Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy lá thông ở núi dũng quyết, thành phố vinh, nghệ an

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH NGUYỄN THỊ TÚ ANH PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY LÁ THÔNG Ở NÚI DŨNG QUYẾT, THÀNH PHỐ VINH, NGHỆ AN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC NGHỆ AN - 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH NGUYỄN THỊ TÚ ANH PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY LÁ THÔNG Ở NÚI DŨNG QUYẾT, THÀNH PHỐ VINH, NGHỆ AN Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.10.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS HOÀNG VĨNH PHÚ NGHỆ AN - 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi, giúp đỡ người hướng dẫn khoa học Các kết quả, số liệu trình bày luận văn kết thực nghiệm chưa công bố cơng trình khác Nghệ An, tháng năm 2017 Tác giả Nguyễn Thị Tú Anh ii LỜI CẢM ƠN Luận văn hồn thành Bộ mơn Sinh học thực nghiệm, Viện Sư phạm Tự nhiên, Trường Đại học Vinh Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành, sâu sắc đến thầy giáo hướng dẫn khoa học TS Hoàng Vĩnh Phú tận tâm giúp đỡ, hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể Viện Sư phạm Tự nhiên, Phòng Đào tạo Sau đại học, Trung tâm Thực hành - Thí nghiệm tạo điều kiện cho học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn thành viên gia đình, bạn bè giúp đỡ tơi suốt q trình làm luận văn Nghệ An, tháng năm 2017 Tác giả Nguyễn Thị Tú Anh C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii BẢNG GHI CHÚ NHỮNG CỤM TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu đề tài Nội dung nghiên cứu Chương TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Đặc điểm sinh học phân bố Thông nhựa 1.1.1 Phân bố Thông nhựa 1.1.2 Đặc điểm sinh học Thông nhựa 1.2 Lignocellulose 1.2.1 Cellulose 1.2.2 Hemicellulose 12 1.2.3 Lignin 13 1.3 Vi sinh vật phân hủy lignin cellulose 17 1.3.1 Nấm mốc 17 1.3.2 Vi khuẩn 18 1.4 Lịch sử vấn đề nghiên cứu 20 1.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 20 1.4.2 Tình hình nghiên cứu nước 21 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Đối tượng địa điểm nghiên cứu 23 2.2 Vật liệu phương pháp nghiên cứu 23 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an iv 2.2.1 Mẫu vật phương pháp lấy mẫu 23 2.2.2 Hóa chất thiết bị 24 2.2.3 Phương pháp nghiên cứu 25 Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 34 1.1 Kết phân tích thành phần hóa học thơng 34 1.2 Kết phân lập chủng vi sinh vật có khả phân hủy thông 35 1.2.1 Phân lập chủng vi sinh vật từ mẫu đất 35 1.2.2 Tuyển chọn chủng vi sinh vật 36 1.3 Xác định hoạt độ enzyme chủng phân lập 37 1.3.1 Xác định hoạt tính enzyme lignin peroxidase (LiP) 37 1.3.2 Xác định hoạt tính manganese peroxidase (MnP) 38 1.3.3 Xác định hoạt tính enzyme cellulase 40 1.4 Sinh trưởng chủng phân lập 43 1.5 Thử nghiệm sử dụng dịch nuôi cấy thô từ chủng vi khuẩn 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 Kết luận 47 Kiến nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC 54 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an v BẢNG GHI CHÚ NHỮNG CỤM TỪ VIẾT TẮT TT Viết đầy đủ Viết tắt CMC Carboxylmethyl cellulose CMCase Enzyme carboxylmethyl cellulase DNS 3,5 Dinitrosalicylic acid ĐC Đối chứng