Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn cố định nitơ tự do trong đất

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA TÀI NGUYÊN VÀ MÔI TRƯỜNG -🕮 - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ TỰ DO TRONG ĐẤT Người thực : NGUYỄN HỒNG HẠNH Mã sinh viên : 621864 Lớp : K62KHMTA Khóa : K62 Giảng viên hướng dẫn : Th.S NGUYỄN THỊ KHÁNH HUYỀN Địa điểm thực tập : Học viện Nông nghiệp Việt Nam Hà Nội – 2021 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn tận tình giảng viên Th.S Nguyễn Thị Khánh Huyền Các số liệu kết nêu khóa luận chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Các số liệu trích dẫn Khóa luận đảm bảo tính xác, tin cậy trung thực Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 06 tháng 09 năm 2021 Sinh viên thực   Nguyễn Hồng Hạnh i LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tri ân sâu sắc thầy cô trường Học viện Nông Nghiệp Việt Nam, đặc biệt thầy cô khoa Tài Nguyên Môi Trường trường tạo điều kiện cho em thực tập khoa để có nhiều thời gian cho khóa luận tốt nghiệp Và em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Khánh Huyền nhiệt tình hướng dẫn hướng dẫn em hồn thành tốt khóa thực tập Em xin gửi lời cảm ơn đến q thầy cơ, cán quản lý phịng thí nghiệm Bộ mơn Vi sinh vật bảo tận tình tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận Cuối em xin bày tỏ lịng biết ơn đến gia đình, bạn bè người thân động viên, giúp đỡ em suốt thời gian học tập nghiên cứu trường Trong trình thực tập, trình làm báo cáo thực tập, khó tránh khỏi sai sót, mong thầy, cô bỏ qua cho em Đồng thời trình độ lý luận kinh nghiệm thực tiễn cịn hạn chế nên báo cáo khơng thể tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận ý kiến đóng góp thầy, để em học thêm nhiều kinh nghiệm hoàn thành tốt báo cáo tốt nghiệp tới Em xin chân thành cảm ơn!   Hà Nội, ngày 06 tháng 09 năm 2021 Sinh viên Hạnh   Nguyễn Hồng Hạnh ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG .vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC PHỤ LỤC HÌNH viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .ix TÓM TẮT KHÓA LUẬN .x MỞ ĐẦU 1.Tính cấp thiết đề tài .1 Mục tiêu nghiên cứu đề tài CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vai trò Nito phát triển trồng .4 1.2 Tình hình sử dụng ảnh hưởng phân đạm sản xuất nông nghiệp 1.2.1 Tình hình sử dụng ảnh hưởng phân đạm vô sản xuất nông nghiệp 1.2.2 Tình hình sử dụng ảnh hưởng phân hữu sản xuất nông nghiệp 11 1.2.3 Tình hình sử dụng ảnh hưởng phân hữu vi sinh sản xuất nông nghiệp 12 1.3 Tổng quan vi khuẩn cố định Nitơ phân tử vai trò chúng sản xuất nông nghiệp .15 1.3.1 Tổng quan vi khuẩn cố định Nitơ phân tử 15 1.3.2 Vai trò VSV cố định N phân tử tự SXNN 18 1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu vi khuẩn cố định nito nước giới 18 iii 1.4.