Ứng dụng phương pháp đột biến nhằm tăng cường khả năng đối kháng bệnh héo xanh cà chua do vi khuẩn Ralstonia solanacearum của một số chủng vi sinh vật đối kháng

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ………… o0o………… TRẦN QUANG MINH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐỘT BIẾN NHẰM TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG BỆNH HÉO XANH CÀ CHUA DO VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ………… o0o………… TRẦN QUANG MINH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐỘT BIẾN NHẰM TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG BỆNH HÉO XANH CÀ CHUA DO VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin cảm ơn phòng Đào tạo thầy cô giáo Cơ sở đào tạo sau đại học Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam quan tâm, tạo điều kiện cho trình học tập Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, xin bày tỏ lòng biết ơn kính trọng sâu sắc tới TS Lê Như Kiểu – Trưởng môn Vi sinh vật – Viện Thổ nhưỡng Nông hóa tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ suốt trình thực tập Tôi xin gửi lời cảm ơn đến cô anh chị môn Vi sinh vật – Viện Thổ nhưỡng Nông hóa giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt trình thực tập Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè động viên, góp ý giúp đỡ suốt trình học tập thời gian thực tập Hà Nội, ngày 28 tháng 12 năm 2010 Học viên Trần Quang Minh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BẢNG KÝ HIỆU VIẾT TẮT ADN Axít deoxyribonucleic AO Acridine da cam ARN Axít ribonucleic Bp Base pair (cặp bazơ) rARN ARN riboxom Chc Các bon hữu CFU Colony forming unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc) CT Công thức cs Cộng ĐC Đối chứng Nts Nitơ tổng số PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) Pts Phốt tổng số VSV Vi sinh vật VSVĐK Vi sinh vật đối kháng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC BẢNG Tên bảng Trang Bảng Đặc tính sinh lý sinh hoá vi khuẩn R.solanacearum Bảng Đánh giá độc tính vi khuẩn Ralstonia solanacearum 26 Bảng Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn phân lập 34 từ đất bệnh bệnh Bảng Nguồn gốc đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn 44 phân lập Bảng Hoạt lực đối kháng chủng vi khuẩn với đại diện 45 chủng R solanacearum Bảng Đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn đối kháng 47 Bảng Kết định danh chủng vi khuẩn đối kháng 49 chương trình NCBI BLAST Bảng Kích thước vòng đối kháng thể đột biến chủng 50 DM nồng độ xử lý AO 24 µl/ml Bảng Kích thước vòng đối kháng thể đột biến chủng 51 DM nồng độ xử lý AO 30 µl/ml Bảng 10 Kích thước vòng đối kháng thể đột biến chủng BK 53 nồng độ xử lý AO 24µl/ml Bảng 11 Kích thước vòng đối kháng thể đột biến chủng 54 BK1 nồng độ xử lý AO 30 µl/ml Bảng 12 Tác động số thể đột biến lên bệnh héo xanh cà chua 57 điều kiện nhà kính Bảng 13 Ảnh hưởng số thể đột biến đến khả sinh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 http://www.lrc-tnu.edu.vn trưởng phát triển cà chua giống HT7 tuần tuổi Bảng 14 Kết thử độc tính chế phẩm đối kháng chuột 59 Bảng 15 Kết xử lý thống kê trọng lượng chuột thí nghiệm 60 Bảng 16 Ảnh hưởng thành phần môi trường lên men đến mật độ 63 hoạt tính sinh học hai thể đột biến Bảng 17 Ảnh hưởng nhệt độ môi trường lên men đến mật độ 67 hoạt tính sinh học hai thể đột biến Bảng 18: Ảnh hưởng độ pH môi trường lên men đến mật độ hoạt 67 tính sinh học hai thể đột