GYEA Glucose Yeast Extract Agar LiP Lignin peroxidase MnP Manganese peroxidase NAD Nicotinamide adenine dinucleotide NADP Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate 10 OD Giá trị mật độ quang 11 PNA Pine Needle agar 12 TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam 13 TN Thí nghiệm 14 VK Vi khuẩn 15 VSV Vi sinh vật Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an vi DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH Trang Bảng: Bảng 1.1 Thành phần lignocellulose vài loài thực vật phế liệu nông nghiệp (%) [26] Bảng 1.2 Vi sinh vật phân hủy lignocellulose 19 Bảng 2.1 Địa điểm thu mẫu kí hiệu mẫu 23 Bảng 2.2 Giá trị pH dung dịch đệm citrat 25 Bảng 2.3 Kết nồng độ đường khử (mg/ml) với mật độ quang OD 540nm 31 Bảng 3.1 Hàm lượng số thành phần hóa học thông(%) 34 Bảng 3.2 Kết ni cấy vi khuẩn mơi trường GYEA có bổ sung PNA 35 Bảng 3.3 Hoạt tính enzyme LiP chủng ngày 37 Bảng 3.4 Hoạt tính enzyme MnP chủng ngày 39 Bảng 3.5 Hoạt tính cellulase (IU) chủng vi khuẩn qua ngày nuôi lắc 41 Bảng 3.6 Khả sinh trưởng chủng vi khuẩn tuyển chọn 43 Bảng 3.7 Một số tiêu theo dõi đánh giá mẫu ủ 45 Hình: Hình 1.1 Cấu trúc lignocellulose Hình 1.2 Cấu trúc cellulose 10 Hình 1.3 Các monomer tạo nên Lignin 14 Hình 2.1 Đường chuẩn glucose bước sóng 540nm 31 Hình 3.1 Các khuẩn lạc mơi trường GYEA bổ sung PNA 35 Hình 3.2 Biểu đồ minh họa kết hoạt tính enzyme LiP cao chủng VSV 38 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an vii Hình 3.3 Biểu đồ hoạt tính enzyme MnP cao chủng VSV 40 Hình 3.4 Biểu đồ kết hoạt động enzyme cellulase chủng VK 42 Hình 3.5 Hoạt tính enzyme LiP, MnP cellulase cao chủng VK 42 Hình 3.6 Biểu đồ thể sinh trưởng qua thời gian chủng VSV 44 Hình 3.7 Mẫu thí nghiệm lúc bắt đầu ủ 45 Hình 3.8 Mẫu thí nghiệm sau tuần ủ 46 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Họ Thông (Pinaceae), họ thực vật Thông (Pinales), bao gồm nhiều lồi thực vật có nón với giá trị thương mại quan trọng tuyết tùng, lãnh sam, thiết sam, thông rụng lá, thông vân sam Họ bao gồm thân gỗ, thân có nhựa thơm, tán thường hình tháp Nó họ lớn tính theo đa dạng loài, với khoảng 220-250 loài (phụ thuộc vào quan điểm phân loại học) 11 chi Ở Việt Nam có chi với 12 lồi thơng, lồi thơng nhựa (Pinus merkusii) trồng phổ biến nhiều địa phương Thông nhựa (P.merkusii) gỗ lớn, phổ sinh thái rộng, có giá trị nhiều mặt, ngồi sản phẩm gỗ thơng dụng, cịn cho sản phẩm nhựa thơng có giá trị thương mại thị trường ngồi nước Nhựa thơng với hai thành phần nhựa tùng hương, loại sản phẩm hàng hóa xuất có giá trị, nguyên liệu thiếu nhiều ngành công nghiệp Diện tích trồng thơng nhựa nước ta nước vùng Đông Nam Á ngày mở rộng Ở Việt Nam, Thông nhựa đối tượng nhà quản lý, nhà khoa học người dân quan tâm gây trồng phát triển Rừng trồng Thơng nhựa ngồi mục tiêu trồng rừng phòng hộ, trồng kinh doanh lấy gỗ, cho thu sản phẩm nhựa thông đặn hàng năm, giúp giải khó khăn tiền mặt, có ý nghĩa giá trị thiết thực với nhiều hộ nơng dân, đặc biệt khu vực miền núi phía Bắc Quảng Ninh, Phú Thọ Nghệ An Tuy vậy, tổng sản lượng nhựa thông loại Việt Nam nhỏ, đạt khoảng 3.500 tấn/năm, có tới 2/3 dùng để xuất Lá thơng có vài cơng dụng tái sinh dinh dưỡng cho đất trồng; Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 41 Bảng 