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn cố định đạm nước 18 1.4.2 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn cố định đạm giới 20 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tượng nghiên cứu 22 2.2 Phạm vi nghiên cứu 22 2.3 Nội dung nghiên cứu 22 2.3.1 Phân lập vi khuẩn cố định Nito phân tử tự đất .22 2.3.2 Đánh giá khả đồng hóa Nito phân tử tự chủng vi khuẩn phân lập 22 2.3.3 Đánh giá số đặc tính sinh học chủng vi khuẩn phân lập 22 2.4 Phương pháp nghiên cứu 22 2.4.1 Phương pháp lấy mẫu 22 2.4.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn có khả cố định Nito phân tử 23 2.4.3 Phương pháp đánh giá đặc tính sinh học vi khuẩn 23 2.4.4 Phương pháp phân tích số liệu 27 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28 3.1 Kết phân lập 28 3.2 Khả đồng hóa Nito chủng vi khuẩn phân lập 30 3.3 Đặc tính sinh học khác chủng vi khuẩn .32 3.3.1 Kết đánh giá khả sinh enzyme 32 3.3.2 Kết đánh giá ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng, phát triển chủng vi khuẩn 34 3.3.3 Kết đánh giá ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng, phát triển chủng vi khuẩn 37 3.3.4 Kết đánh giá khả kháng kháng sinh chủng vi khuẩn 39 3.3.5 Kết đánh giá mức độ an toàn sinh học chủng vi khuẩn 40 3.4 Kết phân lập tuyển chọn vi khuẩn cố định Nito phân tử 41 iv KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 1.Kết luận 44 Kiến nghị .44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC 48 PHỤ LỤC 1: MỘT SỐ HÌNH ẢNH KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 48 PHỤ LỤC 2: ĐỀ CƯƠNG KHOÁ LUẬN 51 v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Kết phân lập vi khuẩn 29 Bảng 3.2: Kết phân tích nồng độ NH4 có dịch chiết vi khuẩn 31 Bảng 3.3: Kết đo hoạt tính sinh enzyme vi khuẩn(D-d) .33 Bảng 3.4: Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng, phát triển chủng vi khuẩn 36 Bảng 3.5: Ảnh hưởng pH môi trường đến sinh trưởng, phát triển chủng vi khuẩn 38 Bảng 3.6: Khả kháng kháng sinh chủng vi khuẩn 39 Bảng 3.7: Đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn tuyển chọn .42 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hình ảnh sử dụng phân đạm nơng nghiệp Hình 1.2: Hình ảnh cà phê thiếu đạm thiếu đạm Hình 1.3: Hình ảnh phân đạm Urea Phú Mỹ Hình 1.4: Hình ảnh phân loại đạm Amoni – đạm Nitrat – đạm Ure 10 Hình 3.1: Thí nghiệm phân tích nồng độ NH4+ dịch thể 30 Hình 3.2: Vòng phân giải enzyme chủng vi khuẩn 34 Hình 3.3: Khả chịu nhiệt Vi Khuẩn TT3 .36 Hình 3.4: Mật độ khuẩn lạc vi khuẩn H3.1 pH khác 39 Hình 3.5: Kết đánh giá an tồn sinh học số chủng vi khuẩn phân lập cà rốt khoai tây 41 Hình 3.6: Hình ảnh tế bào chủng H3.2 NCX5 43 Hình 3.7: Hình ảnh tế bào chủng NCG5.2 A2 43 Hình 3.8: Hình ảnh tế bào chủng TT3 43 vii DANH MỤC PHỤ LỤC HÌNH Hình 1: Hình thái khuẩn lạc tế bào chủng vi khuẩn TT4 48 Hình 2: Hình thái khuẩn lạc tế bào chủng