biến Bảng 19 Mật độ vi khuẩn đột biến chất mang khác 67 sau tháng lưu giữ bảo quản Bảng 20 Thành phần lý hóa than bùn 69 Bảng 21 Thành phần lý hóa bột bã mía 69 Bảng 22 Kích thước vòng đối kháng thể đột biến chế 71 phẩm Bảng 23 Một số tính chất hóa học sinh học đất thí nghiệm 73 (Mê Linh- Hà Nội) Bảng 24 Khả phòng chống bệnh héo xanh cà chua thể đột 74 biến ruộng trồng xã Tiền Phong- Mê Linh- Hà Nội Bảng 25 Ảnh hưởng chế phẩm vi khuẩn đột biến đến suất 76 cà chua xã Tiền Phong- Mê Linh- Hà Nội Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC HÌNH Tên hình Trang Hình Cây cà chua bị bệnh héo xanh R Solanacearum 39 Hình Biểu triệu chứng nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn lát 40 cắt dọc đoạn thân cà chua Hình Một số hình thái khuẩn lạc đại diện cho vi khuẩn 41 gây bệnh héo xanh cà chua Hình Sản phẩm PCR chủng vi khuẩn gây bệnh cà 43 chua Hình Hoạt tính đối kháng số chủng vi khuẩn 46 Hình Hoạt tính đối kháng số thể đột biến 52 Hình Khả phòng trừ bệnh héo xanh số thể đột biến 56 điều kiện nhà lưới Hình Hình ảnh chuột sau tuần thí nghiệm 60 Hình Hoạt tính đối kháng thể đột biến chế phẩm sau 72 tháng Hình 10 Các giai đoạn bón chế phẩm vi sinh vật đột biến Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 74 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Cơ sở khoa học đề tài Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Mục tiêu đề tài Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình gieo trồng cà chua Việt Nam giới 1.2 Bệnh héo xanh cà chua 1.3 Mức độ phổ biến gây hại R solanacearum 1.4 Vi khuẩn Ralstonia solanacearum 1.4.1 Hình thái phân loại 1.4.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá vi khuẩn R solanacearum 1.4.3 Tính độc Ralstonia solanacearum 1.5 Các đường xâm nhiễm vi khuẩn R solanacearum 1.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển vi khuẩn R.solanacearum 1.6.1 Nhiệt độ không khí 1.6.2 Nhiệt độ đất 1.6.3 Cường độ chiếu sáng 1.6.4 Độ ẩm đất 1.6.5 Ảnh hưởng loại đất 1.7 Biện pháp phòng trừ 1.7.1 Biện pháp hóa học 1.7.2 Biện pháp sinh học 1.8 Phòng trừ bệnh hại trồng phương pháp sinh học 1.8.1 Khái niệm 1.8.2 Lựa chọn tác nhân phòng trừ sinh học 1.8.3 Sử dụng tác nhân vi sinh vật phòng bệnh hại thực vật 1.9 Nghiên cứu đột biến 1.9.1 Khái niệm đột biến 1.9.2 Gây đột biến nhân tạo tác nhân vật lý 1.9.3 Gây đột biến nhân tạo tác nhân hoá học 1.10 Phương pháp phát đột biến 1.10.1 Phương pháp đề kháng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên i Trang 1 2 3 4 6 11 11 11 12 12 12 12 13 13 13 14 14 15 15 16 16 17 17 19 19 http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.10.2 Phương pháp làm giàu chậm 1.10.3 Phương pháp làm giàu hạn chế 1.10.4 Phương pháp làm giàu nhờ penicilline 1.10.5 Phương pháp lọc 1.10.6 Trong phương pháp in 1.11 Mục đích tạo thể đột biến 1.12 Ảnh hưởng liều lượng cường độ chất gây đột biến 1.13 Thành tựu chọn tạo giống vi sinh vật phương pháp đột biến 1.13.1 Một số thành tựu chọn tạo giống vi sinh vật phương pháp đột biến giới Việt Nam II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phân lập tuyển chọn chủng Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh cà chua 2.2.1.1 Thu mẫu phân lập vi khuẩn gây bệnh 2.2.1.2 Đánh giá tính độc R solanacearum 2.2.1.3 Nhận dạng vi khuẩn R solanacearum kỹ thuật PCR 2.2.2 Phương pháp phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật đối kháng 2.2.