3.5 Hoạt tính cellulase (IU) chủng vi khuẩn qua ngày ni lắc Chủng Hoạt tính cellulase (IU = µmol/ml/phút) VSV Ngày thứ Ngày thứ Ngày thứ Ngày thứ Ngày thứ MK11 0.364 0.761 1.136 1.01 0.818 MK12 0.138 0.692 0.864 0.937 0.821 MK21 0.176 0.528 0.933 0.752 0.744 MK22 0.269 0.641 0.845 0.828 0.783 MK31 0.113 0.438 0.604 0.726 0.612 MK32 0.207 0.761 0.968 0.835 0.804 MK42 0.271 0.843 1.281 1.022 0.917 MK51 0.315 0.805 1.167 1.016 0.878 MK52 0.452 0.936 1.101 1.314 0.95 Kết nhận bảng 3.5 cho thấy mơi trường, hoạt tính enzyme cao ngày thứ thứ Trong chủng có hoạt độ cellulase cao vào ngày thứ chủng MK42 (1.281 IU), MK51 (1.167 IU), MK11 (1.136 IU), MK32 (0.968 IU), MK21 (0.933 IU), MK22 (0.845 IU) Có chủng có hoạt tính cellulase cao vào ngày thứ MK52 (1.314 IU), MK12 (0.937 IU), MK31 (0.726 IU) Với kết bảng 3.5, nghiên cứu cho kết thấp nghiên cứu vi sinh vật phân hủy đồng thời lignin cellulose thu thập đoạn gỗ mục (Nguyễn Ngô Yến Ngọc, 2014), thu thập từ mạt dừa sau trồng nấm (Lương Bảo Uyên, 2008) Kết minh họa lại biểu đồ hình 3.4 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 42 Hình 3.4 Biểu đồ kết hoạt động enzyme cellulase chủng VK Để so sánh hoạt tính enzyme LiP, MnP, cellulase chủng vi khuẩn thời điểm hoạt độ cao nhất, kết bảng 3.2, 3.3 3.4 tóm tắt biểu đồ hình 3.5 Hình 3.5 Hoạt tính enzyme LiP, MnP cellulase cao chủng VK Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 43 1.4 Sinh trưởng chủng phân lập Việc phát triển chủng phân lập, cần thiết phải có đánh giá mức độ sinh trưởng chúng để xác định thời điểm thu sinh khối Chúng sử dụng phương pháp Hoàng Vĩnh Phú cộng (2011)[27] để xác định đồ thị sinh trưởng chủng Kết trình bày bảng 3.6 biểu đồ 3.6 Bảng 3.6 Khả sinh trưởng chủng vi khuẩn tuyển chọn Tốc độ sinh trưởng (OD 600nm) Thời gian MK11 MK12 MK21 MK22 MK31 MK32 MK42 MK51 MK52 0h 0.02 0.063 0.03 0.023 0.052 0.035 0.009 0.023 0.03 4h 0.202 0.116 0.05 0.041 0.105 0.2 0.201 0.179 0.168 8h 0.792 0.584 0.401 0.351 0.511 0.56 0.89 0.98 1.012 12h 1.035 0.822 0.756 0.75 0.918 0.832 1.175 1.152 1.167 16h 1.192 1.054 1.016 0.89 1.068 1.13 1.212 1.184 1.22 20h 1.278 1.169 1.127 1.124 1.173 1.208 1.29 1.275 1.327 24h 1.334 1.256 1.266 1.278 1.28 1.229 1.44 1.361 1.411 28h 1.532 1.38 1.289 1.312 1.389 1.315 1.686 1.611 1.685 32h 1.768 1.501 1.55 1.446 1.423 1.491 1.823 1.725 1.86 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 44 Hình 3.6 Biểu đồ thể sinh trưởng qua thời gian chủng VSV Đối với chủng vi khuẩn tuyển chọn, kết cho thấy có chủng tốc độ sinh trưởng nhanh MK42 MK52 Các chủng khác có tốc độ tương quan thuận với nhau, khơng có đột biến lớn Kết cho thấy sau 32 chủng vi khuẩn phân lập chưa có dấu hiệu chuyển sang pha bão hòa So với chủng vi sinh vật khác VSV có khả kháng kim loại nặng hay nhóm E.coli tái tổ hợp kháng kim loại nặng [27] tốc độ sinh trưởng nhóm vi sinh vật chậm 1.5 Thử nghiệm sử dụng dịch nuôi cấy thô từ chủng vi khuẩn Trong chủng vi khuẩn phân lập có chủng cho thấy sinh trưởng mạnh chủng MK11, MK42, MK51, MK52 Chúng sử dụng dung dịch nuôi cấy chủng sinh trưởng mạnh để thử nghiệm đánh giá độ phân hủy thông chủng vi khuẩn Tiến hành ủ thông phương pháp ủ quy mô nhỏ theo phương pháp 2.3.3.4 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 45 Sự thay đổi số