CC5 .48 Hình 3: Mật độ khuẩn lạc chủng H3.2 mức nhiệt từ 20-400C 49 Hình 4: Đánh giá độ an tồn sinh học chủng số chủng tuyển chọn 50 viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Cs Cộng VSV Vi sinh vật VK Vi khuẩn SXNN Sản xuất nông nghiệp N Nito TTĐT Thông tin điện tử CNSH Công nghệ sinh học ix PHẦN 2: NỘI DUNG THỰC HIỆN   CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU   1.1 Vai trò Nito phát triển trồng Đạm (Nitơ) thành phần thiếu thể sinh vật nói chung, đạm thành phần thường chiếm 15 -17% chất protein, mà protein chất biểu sống Đạm có nhiều hợp chất hữu cơ, cần thiết cho sinh trưởng phát triển cây: Diệp lục, acid nucleic (DNA RNA), loại men, bazơ có đạm, số hợp chất có hoạt tính sinh học cao Các hợp chất hữu nêu thiếu đạm thành phần chất có vai trị quan trọng đời sóng Diệp lục quan thiếu trình quang hợp, tổng hợp chất hữu cho toàn thể giới sinh vật Các acid nucleic (DNA RNA) chất mang thông tin di truyền huy việc tổng hợp protein cây, thiếu chất dù có đủ nguyên liệu khơng tổng hợp protein Các loại men chất xúc tác sinh học quan trọng làm cho q trình chuyển hóa vật chất thực với tốc độ lớn điều kiện bình thường Đạm yếu tố q trình đồng hóa cacbon nằm thành phần diệp lục Trong tồn mối quan hệ chặt chẽ giữ lượng N hút việc hút yếu tố dinh dưỡng khác (Nguyễn Như Hà, 2006) Theo Nguyễn Như Hà (2006), độ dinh dưỡng phân đạm đánh giá hàm lượng % Nitơ loại phân bón Phần lớn trồng khơng có khả đồng hóa ngun tố nitơ duới dạng khí N2 mà chủ yếu dạng muối nitrat NO3- amoni NH4+ Sự chuyển hoá N2 thành NH3 Con đường hóa học: N2 + 3H2 => 2NH3 Điều kiện: Nhiệt độ: 20000C - áp suất 200 atm thường xuất thời tiết mưa giông có tia sét Cây trồng hấp thụ khoảng 56 40% hàm lượng đạm từ phân bón, cịn lại bị rửa trôi bay Đạm giữ vai trò quan trọng trồng, nguyên tố bậc cấu tạo lên sống Đạm có thành phần tất protein đơn giản phức tạp, mà thành phần màng tế bào thực vật, tham gia vào thành phần axit Nucleic (tức ADN ARN), có vai trị quan trọng trao đổi vật chất quan thực vật Nó nguyên tố tham gia vào thành phần clorôphin, prôtit, peptit, axit amin, enzim nhiều loại vitamin Đạm cịn có thành phần diệp lục tố, mà thiếu xanh khơng có khả quang hợp Nó cịn có hợp chất Alcaloid, phecmen nhiều vật chất quan khác tế bào thực vật Đạm thúc đẩy trình tăng trưởng cây, giúp đẻ nhánh khỏe, phân cành mạnh, nhiều, có khả quang hợp tốt… làm tăng suất trồng (Lê Quang Dũng, 2011) 1.2 Tình hình sử dụng ảnh hưởng phân đạm sản xuất nông nghiệp(SXNN) 1.2.1 Tình hình sử dụng ảnh hưởng phân đạm vơ SXNN 1.2.2 Tình hình sử dụng ảnh hưởng phân đạm hữu SXNN 1.2.3 Tình hình sử dụng ảnh hưởng phân đạm hữu vi sinh SXNN 1.3 Tổng quan vi khuẩn cố định Nitơ phân tử vai trò chúng SXNN 1.3.1 Tổng quan vi khuẩn cố định Nitơ phân tử tự Trong lượng phân nitơ hóa học bù đắp phần lượng nitơ mà lấy khỏi đất, tổn thất nitơ bù