triwidodo Arwiyanto., Masao Goto., Shinji Tsuyumu., and Yuichi Takikawa (1994), Biological Control of Bacterial Wilt of Tomato by an Avirulent Strain of Pseudomonas solanacearum Isolated from Strelitzia reginae, Ann Phytopath Soc Japan 60, pp 421-430 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 89 86 Wang., J.S Hou., and Hu B J (1983), Studies on the control of bacterial wilt of peannut Acta phytophylactica 10, pp 79-84 87 William G W., Susan M Brans., Dale A Pelletier., David J Lane (1991), 16S Ribosomal DNA Amplification for Phylogenetic Study, Journal of Bacteriology, Japan, pp 697-703 88 Winstead N.N and Kelman A (1952), Inoculation techniques for evaluating resistance to Pseudomonas solanacearum Phytopathology 42, pp 628-634 89 Woese CR., O Kandler., M L Wheelis (1990), Towards a nature system of organisms Proposal for the domains Archaea, bacteria and eucarya, Proc Natl Acad Sci USA 87, pp 4576-4579 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 90 ... lưu giữ ứng dụng chủng vi sinh vật đối kháng phòng trừ bệnh héo xanh cà chua; - Sử dụng phương pháp đột biến nhằm tăng cường khả đối kháng bệnh héo xanh trồng số chủng vi sinh vật đối kháng; -... Sản phẩm PCR chủng vi khuẩn gây bệnh cà 43 chua Hình Hoạt tính đối kháng số chủng vi khuẩn 46 Hình Hoạt tính đối kháng số thể đột biến 52 Hình Khả phòng trừ bệnh héo xanh số thể đột biến 56 điều... VI? ??N KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VI? ??T NAM VI? ??N SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ………… o0o………… TRẦN QUANG MINH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐỘT BIẾN NHẰM TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG BỆNH HÉO XANH CÀ