tiêu đống ủ Sau tuần tiến hành theo dõi số tiêu, so sánh mẫu ủ thí nghiệm mẫu ủ đối chứng Có kết đánh giá bảng 3.7 hình 3.7, hình 3.8 Bảng 3.7 Một số tiêu theo dõi đánh giá mẫu ủ Chỉ tiêu Mẫu ủ Đối chứng (1) Thỉ nghiệm (2) Nhiệt độ đống ủ tuần Thấp (30°C) Tăng cao (36°C) Nhiệt độ đống ủ tuần Cao (34°C) Giảm (32°C) Độ giảm chiều cao đống ủ 5cm 12cm Màu sắc thông Nâu Nâu đen Độ dài thông ủ Sợi mềm Sợi mềm, mục nát Chú thích: (1): khơng bổ sung dịch ni cấy; (2): có bổ sung dịch ni cấy Hình 3.7 Mẫu thí nghiệm lúc bắt đầu ủ Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 46 Hình 3.8 Mẫu thí nghiệm sau tuần ủ Ở hộp ủ thí nghiệm nhiệt độ tăng cao hộp đối chứng tác động dịch nuôi cấy vi khuẩn phân giải thành phần cellulose, lignin có thơng, q trình trao đổi chất tăng nhanh nên nhiệt độ tăng cao Đến tuần 4, q trình phân giải thơng gần hoàn tất nên nhiệt độ giảm Trong mẫu đối chứng bắt đầu phân giải nên nhiệt độ vừa tăng Kết mẫu thí nghiệm thông bị phân hủy nên màu sẫm lại, nhũn mềm Còn mẫu đối chứng thơng cịn màu nâu, chưa bị phân hủy mềm Từ kết ta thấy việc bổ sung vi sinh vật vào đống ủ có hiệu ủ tự nhiên, có nghĩa thành phần vi sinh vật đất có khả phân hủy thông, giúp rút ngắn thời gian phân hủy Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua kết thí nghiệm, đưa số kết luận sau: 1.1 Thành phần thơng phân tích có holocellulose 63.35%, pentosan 14.02% lignin 28.02% 1.2 Từ mẫu đất thu địa điểm nghiên cứu, phân lập khiết 14 chủng VSV có khả phân giải thông Chúng đặt tên MK11, MK12, MK21, MK22, MK31, MK32, MK41, MK42, MK51, MK52, MT11, MT21, MT31, MT42 1.3 Qua khảo sát hoạt tính enzyme LiP, MnP cellulase, thấy chủng VSV phân lập có chủng có hoạt độ enzyme LiP cao MK52 (0.122 IU), MK42 (0.118 IU), MK11 (0.108 IU) MK51 (0.097 IU); chủng có hoạt tính enzyme MnP cao MK52 (0.081 IU), MK11 (0.078 IU), MK51 (0.074 IU) MK42 (0.073 IU); chủng có hoạt tính enzyme cellulase cao MK52 (1.314 IU), MK42 (1.281 IU), MK51 (1.167 IU) MK11 (1.136 IU) 1.4 Kết khảo sát tốc độ sinh trưởng chủng, thấy rằng: có chủng vi khuẩn sinh trưởng tốt MK11, MK42, MK51, MK52 có khả phân hủy thông tốt 1.5 Bước đầu thử nghiệm sử dụng dịch nuôi cấy VSV từ chủng vi khuẩn cho thấy hiệu phân giải thành phần có thông cellulose, lignin biểu qua khả chuyển hóa nhanh thơng thành mùn Kiến nghị Nếu có điều kiện thời gian nghiên cứu thêm số vấn đề để hoàn chỉnh đề tài hơn: 2.1 Xác định lại hoạt tính enzyme LiP, MnP cellulase nhiều lần để có kết tốt Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 48 2.2 Định danh chủng vi sinh vật phân lập 2.3 Tiếp tục triển khai thử nghiệm tính phân giải thơng quy mơ lớn để ứng dụng thực tế Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Huỳnh Anh (2001), Khả sinh tổng hợp enzym cellulase T reesei môi trường lỏng với nguồn cacbon CMC, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên TP.HCM [2] Khưu Phương Yến Anh (2007), Nghiên cứu khả sinh enzym cellulase số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ, Luận văn Sinh học, Đại học SP Hồ Chí Minh [3] Trần Thị Kim Anh (1999), Bước đầu nghiên cứu khả phân giải cellulose lignin chủng Phanerochaete chrysosporium, Khóa luận tốt nghiệp, Đại học KHTN, Khoa Sinh học [4] Võ Thị Ngọc Cẩm cộng (2015), “Phân lập tuyển chọn số dòng nấm địa