đắp trình sinh học đặc biệt gọi trình cố định nitơ vi sinh vật thực hiện, chúng có khả chuyển hóa nitơ phân tử khơng khí thành hợp chất chứa nitơ làm giàu thêm nguồn đạm đất, xếp chúng thành hai nhóm lớn: 57 + Nhóm vi sinh vật cộng sinh + Nhóm vi khuẩn sống tự 1.3.1.1 Nhóm Vi khuẩn cố định N tự a) Vi khuẩn cố định nitơ tự kỵ khí Clostridium Clostridium phát lần Vinogradxki (1893) Tế bào Clostridium hình que có kích thước 2,5 – 7,5 x 0,7 – 1,3 µm, đứng riêng rẽ kẹp đơi thành chuỗi ngắn Khi cịn non có khả di động, già khả di động, bào tử nằm trung tâm, khuẩn lạc nhẵn trắng có khả chịu nhiệt độ cao khơ hạn (Phạm Bích Hiên, 2003) Vi khuẩn Clostridium có nhiều lồi có khả cố định nitơ phân tử như: Cl pasteurianum, Cl butylicum lồi có khả cố định đạm cao Clostridium pasteurianum Chúng có khả cố định – 10 mg nitơ tiêu thụ hết 1g carbon Phạm vi hoạt động cố định nitơ Clostridium khoảng pH rộng 4,7 – 8,5, tối thích 6,9 – 7,3 b) Vi khuẩn cố định nitơ tự hiếu khí Nhóm vi khuẩn thuộc chi Beijerinskia sp Beijerinskia sp lồi vi khuẩn hiếu khí cố định nitơ giống với Azotobacter sp Chúng phân lập R J Starkey (1939), tế bào có hình dạng thay đổi hình cầu, hình que, hình bầu dục Beijerinski vi khuẩn gram âm, không sinh bào tử bào xác, đặc điểm chung vi khuẩn thuộc chi chịu chua cao Có khả sống tốt môi trường acid (pH=3), nhiệt độ từ 16 – 37oC Trên môi trường vô đạm, sau ngày nuôi cấy xuất khuẩn lạc nhầy, lồi Vi khuẩn có khả cố định 16 – 20 mg nitơ đồng hóa hết 1g dinh dưỡng carbon Ngồi khả cố định nitơ chúng cịn có khả tổng hợp chất kích thích sinh trưởng cho trồng 58 Nhóm vi khuẩn thuộc chi Azotobacter sp Azotobacter sp đuợc phân lập lần vào năm 1901 (M Beijerinck) Chúng thuộc vi khuẩn hiếu khí chúng phát triển điều kiện kỵ khí Hầu hết loài Azotobacter sp sống dị dưỡng Azotobacter sp vi khuẩn gram âm, khơng sinh bào tử có khả cố định nitơ tự Khi chưa trưởng thành tế bào thường có hình que, kích thước 2,0 – 7.0 x 1,0 – 2,5 µm, sinh sản cách phân cắt, di chuyển nhờ tiêm mao Khi trưởng thành khả di chuyển, kích thước thu nhỏ thành dạng cầu Quan sát kính hiển vi ta thấy già tế bào Azotobacter bao bọc vỏ nhầy dày Vỏ nhầy vi khuẩn Azotobacter chứa khoảng 75 % chất hiđrit axit uronic chứa khoảng 0,023 % nitơ Lượng ADN tế bào Azotobacter thường thấp so với nhiều loại vi khuẩn khác (0,70- 0,81%) Khi sống điều kiện khơng có nitơ, Azotobacter dùng nitơ khơng khí để biến thành nitơ thể sống Khi sống môi trường đủ thức ăn nitơ hữu vơ tác dụng cố định nitơ thấp khơng có Azotobacter thích hợp với điều kiện hiếu khí vừa phải pH trung tính kiềm Azotbacter sp nhạy cảm với độ ẩm đất hàm lượng nguyên tố khoáng có đất (P, K, MO, B, Cu ) Nhiều nghiên cứu cho biết Azotobacter sp phát triển đươc mơi trường có pH khoảng 4,5 – trình cố định nitơ thực khoảng pH 5,5 – 7,2 Nhiệt độ thích hợp từ 26 – 300C Khi nuôi môi trường thạch, vi khuẩn Azotobacter có khuẩn lạc nhầy, lồi tan, lúc đầu không màu, sau biến thành màu nâu tối, chí đến màu đen khơng làm nhuộm màu mơi trường Ngồi số lồi Azotobacter có dạng nhăn nheo, khuẩn lạc có màu vàng lục, màu hồng (Phạm Thị Ngọc Lan, 1999) Các chủng phân lập từ tự nhiên có khả cố định 10 – 15 mg nitơ tiêu thụ hết 1g dinh dưỡng Carbon Một số giống tuyển chọn có khả cố định tới 30 mg/1g dinh dưỡng Carbon 59 Trong đất, Azotobacter sp tập trung vùng đất xung quanh rễ Ngoài khả cung cấp dinh dưỡng nitơ cho cịn có khả kích thích nảy mầm, kích thích sinh trưởng Trong đất, Azotobacter sp thường phổ biến chủng sau: + Azotobacter chrococum: Kích thước tế bào 2,0 x 3,1 micromet, có khả di động cịn non Khi già hình thành nang xác, khuẩn lạc có màu nâu đen già, khơng khuếch tán môi trường (Cao Ngọc Điệp, 2007) + Azotobacter beijerinckii: Có kích thước 2,4 x 4,6 µm Khơng có khả di động hình thành nang xác Khuẩn lạc già có màu nâu sáng, sắc tố khơng khuếch tán mơi trưịng ni cấy + Azotobacter vinelandii: Tế bào có kích thước 1,5 x 3,4 µm, có khả di động hình thành nang xác Khuẩn lạc màu lục huỳnh quang, sắc tố khuếch tán vào môi trường (Cao Ngọc Điệp, 2007) + Azotobacter agilis: Tế bào có kích thước 2,8 x 3,3 µm, có khả di động, khơng hình thành nang xác, khuẩn lạc màu vàng lục huỳnh quang, sắc tố khuếch tán vào mơi trường(Cao Ngọc Điệp, 2007) 1.3.2 Vai trị VSV cố định N phân tử tự SXNN 1.3.2.1 Cố định đạm sinh học Tương tự trình cố định đạm hóa học, q trình cố định đạm sinh học trình phá vỡ liên kết phân tử nitơ khơng khí để tạo thành dạng nitơ dễ hấp thụ cho trồng Nhưng trình việc phá vỡ liên kết phân tử nitơ xảy điều kiện nhiệt độ áp suất bình thường Chính mà vai trị q trình cố định đạm sinh học có ý nghĩa lớn lao nơng nghiệp, nước có cơng nghiệp phân đạm chưa phát triển Các trình cố định đạm sinh học tự nhiên xảy nhờ vi khuẩn cố định đạm Hàng năm, giới có khoảng 160 – 170 triệu nitơ khí cố định chuyển hóa thành nguồn phân đạm dạng khác (Nguyễn Lân Dũng, 2009) 60 Trong tự nhiên, nitơ dạng khí (N2) chiếm 80% khí Tuy nhiên, thực vật động vật sử dụng dạng cho biến dưỡng chúng (Dobereiner J, 1988) Chỉ có số nhóm sinh vật sơ hạch vi khuẩn tự dưỡng đạm có khả sử dụng đạm thể khí nhờ hệ thống sinh hóa chun biệt Đó cố định đạm sinh học 1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu vi khuẩn cố định nito nước giới 1.4.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu vi khuẩn cố định nito nước 1.4.2 Tổng quan tình hình nghiên cứu vi khuẩn cố định nito giới   61 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu - Các chủng vi khuẩn phân lập có khả cố định N phân tử tự đất 2.2 Phạm vi nghiên cứu - Phịng thí nghiệm môn Vi Sinh Vật khoa Tài Nguyên Môi Trường Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam - Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 