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân loại chủng vi khuẩn đối kháng 2.2.3.1 Xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa 2.2.3.2 Phân loại vi sinh vật đối kháng phương pháp tự gen phần tử 16S rARN 2.2.4 Phương pháp xử lý đột biến 2.2.5 Phương pháp đánh giá khả phòng chống bệnh héo xanh cà chua chế phẩm vi sinh vật điều kiện nhà lưới quy mô nhỏ 2.2.6 Đánh giá tính an toàn chủng vi sinh vật đối kháng 2.2.7 Phương pháp đánh giá khả kiểm soát bệnh héo xanh cà chua chế phẩm vi sinh đối kháng đồng ruộng 2.2.8 Phương pháp xử lý số liệu III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập tuyển chọn vi khuẩn R.solanacearum gây bệnh héo xanh cà chua 3.1.1 Thu mẫu, phân lập tuyển chọn vi khuẩn gây bệnh 3.1.2 Thử nghiệm tính độc chủng R solanacearum 3.1.3 Nhận dạng vi khuẩn R solanacearum kỹ thuật PCR 3.2 Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật đối kháng với R solanacearum từ mẫu đất trồng cà chua Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ii 19 20 20 20 20 21 21 22 22 24 24 25 25 25 26 27 29 32 32 34 35 36 37 37 38 39 39 39 42 42 43 http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.2.1 Thu mẫu, phân lập vi khuẩn đối kháng 3.2.2 Đánh giá hoạt lực đối kháng chủng vi khuẩn 3.3 Nghiên cứu hoạt tính sinh học phân loại chủng vi sinh vật đối kháng 3.3.1 Nghiên cứu hoạt tính sinh học 3.3.2 Phân loại vi sinh vật đối kháng phương pháp giải trình tự gen phần tử 16S rARN 3.4 Xử lý đột biến tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính đối kháng cao với vi khuẩn R Solanacearum gây bệnh héo xanh phương pháp đột biến 3.4.1 Xử lý đột biến tuyển chọn thể đột biến 3.5 Đánh giá khả kiểm soát bệnh héo xanh cà chua số thể đột biến nhà lưới 3.6 Đánh giá tính an toàn chủng vi sinh vật đối kháng 3.7 Nghiên cứu, sản xuất chế phẩm vi sinh vật đột biến phòng trừ bệnh héo xanh cà chua 3.7.1 Giống vi sinh vật 3.7.2 Môi trường nhân giống 3.7.3 Nghiên cứu lựa chọn môi trường sản xuất 3.7.4 Một số yếu tố ảnh hưởng trình lên men thu sinh khối 3.7.4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình lên men vi khuẩn đột biến 3.7.4.2 Ảnh hưởng pH đến trình lên men vi khuẩn đột biến 3.7.4.3 Nghiên cứu lựa chọn chất mang 3.7.4.4 Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm vi khuẩn đột biến 3.7.4.5 Đánh giá hoạt tính đối kháng chế phẩm đột biến thời gian bảo quản 3.8 Đánh giá hoạt tính đối kháng chế phẩm điều kiện đồng ruộng IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ V TÀI LIỆU THAM KHẢO A Phần tiếng Việt B Phần tiếng Anh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên iii 43 45 47 47 48 50 50 55 58 61 61 61 62 64 64 65 69 70 71 72 77 77 78 79 79 82 http://www.lrc-tnu.edu.vn data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ... xanh cà chua Hình Sản phẩm PCR chủng vi khuẩn gây bệnh cà 43 chua Hình Hoạt tính đối kháng số chủng vi khuẩn 46 Hình Hoạt tính đối kháng số thể đột biến 52 Hình Khả phòng trừ bệnh héo xanh số thể... VI N KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VI T NAM VI N SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ………… o0o………… TRẦN QUANG MINH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐỘT BIẾN NHẰM TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG BỆNH HÉO XANH CÀ... chống bệnh héo xanh cà chua chế phẩm vi sinh vật điều kiện nhà lưới quy mô nhỏ 2.2.6 Đánh giá tính an toàn chủng vi sinh vật đối kháng 2.2.7 Phương pháp đánh giá khả kiểm soát bệnh héo xanh cà chua