phân hủy số vật liệu hữu từ đất thâm canh lúa xã Phong Hịa, huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp”, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, Phần A:36, tr.1-11 [5] Nguyễn Hữu Chấn (1983), “Enzyme xúc tác sinh học”, Nxb Y học [6] Nguyễn Lân Dũng (1975), “Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật”, Tập 3, Nxb Khoa học kỹ thuật - Hà Nội [7] Đặng Minh Hằng (1999), “Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp cellulase số chủng vi sinh vật để xử lý rác”, Báo cáo Khoa học, hội nghị Cơng nghệ Sinh học Tồn quốc, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội: 333-339 [8] Nguyễn Quang Huy cộng (2012), “Sinh enzym ngoại bào peroxidaza, lactaza phân hủy hợp chất vòng thơm chủng xạ khuẩn XKBH1”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 50 (3), tr 285-295 [9] Hồng Quốc Khánh (2003), “Nghiên cứu khả sinh tổng hợp đặc điểm cellulase A niger Rnnl”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học (3), tr.363 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 50 [10] Nguyễn Văn Lâm cộng (2012), “Khảo sát so sánh hàm lượng pentosan số loại hạt ngũ cốc Việt Nam”, Tạp chí Khoa học Phát triển, Tập 10, số 5, tr.758-763 [11] Phạm Thị Ngọc Lan, Phạm Thị Hòa, Lý Kim Bảng (1999), “Tuyển chọn số chủng xạ khuẩn có khả phân giải cellulose từ mùn rác”, Báo cáo khoa học, Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội: 177-182 [12] Vũ Văn Lợi cộng (2012), “Tối ưu hóa thành phần môi trường lên men sản xuất lignin peroxidase từ Streptomyces HX10.7”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 10(1), tr.105-113 [13] Nguyễn Thị Thúy Nga (2009), “Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật có khả phân giải cellulose hiệu lực cao, phù hợp với điều kiện đất bạc màu đặc điểm sinh học chúng để sản xuất phân vi sinh cho lâm nghiệp”, Tạp chí Khoa học Lâm nghiệp - Vol.3, tr.1038-1045 [14] Nguyễn Thị Thúy Nga (2016), Nghiên cứu sở khoa học sản xuất chế phẩm vi sinh vật đa chủng để gieo ươm trồng thơng nhựa đất thối hóa miền bắc Việt Nam, Luận án Tiến sỹ Lâm nghiệp, Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam [15] Nguyễn Ngô Yến Ngọc cộng (2014), “Phân lập, đánh giá tối ưu hóa điều kiện ni cấy số chủng vi sinh vật có khả phân hủy đồng thời lignin cellulose”, Tạp chí Sinh học, 36(1se), tr.34-41 [16] Võ Văn Phước Quệ, Cao Ngọc Điệp (2011), “Phân lập nhận diện vi khuẩn phân giải cellulose”, Tạp chí Khoa học 2011:18a, tr.177-184 [17] Nguyễn Việt Quốc (2008), Nghiên cứu khả phân hủy lignin cellulose mạt dừa chủng Phanerochaete chrysosporium phương pháp sốc nhiệt, Luận văn Thạc sỹ Sinh học, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 51 [18] Nguyễn Xuân Thành cộng (2007), Thực tập vi sinh vật chuyên ngành, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội [19] Lương Bảo Uyên, Phạm Thị Ánh Hồng (2008), “Xử lý mạt dừa sau trồng nấm bào ngư xạ khuẩn”, Tạp chí Khoa học Phát triển cơng nghệ, Tập 11, số 01 Tài liệu tiếng Anh [20] Arora D.S., Paramjit K.G (2001), “Comparison of two assay procedures for lignin peroxidase”, Enzyme and Microbial Technology, 28: 602-605 [21] Benoit Van A., Jame D.S., Henry N., Spiros N.A., Sreven D.A (2000), “Tranlormation ois 2,4,6-trinnitrotoluent (TNT) Reduction Products by