04/2021 đến tháng 08/2021 2.3 Nội dung nghiên cứu 2.3.1 Phân lập vi khuẩn cố định Nito phân tử tự đất 2.3.2 Đánh giá khả đồng hóa Nito phân tử chủng vi khuẩn phân lập 2.3.3 Đánh giá số đặc tính sinh học chủng vi khuẩn phân lập 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp lấy mẫu Dùng thìa vơ trùng lấy mẫu đất tầng mặt có độ sâu từ 2-10 cm Mỗi mẫu đất lấy ngẫu nhiên nhiều điểm, độ sâu Mẫu đất cho vào túi nylon sạch, buộc kín, ghi thơng tin mẫu (địa điểm lấy, ngày lấy) đem phịng thí nghiệm để tiến hành phân lập vi khuẩn (được bảo quản 40C tiến hành phân lập vi khuẩn.) Môi trường phân lập nuôi cấy: môi trường Ashby gồm: Glucozo 10g; K2HPO4 0.2g; MgSO4 0.2g; NaCl 0.2g; K2SO4 0.1g; CaCO3 5g; Nước cất 1000ml; Thạch 20g 2.4.2 Phương pháp phân lập tuyển chọn vi khuẩn có khả cố định nito Mẫu phân lập vi sinh vật bao gồm mẫu đất trồng rau Mẫu thu đựng bình (túi) đựng riêng biệt khử trùng 62 Mẫu thu tiến hành làm thí nghiệm bảo quản điều kiện nhiệt độ thấp thời gian không tuần Phân lập vi sinh vật theo phương pháp pha loãng Koch mơi trường chun tính Pha lỗng 5g mẫu với 45ml nước vô trùng, lắc 30 phút Dịch pha lỗng cấy ria lên bề mặt thạch chứa mơi trường chuyên tính cho chủng VSV Các chủng phân lập làm mơi trường chun tính tương ứng theo phương pháp cấy ria pha môi trường bán rắn, giữ giống môi trường thạch nghiêng 40C Để xác định chủng vi sinh vật, tiến hành sàng lọc ban đầu thông qua việc nhuộm tế bào quan sát hình thái VSV qua kính hiển vi Tuyển chọn giống VSV thông qua đánh giá đặc tính sinh học cách ni cấy trực tiếp môi trường chuyên định điều kiện khác Xác định hoạt tính enzyme chủng VSV tuyển chọn theo phương pháp khuếch tán đĩa thạch (William, 1983) Nuôi dịch chiết: Nuôi cấy vi sinh vật 9ml dung dịch mơi trường chun tính với vòng que cấy chứa vi sinh vật, đưa lên máy lắc 150 vòng/phút Sau 72 vi khuẩn, dịch nuôi cấy đánh giá khả phân giải enzym Môi trường hấp khử trùng 121°C, áp suất atm vòng 20 phút Để nhiệt độ giảm đến khoảng 55-60°C đổ đĩa peptri với chiều dày 2mm để nguội Các đĩa peptri trước đổ môi trường sấy 150°C để khử trùng Dùng ống khoan khử trùng đục lỗ đĩa thạch Nhỏ 2ml dịch chiết nuôi vào lỗ thạch, sau để tủ lạnh 6h cho enzyme khuếch tán vào thạch đem nuôi 30°C vòng 48h Lấy nhuộm màu thuốc thử lugol để đo vịng phân giải Đường kính vịng phân giải D = d2 – d1 Trong đó: D đường kính vịng phân giải enzym vi sinh vật d2 đường kính vịng phân giải d1 kích thước lỗ đục 63 2.4.3 Phương pháp đánh giá đặc tính sinh học vi khuẩn Nhiệt độ nuôi cấy: vi khuẩn nuôi cấy môi trường, thời gian phù hợp tìm thấy thí nghiệm ni lắc 150 vịng/phút nhiệt độ: 100C, 150C, 200C, 250C, 300C, 350C 400C; Sau xác định mật độ tế bào phương pháp đo OD kiểm tra hoạt tính đối kháng chủng Cụ thể sau: Lấy vòng que cấy giống vi sinh vật pha loãng đến nồng độ 10-1, tiến hành cấy 1ml dịch nồng độ lên 9ml mơi trường chun tính đem ni lắc 150 vòng/phút điều kiện nhiệt độ khác nhau: 20°C; 25°C ;30°C; 35°C; 40°C; Sau đo OD 600 để xác định mật độ vi sinh vật Đồng thời dịch nuôi cấy dùng để xác định khả dối kháng chủng VK mức nhiệt độ khác Xác định pH mơi trường thích hợp: vi khuẩn ni cấy với thời gian, nhiệt độ thích hợp tìm thấy thí nghiệm ni lắc 150 vịng/phút mơi trường phù hợp có pH từ đến 8; Xác định mật độ tế bào phương pháp đo OD kiểm tra hoạt tính đối kháng chủng Cụ thể sau: Lấy vòng que cấy giống vi sinh vật pha loãng đến nồng độ 10-1 tiến hành cấy 1ml dịch vi sinh vật nồng độ vào 9ml môi trường chun tính phù hợp có bổ sung dung dịch đệm Sorensen có pH 4,5,6,7,8 ni nhiệt độ thời gian thích hợp lựa chọn từ thí nghiệm Đo OD 600 để xác định mật độ vi sinh vật Đồng thời xác định khả sinh đối kháng chúng mức pH khác Phương pháp xác định khả kháng kháng sinh vi khuẩn Bổ sung 1ml dịch vi khuẩn chuẩn bị tương tự phần vào ống nghiệm có chứa 9ml mơi trường chun tính thích hợp có bổ sung kháng sinh Steptomicin với nồng độ 300, 500, 800, 1000 mg/l môi trường Vi khuẩn nuôi cấy với thời gian, nhiệt độ, pH thích hợp tìm 64 thấy thí nghiệm Xác định mật độ tế bào kiểm tra khả đối kháng chủng vi khuẩn Đánh giá mức độ an toàn sinh học chủng vi khuẩn tuyển chọn: Mẫu rau, củ, (cà rốt; khoai tây) lấy từ mẫu khoẻ sau rửa ngâm dung dịch nước dịch NaClO 1% phút, rửa lại nước vô trùng; làm khô mẫu giấy hút ẩm đặt đĩa petri; gây nhiễm vật lý thử nghiệm lên mô thực vật để nhiệt độ phịng; Theo dõi hình thành vết bệnh sau 24 - 48h so sánh với mẫu đối chứng 2.4.4 Phương pháp mơ tả đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn cố định đạm Mơ tả đăc ̣ điểm hình thái chủng kính hiển vi, xác định đặc điểm sinh học định dạng theo khóa phân loại Bergey 1994 Phương pháp nhuộm gram: Tiến hành: - Cố định tiêu cồn 900C hơ nhanh lửa đèn cồn - Nhỏ – giọt genlatin phút, rửa nước - Nhỏ – giọt dung dịch lugon phút, rửa nước - Tẩy màu cồn 90o 30 giây đến phút, rửa nước - Nhuộm bổ sung Fucsin Safranin phút, rửa nuớc làm khô - Tiến hành quan sát kính hiển vi quang học Olympus vật kính 40 2.4.5 Phương pháp đếm khuẩn lạc Pha lỗng vi khuẩn đến 10-1 nước vơ trùng, hút 50µL dịch vi khuẩn lên mơi trường ni cấy, chang dịch vi khuẩn bề mặt môi trường Đem nuôi 30oC, từ 24 - 48h Tiến hành đếm khuẩn lạc tính mật độ vi khuẩn Mật độ vi khuẩn đc tính theo cơng thức: Tính số lượng vi khuẩn (CFU) ml gram mẫu cách chia số lượng khuẩn lạc cho hệ số pha lỗng CFU/ml, (CFU/g) tính cơng thức: 65 A (CFU/g hay CFU/ml) = Trong đó: A : số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn 1g hay 1ml mẫu N: tổng số khuẩn lạc đếm đĩa chọn Ni: số lượng đĩa cấy độ pha loãng thứ i V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào đĩa Fi: độ pha loãng tương ứng 2.4.6 Phương pháp xác định mật độ tế bào phương pháp đo OD 600 Phương pháp đo OD 600: Bước sóng 600nm Chuẩn bị dịch vi khuẩn cách lấy vòng que cấy giống vi sinh vật pha loãng đến 10-1 9ml nước vô trùng Bổ sung 1ml dịch vi khuẩn chuẩn bị vào ống nghiệm có chứa 9ml mơi trường dịch thể Trong thí nghiệm chủng vi khuẩn nuôi lắc 30oC, tốc độ lắc 150 vòng/phút 48h Hút 0,1ml mẫu đối chứng vào Cuvet ấn blank Rửa Cuvet nước vô trùng Hút 0,1ml mẫu có chứa vi khuẩn đối chứng vào Cuvet ấn simple Tiếp tục lặp lại hết 2.4.7 Phương pháp đánh giá khả đồng hóa Nito phân tử tự đất Nuôi dịch chiết: Nuôi cấy vi sinh vật 9ml dung dịch môi trường chun tính với vịng que cấy chứa vi sinh vật, đưa lên máy lắc 150 vòng/phút Sau 72 vi khuẩn, dịch nuôi cấy đánh giá khả đồng hóa Nito phân tử phương pháp phân tích NH4+ - Phương pháp phân tích N-NH4+ (Phương pháp so màu Indophenol) Cách tiến hành: Lập đường chuẩn: Dùng cốc đong 50 ml, dán nhãn đánh số kí hiệu chủng vk cần phân tích, lắc dung dịch chiết chuẩn bị sau đổ dung dịch vào ống đong chuẩn bị giấy lọc Hút 4ml dd lọc vào bình định mức 25ml(nhãn dán, 66 đánh số cốc đong), hút xác 2ml dd thuốc thử màu Natri salyxylat, Natri diclorosoxyanurat Dùng bình tia cho nước cất đến vạch định mức Ổn định màu tiến hành đo dung dịch phương pháp so màu( so màu bước sóng 667 nm máy UV/VIS) 2.4.8 Phương pháp phân tích số liệu Các số liệu thu thập, nghiên cứu tổng hợp xử lý thống kê phần mềm excel số phần mềm chuyên dụng khác 67 CHƯƠNG 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU   3.1 Phân lập vi khuẩn có khả cố định N phân tử tự đất 3.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả đồng hóa N chủng tuyển chọn 3.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có đặc tính sinh học tốt 68 PHẦN 3: KẾ HOẠCH NGHIÊN CỨU TT Nội dung Thời gian thực Lập đề cương nghiên cứu Báo cáo đề cương 03/2021 13/04/2021 … Thẩm định tiến độ/ Seminar Nộp khóa luận 09/09/2021 Bảo vệ Khóa luận 21/09/2021 Giảng viên hướng dẫn Sinh viên thực đề tài (Ký ghi rõ họ tên) (Ký ghi rõ họ tên)     Nguyễn Hồng Hạnh   BỘ MƠN QUẢN LÝ SINH VIÊN Trưởng mơn (Ký ghi rõ họ tên) 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO   [1] Nguyễn Xuân Thành, Nguyễn Thị Hiền (2007), Vi sinh vật học Nông Nghiệp, Nhà xuất Đại học Sư Phạm [2] Nguyễn Như Hà, Giáo trình phân bón 1(2006) NXB Nông Nghiệp Hà Nội [3] Nguyễn Lân Dũng (1984), Vi sinh vật đất chuyển hóa hợp chất carbon, nitơ, Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội [4] Nguyễn Lân Dũng (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội [5] Nguyễn Lân Dũng, Bùi Xuân Đồng, Lê Đình Lương (1982), Giáo trình vi nấm, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật [6] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến Phạm Văn Ty (2009), Vi sinh vật học Nhà xuất Giáo dục [7] Chu Thị Thơm, Phan Thị Lài Nguyễn Văn Tố, 2006 Cải Tạo Môi Trường Bằng Chế Phẩm Vi Sinh Vật, Nxb Lao Động 70