lignin peroxidase from the White-Rot Basidiomycete Phanerochaete chrysosporium”, Biosemidiation Joumal 4, pp.135-145 [22] Dashtban M., Schraft H., Qin W (2009), “Fungal bioconversion of lignocellulose residues”, Opportunities and perspectives.Int J.Boil Sci., 5:578-595 [23] David P.Barr and Steven D, Aust (1994), “Mechanism white - rot fungi use to degrade pollutants”, Envirion.Sci Technol., Vol.28 No2 [24] Ghosh and Ghosh (2011), “Pine needles for lactic acid”, BioResources 6(2), 1556-1575 [25] Henriksso G, Nutt A, Henriksson H, Pettersson B, Stahlberg J, Johansson G, Pettersson G (1999), “Endoglucanase 28 (Cell2A), a new Phanerochaete chrysosporium cellulase”, Eur J Biochem 259, pp.88-95 [26] Hetti Palonen (2004), “Role of lignin in the enzymatic hydrolysis of lignocellulose”, VTT Biotechnology, pp.11-39 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 52 [27] Hoang Vinh Phu, Nguyen Thanh Lam, Tran Huyen Trang, Pham Thị Huong and Tran Thi Gai, “Evaluation ATPase activity and Total antioxidant capacity of tellurite resistance operon in bacteria”, Proceeding of 3rd Rajamangala University of Technology International Conferense (RMUTIC), 2011, 50-57 [28] Le Minh Thanh, Hoang Vinh Phu (2014), “Isolation and indentification of cellulolytic microorganism from bovine rumen at TH Truemilk farm, Nghia Dan district, Nghe An”, Khon Kaen Agriculture Journal, Thailand [29] Linko s (1992) “Production of Phanerochaete chrysosporium lignin peroxidase”, Biotechnology Advances 2, Vol.10, pp 191-236 [30] Mawadza C, Hatti-Kaul R, Zvauya R, Mattiasson B (2000), “Purification and characterization of cellulase produced by two Bacillus strains”, Journal of Biotechnology, Vol.83, p.177-187 [31] Miller, G.L., R Blum, W E Glennon and A L Burton (1960), “Measurement of Carboxymethyl cellulase activity”, Anal Biochem, 1:127-132 [32] Phillip K.J Christian W., Wymelenberg A.V., Daniel C (1995), “Phanerochaete chrysosporium Glyoxol oxidase is encoded by two alletic variants: structure, genomic organization and heterologus expression of glx1 and glx2”, Jourmal of Bilogy 21, Vol.17, 6106-6110 [33] Phillip S., Daniel C (1999), “Organization and Yerential regulation of a cluster of lignin peroxidase genes of Phanerochaete chrysosporium”, Joumal of Bacteriology 11, Vol.181, 3427-3432 [34] Smits J.P (1998), Solid-state fermentation, modelling fungal growth and activity, The Doctor Thesis [35] Singh D., Shulin C (2008), “The white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium: conditions for the production of lignin-degrading enzymes”, App.Microbiol.Biotechnol., 81:399-417 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 53 [36] William Michael Lacourt (2011), Enrichment of methanogenic microcosms on recalcitrant lignocellulosic biomass, Masters of Applied Science, Department of Chemical Engineering and Applied Chemistry University of Toronto [37] Yoon-Jae Song (2009), “Characterization of Aromatic Hydrocarbon Degrading Bacteria Isolated from Pine Litter”, Kor.J.Microbiol Biotechnol Vol.37, No.4, p.333-339 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 54 PHỤ LỤC Một số hình ảnh q trình thí nghiệm Pha lỗng mẫu nồng độ khác Mẫu cấy chuyển khuẩn lạc Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn